Anda di halaman 1dari 23

TEKNOLOGI SEDIAAN STERIL Uji Pirogenitas Rabbit Test

Disusun oleh:

Siti Nurlaela Kurnia NIM: P17335112207

POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKES BANDUNG JURUSAN D3 FARMASI 2013

BAB I PENDAHULUAN

I.1 LATAR BELAKANG Studi mengenai efek panas setelah pemberian larutan tertentu secara intravena dimulai sebelum abad ke-19. Pada 1894, Sanarelli menunjukkan kultur larutan Ebert bacillus, yang bebas dari mikroorganisme, tapi dapat menyebabkan intoksikasi yang diikuti dengan demam ketika diinjeksi pada hewan, bahkan beberapa terjadi kematian. Pada abad ke-19, istilah injection fever telah digunakan untuk menunjukkan reaksi demam yang terdapat setelah administrasi beberapa larutan. Pemberian produk secara intravena pada abad ke-20, meningkatkan jumlah kecelakaan yang terjadi akibat pirogen, menyebabkan para peneliti membuat serangkaian evaluasi mengenai hal ini. Pada 1912, Hort dan Penfold membuat nama pyrogenic untuk air yang ketika diinjekkan menyebabkan hipertermia. Istilah ini juga digunakan Florance Seibert pada tahun 1923 yang menyebutkan senyawa pirogenik sebagai hyperthermising atau zat yang menyebabkan hipertermi, yang mengandung bakteri mati-intak maupun disintegrasi, patogenik maupun tidak, atau lebih pada produk metabolik bakteri, seperti protein denaturasi, endotoksin, atau eksotoksin. Jadi, pirogen eksogen merupakan senyawa yang bila diadministrasikan pada manusia dan hewan akan menyebabkan peningkatan suhu tubuh. Semua produk farmasi dengan berbagai macam rute harus memenuhi kriteria safety dan efficacy. Produk parenteral merupakan sediaan dengan pemberian injeksi dengan melalui kulit atau membran mukosa langsung menuju sistem biologis, melewati mekanisme pertahanan tubuh. Dengan demikian sediaan parenteral memiliki kriteria yang lebih ketat jika dibandingkan dengan rute pemberian lain. Hal ini disebabkan karena resiko pemberian secara parenteral yang lebih besar dibandingkan dengan pemberian dengan tipe lain.

Produk parenteral memiliki standar purity (kemurnian) dan safety (keamanan) yang berbeda dari produk lain. Selain harus memenuhi standar potensi dan stabilitas, sediaan parenteral harus memenuhi standar terkait mikroba (sterilitas dan pirogen), parameter fisik (bebas dari kontaminasi partikel), dan parameter kimia (isotonisitas, kapasitas dapar). Untuk mencapai standar tersebut dibutuhkan usaha pada formulasi maupun level manufaktur. Untuk mengetahui apakah produk parenteral memenuhi syarat bebas pirogen, maka dilakukan pengujian. Salah satu metode pengujiannya adalah Rabbit Test. Pada praktikum kali ini, dilakukan pengujian pirogen terhadap sediaan parenteral dengan metode Rabbit test. Tujuan dari praktikum ini agar praktikan dapat mengetahui dan memahami uji pirogenitas dengan metode Rabbit Test. Pengujian dilakukan dengan mengukur peningkatan suhu badan kelinci yang disebabkan penyuntikan intravena sediaan uji steril.

I.2 TUJUAN PRAKTIKUM Adapun tujuan dari praktikum ini adalah: 1. Praktikan dapat mengetahui dan memahami uji pirogenitas dengan metode Rabbit Test. 2. Praktikan mampu melaksanakan uji pirogenitas dengan metode Rabbit Test.

BAB II LANDASAN TEORI II.1 PROGEN Pirogen adalah racun (toksin) yang menimbulkan demam bila diberikan secara intravena dalam jumlah tertentu (Goeswin Agus, 2009). Ada dua kelas utama pirogen, yaitu endogenus dan eksogenus. Pirogen endogen merupakan senyawa yang diproduksi oleh tubuh setelah seseorang mengkonsumsi pirogen eksogen. Respon ini merupakan mediator utama dari proses demam. Senyawa pirogenik yang paling poten adalah yang diproduksi oleh bakteri gram negatif (endotoksin), akan tetapi gram positip dan fungi juga menghasilkan pirogen dengan potensi yang lebih rendah. Selain pirogen beberapa senyawa lain juga diketahui menyebabkan reaksi piretik ini, yaitu steroid, virus, bahan kimia dan obat tertentu. Akan tetapi, yang paling menjadi perhatian industri farmasi adalah, eksogenus pirogen yang paling penting, yaitu endotoksin. Endotoksin, disebut juga LPS, merupakan komponen utama dari membran terluar bakteri gram negatif. Endotoksin tersusun dari polisakarida hidrofilik, yang terikat secara kovalen dengan kandungan lipid yang hidrofobik (Lipid A). LPS dari sebagian besar spesies bakteri tersusun dari tiga bagian yang berbeda, yaitu: bagian antigen-O, oligosakarida inti (core oligosacharida) dan Lipid A. Lipid A merupakan bagian yang paling konservatif, dan merupakan bagian yang menjadi penyebab aktifitas biologi endotoksin, misalnya toksisitas endotoksin. Bagian hidrofobik dari endotoksin tersebut tersusun secara heksagonal, sehingga secara struktur lebih rigid (kuat)

