NOMBRE DEL PROYECTO: Caracterizacin de Bacterias en cultivo y desarrollo del centro de investigacin de Macagual para la produccin de Biodiesel.

INVESTIGADORES PRINCIPALES: Bolvar-Pineda, Lina Marcela; Gallego-Vargas, Gustavo Adolfo; Gallego-Vargas, Karen Adriana; Quiones-Murcia, Kiara Zulay. DESCRIPCIN DEL PROYECTO 1. Resumen: En el centro de Investigacin de Macagual, ubicado a veinte kilmetros (20 km) de Florencia, al sur del departamento de Caquet y localizada geogrficamente a 137N y 7538 W, se realiz la recoleccin de bacterias, para conocer y estudiar las caractersticas morfolgicas a nivel macro y micro para determinar a largo plazo cual poseen propiedades enzimticas para la produccin de Biodiesel. Para llevar a cabo est recoleccin se utilizaron cajas de Ptri con medio de cultivo agar BHI, que luego fueron analizadas en el laboratorio de microbiologa de la universidad de la Amazonia, en donde se encontraron diversas colonias bacterianas de color amarillo, naranja, blanco, negro, rosadas, beige y caf, y la mayora se presentaron en forma circular, debido a que en las placas o cajas de Ptri las bacterias forman acumulaciones visibles de clulas (colonias). Para la identificacin morfolgica a nivel micro de las bacterias, se utiliz la tincin de Gram, que permiti diferenciar los tipos de bacterias Gram + y Gram --, obteniendo cocos Gram + (estafilococos, sarcinas y ttrada), bacilos Gram+ y Estreptobacilos y cocobacilos Gram--. Esto se pudo visualizar en el microscopio debido a que las bacterias Gram + retienen el colorante y permanecen de color violeta (cristal violeta colorante primario) y las clulas Gram , no retienen el colorante, son incoloras hasta que se agrega el colorante de contraste Safranina por la cual despus aparecen de color rosado, esta diferencia se determina por la estructura de la pared de las bacterias ya que definen la retencin o escape de violeta-yodo. Ya identificada la morfologa de las bacterias, se realizaron cultivos puros, estafilococos en medio de cultivo agar sal manitol, cocobacilos Gramen Macconkey sarcinas y bacilos en agar BHI. Palabras claves: Estudio Morfolgico, morfotipo, Microorganismos, colorante bsico. Abstract In the center of Investigation of Macagual, located to twenty kilometers (20 km) of Florence, to the south of the department of Caquet and located 137'N and 7538 ' W geographically, it was carried out the gathering of bacteria, to know and to study the morphological characteristics to level macro and micro to determine long term which possess enzymatic properties for the production of Biodiesel. To carry out it is gathering Ptri boxes they were used with half of cultivation agar BHI that then were analyzed in the laboratory of microbiology of the university of the Amazonia where they were diverse bacterial colonies of yellow color, orange, white, black, rosy, beige and brown, and most was presented in form to circulate, because in the badges or Ptri boxes the bacteria form visible accumulations of cells (colonies). For the morphological identification at level micro of the bacterias, the tint of Gram was used that allowed to differentiate the types of bacterias Gram + and Gram--, obtaining coconuts Gram + (staphylococcus, sarcinas and tetrad), bacillis Gram+ and Streptobacillus and coccobacillus Gram--. This you could visualize in the microscope because the bacterias Gram + they retain the coloring and they

remain of color violet (primary glass coloring violet) and the cells Gram-, they don't retain the coloring, they are colorless until one adds the contrast coloring Safranina for the one which later appear of rosy color, this difference is determined since by the structure of the wall of the bacterias they define the retention or escape of violet-iodine. Already identified the bacterias morphology, they were carried out pure cultivations, staphylococcus amid cultivation agar manitol salt, coccobacillus Gramen Macconkey sarcinas and bacilli in agar BHI. Key words: Morfolophy Study, morphotype, Microorganism , basic dye

