CROMATOGRAFA Y ESPECTROSCOPA DE RMN APLICADA AL ARA DE POLMEROS

1.1 Introduccin a la cromatografa La cromatografa es un mtodo fsico de separacin para la caracterizacin de mezclas complejas, la cual tiene aplicacin en todas las ramas de la ciencia. Es un conjunto de tcnicas basadas en el principio de retencin selectiva, cuyo objetivo es separar los distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos componentes. Diferencias sutiles en el coeficiente de particin de los compuestos da como resultado una retencin diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separacin efectiva en funcin de los tiempos de retencin de cada componente de la mezcla. La cromatografa puede cumplir dos funciones bsicas que no se excluyen mutuamente: Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos ms puros y que puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas sntesis). Medir la proporcin de los componentes de la mezcla (finalidad analtica). En este caso, las cantidades de material empleadas son pequeas. 1.2 Tipos de cromatografa Las distintas tcnicas cromatogrficas se pueden dividir segn cmo est dispuesta la fase estacionaria: Cromatografa plana. La fase estacionaria se sita sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales tcnicas son: Cromatografa en papel Cromatografa en capa fina Cromatografa en columna. La fase estacionaria se sita dentro de una columna. Segn el fluido empleado como fase mvil se distinguen: Cromatografa de lquidos Cromatografa de gases Cromatografa de fluidos supercrticos La cromatografa de gases incluye a numerosos compuestos orgnicos. En el caso de compuestos no voltiles se recurre a procesos denominados de "derivacin", a fin de convertirlos en otros compuestos que se volatilicen en las condiciones de anlisis. Dentro de la cromatografa lquida destaca la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC, del ingls High Performance Liquid Chromatography), que es la tcnica cromatogrfica ms empleada en la actualidad, normalmente en su modalidad de fase reversa, en la que la fase estacionaria tiene carcter no polar, y la fase mvil posee carcter polar (generalmente agua o mezclas con elevada proporcin de la misma, o de otros disolvente polares, como por ejemplo metanol). El nombre de "reversa" viene dado POLMEROS II Pgina 1

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porque tradicionalmente la fase estacionaria estaba compuesta de slice o almina, de carcter polar, y por tanto la fase mvil era un disolvente orgnico poco polar. Una serie eluotrpica es un rango de sustancias de diferentes polaridades que actan como fase mvil y que permiten observar un mejor desplazamiento sobre una fase estacionaria. 1.3 Historia de la cromatografa El botnico ruso Mijal Tsweet (Mikhail Semenovich Tsweet, 1872-1919) emple por primera vez en 1906 el trmino "cromatografa" (que proviene del griego y que significan respectivamente chroma "color" y graphos "escribir"). A comienzos del ao 1903, Mijail Tsweet us columnas de adsorcin de lquidos para separar pigmentos vegetales (por ejemplo, clorofilas). Las disoluciones se hacan pasar a travs de una columna de vidrio rellena de carbonato de calcio, que finamente dividido de un material poroso que interacciona de forma diferente con los componentes de la mezcla, de forma que stos se separaban en distintas bandas coloreadas a lo largo de la columna. Los primeros equipos de cromatografa de gases aparecieron en el mercado a mediados del siglo XX. A su vez, la cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) comenz a desarrollarse en los aos 1960, aumentando su importancia en las dcadas siguientes, hasta convertirse en la tcnica cromatogrfica ms empleada. Sin embargo esto se ir modificando con el paso de los aos. 1.4 Cromatografa por exclusin de tamao (SEC) La cromatografa de exclusin por tamaos est basada en la utilizacin de fases estacionarias constituidas por una material, principalmente orgnico, muy poroso y tericamente inerte que permite la discriminacin de los solutos segn su forma o tamao molecular. Es muy difcil conocer la forma de los solutos en disolucin, por lo que principalmente se utiliza el diferente tamao (peso molecular) para realizar la separacin. Un material muy poroso es aqul en el que el volumen del material es despreciable frente al volumen de los poros. La IUPAC divide a la SEC en dos modalidades en funcin de la solubilidad de las sustancias a separar, aunque es una divisin en desuso. Cromatografa de filtracin en gel (GFC). Para sustancias solubles en agua. Cromatografa de penetracin en gel (GPC). Para sustancias lipoflicas. 1.4.1 Mecanismo de separacin

