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2012 Volumen 4, No.

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Revista Cientfica de la Universidad Autnoma de Coahuila

CONTROL DE INSECTOS-PLAGA EN LA AGRICULTURA UTILIZANDO HONGOS ENTOMOPATOGENOS: RETOS Y PERSPECTIVAS


Marily Gonzlez-Castillo, Cristbal No Aguilar y Ral Rodrguez-Herrera*
1 Departamento de Investigacin en Alimentos. Universidad Autnoma de Coahuila. Blvd. V. Carranza esquina Ing. Jos Crdenas V. s/n. Col. Repblica Ote. Saltillo 25280, Coahuila* rrh961@hotmail.com

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RESUMEN El manejo de insectos plaga generalmente se ha realizado por medio de agentes pesticidas que entre otras cosas son txicos y contaminan el ambiente. Por este motivo en el presente documento se aborda la importancia de implementar nuevas estrategias de control de plagas a travs del uso de microorganismos entomopatgenos, resaltando el empleo de hongos como grupo mayoritario y ms comnmente empleado para este fin. Introduccin En la actualidad la produccin de alimentos enfrenta el reto de mantener un alto nivel de calidad, considerando aspectos de inocuidad alimentaria y sistemas de produccin con retribucin ms justa para los productores (Garca y Gonzlez, 2010). En Mxico son frecuentes e importantes los daos que causan plagas tan conocidas como el gusano cogollero del maz, la mosca de la fruta, el picudo del algodonero y del manzano, las araas rojas, las mosquitas blancas, las chicharritas o los pulgones que atacan a las plantas cultivadas (Alatorre y col., 2000). Para controlar este tipo de insectos se ha tenido que recurrir al uso de plaguicidas qumicos sintticos tales como los clorados, organofosforados y piretroides, los cuales fueron exitosos en el control de plagas en sus inicios, minimizando las prdidas de las cosechas. Sin embargo, como consecuencia de su uso inadecuado e indiscriminado, pronto aparecieron problemas de resistencia de los insectos hacia estos productos, as como un rpido crecimiento de las poblaciones de plagas secundarias y alteraciones ecolgicas, causando efectos indeseables en el medio ambiente y en la salud del ser humano. Esto ha ocasionado la prohibicin o restriccin de muchos insecticidas como el dieldrn, mirex, BHC, paratin etlico, toxafeno y DDT (Morales y col., 2009). Con el fin de minimizar estas consecuencias desfavorables, se ha propuesto disminuir el uso de los plaguicidas convencionales y desarrollar nuevas estrategias para un Manejo Integrado de Plagas (MIP), principalmente por medio del control biolgico siendo este un mtodo de control de plagas ms racional y respetuoso con el medio ambiente y acordes con la filosofa de desarrollo sustentable (Badii y col, 2006). El MIP es una alternativa para disminuir la dependencia en el uso de insecticidas qumicos sintticos. Se basa en las prcticas culturales con orientacin al control de plagas, la capacidad que tienen las plantas para tolerar o resistir sus daos y la accin de los factores naturales de mortalidad de las mismas, como lo son los parasitoides, depredadores y patgenos de insectos-plagas. Estas tres ltimas son la alternativa de control ms usada para sustituir el uso inadecuado de los insecticidas (Alatorre y col., 2000).

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INSECTOS NSECTOS PLAGA QUE ATACAN LOS CULTIVOS EN MXICO

Existen ms de 100 especies de insectos atacando los cultivos en Mxico, a continuacin se describirn solo tres de los ms importantes.
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El gusano cogollero del maz, Spodoptera frugiperda (Lepidptera: Noctuidae), es una de las principales plagas que atacan a los cultivos del maz, puede ocasionar una reduccin en la produccin que va desde un 20 % hasta la prdida total del cultivo desde las primeras etapas de desarrollo de la planta e incluso cuanto ste se encuentra en pocas de floracin (Del Rincn y col., 2006). Este insecto hace raspaduras sobre las partes tiernas de las hojas, que posteriormente aparecen como pequeas reas traslcidas; una vez que la larva alcanza cierto desarrollo, empieza a comer follaje preferentemente en el cogollo y al des desplegarse, plegarse, las hojas muestran una hilera regular de perforaciones a travs de la lmina o bien reas alargadas comidas (figura 1) (Soto, 2008).

