2.3.2.4 Embriognesis somtica.

Consiste en el desarrollo de embriones a partir de clulas que no son el producto de una fusin de gametos durante la fecundacin o tambin formacin de un embrin a partir de una sola clula o de un pequeo grupo de clulas somticas. Caractersticas morfolgicas y anatmicas _ Origen unicelular _ 2n. _ Estructura bipolar. _ Conexin tallo-raz slida (procambium). _ pice radicular cerrado. _ Primeras hojas semejan cotiledones. Factores que afectan la embriognesis Somtica _ Ex planto _ Medio de cultivo _ Reguladores de crecimiento _ Condiciones del ambiente _ Otros factores Origen del ex planto embriognico. Depende de la especie y parte de la planta Daucus carota: embriones, hipoctilos, races jvenes, Puntas de races, pecolos, protoplastos. Solanceas: muy ocasionalmente forman embriones Somticos en cultivo. Sps. leosas: embriones inmaduros, embriones maduros, Platines muy jvenes. Gramneas: zonas con clulas en activa divisin celular. Embriones inmaduros: Material vegetativo joven e inflorescencias inmaduras Cebada, sorgo.

ETAPAS 1. Etapa de induccin o de proliferacin. 2. Etapa de desarrollo. 3. Maduracin y germinacin.

1. Induccin o proliferacin Adquisicin de competencia Auxina (2,4 D) De diferenciacin de clulas Embriolgicamente competentes: Masas pro embriognicas (PEMs) Caractersticas citolgicas de las PEMs. Clulas pequeas redondeadas Compactas, citoplasma rico Se dividen asimtricamente Clulas hijas fuertemente adheridas

2. Etapa de desarrollo. o Ausencia o bajos niveles de auxina o Baja densidad celular

3. Maduracin y germinacin.

Fro (vid 4C, estado globular). AG3 (Citrus, germinacin). ABA (rangos y tiempos variables). Sacarosa (3-6%).

Ventajas de la embriognesis somtica. Posibilidad de manipular grandes cantidades de embriones en medio lquido (100.000 en 1 litro en conferas) Semillas artificiales Automatizacin de la produccin (Birreactores) Abaratamiento de los costos Mejor calidad de la planta obtenida (sistema radicular)

2.3.3 tcnicas de mejoramiento gentico.

2.3.3.1 variaciones somaclonal. Es la variacin gentica que surge como consecuencia del cultivo in vitro y, ms concretamente, de los procesos de regeneracin por va indirecta, es decir, los que implican una fase de callo ms o menos larga.

Causas de la variacin somaclonal. Variacin somaclonal debida al ex plante. -Variacin preexistente en el ex plante de partida (mixoploida)-Quimieras naturales: plantas que contienen sectores que proceden de capas meristemticas con distinta constitucin gnica. -Existencia de mutaciones somticas en los ex plantes de partida

Variacin monoclonal a lo largo del cultivo. Debida al estrs que representa el cultivo in vitro cambios en el metabolismo (produccin de sustancias muta gnicas) aceleracin de los procesos de replicacin anormal duplicacin de los bloques de heterocromatina alteracin de los planos de divisin celular cambios gnicos: mutaciones puntuales, cambios estructurales y numricos) cambios en el genoma del cloroplasto y de la mitocondria cambios epigenticosclonal a lo largo del cultivo.

Aplicacin de VS en Mejora. Ventajas Rapidez Econmica Altas tasas de mutacin Menor nmero de cambios no deseados xito para eliminar uno o pocos caracteres en cultivares bien adaptados til con especies de propagacin sexual y asexual

2.3.3.2 induccin de plantas haploides.

Haploide Individuo que posee la mitad del nmero cromosmico normal contenido en las clulas somticas de la especie. Identificacin de haploides Morfologa: suelen ser plantas ms pequeas. Poliembrionia: La presencia de poliembrionia facilita la deteccin de embriones haploides. Genes marcadores: Cualquier par de alelos cuyos fenotipos dominante y recesivo sean fcilmente distinguibles y posean manifestaciones fenotpicas claras en semilla o en plntula y as hacer una seleccin ms econmica en tiempo y esfuerzo.