2. Introduccin (justificacin y objetivos inmersos): Los microorganismos son seres vivos pequeos, que no son captados por el ojo humano y se visualizan por medio del microscopio. Estos seres diminutos segn Murray (2000) estn capacitados para adaptarse en diferentes lugares, debido a su poco peso y cuyas caractersticas del ambiente definen cuales especies se pueden multiplicar. Entre los microorganismo se encuentran los mohos, larvas, protozoos, virus, algas y las bacterias, estas ultima son de gran inters para la investigacin por ser una de las formas de vida ms abundantes en la tierra. Las bateras son microorganismos que carecen de ncleo (clulas procariotas), es decir son unicelulares y pertenecen al reino mnera. Poseen una estructura, relativamente simple no poseen organelos como mitocondrias, membrana nuclear, aparato de Golgi, retculo endoplasmatico, entre otros y se reproducen por divisin asexual (Murray, et al. 2000). En el transcurso de la historia los microorganismos han participado en las actividades del hombre, por ejemplo antes de haberse conocido la existencias de estos, ya los utilizaban en la preparacin de alimentos (el queso emmenthal es uno de los muchos ejemplos), mejorar las cosechas y eliminar residuos. Por esto se ha ido ampliando el conocimiento acerca de los microorganismos, en la cual se ha mejorado e incrementado sus usos. (Ingraham, et al. 1998). La manipulacin de los diminutos seres se convirti en una ciencia que cambio profundamente la vida del hombre al producir antibiticos, vitaminas, aditivos de alimentos y compuestos qumicos industriales (Ingraham, et al 1998). En los procesos de la utilizacin de microorganismo como fbricas qumicas y manipuladas, se tiene como ejemplo las bacterias (del cido lctico), participando en la creacin de productos lcteos, en la conservacin de alimentos vegetales, en la fermentacin de ciertos alimentos y bebidas. De tal forma las bacterias cumplen diversas funciones ya sean en beneficio de los seres vivos o como la causa de algunas enfermedades. Tambin es importante conocer que los microorganismos son una fuente importante de enzimas que tienen muchos usos comerciales, por ejemplo en la industria de la alimentacin se usan para evitar que los caramelos cristalicen, en medicina se utilizan como compuestos digestivos y para tratar los enfermos que han sufrido de un ataque al corazn, los detergentes para el lavado de ropa (rompimiento de enlaces peptdicos), en general. (Ingraham, et al. 1998; Murray, et al. 2000). Por tanto, el propsito del proyecto es conocer y estudiar las caractersticas de las diversos tipos de bacterias que se pueden encontrar en el centro de Investigacin Macagual de la Universidad de la Amazonia, ubicado en Florencia- Caquet. Todo esto con el fin de detectar algunas enzimas que producen y su funcin en la creacin de biocombustibles (biodiesel), esta es una meta a largo plazo. A la vez se quiere revelar las destrezas y habilidades de los profesionales de la regin de la amazonia y de sus estudiantes. El proyecto se quiere realizar en primer lugar porque tiene una gran importancia a nivel personal de los estudiantes que es investigar, analizar, aprender, conocer y brindar informacin acerca de los diferentes tipos de bacterias que se logre encontrar en el centro

de investigacin de Macagual, y por ultimo por el tema de la contaminacin causada en parte por los combustibles relacionados con hidrocarburos y porque hoy se habla del fin de los combustibles, debido al agotamiento de reservas de petrleo. Adicionalmente porque cada da se requiere ms el consumo de Combustibles, por la importancia que presenta en la satisfaccin de necesidades del ser humano. De esta manera se creara prestigio a la Universidad de la Amazonia en calidad de entidad, con la habilidad en forjar profesionales con conocimientos slidos, capaces de desarrollar competentemente la ciencia y utilizarla a cabalidad para el progreso del departamento y del pas. 3. Marco terico: BACTERIAS Las bacterias son seres vivientes microscpicos, unicelulares y procariotas, ampliamente diseminadas en todo el planeta. Algunas son saprofitas, otras patgenas para las plantas, los animales o el hombre. Pertenecen al reino de los protistas, tercer reino viviente junto al reino vegetal y el reino animal. Las bacterias poseen una estructura simple, sin embargo se nutren, respiran y se reproducen. Se pueden cultivar (Tortora, et al. 2007). Las bacterias suelen reproducirse mediante la divisin en dos clulas iguales; este proceso se conoce a partir de sustancias inorgnicas (Tortora, et al. 2007). La clula bacteriana Morfologa.

Fig. 1. Principales tipos de morfolgicos de las bacterias (Tortora, et al. 2007) Las bacterias poseen un tamao muy pequeo, este se expresa con el micrn ( . segn

Madigan (2004) la morfologa de estos microorganismos es variable y se distinguen: Cocos: bacterias con forma esfrica u ovoide, tienen un aspecto reniforme (en forma de granos de caf o de frijol) como los meningococos o los gonococos; o, tener forma oblonga u ovoide, como los neumococos. Los coccidios pueden estar aislados o, por el contrario, agrupados: ya sea de dos en dos (se los denomina entonces diplococos), de cuatro en cuatro (son las ttradas), en racimos tras de otros en cadenetas (estreptococos). Bacilos: bacterias con forma cilndrica, alargadas. Pueden observarse mltiples formas: bacilos muy delgados o bacilos gruesos. Formas cortas o largas, formas curvas en vrgula (vibriones); bacilos en extremidades redondeadas, deshilados en forma de maza as mismo, el agrupamiento de estas bacterias es tambin variable: bacilos aislados, agrupados por pares (diplobacilos), en cadenetas (estreptobacilos), unidos en empalmes o reunidos en manojo. Algunos bacilos se curvan en forma espiral, y se llaman espirilos, espiroquetas y treponema.