Figura 1.- Dao causado por Sodoptera frugiperda en cultivos de maz (Soto, 2008).

La mosca blanca, Bemisia tabaci o Trialeurodes vaporariorum es un insecto plaga, perteneciente al orden Homoptera. Los cultivos que se ven ms afectados por este insecto son: las plantas del tomate, chile, pepino, frijol y tabaco. Los daos que ocasionan comienzan cuando la mosca se instala en el envs de la hoja hospedante y tanto en estado adulto como larvario, comienzan a nutrirse de ella y deterioran el crecimiento de la misma. Debido a su facilidad para desplazarse de una planta a otra, e introducir su aparato bucal, llega a t transmitir ransmitir enfermedades vrales e incluso por su excremento, que forma una lmina pegajosa y produce el desarrollo de hongos (Alas Marroqun, 2000; Gonzlez, 2009).

El picudo del manzano, Amphidees latifrons, es un escarabajo de hbitos nocturnos, altamente destructivo. Las hembras ovipositan los huevecillos dentro de las yemas de los rboles, al eclosionar emergen larvas muy voraces que consumen todo el tejido celular, posteriormente hacen un agujero y caen al suelo enterrndose y comiendo races del mismo rbol hasta completar todo su ciclo larvario. Despus el insecto pasa al estado pupal, naciendo los adultos en la primavera, los cuales suben de regreso al rbol para comer las hojas haciendo mordeduras en forma de U hasta el otoo, en los meses de noviembre a febrero en la ausencia de hojas, atacan las yemas vegetativas y florales causando anillamientos y la muerte de la rama del rbol (Dvila, 2007). http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/divulgacionAQM.html

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CONTROL BIOLGICO

El estudio y aplicacin del control biolgico en Mxico tiene una larga historia. Diferentes autores han tratado de documentar en diversas pocas el desarrollo de las actividades del control biolgico como disciplina cientfica y estrategia fundamental en el manejo integrado de plagas (Rodrguez y Arredondo, 2007). Los insecticidas biolgicos se usan en Mxico desde hace 56 aos, pero su aplicacin se incremento significativamente desde 1990 (Morales y col., 2009). El Control Biolgico es parte muy importante del MIP, ya que adems de cuidar y reforzar la accin de los agentes que normalmente estn presentes en el ecosistema (Alatorre y col., 2000) se desarrolla la manipulacin deliberada de parasitoides, depredadores y patgenos de las especies plaga dentro del agrosistema, diseada o proyectada para reducir la poblacin plaga a un nivel que no produzca daos econmicamente importantes (Badii y col, 2006). A partir del uso de insectos entomfagos para el control de insectos plaga, el control biolgico se ha extendido al uso de una amplia gama de organismos para el control de insectos. Entre los organismos ms utilizados como agentes de control se incluyen virus, bacterias y sus toxinas, hongos y otros microorganismos patgenos. Estos organismos generalmente tienen como efecto la muerte directa de la especie de insecto que atacan o actan como antagonistas inhibiendo el desarrollo de otros microorganismos mediante sustancias que excretan (Rodrguez y Arredondo, 2007).
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MICROORGANISMOS UTILIZADOS EN EL CONTROL BIOLGICO DE INSECTOS PLAGA

Hasta el momento solo se conocen 3 especies de bacterias con posibilidad de ejercer control sobre insectos: Bacillus thuringiensis, Bacillus sphericus, y Bacillus popilliae. Sin embargo, estas especies presentan algunas subespecies y muchas razas que durante su proceso de esporulacin producen cristales protecos con efecto insecticida y/o algunas toxinas con el mismo efecto. Estas bacterias han sido encontradas colonizando insectos de los rdenes Dptera, Ortptera, Hymenptera y Coleptera. Destaca el empleo de Bacillus thuringiensis para el control de larvas de lepidpteros que atacan a plantas agrcolas y forestales.