Ventajas del uso de haploides en Mejora

2.3.3.3.3 Aislamiento y fusin de protoplastos.

Protoplasto: Clula vegetal desprovista de pared celular, por proceso mecnico o enzimtico. Membrana plasmtica completamente expuesta. Estado transitorio, permite manipulacin de esas clulas. Mantiene potencialidades de clulas vegetales completas.

1) Factores que afectan la produccin y viabilidad de los protoplastos. Fuente de material Tratamientos pre-enzimticos Tratamientos enzimticos
Os molaridad.

2) Purificacin.

3) Viabilidad Toma de oxgeno. Actividad fotosinttica. Tinciones. 4) Cultivo Medio de cultivo: MS, B5 (lquido o slido) Os molaridad densidad de plaqueo Condiciones de almacenamiento material vegetal. 5) Regeneracin Organognesis/Embriognesis somtica .Eficiencia generalmente baja.

2.3.3.4 Micro injertos.

El microinjerto fue desarrollado a inicio de los 80s y consiste en colocar en condiciones aspticas una pa miniatura sobre un pie in vitro o in vivo establecido. El resultado del microinjerto puede ser luego micro propagado y a climatizado. El xito depende de la unin funcional de los dos componentes a fin de que el prendimiento sea efectivo.

Partes del injerto

Sistema radical, al cual se le conoce como patrn, pie o portainjerto. A la parte superior de la nueva planta se le llama: pa, injerto o espiga.

Eventos de los injertos compatibles. 1. Adhesin entre el injerto y el patrn. 2. Proliferacin de clulas del callo. 4. Re diferenciacin.

Tcnicas de la enjertacin.

De cua o hendidura simple

De yema Injerto en T

En condiciones in vitro es comn utilizar como injertos: pices, meristemos, embriones cigticos y somticos.

Proliferacin de clulas de callo.

Despus de la unin se forma un callo parenquimatoso en la zona de corte, como respuesta de cicatrizacin y reaccin al dao sufrido.

Re diferenciacin

-Algunas de las clulas del callo se diferencian en cambium para producir tejido
vascular, uniendo ambas partes (plantas crecimiento secundario).

-En plantas crecimiento primario, xilema y floema se forman directamente del

callo. La efectividad depende de: a) Formacin de conductos vasculares entre las partes.

b) Depsito de polisacridos en el tejido de unin.

Tipos de establecimiento de injertos

Autoplstico: cuando el injerto es entre la misma planta o auto injerto.

entre plantas de diferentes especies

2.3.4 transferencia de vitro plantas a viveros.

La incubacin de los cultivos se debe llevar a cabo en condiciones controladas. Por lo menos en lo que se refiere a temperatura, calidad e intensidad de luz, fotoperiodo, humedad atmosfrica e higiene. Estas condiciones se logran con el empleo de cmaras climatizadas o cuartos especialmente preparados con aire acondicionado (fro-calor) y una buena y uniforme circulacin de aire en el interior y dotados de un buen sistema de alarma para cortar la iluminacin en caso de no funcionar el aire acondicionado. En general, los cultivos son incubados a temperatura constante de 25-28 C, con ciclo de luz/oscuridad de 16/8horas. La luz es generalmente provista por lmparas fluorescentes del tipo luz da con una irradiacin de entre 50 y 200mol m-2s-1. La humedad atmosfrica debe ser elevada (80- 90%).

Unidad tres nociones de transformacin gentica de plantas.