dibandingkan dari molekul lain. Bagian oligosakarida inti memiliki struktur konservatif dengan bagian dalam berupa 3-deoxy-D-manno-2octulosonic acid (KDO)-heptose region, terdapat lima tipe inti yang berbeda, sedangkan spesies salmonella memiliki hanya satu tipe. AntigenO secara umum tersusun dari sekuens oligosakarida yang identik (masingmasing terdiri dari 3-8 monosakarida), yang spesifik sesuai jenisnya.

Molar mass dari monomer endotoksin bervariasi dari 10-20 KD, bervariasi tergantung pada ikatan oligosakaridanya, akan tetapi ada juga yang mencapai 70 KD. Telah diketahui bahwa endotoksin membentuk berbagai agregat supra-molekular di larutan yang mengandung air, yang disebabkan oleh interaksi non-polar antara ikatan lemak dan juga jembatan yang dihasilkan antara gugus fosfat oleh kation divalen. Berbagai studi telah dilakukan yang menghasilkan bahwa pada larutan aquous, endotoksin dapat self assemble menjadi berbagai bentuk, seperti lamela, kubik dan heksagonal, dengan diameter hingga 0,1 mikrometer, dan memiliki stabilitas yang tinggi tergantung pada sifat larutan (pH, ion, surfaktan). Endotoksin dihasilkan pada jumlah besar pada saat sel mati dan selama pertumbuhan dan pembelahan. Endotksin memiliki sifat haet-stable dan tidak dapat dihancurkan dengan kondisi sterilisasi biasa, karena banyak pirogen tahan terhadap proses autoklaf, dan dapat lolos filtrasi dengan ukuran pori-pori 0,2 mikrometer yang biasa digunakan untuk sterilisasi akhir. Endotoksin baru bisa diinaktivasi ketika diekspos pada suhu 2500C selama lebih dari 30 menit, atau 1800C selama lebih dari 3 jam. Asam dan alkali dengan kekuatan minimal 0,1 M dapat juga digunakan untuk menghancurkan endotoksin pada skala laboratorium. Level endotoksin maksimum untuk aplikasi intravena pada produk farmasi dan biologi adalah 5 endotoksin unit (EU) per kg berat badan per jam yang dicantumkan pada farmakope. Istilah EU menunjukan aktivitas biologis endotoksin. Sebagai contoh, 100 pg standar endotoksin EC-5 dan 120 pg endotoksin dari Eschercia coli O111:B4 memiliki aktivitas 1 EU. Untuk memenuhi persyaratan ini, merupakan tantangan bagi industri farmasi. II.2 DEPIROGENASI Depirogenasi bahan, alat dan wadah pada produksi sediaan farmasi dapat dilakukan dengan dua cara, yaitu inaktivasi (destruksi) atau removal. A. Inaktivasi Inaktivasi biasanya melibatkan beberapa reaksi kimia

(contohnya oksidasi, alkilasi, atau hidrolisis endotoksin). Metode

tersebut tidak banyak digunakan untuk depirogenasi bahan awal dan air. Bila menggunakan metode ini maka harus memperhatikan bahan kimia yang digunakan untuk memastikan tidak adanya efek samping. Inaktivasi dengan panas kering merupakan metode yang efektif untuk inaktivasi pirogen pada alat-alat gelas dan minyak yang tahan panas, juga bubuk tahan panas. Temperatur yang disarankan untuk insinerasi adalah 170-350 deg C. Suhu yang paling umum digunakan adalah 2500C selama 30 menit (Remington: 45 menit). Suhu lain bisa digunakan 6500C selama 1 menit atau 1800C selama 4 jam. Dengan suhu yang lebih rendah membutuhkan waktu insinerasi selama 1 hingga 12 jam. B. Removal Removal pirogen secara fisik lebih menguntungkan dari pada penambahan bahan kimia karena tidak ada bahan kimia yang ditambahkan pada bahan yang akan di sterilisasi. 1. Rinsing Atau dilusi bahan/ alat dengan air bebas pirogen merupakan cara yang efektif untuk menghilangkan pirogen. 2. Destilasi Metode ini merupakan metode yang cukup umum digunakan untuk raw water dimana pirogen merupakan bahan yang tidak menguap dan dengan demikian tidak akan ada pada destilat. 3. Ultrafiltrasi Merupakan teknik separasi berdasarkan pada ukuran partikel molekul endotoksin. Endotoksin aktif merupakan suatu agregat dengan berat lebih dari 10.000 D. Kombinasi ultrafiltrasi dengan ukuran pori 0,1 mikrometer dengan filter sterilisasi (0,2 mikrometer) digunakan untuk sediaan larutan LVP. Penggunaan depth filter dilakukan dengan cara melewatkan larutan pada katridge atau pad yang tersusun dari kaolin, alumunium oksida atau keiselguhr.