Las familias de virus ms comunes en el control de plagas son: Baculoviridae, virus de la poliedrosis nuclear que ataca Lepidpteros e himenpteros; Reoviridae, virus de la poliedrosis citoplasmtica que ataca Lepidpteros y Dpteros; y Poxviridae virus entomopox que ataca Lepidpteros y Colepteros. De los virus entomopatgenos, los baculovirus son los ms utilizados con fines de control biolgico, debido a que tienen un rango de hospedantes limitado a algunas especies de Lepidpteros, Hymenpteros, Dpteros, Colepteros y Tricpteros. Se han encontrado hasta 450 especies de virus patgenos de insectos y caros (Badii y col, 2006).

Particularmente, los hongos han sido una de las mejores alternativas para el control de plagas en los ltimos aos. Ms de 750 especies de hongos se han documentado infectando insectos (National Academy of Sciences 1979). Entre los hongos ms utilizados como insecticidas biolgicos se incluye a Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin y Metarhizium anisopliae (Metchnikoff) Sorokin (Monzn, 2001; Rodrguez y Arredondo, 2007). Aproximadamente el 80% de las enfermedades que se producen en los insectos tienen como agente causal un hongo (Badii y col, 2006).

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Los hongos entomopatgenos poseen caractersticas muy especiales que les permiten sobrevivir en forma parastica sobre los insectos y en forma saprofita sobre material vegetal en descomposicin. El crecimiento saprofito puede dar como resultado la produccin de conidiforos, conidias y desarrollo miceliar, lo cual permite que el hongo pueda ser cultivado en el laboratorio utilizando tcnicas de produccin en masa de bajo costo (Alean Carreo, 2003). Prcticamente, todos los insectos son susceptibles a algunas de las enfermedades causadas por estos hongos (Cuadro 1). Se conocen aproximadamente 100 gneros y 700 especies de hongos entomopatgenos. Entre los gneros ms importantes se encuentran: Metarhizium, Beauveria, Aschersonia, Entomophthora, Zoophthora, Erynia, Eryniopsis, Akanthomyces, Fusarium, Hirsutella, Hymenostilbe, Paecelomyces y Verticillium (Monzn, 2001).
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Cuadro 1. Plagas de importancia econmica controladas mediante hongos entomopatgenos (Monzn, 2001). Cultivo Caf Plaga Broca Minador Repollo Pltano, algodn Arroz Ajonjol Caa de azcar, pastos Papa Granos bsicos Salivazo Gallina ciega Plutella Picudos Chinches Hongo entomopatgeno B. bassiana M. anisopliae B. bassiana B. bassiana B. bassiana M. anisopliae M. anisopliae M. anisopliae B. bassiana

HONGOS ENTOMOPATGENOS MS UTILIZADOS PARA EL CONTROL DE INSECTOS-PLAGA

Beauveria bassiana.

Este hongo ataca a ms de 200 especies de insectos de diferentes rdenes, incluyendo plagas de gran importancia agrcola, entre las que estn la broca del caf, la palomilla del repollo y el picudo del pltano (Monzn, 2001). El gnero Beauveria est compuesto por varias especies: B. bassiana, B. brongniartii B. tenella, B. amorpha y B. velata, sin embargo las ms frecuentemente estudiadas son B. bassiana y B. brongniartii (Alean Carreo, 2003).

