Anda di halaman 1dari 8

LAPORAN PERCOBAAN II PEMISAHAN PROTEIN PUTIH TELUR DENGAN FRAKSINASI (NH4)2SO4

Nama NIM Tanggal Praktikum

: : :

Ahlul Hafizan Resha 10511030 24 September 2013 1 Oktober 2013 : Ainun

Tanggal Pengumpulan: Asisten

LABORATORIUM BIOKIMIA PROGRAM STUDI KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT TEKNOLOGI BANDUNG 2013

PEMISAHAN PROTEIN PUTIH TELUR DENGAN FRAKSINASI (NH4)2SO4


I. TUJUAN Menentukan berat molekul dari protein yang terdapat pada sampel dan pengaruhnya terhadap mobilitas dari masing-masing fraksi dalam amonium sulfat. TEORI DASAR Protein tersusun dari monomer yang disebut asam amino. Karakteristik asam amino membantu dalam menggambarkan karakteristik dari protein. Asam amino mempunyai dua gugus pada tiap molekulnya, yaitu gugu samino dan gugus karboksil, yang digambarkan sebagai struktur ion dipolar. Gugus amino dan gugus karboksil pada asam amino menunjukkan sifat-sifat spesifik. Sebagai contoh adalah reaksi asetilasi dan esterifikasi. Asam amino juga bersifat amfoter, yaitu dapat bersifat sebagai asam dan memberikan proton kepada basa kuat, atau dapat bersifat sebagai basa dan menerima proton dari basa kuat. Semua asam amino yang ditemukan pada protein mempunyai ciri yang sama, gugus karboksil dan amino diikat pada atom karbon yang sama. Masing-masing berbeda satu dengan yang lain pada gugus R-nya, yang bervariasi dalam struktur, ukuran, muatan listrik, dan kelarutan dalam air. Beberapa asam amino mempunyai reaksi yang spesifik yang melibatkan gugus R-nya (Lehninger 1982). Protein dapat juga dipisahkan satu dari yang lain oleh elektroforesis berdasarkan tanda dan jumlah muatan listrik pada gugus R dan gugus termal asam amino dan terminal karboksil yang bermuatan. Seperti peptida sederhana, rantai polipeptida protein mempunyai titik isoelektrik yang khas, yang akan mencerminkan jumlah relatif gugus R asam dan basa (Lehninger, 1982). Kecepatan migrasi protein dalam medan listrik tergantung pada kekuatan medan listrik, muatan protein, dan koefisian pergesekan (Stryer, 2000). Pemisahan protein dapat dilakukan dengan fraksinasi menggunakan amonium sulfat dengan metode SDS-Page. Jika dialurkan, kurva dari percobaan menggunakan SDS-Page dengan variabel mobilitas dan logaritma berat atau massa molekul dapat digambarkan sebagai berikut ;

II.

III.

DATA PENGAMATAN

Hasil fraksinasi pada gel dengan metoda SDS-Page, daerah dalam kotak hijau adalah 3 fraksi hasil

percobaan

IV.

PENGOLAHAN DATA Contoh Marker Standar

Pencocokan range marker dengan fraksi pada gel : 4 garis oranye memisahkan 3 fraksi supernatan Garis hitam menunjukkan fraksinasi protein pada gel

1 2 3 4

A. Penentuan jarak tempuh

Dari literatur rata-rata ukuran gel adalah 13.3 8.7 0.1 cm. Dengan menggunakan prinsip kesebandingan didapatkan jarak migrasi masing-masing fraksi protein ; No jarak tempuh (cm) jarak tempuh(cm) jarak tempuh(cm) (fraksi 0-20%) (fraksi 20-50%) (fraksi 50-70%) 1 1,8 1,8 2 2,3 2.3 3 2,9 2,9 4 3,6 B. Penentuan kurva kalibrasi marker MARKER logkDa jarak tempuh(cm) 1.158362 8 1.264818 7 1.39794 6 1.544068 5 1.653213 4 1.820858 3 2.064458 2

kDa 14.4 18.4 25 35 45 66.2 116

KURVA KALIBRASI MARKER


2.50 2.00

log kDa

1.50 y = -0.1459x + 2.2873

1.00

0.50

0.00 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

Jarak migrasi (cm)