Endotoksin elektrostatik

dihilangkan atau obstruksi

dengan

cara

absorpsi itu,

mekanis.

Selain

dikembangkan juga suhu filter bermuatan, dimana media filter diberi muatan positif yang dapat meningkatkan afinitas terhadap endotoksin yang bermuatan negatif. 4. Adsorpsi Adsorpsi menggunakan charcoal biasa juga digunakan. Akan tetapi bahan ini merupakan adsorben kuat untuk banyak obat, terutama dalam bentuk larutan, dan biasanya sulit dihilangkan dari larutan akhir. Adsorbsi yang lain yang bisa digunakan adalah adsorpsi pada suspensi barium sulfat. 5. Reverse Osmosis Reverse osmosis diikuti dengan deionisasi merupakan metode yang diketahui berhasil digunakan untuk

menghilangkan berbagai kontaminan pada air, termasuk endotoksin. 6. Resin ion-exchange dan gamma irradiasi Merupakan metode yang digunakan juga untuk

menghilangkan endotoksin dari sediaan parenteral. III.3 TEKNIK DETERMINASI ENDOTOKSIN Prosedur detail mengenai uji pirogen dan uji bakteri endotoksin telah dijelaskan dengan lengkap pada farmakope. Untuk pengujian pirogen, digunakan kelinci, dimana hewan coba diukur peningkatan suhu tubuhnya setelah diinjeksi IV larutan steril yang diuji. Digunakan kelinci oleh karena respon fibrilnya mirip dengan manusia. Farmakope telah mensyaratkan, apabila tidak dipersyaratkan untuk melakukan uji bakteri endotoksin, maka uji ini harus dilakukan pada semua larutan parenteral dimana volume konsumsinya untuk dosis tunggal adalah 15 ml atau lebih. Kerugian dari rabbit test ini adalah biaya yang mahal dan waktu yang panjang untuk pengujian; tidak dapat dikuantifikasi dan larutan parenteral

tertentu (misalnya yang mengan dung fosfat kalium disis tinggi) akan memberikan respon pirogen. Uji untuk bakteri endotoksin, diketahui sebagai Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) test. Uji ini merupakan uji yang telah umum dilakukan di industri farmasi dimana diperlukan hasil yang terkuantifikasi. Basis dari uji ini adalah lysate dari amoebocyte yang berasal dari darah Horseshoe Crab (Limulus polyphemus), dengan penambahan endotoksin, akan terjadi clotting atau gelasi, sehingga menimbulkan turbiditas atau presipitasi. Saat ini telah dikembangkan kit untuk uji LAL ini yang banyak digunakan di industri. Uji ini telah banyak digunakan untuk uji air dan end-process-testing untuk sediaan parenteral, radiofarmasi dan alat-alat kesehatan. Rhodes dan Hoft mengemukakan alasan mengapa pengujian LAL lebih disukai dibandingkan dengan pengujian pirogen pada kelinci untuk radiofarmasetikal: 1. Pengujian lebih sensitif 2. Pengujian lebih cepat 3. Memerlukan material uji dalam jumlah kecil 4. Keduanya, baik kontrol positif maupun kontrol negatif, dapat dilakukan untuk setiap pengujian 5. Tidak menyebabkan kelinci mengandung bahan radio aktif sehingga lebih disukai dari segi keamanan radiologi. 6. Lebih murah dan lebih mudah disimpan. Akan tetapi terdapat beberapa kerugian dari metode LAL ini.

Beberapa faktor sangat mempengaruhi hasil uji, yaitu pH larutan uji, sumber reagen yang digunakan, konsentrasi kation (kalsium atau magnesium) pada larutan uji, dan level agregasi dari bakteri juga mempengaruhi hasil uji. Sedangkan keuntungan dari metode LAL adalah waktu singkat untuk uji, relatif murah, mudah dilakukan, dan terkuantifikasi.