La colonia de Beauveria en PDA a los 14 das es algodonosa a polvorienta, blanca y a medida que va pasando el tiempo se vuelve amarillenta y cremosa. El revs es de color rojizo al centro y amarillento alrededor (figura 2). Se caracteriza por presentar conidiforos sencillos, aproximadamente de 1-2 de dimetro (Caedo y Ames, 2004), http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/divulgacionAQM.html

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estn irregularmente agrupados o en grupos verticilados, en algunas especies hinchados en la base y adelgazndose hacia la porcin que sostiene la conidia, la cual se presenta en forma de zig-zag, despus de que varias conidias se producen; las conidias son hialinas, redondeadas a ovoides y unicelulares (Alean Carreo, 2003), midiendo aproximadamente de 2 a 3 X 2 a 2.5 (Caedo y Ames, 2004).
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Figura 2.- Morfologa macroscpica (A: Echeverra, 2006) y microscpica (B: Luque, 2011.) de Beauveria bassiana.

Metarhizium anisopliae Este hongo entomopatgeno ataca naturalmente ms de 300 especies de insectos de diversos rdenes. Algunas plagas que son afectadas por este hongo son la salivita de la caa de azcar (Aeneolamia varia), y chinches plagas de diversos cultivos. Los insectos muertos por este hongo son cubiertos completamente por micelio, el cual inicialmente es de color blanco pero se torna verde cuando el hongo esporula (Monzn, 2001).

Presenta una colonia pegada al medio, completamente redonda, de colores olivceo, amarillento, verdoso, marrn oscuro, dependiendo del aislamiento, con un revs incoloro a marrn, a veces verdoso citrino (figura 3). Los conidiforos nacen del micelio y son irregularmente ramificados con dos a tres ramas en cada septo, miden de 4 a 14 de longitud x 1.5 a 2.5 de dimetro. Las filides son cilndricas en forma de clava, adelgazados en el pice, miden de 6 a 13 de longitud y de 2 a 4 de dimetro. Las conidias son unicelulares, cilndricas y truncadas, formadas en cadenas muy largas, hialinas a verde olivceo, miden de 3.5 a 9 de longitud x 1.5 a 3.5 de dimetro (Caedo y Ames, 2004).

Figura 3.- Morfologa macroscpica y microscpica de Metarhizium anisopliae (Pik-Kheng y col., 2009).

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Nomuraea rileyi

Este hongo ataca ms de 32 especies de insectos de los rdenes Coleoptera, Lepidoptera y Orthoptera. Con mayor frecuencia se encuentra atacando lepidopteros, por ejemplo Spodoptera en maz. El cuerpo de los insectos muertos por este hongo presentan un micelio blanco, que puede tornarse verde con la esporulacin (Monzn, 2001).Posee conidiforos muy complejos que se ramifican a intervalos regulares que se levantan erectos y muy densamente agrupados para dar lugar a conidios verdes muy plido que con el tiempo cambian a tonalidades hasta verde malaquita (figura 4). Las hifas son lisas y hialinas. Los conidiforos son cortos y anchos, las filides son redondas, cilndricas a globosas con una base muy ancha (Elsegui, 2006).
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Figura 4.- Morfologa macroscpica (A: Aguirre N. 2006) y microscpica (B: Edelstein y Trumper, 2005) de Nomuraea rileyi.

Paecilomyces fumosoroseus

Se han reportado como mnimo cinco especies de Paecilomyces infectando ocho insectos diferentes. Las infecciones causadas por P. fumosoroseus se reconocen por el color rosado plido mientras que en P. lilacinus son de color violeta claro. La especie ms importante del gnero es Paecilomyces fumosoroseus (Alean Carreo, 2003). Sus colonias son inicialmente de color blanco en medio PDA, luego adquieren el tinte rosado caracterstico. El revs de la colonia es al comienzo ligeramente amarillento, pero a medida que pasa el tiempo se vuelve de color anaranjado intenso (Caedo y Ames, 2004).