Estructura. Las bacterias son seres unicelulares, es decir, constituidos por una sola clula. sta posee una estructura necesariamente compuesta por un citoplasma, que contiene varios elementos y est rodeado por una membrana, y contiene un aparato nuclear (ncleo). El conjunto est sostenido por un cascaron rgido. Adems, la bacteria puede presentar otras caractersticas: esporas, cpsula, cilios (Burdin y Lavergne.1966). Las bacterias poseen paredes celulares, que adems son las responsables de la forma y rigidez de la clula. La pared celular no se observa fcilmente con el microscopio ptico. Las bacterias se dividen en dos grandes grupos: las Gram positivas y las Gram negativas. La distincin inicial entre estos dos tipos se lleva a cabo mediante una tincin diferencial denominada tincin de Gram; la diferencia entre estas se basan en la estructura de la pared celular. La morfologa de las paredes celulares es muy distinta en las clulas Gram positivas y en las Gram negativas (Fig. 2.). la pared celular en la Gram negativas est compuesta por varias capas y es bastante compleja, mientras que la pared de la Gram positivas est formada fundamentalmente por un solo tipo de molcula y suele ser ms ancha (Madigan, et al. 2004)

Fig. 2. Pared celular de las bacterias. (a,b) Diagrama esquemticos de paredes celulares Gram positivas y Gram negativas. (c,d) micrografa electrnica de la pared bacteriana Gram + Y Gram - (Madigan, et al. 2004). Algunas bacterias producen en el interior de sus clulas estructuras especiales llameadas endosporas durante un procesos denominado esporulacin. Las endosporas son clulas diferenciales extraordinariamente resistentes al calor y difciles de destruir, incluso por agentes qumicos muy agresivos. Las bacterias que forman endosporas se encuentran habitualemte en el suelo. Entre las bacterias formadoras de endosporas. Los gneros mejor conocidos son Bacillus y Clostridum (Madigan, et al. 2004).

Fig 3. La endospora bacteriana. Macrografa de diferentes tipos de endosporas y su localizacin. a) Terminal b) subterminal c) Central (Madigan, et al. 2004). Clasificacin de las bacterias Una de las clasificaciones ms conocida sobre las bacterias es la de Bergey. Esta clasificacin tiene en cuenta mltiples criterios: aspectos morfolgicos, aspectos estructurales, aspectos tintreos, tipos trficos, propiedades metablicas, caracteres genticos (Tortora, et al. 1993). Tabla 1. Resumen de algunas caractersticas seleccionadas de los grupos bacterianos, segn la primera edicin del Bergeys Manual of systematic Bacteriology. (Tortora. Et al.1993) Grupo Espiroquetas Gneros Treponema Borrelia leptospira Spirillun Gram-negativas, aerobias/microaerfilas, Campylobacter mviles, helicoidales / azospigrillum vibroides. Hbitat Acutico; parsitos de animales Suelos y aguas; tracto intestinal humano y cavidad oral. Caractersticas Morfologa helicoidal, movilidad por filamentos axiales. Morfologa helicoidal, movilidad por flagelos sin filamentos axiales; los vibroides no tienen una vuelta completa de hlice. y Raras, la mayora acutica, no patgena.

Bacterias curvadas, gram-negativas, inmviles Cocos y bacilos gramnegativos aerbicos.

Meniscus Spirosoma

Aguas sedimentos

Neisseria Branhamella Francisella Legionella agrobacterium Bacilos Gram- negativos Salmonella anaerbicos facultativos Klebsiella Yersinia Vibrio Bacilos Gram- negativos Bactoerium

Suelo, aguas y Comprende parsitos de microorganismo de animales inters clnico, industrial y ambiental. Suelo, plantas, Incluye muchos tracto intestinal patgenos importantes. de animales Animales e Anaerobios obligados; la

anaerbicos, rectos, Fusobacterium curvados o helicoidales.

insectos

Bacterias disimilatorias, Desulfovibrio reductoras de sulfato o azufre. Cocos anaerbicos Veillonella Gram-negativos

Sedimentos anaerbicos

Rickettsias y clamidias

Rickettesia Coxiella Chlamydia

Principalmente el tracto intestinal de animales. Prasitos de Bacterias intracelulares artrpodos y obligadas; muchos son animales patgenos importantes; gram-negativos.

mayora viven en el tracto intestinal, algunos en la boca y tracto genital. Reducen formas oxidadas de azufre hasta SH2 Gram- negativas. Anaerobios inmviles

Clasificacin por caractersticas de tincin de Gram.