BAB III PERCOBAAN

III.1 PERALATAN 1. Alat suntik bebas pirogen 2. Alat kaca bebas pirogen 3. Jarum bebas pirogen 4. Termometer 5. Kandang kelinci 6. Timbangan

III.2 BAHAN 1. Kelinci dewasa yang sehat 2. NaCl 0,9% bebas pirogen 3. Larutan Uji

III.3 PROSEDUR KERJA Uji pirogenitas menurut FI edisi III adalah sebagai berikut: A. Kondisi hewan uji: Hewan percobaan digunakan kelinci yang selama seminggu sebelum pengujian tidak menunjukkan penurunan bobot badan. Kelinci tidak dapat digunakan uji pirogenitas jika: 1. 3 hari sebelumnya telah digunakan untuk pengujian pirogenitas dan memberikan hasil negatif. 2. 3 minggu sebelumnya telah digunakan untuk pengujian pirogenitas, sediaan uji tidak memenuhi syarat. 3. Telah digunakan kapan saja untuk pengujian pirogenitas dan respon rata-rata kelompok kelinci melebihi 1,20. B. Alat Digunakan
0

termometer

atau

termometer

listrik

dengan

ketelitian skala 0,1 dan dapat dimasukkan ke dalam rektum kelinci sedalam lebih kurang 5 cm.

Alat suntik dibuat dari kaca atau bahan lain yang cocok, tahan pemanasan pada suhu 2500. C. Sediaan uji Dibuat dari zat uji dengan melarutkan atau mengencerkan dengan larutan natrium klorida P steril bebas pirogen atau jika zat uji berupa larutan yang sesuai dapat langsung digunakan. D. Prosedur Kerja Terdiri dari uji pendahuluan dan pengujian pendahuluan. D.1 Uji pendahuluan 1. 1 jam sebelum pengujian masukkan kelinci ke dalam kotak kelinci sedemikian rupa sehingga kelinci tertahan dengan letak leher yang longgar, badannya bebas hingga kelinci dapat duduk dengan bebas. 2. 1 sampai 3 hari sebelum pengujian, suntikkan intravena 10 ml per kg bobot badan dengan larutan NaCl P 0,9% steril bebas pirogen dalam ruangan yang tenang. 3. Perbedaan suhu ruangan terhadap suhu pemeliharaan tidak boleh lebih dari 30. 4. Selama 1 malam hingga pengujian selesai kelinci tidak di beri makan dan selama waktu pengujian tidak diberi minum. 5. Catat suhu badan kelinci dengan interval tidak lebih dari 30 menit dimulai 90 menit sebelum penyuntikan hingga 3 jam sesudah penyuntikan dengan larutan NaCl P 0,9% steril bebas pirogen. 6. Kelinci yang menunjukkan beda suhu lebih besar dari 0,60 tidak dapat digunakan untuk pengujian utama. D.2 Pengujian utama 1. Lakukan pengujian menggunakan sekelompok hewan percobaan terdiri dari 3 ekor kelinci. 2. Hangatkan sediaan uji hingga suhu lebih kurang 38,50, suntikkan perlahan-lahan ke dalam vena auricularis tiap kelinci.

3. Kecuali

dinyatakan lain,

waktu

penyuntikkan tidak

melebihi 4 menit dan volume sediaan uji tidak kurang dari 0,5 ml dan tidak lebih dari 10 ml per kg berat badan. 4. Jika pengujian gagal, ulangi pengujian hingga 4 kali, tiap kali menggunakan 1 kelompok yang terdiri dari 3 ekor kelinci. D.3 Penafsiran hasil Suhu awal tiap kelinci adalah suhu rata-rata pembacaan suhu dengan interval 30 menit dan dilakukan 40 menit sebelum penyuntikan sediaan uji. Suhu maksimum adalah suhu tertinggi yang dicatat selama 3 jam setelah penyuntikan sediaan uji. Catat suhu badan kelinci dengan interval tidak lebih dari 30 menit dimulai 90 menit sebelum penyuntikan hingga 3 jam setelah penyuntikan sediaan uji. Selisih antara suhu inisial dan suhu maksimum tiap kelinci dinyatakan sebagai suhu respon. Jika suhu respon negatif, dianggap nol. Kelinci dinyatakan memenuhi syarat jika perbedaan suhu awal antara kelinci yang satu dengan yang lain tidak lebih dari 10. Kelinci dinyatakan tidak memenuhi syarat jika perbedaan suhu awalnya lebih besar dari 0,20, suhu awal lebih kecil dari 38,00 dan tidak lebih besar dari 39,80. Sediaan uji dinyatakan memenuhi syarat jika jumlah respon tidak melebihi kolom 2 dan dinyatakan tidak memenuhi syarat jika jumlah respon melebihi kolom 3 untuk tiap kelompok. Jika jumlah respon terletak antara kolom 2 dan kolom 3, pengujian diulangi. Jika pengujian ke- 4 jumlah respon melebihi 6,600 sediaan uji dinyatakan tidak memenuhi syarat.