Tenemos una columna constituida por una fase estacionaria de tamao de partculas de 3 a 5 micras y totalmente porosas. Para el estudio de la separacin inyectamos en un flujo de velocidad constante dos tipos de molculas de determinado tamao, unas de menor POLMEROS II Pgina 2

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tamao que el dimetro del poro (A) y otras de mayor tamao que el dimetro del poro (B). 1. El distinto tamao de las molculas hace que unas recorran ms camino que otras. Las ms pequeas entran en el entramado poroso de las partculas de la fase estacionaria, mientras que las ms grandes no entran, avanzan en la columna a travs de los espacios intersticiales (espacios entre partculas), por lo que recorrern menos camino. 2. Todas aquellas partculas de mayor tamao que el de los poros salen a la vez creando el primer pico cromatogrfico. Este pico define exclusin total, ninguna de las molculas correspondientes a este pico se introduce en el entramado poroso. Este pico nos define el volumen vaco intersticial (Vo), es decir, el volumen de la fase mvil de los intersticios. 3. Aquellas molculas que se introducen en los entramados porosos tardan ms en salir, tardando ms cuanto ms pequeas sean. Suponemos que se trata de molculas no mucho ms pequeas que el tamao de poro, suponemos penetracin parcial. 4. Este ltimo pico se debe a las molculas de disolvente, ya que son las ms pequeas y por tanto las que ms tardan en salir.

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1.4.2 Medicin de pesos moleculares de polmeros utilizando SEC

Recuerde que cuando hablamos de un polmero, no nos referimos a un solo peso molecular, sino a una distribucin de pesos moleculares, como usted puede ver en el grfico de abajo. Lo mejor que podemos hacer es hablar de un peso molecular promedio y describir la distribucin de pesos moleculares alrededor del promedio. Eso significa contar cuntas molculas de polmero tienen realmente el peso molecular promedio, cuntas tienen peso superior o inferior al promedio y en qu cantidad.

Primero se disuelve el polmero, generalmente en un solvente llamado tetrahidrofurano, o THF. Luego tomamos la solucin del polmero y la inyectamos a travs de un tubo. Llamamos columna a este tubo, aun cuando esta no sea recta ni vertical, sino enrollada como un ovillo espiralado. Claro que esto no es cualquier tubo. Est relleno con pequesimas bolitas constituidas por poliestireno entrecruzado. Se encuentra entrecruzado para que no lo disuelva el THF. A su vez las bolitas contienen diminutos agujeros o poros. Los poros son de distintos tamaos. Algunos son grandes agujeros, mientras que otros son extremadamente pequeos. Esto es importante tenerlo en cuenta, ya que la SEC no funcionara si los agujeros fuesen todos del mismo tamao. Todos tienen que ser de distintos tamaos. La explicacin es esta: cuando usted inyecta la solucin de polmero dentro de la columna, las molculas del mismo se vern muy entretenidas en su camino. Las cadenas quedarn atrapadas dentro de los agujeros de las bolitas. Sin embargo, no se quedarn all por mucho tiempo. Una molcula quedar atrapada en un agujero, luego saldr, avanzar un poco por el tubo y quedar atrapada en otro poro. Quedar retenida all por un momento, luego saldr, viajar un poco ms a lo largo del tubo hasta encontrar otro agujero que le apetezca... y as sucesivamente. Finalmente, avanzar hacia el extremo de la columna. Pero ese punto final no ocurre al mismo tiempo para cada molcula del polmero. Lo que trato de decir es que algunas molculas demorarn ms que otras en emerger de la columna. Las molculas grandes, con elevados pesos moleculares, no pueden entrar en algunos de los agujeros ms pequeos. Dado que hay menos poros en los que las grandes molculas puedan quedar retenidas, estas avanzan a travs de la columna sumamente rpido. Pero las molculas ms pequeas con pesos moleculares menores, s POLMEROS II Pgina 4