Paecilomyces fumosoroseus (figura 5) presenta hifas hialinas a amarillosas, septadas, de paredes delgadas. La mayora presenta ramificaciones verticiladas o irregularmente ramificadas, llevan en su parte terminal en cada rama grupos de filides, las cuales pueden ser tambin solitarias, stas constan de una porcin basal cilndrica o hinchada, adelgazndose abruptamente a menudo para formar un cuello muy notorio, miden de 5 a 7 de largo x 2.5 a 3 de dimetro, que se reduce a 0.5 en el extremo superior. Los conidiforos alcanzan hasta 100 de largo x

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1.5 a 3 de dimetro. Las conidias son hialinas, unicelulares y de forma ovoide, miden de 3 a 5 x 1 a 2 y se observan agrupadas en cadenas largas (Carreo, 2003; Caedo y Ames, 2004).

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Figura 5.-Morfologa macroscpica (A) y microscpica (B) de Paecilomyces fumosoroseus (Carreo, 2003).

Verticillium lecanii.

Este hongo se encuentra frecuentemente atacando fidos y escamas en zonas tropicales y subtropicales. Adems ha sido encontrado sobre insectos del orden Coleoptera, Diptera, Hymenoptera y sobre caros. Los insectos infectados por este hongo tienen una apariencia blanquecina (Monzn, 2001). El hongo en medio PDA presenta un color blanco amarillento compacto y revs amarillo intenso (figura 6). Los conidiforos de las especies de Verticillium son poco diferenciados de las hifas vegetativas, las clulas conidigenas (filides) estn en forma de verticilios de dos a seis, en parejas o solitarias sobre hifas o apicalmente sobre cortas ramificaciones, miden de 11 a 30 de largo x l.5 a 2 de dimetro, son ligeramente anchos en la base y van adelgazando hacia la punta. Las conidias de Verticillium lecanii son pequeas, hialinas cilndricas o elipsoidales y redondeadas en sus extremos midiendo de 2 a 4 x 1 a 1.5. Son uniformes en cuanto a forma y tamao dependiendo del aislamiento. Estas conidias nacen en forma de gotas filamentosas o en cadenas (Carreo, 2003; Caedo y Ames, 2004).

Figura 6.- Morfologa macroscpica (A) y microscpica (B) de Verticillium lecanii (Carreo, 2003). http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/divulgacionAQM.html

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MECANISMO DE INFECCIN DE HONGOS ENTOMOPATGENOS

En forma general los hongos presentan las siguientes fases de desarrollo sobre los hospederos: germinacin, formacin de apresorios y estructuras de penetracin, colonizacin y reproduccin del patgeno. El inoculo o unidad infectiva est constituida por las as estructuras de reproduccin sexual y asexual, es decir las esporas y conidias (Monzn, 2001). El inicio de la infeccin se realiza por germinacin de las esporas del hongo sobre el tegumento del insecto plaga. La dispersin de las esporas se realiza por contaminacin ambiental a travs del viento, suelo, la lluvia e incluso insectos enfermos al entrar en contacto con otros sanos ( (Giraldo, 2009).
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Las caractersticas fsicas y qumicas de las superficies de la cutcula del insecto y la espora son las responsables de esta unin, algunas glicoprotenas pueden servir como un receptor especfico para las esporas (Tanada y Kaya 1993). Luego se produce un tubo germinativo y un apresorio, con ste se fija en la cutcula y con el tubo germinativo o haustorio (hifa) se da la penetracin al cuerpo del insecto (figura 7). Aqu participa un mecanismo fsico y uno qumico, el primero consiste en la presin ejerci ejercida da por la estructura de penetracin, la cual rompe las reas esclerosadas y membranosas de la cutcula. El mecanismo qumico consiste en la accin enzimtica, principalmente por proteasas, lipasas y quitinasas, las cuales causan descomposicin del tejido e en n la zona de penetracin, lo que facilita el proceso (Monzn, 2001). ). Despus de sta fase se inicia el proceso de colonizacin, en el cual la hifa sufre un engrosamiento y se ramifica en la cavidad general del cuerpo. A partir de ese momento se forman pequeas pequ colonias del hongo y otros cuerpos hifales (blastosporas), sin embargo no ocurre gran crecimiento hifal antes de la muerte del insecto (Giraldo, 2009).