DAFTAR Jumlah kelinci Sediaan uji memenuhi syarat Sediaan uji tidak jika jumlah respon tidak memenuhi syarat

melebihi
0

jika jumlah respon melebihi 2,700 4,300 6,00 6,600

3 6 9 12

1,20

2,800 4,500 6,600

Pengujian pirogen menurut FI edisi IV adalah sebagai berikut: I. Kondisi hewan uji 1. Gunakan kelinci dewasa yang sehat. 2. Masukkan satu ekor kelinci ke kandang/ ruangan dengan suhu 20-230C. 3. Tempatkan kandang pada ruangan yang tidak menimbulkan kegelisahan pada kelinci. 4. Jika kelinci belum pernah digunakan, maka adaptasikan kelinci selama 7 hari. 5. Kelinci tidak boleh digunakan, jika: a. Lebih dari satu kali dalam jangka waktu 48 jam. b. Sebelum 2 minggu setelah dilakukan uji pirogen, kelinci mengalami kenaikan suhu maksimum 0,600C. c. Telah digunakan untuk melakukan uji sediaan yang mengandung pirogen dalam jangka waktu sebelum 2 minggu. 6. Pada waktu pengujian, kelinci tidak boleh diberi makan, boleh diberi minum, tetapi dibatasi. II. Prosedur kerja: 1. Siapkan alat dan bahan uji. 2. Lakukan pengujian di ruang terpisah (agar tidak

menimbulkan kegelisahan pada kelinci).

3. Masukkan kelinci dalam kotak penyekap sehingga kelinci tertahan dan letak leher longgar (jika menggunakan transmisator). 4. Tentukan suhu awal kelinci, 30 menit sebelum disuntikan larutan uji. 5. Atur suhu awal kelinci, tidak boleh lebih dari 39,80C dan beda suhu tiap kelinci dalam 1 kelompok tidak boleh lebih dari 10C. 6. Suntikan 10 ml/ KgBB, melalui vena tepi telinga 3 ekor kelinci dan penyuntikan dilakukan dalam waktu 10 menit. 7. Larutan uji berupa sediaan yang bila perlu di konstitusi seperti yang tertera pada masing-masing monografi dan disuntikan dengan dosis seperti yang tertera pada etiket. 8. Jika uji pirogen pada alat kesehatan, maka cuci permukaan alat yang berhubungan langsung dengan tubuh atau jaringan tubuh pasien dan air bilasan pencucian alat kesehatan yang di ujinya. 9. Hangatkan larutan pada suhu 370C 20C sebelum penyuntikan. 10. Rekam suhu berturut-turut setelah 1 jam pertama

penyuntikan sampai jam ke-3, suhu di ukur setiap 30 menit. III. Penafsiran hasil 1. Setiap penurunan suhu di anggap nol. 2. Sediaan memenuhi syarat apabila tak seekor kelinci pun menunjukkan kenaikan suhu 0,50C atau lebih, lanjutkan pengujian dengan 5 ekor kelinci. 3. Jika tidak lebih dari 3 ekor, dari total 8 ekor kelinci masingmasing mengalami kenaikan suhu 0,50C atau lebih, tetapi suhu total dari 8 ekor kelinci maksimum 3,30C, maka sediaan dianggap bebas pirogen.

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

IV.1 HASIL A. Pengamatan bobot kelinci selama 1 minggu Tabel 4.1 Bobot kelinci Identitas Kelinci Selasa, 17 09 2013; 12.30 1,55 kg WIB Rabu, 18 09 2013; 12.30 1,55 kg WIB Kamis, 19 09 2013; 12.30 1,56 kg WIB Kelinci 1 Jumat, 20 09 2013; 12.30 1,58 kg WIB Sabtu, 21 09 2013; 12.30 1,58 kg WIB Minggu, 22 09 2013; 12.30 1,59 kg WIB Senin, 23 09 2013; 12.30 1,60 kg WIB Selasa, 17 09 2013; 12.30 1,64 kg WIB Rabu, 18 09 2013; 12.30 1,64 kg WIB Kelinci 2 Kamis, 19 09 2013; 12.30 1,64 kg WIB Jumat, 20 09 2013; 12.30 1,65 kg WIB Sabtu, 21 09 2013; 12.30 1,70 kg Novia Novia Ghina Ghina Ghina Ghina Ghina Citra Citra Citra Citra Citra Hari-Jam pengamatan Bobot (Kg) Keterangan

WIB Minggu, 22 09 2013; 12.30 1,72 kg WIB Senin, 23 09 2013; 12.30 1,72 kg WIB Selasa, 17 09 2013; 12.30 1,80 kg WIB Rabu, 18 09 2013; 12.30 1,83 kg WIB Kamis, 19 09 2013; 12.30 1,83 kg WIB Kelinci 3 Jumat, 20 09 2013; 12.30 1,83 kg WIB Sabtu, 21 09 2013; 12.30 1,84 kg WIB Minggu, 22 09 2013; 12.30 1,86 kg WIB Senin, 23 09 2013; 12.30 1,86 kg WIB Bu Ela Bu Ela Bu Ela Bu Ela Bu Ela Bu Ela Novia Novia Novia

Kesimpulan: Dari ketiga kelinci yang diamati, tidak ada satupun kelinci yang mengalami penurunan berat badan selama satu minggu. Jadi ketiga kelinci tersebut memenuhi persyaratan sebagai hewan percobaan pada uji pendahuluan.