3.1TENDENCIA ACTUALES DE LA TRANSFORMACIN GENTICA DE

PLANTAS

Transferencia de genes exgenos al interior del genoma vegetal, los cuales previamente han sido modificados in vitro para permitir su expresin mediante un Cassette de expresin donde se ubican genes reporteros, esta construccin es llevada al vector que se emplea como vehculo para transferir las secuencias genmicas al vegetal La tecnologa del DNA Recombinante ofrece la posibilidad de evitar los problemas asociados con el mejoramiento clsico, permitiendo a los genetistas identificar y clonar genes especficos para las caractersticas deseables e introducir estos rasgos en las plantas. Proceso de alteracin del genotipo de una clula mediante la introduccin de uno o ms genes por va no sexual

Transformacin Gentica: Transferencia mediada por Agrobacterium t. Transferencia directa: microinyeccion, electrophoracion, biobalistica Procedimiento Corte del gen Colocarlo dentro del vector Insertar el vector en el genoma objetivo Evaluacin de la expresin en el organismo modificado Localizacin del gen CARACTERISTICAS Se transfiere directamente o indirectamente ADN Los transgenes pueden provenir de diferentes gneros, familias o reinos El pool gentico a utilizar es ilimitado Adems del gen de inters se transfieren genes marcadores de seleccin y genes marcadores de deteccin La transformacin se refiere a un cambio gentico estable producido al incorporar ADN desnudo (ADN sin clulas o protenas asociadas) al genoma, y la competencia refiere al estado de ser capaz de incorporar ADN exgeno del ambiente. Dos formas distintas de competencia deben ser distinguidas: natural y artificial. Las clulas capaces de crecer en un medio de cultivo con este antibitico, sern las que han sido transformadas por el plsmido, y las clulas que no puedan crecer carecern de ste. Otro marcador, usado para identificar bacterias E. coli que han adquirido plsmidos recombinantes, es el gen las, que codifica para -galactosidasa. Debido a que la galactosidasa es un homotetrmero, en que cada monmero esta hecho de una protena lacZ- y lacZ-, si solo una de estas protenas se expresa en la clula resultante, no se formar la enzima funcional. De esta manera, si una cepa de E. coli que ni tenga el

gen lacZ- en su genoma, es transformado usando un plasmidio que contiene el gen faltante, las clulas producirn -galactosidasa, mientras que las no-transformadas no lo harn. En ste tipo de transformacin, la regin que contiene el sitio mltiple de clonamiento, o sitio polylinker, reside en el fragmento del gen lacZ-, lo que significa que los plasmidios recombinantes tendrn el gen deseado insertado en alguna parte dentro de lacZ-. Cuando este fragmento gentico interrumpido sea expresado por la E. coli, no se producir una protena lacZ- utilizable, por lo que no se formar -galactosidasa utilizable. Cuando es crecida en un medio que contiene la galactosa modificada X-gal, las colonias que son capaces de metabolizar el sustrato (y por lo tanto, han sido transformadas, pero no por plasmodios recombinantes) aparecern en color azul; las colonias que no puedan metabolizar el sustrato (y por ende no han sido transformadas por plsmidios recombinantes) aparecern de color blanco.

3.2 METODOS DE TRASFORMACIN GENETICA Perlitas microscpicas de oro o tungsteno se recubren del ADN de inters, y se disparan a gran velocidad con una pistola especial. Las clulas en la lnea directa del proyectil pueden morir, pero a su alrededor muchas clulas captan el ADN sin daos. Incluso se pueden transformar cloroplastos con este sistema. Sirve para plantas que son ms difciles de cultivarse sus tejidos (cereales, leguminosas), aunque tiene el inconveniente de que el ADN puede insertarse en copias, y puede ser inestable. El ADN se mezcla con protoplastos, y se aplican corrientes elevadas, lo que provoca la entrada.