Figura 7.-Estructura y composicin de la cutcula de insectos y forma de penetracin de hongos entomopatgenos entomopatgenos (Montesinos, 2008). http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/divulgacionAQM.html

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Otra forma mediante la cual el hongo puede causar la muerte del insecto, es mediante la produccin de toxinas. Los hongos entomopatgenos tienen la capacidad de sintetizar toxinas que son utilizadas en el ciclo de la relacin patgeno- hospedante. Entre estas toxinas destacan las dextruxinas (demetildextruxina y protodextruxina) ya que su modo de accin tambin inhibe la sntesis de ADN, ARN y protenas en las clulas de los insectos (Pucheta y col., 2006); adems son sustancias de baja toxicidad, pero de mucha actividad txica sobre insectos, caros y nematodos (Monzn, 2001; Giraldo, 2009).
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La muerte del insecto se produce con mayor rapidez cuando es afectado por un hongo que produce cantidades considerables de toxinas, ya que se adiciona la toxemia a la destruccin de los tejidos y a las deficiencias nutricionales. Los individuos enfermos no se alimentan, presentan debilidad, desorientacin y cambian de color, presentando manchas oscuras sobre el tegumento, que corresponden con las esporas germinadas del hongo (Alean Carreo, 2003; Caedo y Ames, 2004; Giraldo J. 2009). Con la muerte del insecto termina el desarrollo parastico del hongo y empieza la fase saproftica: el hongo crece en el hemocele formando masas miceliares que salen al exterior fundamentalmente por las regiones intersegmentales, esporulando sobre el cadver y produciendo inculo para infectar a otros insectos y por las aberturas naturales: espirculos, boca y ano (Caedo y Ames, 2004).

Normalmente, los hongos entomopatgenos son de accin lenta. Pero estos productos dependen generalmente de las condiciones ambientales de temperatura y de elevada humedad relativa para que su desarrollo y accin patgena sea la adecuada. Generalmente tardan una semana como mnimo en eliminar a la vctima o al menos en que esta deje de alimentarse. Son adecuados para su aplicacin por introduccin, manipulacin ambiental o aumento inoculativo (Giraldo, 2009).

RETOS DEL USO DE MICROORGANISMOS PARA EL CONTROL BIOLGICO

El desarrollo de productos basados en microorganismos para su uso como bioinsecticidas implica numerosas pruebas de laboratorio y de campo, para confirmar su presencia natural del microorganismos en el medio ambiente, su virulencia, factores medioambientales y su correcta identificacin (Arredondo, 2007). Dentro de los agentes entomopatgenos se incluyen principalmente hongos, bacterias y virus, por su disponibilidad en el mercado, adems de nematodos y protozoos en menor proporcin (Dufour, 2001). Estos microorganismos por lo general, se caracterizan por su escasa toxicidad sobre otros organismos del ambiente, su aptitud para ser tratados de forma industrial, es decir, que se cultivan, formulan, empaquetan, almacenan y se comercializan como un insecticida convencional. Estos insecticidas biolgicos penetran en el insecto plaga por ingestin y por contacto en el caso de los hongos (Badii y col, 2006; Giraldo, 2009). Los hongos entomopatgenos tienen un gran potencial para ser empleados como biocontroladores (Caedo y Ames, 2004). Por ejemplo, los gneros Beauveria sp, Metarhizium sp y Paecilomyces sp tienen un amplio uso y aceptacin por su especificidad y efectividad como insecticidas biolgicos (Caedo y Ames, 2004; Morales y col., 2009; Garca y Gonzlez, 2010). Se suelen comercializar en preparados a base de esporas (Giraldo, 2009).