B.Uji pendahuluan Waktu pelaksanaan: 24 september 2013 Larutan uji: Larutan NaCl 0,9% steril bebas pirogen Keterangan mengenai penyuntikan: Volume penyuntikkan masing-masing kelinci adalah sebesar 10 ml/kg BB. Penyuntikan dilakukan secara intravena. Penyuntikan : Kelinci 1 : 1,60 kg x 10 ml = 16 ml Kelinci 2 : 1,72 kg x 10 ml = 17,2 ml Kelinci 3 : 1,86 kg x 10 ml = 18,6 ml Pencatatan suhu tubuh kelinci adalah sebagai berikut: Tabel 4.2 Uji pendahuluan Identitas Kelinci Jam pengamatan Suhu (oC) Keterangan (nama pelaksana 07.00 WIB 07.30 WIB 08.00 WIB 08.05 WIB Kelinci 1 08.35 WIB 09.05 WIB 09.35 WIB 10.05 WIB 10.35 WIB 11.05 WIB 07.05 WIB 07.35 WIB Kelinci 2 08.05 WIB 08.10 WIB 08.40 WIB 36,0 36,1 36,1 (Penyuntikan) 36,1 36,1 36,2 36,2 36,2 36,2 36,2 36,2 36,3 (penyuntikan) 36,5 Citra Citra Citra Citra Citra Citra Citra Ghina Ghina Ghina Ghina Ghina Ghina Ghina Bu Ela

09.10 WIB 09.40 WIB 10.10 WIB 10.40 WIB 11.10 WIB 07.10 WIB 07.40 WIB 08.10 WIB 08.15 WIB Kelinci 3 08.45 WIB 09.15 WIB 09.45 WIB 10.15 WIB 10.45 WIB 11.15 WIB

36,5 36,5 36,5 36,5 36,5 35,5 35,5 35,6 (Penyuntikan) 35,6 35,7 35,8 35,8 35,8 35,8

Bu Ela Bu Ela Bu Ela Bu Ela Bu Ela Bu Ela Novia Novia Novia Novia Novia Novia Novia Novia Novia

Kesimpulan: Dari ketiga kelinci yang telah diuji pendahuluan, tidak satupun kelinci menunjukkan perbedaan suhu atau kenaikan suhu lebih dari 0,6oC sehingga dapat disimpulkan bahwa ketiga kelinci tersebut dapat digunakan untuk pengujian utama. B. Uji Utama (menurut FI edisi IV) Waktu Pelaksana: Kamis, 26 September 2013 Larutan Uji: Calcii Glukonas injeksi 10% Keterangan mengenai penyuntikkan: Dosis untuk manusia adalah sebesar 10% = 10 gram/100ml = 0.1 gram/ml Konversi dari manusia (70 kg) ke kelinci adalah 0,07 Dosis untuk kelinci = 0,1 gram/ml x 0,07 = 0.007 gram/ml = 7 mg/ml Penyuntikan :

Kelinci 1 : 1,60 kg/1,50 kg x 7 mg/ml = 7,5 mg + WFI ad 16 ml Kelinci 2 : 1,72 kg/1,50 kg x 7 mg/ml = 8,0 mg + WFI ad 17,2 ml Kelinci 3 : 1,86 kg/1,50 kg x 7 mg/ml = 8,7 mg + WFI ad 18,6 ml Tabel 4.3 Uji utama Identitas Kelinci Jam pengamatan Suhu (oC) Keterangan (nama pelaksana) 07.00 WIB 07.30 WIB 08.30 WIB Kelinci 1 09.00 WIB 09.30 WIB 10.00 WIB 10.30 WIB 07.00 WIB 07.30 WIB 08.30 WIB Kelinci 2 09.00 WIB 09.30 WIB 10.00 WIB 10.30 WIB 07.00 WIB 07.30 WIB 08.30 WIB Kelinci 3 09.00 WIB 09.30 WIB 10.00 WIB 10.30 WIB 36,2 (Penyuntikan) 36,6 36,7 36,7 36,7 36,7 36,5 (Penyuntikan) 36,8 36,9 37,9 37,0 37,0 35,8 (Penyuntikan) 36,0 36,0 36,1 36,1 36,1 Citra Citra Citra Citra Citra Ghina Ghina Ghina Ghina Ghina Ghina Bu Ela Bu Ela Bu Ela Bu Ela Novia Novia Novia Novia Novia Novia 0,3 0,5 0,5 Keterangan (suhu respon)