C. Berat setiap fraksi (kDa) Dengan mensubstitusikan jarak migrasi sampel ke dalam persamaan [ y = 0,1459x + 2,2873 ] , didapatkan log kDa dan kDa masing-masing fraksi protein pada gel ;
Fraksi 0-20 % Jarak (cm) Log kDa 1,8 2,02 2,3 1,95 2,9 1,86 3,6 1,76 Fraksi 20-50 % kDa Jarak (cm) Log kDa 105,85 1,8 2,02 89,48 2,3 1,95 73,15 2,9 1,86 57,82 - Fraksi 50-70% kDa Jarak (cm) Log kDa 105,85 89,48 73,15 -

kDa -

V.

PEMBAHASAN Pada percobaan ini dilakukan fraksinasi dari rotein yang ada pada telur berdasarkan berat molekulnya. Metode yang digunakan adalah fraksinasi berdasarkan kelarutan dilanjutkan dengan metode SDS-Page. Penambahan amonium sufat ke dalam putih telur awalnya mengurangi kekentalan dari telur, kemudian ketika ditambahkan lagi dengan jumlah tertentu, terjadi koagulasi berupa endapan berwarna putih. Hal ini menunjukkan bahwa ketika amonium sulfat ditambahkan dalam jumlah yang relatif sedikit, terjadi salting out, kelarutan dari pelarut yang ada pada putih telur meningkat sehingga kekentalannya berkurang, menunjukkan interakasi antara zat terlarut (protein) dan pelarut cukup homogen. Kemudian ketika amonium sulfat ditambahkan semakin banyak terjadi penggumpalan, ini menunjukkan terjadinya proses salting out di mana kelarutan protein berkurang karena terjadinya kompetisi antara protein dengan ion amonium dalam proses pelarutan oleh air, sehingga air yang melarutkan atau mengililingi protein terhalang oleh amonium.