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Los hongos entomopatgenos presentan grados variables de especificidad, pueden ser especficos a nivel de familia o especies muy relacionadas. En el caso de las cepas, pueden ser especficas a nivel de especie, sin afectar a los enemigos naturales (Alean Carreo, 2003; Caedo y Ames, 2004). Si el entomopatgeno encuentra las condiciones adecuadas para introducirse y colonizar un ecosistema, se reproduce y renueva en forma continua, es decir, se vuelve persistente, haciendo innecesarias nuevas aplicaciones. Se pueden aplicar mezclas de hongos entomopatgenos con dosis subletales de insecticidas para lograr efectos sinrgicos superiores a los logrados con aplicaciones de cada producto por separado. Cuando el hongo no llega a causar la muerte directamente, se presentan efectos secundarios que alteran el desarrollo normal del ciclo de vida del insecto plaga (Caedo y Ames, 2004).
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PERSPECTIVAS DEL USO DE HONGOS ENTOMOPATOGENOS PARA EL CONTROL DE INSECTOS-PLAGA

El aislamiento consiste en la obtencin del hongo a partir de la fuente de inoculo, la cual puede ser insectos, plantas, suelos o medios artificiales como PDA o de preservacin en seco como la slica gel. A partir del aislamiento del hongo se procede a la inoculacin de un medio de cultivo, para la obtencin de un cultivo puro. Por tal razn se debe tener la seguridad de que el hongo aislado corresponde al de inters, adems ste debe estar libre de contaminantes. El aislamiento de hongos entomopatgenos puede hacerse de dos maneras: por dilucin seriada y de forma directa.

El aislamiento por dilucin seriada consiste en colocar un insecto infectado por hongos y esporulado en un recipiente que contiene 10 ml de agua destilada estril con 0,1% de Tween 80. Como resultado se obtiene una suspensin concentrada del inoculo. A partir de esta solucin, se preparan diluciones en serie (10-1, 10-2, 10-3, 10- 4, 10-5, 10-6). Para realizar la siembra y obtener los cultivos del hongo se deben usar las ltimas diluciones (10-4, 10- 5, 10-6). El aislamiento directo consiste en la obtencin del hongo a partir del cuerpo del insecto, pasndolo luego a un medio nutritivo. Debido a que las muestras que se toman del insecto pueden estar sucias y contaminar el aislamiento se recomienda hacer una desinfeccin externa del insecto con hipoclorito de sodio (3-5 %), enjuagndose con agua destilada estril. Este tipo de aislamiento puede ser de dos formas: raspando partculas del hongo en un insecto desinfectado, utilizando un asa bacteriolgica y pasndola en un medio nutritivo o bien con una pinza seca y estril se toma el insecto esporulado desinfectado y se agita con movimiento verticales y horizontales, sobre la superficie del medio de cultivo (Monzn, 2001).

El aislamiento de hongos de suelos cultivados generalmente se realiza haciendo un muestreo del rea de cultivo seleccionada, se toma alrededor de 0,5 Kg de suelo de los primeros 10-20 cm de profundidad y con una distancia de 5 m entre cada una de ellas. Las submuestras se mezclan y se toma una muestra final de 0.5 Kg. El suelo se debe colocar en bolsas de plstico, mantenindose a la sombra durante el traslado al laboratorio. En las muestras de suelo se colocan insectos trampa preferentemente aquellos que son altamente susceptibles a especies de hongos y nematodos entomopatgenos. Las larvas del insecto trampa se recuperan del suelo y se desinfectan superficialmente en hipoclorito de sodio al 1 %, se enjuagan en agua destilada estril; se remueve el exceso de y se colocan en cajas de Petri con una capa doble de papel filtro, con el fin de producir una humedad relativa elevada y http://www.postgradoeinvestigacion.uadec.mx/divulgacionAQM.html

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para favorecer el desarrollo de los hongos y se incuban. Los hongos que se desarrollan sobre la superficie de las larvas se aslan y se procede a su identificacin (Gaitn, 2003; Quesada y col., 2007).