Kesimpulan: Dari ketiga kelinci diatas ada dua kelinci yang mengalami kenaikan suhu lebih atau sama dengan 0,5oC sehingga pengujian dilanjutkan dengan lima ekor kelinci. (FI IV, 1995) Tabel 4.4 Uji tambahan Identitas Kelinci Jam pengamatan Suhu (oC) Keterangan (nama pelaksana 12.00 WIB 12.30 WIB 13.30 WIB Kelinci 4 14.00 WIB 14.30 WIB 15.00 WIB 15.30 WIB 12.00 WIB 12.30 WIB 13.30 WIB Kelinci 5 14.00 WIB 14.30 WIB 15.00 WIB 15.30 WIB 12.00 WIB 12.30 WIB 13.30 WIB Kelinci 6 14.00 WIB 14.30 WIB 15.00 WIB 15.30 WIB 12.00 WIB Kelinci 7 12.30 WIB 13.30 WIB 36,6 (Penyuntikan) 36,7 36,8 36,8 36,8 36,8 37,0 (Penyuntikan) 37,2 37,4 37,4 37,4 37,4 37,3 (Penyuntikan) 37,5 37,5 37,5 37,7 37,7 36,8 (Penyuntikan) 37,0 Citra Citra Citra Citra Citra Citra Citra Ghina Ghina Ghina Ghina Ghina Ghina Ghina Novia Novia Novia Novia Novia Novia Novia Bu Ela Bu Ela Bu Ela 0,3 0,4 0,4 0,2 Keterangan (suhu respons)

14.00 WIB 14.30 WIB 15.00 WIB 15.30 WIB 12.00 WIB 12.30 WIB 13.30 WIB Kelinci 8 14.00 WIB 14.30 WIB 15.00 WIB 15.30 WIB

37,0 37,1 37,1 37,1 36,5 (Penyuntikan) 36,4 36,3 36,3 36,3 36,3

Bu Ela Bu Ela Bu Ela Bu Ela Ghina Ghina Citra Citra Bu Ela Bu Ela Bu Ela 0

Kesimpulan: Setelah dilakukan pengujian kembali pada 5 ekor kelinci, tidak ada satupun dari 5 ekor kelinci tersebut mengalami kenaikan suhu lebih dari atau sama dengan 0,5 oC, serta jumlah kenaikan suhu maksimum dari 8 ekor kelinci tidak lebih dari 3,3oC yakni hanya 2,6oC (0,5 + 0,5 + 0,3 + 0,2 + 0,4 + 0,4 + 0,3 + 0), maka dinyatakan sediaan memenuhi syarat bebas pirogen. IV.2 PEMBAHASAN Pada praktikum kali ini dilakukan uji pirogen terhadap sediaan uji yaitu injeksi calcii glukonas 10%. Uji pirogen ini menggunakan metode Rabbit Test. Pengujian dilakukan pada kelinci yang sehat dan memenuhi syarat sebagai hewan percobaan uji pirogen sebagaimana tercantum dalam Farmakope Indonesia. Adapun alat-alat yang digunakan dalam uji pirogen ini adalah alat suntik bebas pirogen, alat kaca bebas pirogen, jarum bebas pirogen, kandang kelinci, dan termometer dengan tingkat ketelitian skala 0,10C. Sedangkan bahan yang digunakan adalah larutan NaCl 0,9% steril bebas pirogen, dan larutan sediaan yang akan di uji. Uji pirogen dilakukan menurut FI edisi III, yang terdiri dari beberapa tahap yaitu: pengamatan bobot kelinci selama 1 minggu, uji pendahuluan dan uji utama. Pada praktikum

kali ini dilakukan pengamatan bobot kelinci selama 1 minggu, dan uji pendahuluan (menurut FI edisi III) dan uji utama (menurut FI edisi IV). Pengamatan bobot kelinci dilakukan selama 1 minggu dari tanggal 17 - 23 september 2013. Pengamatan dilakukan terhadap 3 ekor kelinci, dan dari ke-3 ekor kelinci tersebut, tidak satupun kelinci yang mengalami penurunan berat badan (lihat tabel 4.1). Jadi ke-3 ekor kelinci tersebut dapat digunakan atau memenuhi syarat sebagai hewan percobaan pada uji pendahuluan. Uji pendahuluan dilaksanakan pada tanggal 24 september 2013. Larutan uji yang digunakan adalah larutan NaCl 0,9% steril bebas pirogen. Volume penyuntikan 10 ml/ KgBB, secara intravena ke dalam vena auricularis dari masing-masing kelinci. Perbedaan suhu ruangan terhadap suhu pemeliharaan tidak boleh lebih dari 30. Selama 1 malam hingga pengujian selesai kelinci tidak di beri makan dan selama waktu pengujian tidak diberi minum. Catat suhu badan kelinci dengan interval tidak lebih dari 30 menit dimulai 90 menit sebelum penyuntikan hingga 3 jam sesudah penyuntikan dengan larutan NaCl 0,9% steril bebas pirogen. Kelinci yang menunjukkan beda suhu lebih besar dari 0,60C tidak dapat digunakan untuk pengujian utama. Dari hasil pengamatan, dari ke-3 kelinci tersebut tidak satupun kelinci yang menunjukkan beda suhu lebih dari 0,60C (lihat tabel 4.2). Sehingga ke-3 kelinci tersebut dapat digunakan pada pengujian utama. Pengujian utama dilaksanakan pada tanggal 26 september 2013. Pengujian dilakukan menurut FI edisi IV. Sediaan yang di uji adalah injeksi calcii glukonas 10%. Volume penyuntikan 10 ml/ KgBB, secara intravena ke dalam vena auricularis dari masing-masing kelinci. Penyuntikan dilakukan dalam waktu 10 menit. Untuk perhitungan dosis, dilakukan konversi dari dosis manusia (70 kg) ke kelinci (1,5 kg) yaitu 0,007. Tentukan suhu awal kelinci, 30 menit sebelum disuntikan larutan uji. Suhu awal kelinci tidak boleh lebih dari 39,80C dan beda suhu tiap kelinci dalam satu kelompok tidak boleh lebih dari 10C. Catat suhu berturut-turut setelah 1 jam pertama penyuntikan sampai jam ke-3, suhu di ukur setiap 30 menit. Setiap penurunan suhu di anggap nol. Sediaan memenuhi syarat apabila tak seekor kelinci pun menunjukkan kenaikan suhu 0,50C atau lebih, lanjutkan pengujian dengan 5 ekor kelinci. Dari hasil pengamatan, ada 2 kelinci yang mengalami kenaikan suhu lebih dari atau sama dengan 0,50C yaitu kelinci 1 dan 2 (lihat tabel 4.3). Sehingga pengujian dilanjutkan dengan 5 ekor kelinci.