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pueden quedar retenidas en los poros pequeos. Dado que pueden penetrar en una mayor cantidad de poros, obviamente quedan atrapadas en ms poros. Esto hace que demoren ms tiempo en salir de la columna. Cuando un cromatgrafo por exclusin de tamao (as llamamos al aparato que usamos para realizar una SEC) est correctamente calibrado, podemos conocer el peso molecular de un polmero basndonos en el tiempo que le lleva pasar, o eluir a travs de la columna. Y lo que es ms, tenemos detectores que pueden registrar cuntas molculas polimricas estn saliendo de la columna a un tiempo dado. Por lo tanto, podemos hacer un grfico que registre el tiempo en el eje x y el nmero de molculas emergiendo de la columna a un tiempo dado en el eje y:

Puesto que podemos calcular el peso molecular a partir del tiempo de elucin, tambin es posible modificar este grfico colocando el peso molecular en el eje x y el nmero de molculas con un determinado peso molecular en el eje y:

Recuerde que cuando mayor sea el peso molecular, menor ser el tiempo que tarde la molcula polimrica en atravesar la columna. Por lo tanto en este grfico, el peso molecular decrece de izquierda a derecha. Esto es justamente lo contrario de lo que usted podra esperar, de modo que sea cauteloso y tngalo en mente cuando observe un grfico de SEC. Hay una desventaja con la SEC. En realidad en la SEC no medimos masa sino el volumen hidrodinmico de las molculas polimricas, es decir, el espacio que ocupa una POLMEROS II Pgina 5

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molcula particular cuando se encuentra en solucin. A partir de la SEC podemos hacer una aproximacin al peso molecular, puesto que conocemos la relacin exacta entre peso molecular y volumen hidrodinmico para el poliestireno y usamos poliestireno como standard. Pero la relacin entre volumen hidrodinmico y peso molecular no es la misma para todos los polmeros, de modo que slo obtenemos una medicin aproximada.

1.4.3

Aplicaciones de la SEC

Los mtodos de exclusin por tamaos se subdividen en la cromatografa de filtracin en gel y la de gel permeable. En el primer tipo se utilizan disolventes acuosos y rellenos hidroflicos. En el ltimo, los mtodos se basan en disolventes no polares y en rellenos hidrofbicos. Los mtodos son complementarios en el sentido que en un caso se aplican a muestras solubles en agua, y en el otro a sustancias solubles en disolventes orgnicos poco polares. Una de las aplicaciones ms tiles del procedimiento de filtracin en gel consiste separar las molculas de alto peso molecular de productos naturales de las especies bajo peso molecular y de las sales. Por ejemplo, un gel con un lmite de exclusin varios miles, puede separar bien las protenas de los aminocidos y de los pptidos bajo peso molecular. en de de de

Otra gran aplicacin de la cromatografa de exclusin por tamaos es a la determinacin rpida de los pesos moleculares, o de la distribucin de pesos moleculares en los grandes polmeros o en los productos naturales. En este caso, se comparan los volmenes de elucin de la muestra con los volmenes de elucin de compuestos estndar que tengan las mismas caractersticas qumicas. Las ventajas ms importantes de los procedimientos de exclusin por tamaos son:

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1. Tiempos de separacin cortos y bien definidos [todos los solutos salen de la columna entre dos lmites 2. Bandas estrechas, que conducen a una buena sensibilidad 3. No hay prdida de muestra, porque los solutos no interaccionan con la fase estacionaria 4. No se desactiva la columna por interaccin del soluto con el relleno. Las desventajas son: 1. Debido a que la escala de tiempos en el cromatograma es corta, slo se pueden acomodar un nmero limitado de bandas 2. No es aplicable a muestras de componentes semejantes, como las mezclas de ismeros resolucin aceptable se necesita que la diferencia de pesos moleculares sea la menos de un 10%.