3.2.1MTODOS DIRECTOS BIOVALISTICAS, ELECTROPORACION, MICROINYECCION, LASER, FIBRAS DE CARBURO DE SILICICON La pirobalstica es uno de los mtodos directos de transformacin ms usados en la actualidad. Se basa en disparar hacia el ncleo de las clulas a transformar, con alta aceleracin, pequeos proyectiles con ADN adherido en su superficie, permitiendo as la incorporacin de ADN forneo al ADN de la clula (Sanford, 1993). En gramneas como arroz, avena, caa de azcar, cebada, maz, pasto, trigo y sorgo, se han obtenido transformantes estables a partir de callos embriognicos, que expresan los genes de seleccin NPTII (gen que incorpora resistencia al antibitico kanamicina) y BAR (gen de resistencia al herbicida fosfinotricina o PPT) y los genes reporteros GUS (gen que codifica la enzima -glucuronidasa) o sgfp (gen que codifica una protena verde fluorescente), utilizando promotores especficos para monocotiledneas, comprobndose la integracin y expresin de los genes a travs de pruebas de PCR, Southern y Western

blotting y RT-PCR (Vallejos et al., 1992; Vain et al., 1993; Casas et al., 1997; Yao y Kasha, 1997; Falco et al., 2000; Toldi et al., 2000; Kuai et al., 2001; Richards et al., 2001). En lo que respecta a las dicotiledneas, en la familia de las leguminosas se han transformado embriones cigticos de Phaseolus vulgaris con el plsmido que contiene los genes 2s-albmina y la secuencia estructural de -glucuronidasa, bajo el control del promotor CaMV35S, obtenindose tejidos quimricos (Arago et al., 1992). EnRacoperma mangium se ha confirmado la transferencia de ADN, tanto en callos de hipoctilo como en semillas. El plsmido utilizado para el bombardeo fue el BI426 que contena el gen GUS bajo el control del promotor CaMV35S. La expresin de este gen se observ despus de 24 horas, siendo muy bajo el nmero de puntos azules (Quoirinet al., 1997). En races y tubrculos tambin ha sido sealado el uso de la biobalstica para la transformacin gentica, obtenindose transformantes estables en batata y yuca que expresan los genes NPTII y GUS. En yuca se han bombardeado tejidos derivados de suspensiones celulares y en batata hojas y pecolos (Prakash y Varadarajan, 1992 y Schpke et al., 1997). En lechosa (Carica papaya L.) se ha sealado transformacin estable a travs del bombardeo de microproyectiles utilizando tres tipos de explantes, embriones cigticos inmaduros, secciones de hipoctilo y callos embriognicos. Estos tejidos fueron bombardeados con partculas de tungsteno llevando los genes de seleccin BAR y NPTII, de la protena de la cpside del virus de la mancha anillada de la lechosa (PRSV-P) y el reportero GUS. Se hizo evidente la transformacin cuando se realizaron las pruebas de actividad enzimtica para la expresin de los genes GUS y NPTII, el PCR para el gen de la protena de cpside del PRSV-P y Southern blot para el gen BAR (Fitch et al., 1990; Cabrera et al., 1995; Cai et al., 1999). En las variedades Kensington Pride y Carabao de mango ha sido sealada la optimizacin de las condiciones de bombardeo usando partculas de tungsteno de 0,7m, una distancia entre la muestra y la Introduccin directa de cidos nucleicos a clulas intactas, tejidos y rganos a travs del disparo de microproyectiles con una pistola de genes.

PARAMETROS QUE HAY TENER EN CUENTA.

Parmetros referidos al acelerador La fuente de energa El macroproyectil: Forma cilndrica o circular Vacio Pantalla dispersora de macroparticulas Velocidad del impacto: Presin, recorrido y distancia de ubicacin del impacto Parmetros de los micro proyectiles Tipo de micro proyectil (tungsteno, oro, platino etc. ) Tamao de la partcula Recubrimiento de la partcula con el DNA (CaCl2 Y espermidina) Ubicacin de la partcula en el macroproyectil.

