Aula 3 - Isolamento de clulas de retina de embrio de pinto.

Variados tipos de clulas (vegetais e animais) e organismos so actualmente utilizados como modelos experimentais para estudar diferentes aspectos da biologia celular e molecular. Uma vez que as caractersticas fundamentais de todas as clulas foram sendo conservadas ao longo da evoluo, os princpios bsicos retirados de experincias realizadas com um tipo de clulas so muitas vezes aplicveis a outros tipos de clulas. As culturas de clulas (in vitro) tm um largo espectro de aplicao, estando na base de uma grande variedade de estudos, permitindo, por exemplo, o estudo do crescimento e diferenciao celular e, inclusivamente, a manipulao gentica de forma a compreender a funo e a estrutura de um determinado gene. Uma das maiores vantagens da utilizao de culturas celulares o facto de se poder controlar mais eficazmente o ambiente experimental. De forma a preservar mais informao sobre cada tipo individual de clula desenvolveram-se mtodos de dissociar as clulas dos tecidos e separar os vrios tipos celulares. O resultado desta dissociao, uma populao celular homognea, pode ser ento analisado directamente ou aps o nmero de clulas ser aumentado atravs da sua proliferao em cultura. O primeiro passo para se isolarem clulas animais de um nico tipo romper a matriz extracelular e as junes intercelulares que mantm as clulas juntas. Quando se querem isolar clulas sem capacidade proliferativa, como os neurnios, normalmente recorre-se a tecido fetal, embrionrio ou neo-natal. Podem-se tambm isolar clulas com capacidade proliferativa provenientes de tecido adulto ou de tecido tumoral. O isolamento celular feito atravs do tratamento com enzimas proteolticas (ex. tripsina ou colagenase) e/ou com agentes que ligam clcio (EDTA), necessrio para a adeso entre as clulas. Aps o isolamento, realizado em condies asspticas de forma a minorar as contaminaes microbiolgicas, as clulas so mantidas em caixas ou frascos de plstico especiais para culturas, contendo meio de cultura com os nutrientes necessrios, numa incubadora a 37C com 95% humidade e 5% CO2.

As culturas celulares que se estabelecem inicialmente a partir de um tecido so denominadas culturas primrias. Normalmente, clulas com capacidade de diviso crescem at cobrirem toda a superfcie do frasco ou caixa. Algumas clulas da cultura primria podem ento ser colocadas numa densidade mais baixa em novos frascos de cultura estabelecendo culturas secundrias ou culturas filhas. Este processo pode ser repetido vrias vezes mas, de uma maneira geral, no indefinidamente. De facto, a partir de determinado nmero de divises,

dependendo do tipo de clulas, as clulas acabam por morrer. Por

exemplo, fibroblastos humanos normais podem ser cultivados cerca de 50 vezes a partir de uma cultura primria. No entanto, clulas retiradas de tumores ou clulas modificadas atravs de vrus podem proliferar de forma indefinida em cultura, sendo referidas como linhas celulares imortais. Este tipo de linhas bastante til em diferentes tipos de experincias uma vez que providenciam uma fonte de clulas de forma contnua e uniforme, podendo ser manipuladas, clonadas e propagadas indefenidamente no laboratrio.

Cmara de contagem , Cmara de NeuBauer ou Hemocitmetro

Isolamento de Clulas da Retina de Embrio de Pinto - Protocolo

Na aula prtica ir-se- proceder ao isolamento de clulas de retina a partir de embries de pinto, com o objectivo de estabelecer uma cultura celular primria. O isolamento das clulas de retina de pinto deve ser feito em condies asspticas numa cmara de fluxo laminar (ver figura).

A. Material - Ovos de galinha com 8 dias de incubao a 38,5 C, 70% humidade - Caixas de Petri - Multi-wells revestidas com poli-L-lisina 0,1 % - Pinas

B. Solues - BME Meio basal de Eagle com 20 mM de Hepes e 1 mM NaHCO3, suplementado com 5% de soro fetal bovino, penicilina (100 U/ml) e estreptomicina (100 g/ml) - Meio de isolamento Meio de Hanks sem Ca2+ nem Mg2+ (NaCl 137 mM, KCl 4,4 mM, KH2PO4 0,34 mM, NaHCO3 4 mM, glicose 5 mM, pH 7,4) - 0,1 % de tripsina em meio de isolamento

C. Procedimento - Aquecer os meios a 37 C e preparar a soluo de tripsina - Preparar as caixas de Petri com Meio de Isolamento - Passar os ovos por lcool, partindo-os com a tesoura pela parte mais larga - Remover o embrio para uma caixa de Petri, separar os olhos e retirar o tecido em volta destes - Retirar o humor aquoso ou cristalino e o humor vtreo - Separar a retina do epitlio pigmentado - Colocar as retinas num tubo de falcon com tripsina em Meio de isolamento (0,1 %) - Incubar a 37 C durante 15 minutos - Centrifugar a 800 rpm durante 1 min

- Ressuspender as clulas em Meio de Cultura e aspirar com uma pipeta repetidamente para as dissociar.

Contagem das clulas (exemplo): - Retirar 25 l da suspenso celular e diluir 5x com azul de trip. - Colocar a suspenso numa cmara de contagem (ver figura) e contar as clulas. - Colocar o n de clulas desejado em multi-wells revestidas com poli-L-lisina.

Exemplo: Quadrado 1 - 50 clulas viveis Quadrado 2 - 45 clulas viveis Quadrado 3 - 52 clulas viveis Quadrado 4 - 56 clulas viveis [ ] suspenso celular: 50,75 x factor de diluio x 104 clulas/ml 50,75 x 5 x 104 clulas = 2, 54 x 106 clulas/ml de suspenso Mdia: 50,75 clulas