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2.1 Introduccin a la espectroscopia de resonancia magntica nuclear (RMN) La espectroscopia de resonancia magntica nuclear (RMN) es una tcnica empleada principalmente en la elucidacin de estructuras moleculares, aunque tambin se puede emplear con fines cuantitativos y en estudios cinticos y termodinmicos. Algunos ncleos atmicos sometidos a un campo magntico externo absorben radiacin electromagntica en la regin de las frecuencias de radio o radiofrecuencias. Como la frecuencia exacta de esta absorcin depende del entorno de estos ncleos, se puede emplear para determinar la estructura de la molcula en donde se encuentran stos. Para que se pueda emplear la tcnica los ncleos deben tener un momento magntico distinto de cero. Esta condicin no la cumplen los ncleos con nmero msico y nmero atmico par (como el 12C, 16O, 32S). Los ncleos ms importantes en qumica orgnica son: 1H, 13C, 31P, 19F y 15N. Otros ncleos importantes: 7Li, 11B, 27Al, 29Si, 77Se, 117Sn, 195Pt, 199 Hg, 203Tl, 205Tl, 207Pb Se prefieren los ncleos de nmero cuntico de spin nuclear igual a 1/2, ya que carecen de un momento cuadripolar elctrico que produce un ensanchamiento de las seales de RMN. Tambin es mejor que el istopo sea abundante en la naturaleza, ya que la intensidad de la seal depender de la concentracin de esos ncleos activos. Por eso, uno de los ms tiles en la elucidacin de estructuras es el 1H, dando lugar a la espectroscopia de resonancia magntica nuclear de protn. Tambin es importante en qumica orgnica el 13C, aunque se trata de un ncleo poco abundante y poco sensible. La tcnica se ha empleado en qumica orgnica, qumica inorgnica y bioqumica. La misma tecnologa tambin ha terminado por extenderse a otros campos, por ejemplo en medicina, en donde se obtienen imgenes por resonancia magntica. 2.2 Tipos de RMN Espectroscopia de RMN con Onda Continua: Desde sus comienzos hasta finales de los 60, la espectroscopia de RMN utiliz una tcnica conocida como espectroscopia de onda continua (CW). La manera de registrar un espectro de RMN en el modo de CW era, bien mantener constante el campo magntico e ir haciendo un barrido de frecuencias con un campo oscilante, o bien, lo que era usado ms a menudo, se mantena constante la frecuencia del campo oscilante, y se iba variando la intensidad del campo magntico para encontrar las transiciones (picos del espectro). En la RMN de CW las seales del espectro se registran como seales en resonancia. La espectroscopia CW est limitada por su baja sensibilidad, ya que cada seal se registra una sola vez por cada barrido y la tcnica de resonancia magntica nuclear ya es de por s no demasiado sensible; esto quiere decir que la tcnica sufre de una baja relacin seal-ruido. Afortunadamente, en RMN es posible mejorar la relacin seal-ruido mediante el promediado de seal. El promediado de seal consiste en repetir la POLMEROS II Pgina 8