Tradicionalmente, la identificacin de hongos se basa en mtodos fenotpicos como son: la morfologa de las esporas (conidios) e hifas, o bioqumicos, como el perfil de protenas extracelulares, los cuales son influenciados grandemente por la interpretacin y dependen de un alto grado de especializacin del analista y del ambiente. Las caractersticas morfolgicas que se utilizan para la identificacin de hongos son el tipo de crecimiento, forma y tamao de la espora y tipo de estructuras reproductivas, lo cual muchas de las veces resulta insuficiente para la identificacin certera a nivel de especie (Carrillo, 2003). La caracterizacin molecular, consiste especficamente en diferenciar individuos de inters segn sus variaciones o polimorfismos en el ADN. Estos polimorfismos pueden darse debido a dos tipos de cambios principalmente: cambios en las bases nitrogenadas por adicin, transicin, traslocacin o delecin, y reorganizaciones en la secuencia del ADN (Luna y col., 2001). Con el desarrollo de tcnicas ms especficas basadas en las diferencias en la informacin o configuracin gentica, ha sido posible aminorar estos errores, y brindar informacin ms exacta y reproducible (Echeverra, 2006). El principal argumento a favor del uso de caracteres moleculares es que son universales. Existen genes presentes en todos los genomas celulares como los ribosomales, que pueden proveer de informacin para reconstrucciones filogenticas, donde los caracteres morfolgicos son inaplicables (Ochoa, 2008).
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Las regiones que codifican para el RNA ribosmico (rDNA) (Iturralde, 2005) se pueden encontrar en mitocondrias, cloroplasto y ncleo, y contiene la informacin para el RNA que conforma los ribosomas, por lo que es informacin que se transcribe pero no se traduce (Rentara 2007). La principal razn para el estudio de rDNA es que es un gen multicopia que contiene regiones que no codifican para protenas, y que estas copias estn repetidas en tndem, facilitando as su amplificacin (Calle, 2005). En el DNA ribosmico existen fragmentos con distinto grado de conservacin de una longitud cercana a 6Kb, lo que permite realizar estudios evolutivos a nivel de gneros y familias y suelen usarse para el diseo de iniciadores universales. La regin del rDNA en eucariotes incluye el gen 18S (tambin denominado small sub unit, SSU), el espaciador intergnico ITS1, el gen 5.8S, el espaciador ITS2 y el gen 28S (tambin denominado large sub unit, LSU). Las regiones 18S, 5.8S, 28S estn relativamente conservadas entre los hongos, facilitando una base molecular para buscar relaciones filogenticas a diferentes niveles. El tamao pequeo del gen 5.8S limita su utilidad en comparaciones filogenticas (Ochoa, 2008).

La amplificacin por PCR y la posterior secuenciacin del gen 18S rDNA para la caracterizacin de hongos presenta una serie de ventajas como son: est presente en todos los organismos y tiene la misma funcin en todos ellos; debido a restricciones estructurales, diferentes regiones de la molcula presentan distinto grado de variabilidad en secuencia, lo que permite realizar comparaciones con diferente nivel de resolucin; su transmisin es principalmente vertical ya que se considera que no est sujeto a transferencia gnica horizontal entre microorganismos; la longitud de su secuencia tiene un tamao adecuado como para proporcionar suficiente informacin, con un coste asumible, y el anlisis de la secuencia permite realizar reconstrucciones filogenticas de los microorganismos (Nogales, 2005).

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Por otra parte, los hongos presentan sensibilidad a la variacin de las condiciones climticas como temperaturas extremas, desecacin y luz ultravioleta (Alean Carreo, 2003; Caedo y Ames, 2004). Estas limitantes pueden ser contrarrestadas mediante el uso de aditivos (protectores solares, aceites y anti-desecantes). Por lo tanto, requieren de condiciones de almacenamiento ms exigentes que las molculas inorgnicas, para evitar que pierdan su patogenicidad. En general, los insecticidas biolgicos no matan instantneamente pero alcanzan buenos niveles de control entre una y tres semanas despus de la aplicacin, dependiendo de la plaga y del ambiente. Aunado a esto, el insecto deja de ser plaga al ser parasitado por el hongo, ya que deja de alimentarse mucho antes de morir, disminuyendo el dao al cultivo (Caedo y Ames, 2004).
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