ELECTROPORACION. Es el proceso por el cual las membranas bilipidicas se vuelven permeables en forma reversible, producto de la aplicacin de campos electricos de alta intensidad. Cuando la membrana celular es polarizada por alto voltaje, se forman poros que permiten el intercambio de compuestos entre el medio intra y extracelular, este efecto es transitorio y despues de un lapso de tiempo la impermeabilidad y resistencia de las clulas es reestablecida, el pulso de electroporacion es generado por la descarga de un capacitor a traves de electrodos colocados en una cubeta diseada para estos fines, en esta son colocados los blancos biolgicos y el ADN plasmidico que porta la informacin gentica que se desea expresar, ambos en un buffer de composicin y conductancia elctrica conocidas

Ventajas y desventajas del mtodo Al comparar la electroporacion con otros mtodos directos esta los supera respecto a la mayor facilidad de controlar los factores que influyen positivamente en la obtencion de buenos resultados Como principal desventaja se tiene la de necesitar un gran nmero de manipulaciones y necesitar gran cantidad de ADN para cada ensayo MICROINYECCION El micro inyeccin es un proceso que consiste en utilizar micro agujas para insertar sustancias a un nivel microscpico o en el lmite de lo macroscpico dentro de una clula viva. Es un simple proceso mecnico en el cual una aguja extremadamente fina penetra la membrana celular y a veces la membrana nuclear para lanzar su contenido. La micro inyeccin es normalmente realizada bajo un microscopio ptico llamado micromanipulador. El proceso es frecuentemente usado como un vector en ingeniera gentica y transgentica para insertar material gentico en una clula. El proceso de clonacin tambin involucra micro inyecciones. Las micro agujas miden alrededor de 10 micrmetros. Pueden contener cerca de 15 micro litros de ADN. Es similar a la seccin transversal de un cabello humano. Es un mtodo muy preciso de transferencia gnica. Requiere personal capacitado LASER El lser fusiona de forma selectiva material en forma de polvo en una cubeta mediante el barrido de finas capas transversales que van, as, generando el objeto tridimensional. La informacin dimensional de la pieza a imprimir proviene de un archivo informtico que ha sido generado o previamente escaneado. Una vez que la seccin transversal, o capa, se van formando la cubeta de polvo desciende una distancia equivalente al espesor de la capa formada, y una nueva capa de material base es aadida a la superficie. El proceso es as repetido tantas veces como capas se necesiten fundir hasta crear el objeto tridimensional.

Las piezas terminadas tendrn una densidad que depende de la potencia pico del lser ms que de su duracin, los equipos SLS usan un lser de pulso. El equipo SLS precalienta el material polvo base en la cubeta a una temperatura ligeramente inferior a la de fusin de dicho material. De esta forma hace que la fusin del material por calentamiento sea ms sencilla

3.2.2

METODOS INDIRECTOS SISTEMA DE AGROVACTERIUM Y VECTORES VIRICO

Agrobacterium es un gnero de bacterias que causan tumores en las plantas. Esta capacidad tumorignica viene dada por su capacidad natural para transferir ADN a las clulas vegetales, hecho que los cientficos rpidamente aprovecharon para convertirla en una herramienta para la creacin de plantas transgnicas mediante ingeniera gentica. Nota taxonmica: Estudios recientes han reclasificado todas las especies del gnero Agrobacterium, la mayora en Rhizobium y otras enRuegeria, Pseudorhodobacter y Stappia (gneros nuevos). Comparado con otros mtodos de fabricacin por adicin, el SLS puede producir piezas a partir de un rango relativamente amplio de materiales de polvo. Estos incluyen polmeros como el nailon(puro, con fibras de vidrio u otras fibras), o poliestireno, metales que incluyen acero, titanio, aleaciones y compuestos. El proceso qumico puede conllevar un fundido completo, parcial o sinterizado en fase lquida. Dependiendo del material se pueden conseguir piezas con densidades del 100% de la densidad del material, teniendo as la pieza propiedades fsicas comparables a aquellas fabricadas por mtodos tradicionales. 3.3 PROTOCOLO AGROVACTERIUM DE TRANSFORMACIN POR BIOBALISTICA Y