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adquisicin del experimento e ir sumando los espectros que se obtienen. De esta manera, las zonas del espectro en que existen seales se suman de manera constructiva, mientras que, por su parte, las zonas en que hay ruido, por su carcter aleatorio, se acumula ms lentamente que la seal. Mediante el promediado de seal se incrementa la relacin seal-ruido en un valor que es la raz cuadrada del nmero de espectros que se han acumulado. Esta relacin se cumple con espectros de RMN en los que intervienen un slo tipo de ncleos. Espectroscopia de RMN de pulsos y Transformada de Fourier: La tcnica de RMN con transformada de Fourier (FT-NMR) es la que se utiliza en los espectrmetros actuales. Uno de los pioneros en este campo es Richard R. Ernst, que la desarroll a partir del ao 1966 y por la que fue galardonado con el Premio Nobel de Qumica en 1991. FT-NMR permite disminuir drsticamente el tiempo que requiere adquirir una acumulacin (scan) del espectro completo de RMN. En vez de realizar un barrido lento de la frecuencia, una en cada instante, esta tcnica explora simultnea e instantneamente todo un rango de frecuencias. Dos desarrollos tcnicos fueron fundamentales para poder hacer realidad la tcnica FT-NMR: ordenadores capaces de llevar a cabo las operaciones matemticas necesarias para pasar desde el dominio de tiempo al de la frecuencia, es decir, para obtener el espectro; y el conocimiento sobre cmo poder excitar simultneamente todo un rango de frecuencias. La FT-NMR funciona con la muestra (espines nucleares) sometida a un campo magntico externo constante. Se irradia la muestra con un pulso electromagntico de muy corta duracin en la regin de las radiofrecuencias. La forma que suele usarse para este pulso es rectangular, es decir, la intensidad de la radiofrecuencia oscila entre un mximo y un mnimo que es constante mientras dura el pulso. Un pulso de corta duracin tiene una cierta incertidumbre en la frecuencia (principio de indeterminacin de Heisenberg). La descomposicin de fourier de una onda rectangular contiene contribuciones de una de todas las frecuencias. El pulso que se genera es por tanto policromtico y cuanto ms corto sea, es capaz de excitar un mayor rango de frecuencias. La aplicacin de un pulso policromtico en una regin estrecha de la banda de radiofrecuencias (MHz) afecta a aquellos espines nucleares que resuenen en esa regin. Un pulso policromtico con una anchura en frecuencia de unos pocos kHz puede llegar a excitar simltaneamente slo a los espines nucleares de un mismo tipo de ncleo atmico dentro de una molcula, por ejemplo, todos los ncleos de hidrgeno (1H). Antes del pulso el vector de polarizacin neta de cada uno de los espines nucleares se encuentra en situacin de equilibrio alineado en la direccin del campo magntico. Durante el tiempo que se aplica el pulso, el pulso introduce un segundo campo magntico en una direccin perpendicular al campo principal del imn y el vector polarizacin realiza un determinado movimiento de precesin. Tras cesar el pulso, el vector polarizacin de todos los espines afectados puede formar un cierto ngulo con el eje del campo magntico principal. En POLMEROS II Pgina 9

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este momento, los espines, comportndose como pequeos imanes polarizados, comienzan a precesionar con su frecuencia caracterstica en torno al campo magntico externo, induciendo una pequea corriente oscilante de RF en una bobina receptora situada en las inmediaciones de la muestra. A medida que los ncleos van regresando poco a poco a la situacin inicial de equilibrio alineados con en el campo magntico principal, la seal detectada va disminuyendo de intensidad hasta hacerse cero. Esta cada de la seal se conoce como cada libre de la induccin (Free Induction Decay) (FID) y da lugar al espectro de RMN.

2.3 Instrumentacin en RMN Un espectrmetro de RMN consta de las siguientes partes fundamentales: Un imn que genere un campo magntico estable, el cual puede ser de una intensidad variable, definiendo la frecuencia de resonancia de cada ncleo. Generalmente se identifica cada espectrmetro por la frecuencia de resonancia del protn, as en un imn de 7.046 Tesla, los ncleos de 1H resuenan a 300 MHz, y por tanto sera un espectrmetro de 300 MHz. Por el momento el imn de mayor campo magntico del mundo lo ha instalado Bruker en la Universidad de ciencia y tecnologa Rey Abdullah en Arabia Saudita, de 950 MHz (22.3 Tesla). Una sonda, que se sita dentro del imn, en la que se introduce la muestra y que consta de las bobinas responsables de emitir y recibir las radiofrecuencias (RF). El nmero de bobinas y su disposicin determinan el tipo y las aplicaciones de cada sonda. Una consola en la que se generan los pulsos de RF y se controla el resto de la parte electrnica del espectrmetro Un ordenador que sirve de interfaz con el espectrmetro y con el que se analiza toda la informacin obtenida.