Pengujian tambahan dilakukan pada 5 ekor mencit. Perlakuan sama dengan halnya pada uji utama. Jika tidak lebih dari 3 ekor, dari total 8 ekor kelinci masing-masing mengalami kenaikan suhu 0,50C atau lebih, tetapi suhu total dari 8 ekor kelinci maksimum 3,30C, maka sediaan dianggap bebas pirogen. Setelah dilakukan pengamatan dan pencatatan kenaikan suhu dari ke-5 ekor kelinci tersebut, ternyata tidak ada satupun dari 5 ekor kelinci tersebut mengalami kenaikan suhu lebih dari atau sama dengan 0,5oC, serta jumlah kenaikan suhu maksimum dari 8 ekor kelinci tidak lebih dari 3,3oC yakni hanya 2,6oC (0,5 + 0,5 + 0,3 + 0,2 + 0,4 + 0,4 + 0,3 + 0), maka dinyatakan sediaan memenuhi syarat bebas pirogen. Dari percobaan uji pirogen terhadap sediaan uji injeksi calcii glukonas 10%, dapat disimpulkan bahwa injeksi calcii glukonas tersebut memenuhi syarat bebas pirogen, karena hanya 2 ekor kelinci dari 8 ekor kelinci yang diuji, yang mengalami kenaikan suhu lebih dari atau sama dengan 0,50C, dan jumlah kenaikan suhu maksimum dari 8 ekor kelinci tidak lebih dari 3,3oC yakni hanya 2,6oC.

IV.3 PENDALAMAN MATERI Uji pirogen dilakukan untuk mengetahui apakah sediaan uji (sediaan parenteral) bebas dari pirogen. Uji pirogen ini sangat penting, karena pirogen yang ada dalam sediaan, jika disuntikan ke tubuh manusia dapat menimbulkan peningkatan suhu tubuh atau demam. Selain itu pirogen memberikan efek vasokontriksi, dilatasi pupil, depresi nafas, dan peningkatan tekanan darah. Mungkin reaksi yang muncul juga adalah nyeri pada persendian dan punggung, sakit kepala, mual dan malaise, shok endotoksin, kerusakan jaringan tubuh dan kematian. Akan sangat berbahaya untuk pasien dengan kondisi sakit yang menerima LVP (Large Volume Parenteral) yang mengandung endotoksin. Salah satu metode uji pirogen adalah Rabbit Test. Digunakan kelinci sebagai hewan coba. Hal ini dikarenakan kelinci memiliki respon fibriel yang mirip dengan manusia. Pada uji pirogenitas, penyuntikan dilakukan pada pembuluh vena. Hal ini bertujuan agar obat atau sediaan uji yang disuntikan, langsung terdistribusi ke dalam aliran darah. Sehingga efek panas dari pirogen dapat langsung diamati. Penyuntikan dilakukan pada vena auricularis, karena vena auricularis adalah vena terbesar yang ada pada tubuh kelinci. Sehingga vena dapat dengan mudah dicari dan dilihat.

Sebelum dilakukan uji pirogen terhadap kelinci, perlu dilakukan pengadaptasian terhadap kelinci, dengan tujuan untuk menghindari hasil yang positif palsu, kelinci mengalami kenaikan suhu tubuh bukan disebabkan oleh sediaan uji, melainkan kelinci stress dengan lingkungan yang baru karena sebelumnya tidak diadaptasikan terlebih dahulu.