Kemudian dilakukan proses sentrifugasi, tahap ini bertujuan untuk memisahkan endapan protein yang cenderung mempunyai rapat massa yang lebih besar dibandingkan pelarut murni sehingga endapan protein terkumpul di bawah tabung reaksi. Proses sentrifugasi ini didasari oleh prinsip gaya gravitasi yang dipengaruhi oleh massa suatu materi. Penambahan buffer pH 5 adalah agar melindungi protein dari proses denaturasi yang bisa merusak struktur tersier protein dengan memutuskan interaksi-interaksi yang ada. Analisis setiap fraksi amonium sulfat dengan metode SDS-Page bertujuan untuk mentukan berat molekul dari protein penyusun dari sampel. Menurut Kenkel (1994:355-356), fraksinasi dengan menggunakan metode pemisahan berdasarkan filtrasi oleh gel akan menghasilkan fraksi-fraksi dikarenakan adanya perbedaan ukuran dan berat molekul. Molekul protein dengan berat dan ukuran molekul paling besar akan berada pada fraksi awal sedangkan molekul dengan ukuran dan berat terkecil akan berada pada fraksi terakhir. Pada percobaan ini terbukti bahwa protein dengan berat molekul yang paling besar terdapat pada fraksi 0-20% amonium sulfat jenuh. Namun masih terdapat sebagian molekul yang berat pada fraksi 20-50% amonium sulfat jenuh. Hal ini bisa disebabkan proses pengendapan oleh amonium sulfat tidak mengendapkan protein secara bertahap sesuai berat molekul. Namun faktor ukuran molekul dan kereaktifan juga dapat menyebabkan adanya molekul yang lebih kecil terdapat pada fraksi awal. Fraksi-fraksi pada metode SDS-Page terpisah dengan baik terlihat dari jarak antar pita yang tidak terlalu dekat. Prinsip dasar dari SDS-Page adalah elektroforesis. Elektroforesis merupakan suatu proses bergeraknya molekul yang bermuatan didalam suatu medan listrik dimana molekul yang bergerak ini tergantung pada muatan yang dimiliki, bentuk dan ukurannya. Sehingga dengan elektroforesis ini dapat digunakan untuk separasi makromolekul seperti asam nukleat dan protein. SDS-PAGE banyak digunakan saat ini untuk memisahkan suatu protein berdasarkan berat molekul dan muatan yang dimilikinya karena pelaksanaannya mudah dan relatif tidak mahal. Gel pada SDS-Page terdiri dari dua jenis yaitu Stcaking Gel dan Spearating Gel. Stacking gel digunakan hanya untuk membentuk sumur (well) tempat sampel diinjeksikan. Separating gel ini berfungsi untuk memisahkan atau menseparasi protein berdasarkan berat molekulnya, bahan yang digunakan dalam praktikum yaitu akrilamid sebagai bahan untuk membentuk pori-pori dalam gel agar protein dapat terpisah berdasarkan ukurannya, tris pH 8.8 untuk menstabilkan. pH buffer agar muatan dari protein tidak berubah , SDS digunakan untuk memutuskan ikatan disulfida dari protein agar menjadi unfolding dan menyelubungi protein dengan muatan negatif. Keasaman juga mempengaruhi struktur protein dalam larutan. Protein merupakan zwitter ion sehingga jika tidak dalam kondisi atau pH optimal, maka pengukuran yang dihasilkan tidak akurat begitu juga ketika protein berada pada titik isoelektriknya yang muatannya secara keseluruhan adalah netral. Data dari SDS-PAGE dapat diolah dengan membuat persamaan regresi linier dari pita marker sebagai standar. Setelah mendapatkan persamaan regresi linier dari marker, karenatidak dilakukan standarisasi jarak migrasi atau jarak tempuh marker maka digunakan jarak tempuh yang berada pada referensi. Persamaan regresi linier dari marker referensi : y = -0.1459x + 2.2873. Y menunjukkan panjang jarak dari bagian atas gel sampai pita protein yang akan diukur. Sedangkan x menunjukkan berat molekul. Dari persamaan di atas terlihat bahwa semakin berat suatu molekul maka jarak yang ditempuh akan semakin pendek. Hal ini juga terbukti dari data yang diperoleh pada percobaan. Ukuran pori poliakril amid bersifat selektif terhadap ukuran molekul yang melewatinya, jika ukuran ukuran suatu molekul protein lebih besar dari pada ukuran pori,

maka protein tidak akan bisa melewati pori tersebut secara spontan. Sehingga molekulmolekul protein bisa dipisahkan. Dari data, persentase fraksinasi amonium sulfat yang besar cenderung mengandung jumlah protein yang lebih sedikit. Ini artinya pemisahan pada persentase sebelumnya yang lebih kecil berlangsung optimal. Dari data hasil perhitungan di atas dan data dari marker literatur, terbukti bahwa protein yang terdapat pada telur adalah albumin yaitu direntang 57-105 kDa. VI. KESIMPULAN Protein yang dengan berat atau ukuran molekul yang lebih besar mempunyai jarak migrasi atau jarak tempuh yang lebih kecil. Protein yang terdapat pada telur adalah albumin. Fraksi 20-50 % kDa Jarak (cm) Log kDa 105,85 1,8 2,02 89,48 2,3 1,95 73,15 2,9 1,86 57,82 - Fraksi 50-70% Jarak (cm) Log kDa -

Fraksi 0-20 % Jarak (cm) Log kDa 1,8 2,02 2,3 1,95 2,9 1,86 3,6 1,76 VII. DAFTAR PUSTAKA

kDa 105,85 89,48 73,15 -

kDa -

Lehninger. 1982. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta:Erlangga


Harper, et al. 1980. Biokimia (Review Of Physilogical Chemistry). Edisi 17. Jakarta: EGC Ophart C.E. 2003 .Virtual Chembook . Jakarta: Elmhurst College Poejiandi, Anna.2006. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta : Universitas Indonesia

http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/Bulletin_6007B.pdf (dilihat pada 30 September 2013)

LAMPIRAN Diagram alat SDS-Page

Perubahan distribusi muatan pada struktur protein setelah elektroforesis SDS-Page