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2.4 Informacin obtenida mediante RMN La aplicacin fundamental de la espectroscopia de RMN es la determinacin estructural, ya sea de molculas orgnicas, organometlicas o biolgicas. Para ello es necesaria la realizacin de diferentes tipos de experimentos de los cuales se obtiene una determinada informacin. Para la elucidacin estructural de molculas orgnicas y organometlicas los experimentos ms utilizados son los siguientes: Espectro monodimensional de 1H: Da informacin del nmero y tipo de hidrgenos diferentes que hay en la molcula. La posicin en el espectro (desplazamiento qumico) determina el entorno qumico del ncleo, y por tanto da informacin de grupos funcionales a los que pertenecen o que estn cerca. La forma de la seal da informacin de los protones cercanos acoplados escalarmente. Espectro monodimensional de 13C: Al igual que en 1H el desplazamiento qumico da informacin de los grupos funcionales. Dependiendo del tipo de experimento realizado se puede obtener informacin del nmero de hidrgenos unidos a cada carbono. Espectros bidimensionales homonucleares: Los experimentos COSY y TOCSY dan informacin de las relaciones entre los protones de la molcula, por acomplamiento escalar o dipolar (NOESY) Espectros bidimensionales heteronucleares: Los experimentos HMQC y HSQC indican qu hidrgenos estn unidos a qu carbonos. El experimento HMBC permite determinar relaciones entre protones y carbonos a mayor distancia (2 o 3 enlaces) POLMEROS II Pgina 11

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Experimentos con otros ncleos: Si la molcula posee otros ncleos activos en RMN es posible su medida a travs de experimentos monodimensionales o bidimensionales (por deteccin indirecta)

Ejemplo de un espectro 1H de RMN

Ejemplo de un espectro COSY 2.5 Aplicaciones de la RMN en polmeros El rango de posibles aplicaciones de la resonancia magntica nuclear es demasiado amplio para incluir una lista completa, pero algunas aplicaciones incluyen: Verificacin del grado de pureza de materias primas. Anlisis de drogas y frmacos. Desarrollo de productos qumicos. Control de calidad de productos qumicos. Investigacin de reacciones qumicas. Identificacin de sustancias desconocidas. Anlisis de polmeros.

La informacin obtenida de estos experimentos, asociada con el uso de otras tcnicas espectroscpicas, hace posible la determinacin de complejas estructuras moleculares de POLMEROS II Pgina 12

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productos naturales, compuestos sintticos o semisintticos, de biomolculas de gran peso molecular como pptidos, protenas, oligosacridos o cidos nucleicos. El campo de aplicacin de la Resonancia Magntica Nuclear no slo se limita a la determinacin estructural sino que tambin se extiende a aspectos de determinacin conformacional, dinmica molecular y cintica de reacciones. Adems la posibilidad de realizar espectros de resonancia en estado slido, aunque ello implique unos requerimientos instrumentales importantes, extiende las aplicaciones de esta tcnica al estudio de materiales polimricos tanto de naturaleza orgnica como inorgnica. 3. Bibliografas https://portal.uah.es/portal/page/portal/cai_quimica/servicios/cermn http://es.wikipedia.org/wiki/Espectroscopia_de_resonancia_magn%C3%A9tica_nuclear http://www.inbio.ac.cr/es/inbio/inb_prosprmn.htm http://www.uned.es/dpto-fisicoquimica/docencia/videos/cromatogra.htm http://www.pslc.ws/spanish/sec.htm http://www.shodex.net/index.php?lang=3&applic=1483

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