El trmino biobalstica deriva de la conjuncin de biologa y balstica o balstica biolgica. Este es un mtodo muy original ideado y refinado en la dcada de 1980 por un grupo de investigadores de la Universidad de Cornell (EE.UU.), que permite introducir ADN a virtualmente cualquier tipo de clula. En este procedimiento el ADN es introducido en las clulas por medio de partculas microscpicas (macropartculas) aceleradas a velocidades supersnicas, que atraviesan la pared y la membrana celular. Las partculas son aproximadamente esfricas (de 0.4 a 2.0 micrmetros de dimetro), estn hechas de materiales densos como oro o tungsteno (ver microfotografa 1 y 2 , respectivamente), y se recubren con el ADN que se desea transferir a las plantas. Para que las macropartculas pueda atravesar las membranas celulares y llegar al ncleo de las clulas blanco, son impulsadas a gran velocidad por explosin de plvora seca, liberacin de gas comprimido a alta presin (aire, helio, CO2 o N2 ), o por una descarga elctrica de una

gota

de

agua.

Si las partculas atraviesan las membranas y son atrapadas en el ncleo, el ADN puede integrarse de forma estable en los cromosomas mediante un proceso de recombinacin al azar, lo que se considera como transformacin estable. La transformacin estable ocurre a muy baja frecuencia, por lo que es necesario utilizar un sistema de seleccin in vitro (ver cuadernos N 5, 18 y 67) que permita distinguir clulas transformadas y no transformadas. En este mtodo de transformacin las construcciones genticas son ms simples e incluyen los genes de inters y de seleccin con sus secuencias regulatorias respectivas. El ADN para ser clonado es incluido en plsmidos que son transferidos completos durante el bombardeo a las clulas, o bien de forma de molcula lineal (el plsmido cortado en un punto), a diferencia de los plsmidos utilizados con Agrobacterium (plsmido ti desarmado). Tambin es muy comn que una vez obtenida la construccin gentica dentro de un plsmido (en el cual se clona y se obtienen muchas copias para trabajar), luego se la extrae del mismo para slo tener la secuencia con los genes de inters y de seleccin (incluidas las secuencias regulatorias) .El primer can gnico desarrollado operaba de forma similar a una pistola, en la que una bala de plstico acelerada por explosin de plvora liberaba una salva de macropartculas metlicas revestidas de ADN. Como se muestra en el esquema, luego del impacto, la bala quedaba retenida en el extremo del tubo de aceleracin y las macropartculas eran impulsadas hacia el tejido blanco a travs de un orificio existente en la placa. La primera demostracin de que el sistema funcionaba se realiz en 1987 al introducir ADN en clulas epidrmicas de cebolla. Poco despus, el mtodo fue probado en diferentes organismos con xito. As el mtodo de bombardeo de macropartculas se constituy en el segundo mtodo de transformacin gentica de plantas ms empleado, luego de Agrobacterium. Posteriormente este can gnico fue modificado y se reemplaz la carga de plvora por presin de gas para generar el impulso de las macropartculas. El modelo ms utilizado en la actualidad es el can de alta presin de helio PDS-1000/He, registrado como sistema biobalstico por Dupont. Este can consta de una cmara principal en donde se bombardea el tejido blanco en condiciones de vaco parcial. El helio comprimido es liberado a gran velocidad hacia la cmara, e impulsa una membrana de plstico que lleva las micropartculas recubiertas de ADN, las cuales son as aceleradas hacia el tejido blanco. En 1996 se empez a utilizar una pistola gnica de mano como alternativa al can PDS 1000/He. Este dispositivo permite trabajar sin vaco con virtualmente cualquier tipo de clulas o tejido blanco. Adems puede utilizarse para realizar estudios en organismos vivos.

AGROVACTERIUM
Es la especie ms comnmente estudiada de este grupo. En plantas causa la enfermedad de las agallas del cuello, denominada as porque produce agallas o tumores, a menudo en la zona donde se une la raz al tallo (cuello, o tambin llamado corona). Los tumores son producidos por la transferencia de un segmento de ADN (ADN-T) del plsmido bacteriano Ti (abreviatura de tumor-inductor).