La mayor parte de las bacterias que se obtienen de muestras clnicas se identifica en forma inicial hacindolas crecer en un cultivo puro o en un medio artificial, se observa la forma y color de las mismas mediante la colocacin de una muestra del cultivo en un portaobjetos y su tincin. En casi todos los casos el procedimiento inicial clave es la tincin de Gram (Walker. 2000). Procedimiento de tincin de Gram El patlogo dans Christian Gram cre el procedimiento de tincin de Gram en el decenio de 1880. Se coloca una cantidad diminuta de las bacterias que se teirn en una gota de lquido sobre un porta objetos y se deja secar al aire. La gota seca debe tener apariencia un poco opaca; la tincin no es confiable cuando se emplean demasiadas bacterias. Luego se deja el portaobjetos con calor de baja intensidad, de manera que quede suficientemente tibio como para poderse tocar con el dorso de la mano sin que ello ocasione ninguna quemadura. El portaobjetos se tie con Violeta cristal, se lava y se le agrega un mordente llamado solucin de lugol ( / KI A 3%) para fijar la tincin. El portaobjeto se lava de nuevo y se decolora un poco con una mezcla de alcohol y acetona. Por ltimo el portaobjetos se vuelve a teir con safranina, se lava y se seca con absorbente. Al examinar con una lente de inmersin en aceite las bacterias teidas, las grampositivas se muestran de color azul o prpura, pero las gramnegativas tienen apariencia roja o rosada. Las muestras teidas que se toman de cultivos envejecidos de bacterias grampositivas contienen una mezcla de bacterias azules y rosas, y se dice que son gramvariables. El procedimiento de tincin Gram permite diferenciar los dos principales grupos de bacterias, cuyas cubiertas celulares son muy distintas entre s (Walker. 2000)

Medios de Cultivos Un medio de cultivo es un sustrato o solucin de nutrientes en los que crecen y se multiplican los microorganismos en el laboratorio, con el objeto de aislar diferentes especies bacterianas y proceder a su identificacin para llevar a cabo una serie de estudios complementarios. Los sustratos energticos y la materia orgnica sinttica (sustratos como protenas, derivados de la celulosa, etc.) pueden suministrarse por sustancias nutritivas contenidas en la maceracin de carne y vsceras (Montoya, 2008). Clasificacin Segn Montoya (2008) los medios de cultivo pueden clasificarse segn su consistencia, origen, composicin y utilizacin. Consistencia - Lquidos: contienen los nutrientes antes citados a los cuales se les adiciona una sustancia capaz de mantener el pH adecuado. Entre los ms empleados estn el caldo nutritivo y el caldo pentona. - Slidos: se obtienen agregando agar. Este debidamente esterilizado se vierte en una caja de Ptri o en un tubo de ensayo. Las exigencias nutritivas y las condiciones fisicoqumicas son similares a las de los medios lquidos. Pero a diferencia de ellos, ofrecen la posibilidad de obtener colonias aisladas, siempre que la cantidad del inculo este suficientemente diluida. En este caso se observa la existencias de colonias separadas unas de otras. - Semislidos: son muy semejantes a los medios slidos con la diferencia que a estas se les disminuye la concentracin del agar. Se utiliza para la conservacin de cepas bacterianas y la observacin y registro de bacterias mviles. Origen - Los medios sintticos qumicamente bien definidos son medios compuestos por productos qumicos conocidos y se usan para estudios metablicos. Ejemplo: agar nutritivo, agar blanco, caldo nutritivo, etc. - Los medios naturales son aquellos medios preparados a partir de sustancias naturales animales o vegetales, de composicin no rigurosamente constante. Ejemplos: la leche, la papa, etc. Composicin y utilizacin - Medios simples: poseen los requisitos nutricionales mnimo para permitir el desarrollo bacteriano en general. Ej.: agar nutritivo, caldo nutritivo, etc. - Medios enriquecidos: son medios simples o comunes a los que se aaden ciertos componentes como sangre, suero, glucosa, etc., que permiten el aporte de factores de crecimiento o sustancias que neutralizan agentes inhibidores del crecimiento, en bateras exigentes nutricionalmente. Son diferentes para cada tipo de bacterias. Ej.: agar de sangre. - Medios selectivos: se consiguen aadiendo agar nutritivo compuestos qumicos nocivos para las bacterias cuyo crecimiento no interesa o tambin alterando las condiciones fsicas del medio. - Medios diferenciales: a estos medios de cultivo se les adicionan sustancias para que slo crezcan determinadas bacterias y estas al actuar sobre algunas de las

sustancias adicionadas, permiten observar macroscpicamente ciertas propiedades de crecimiento que ayudan a diferenciar sus colonias de otras especies diferentes. Medios de enriquecimiento: medios lquidos que favorecen o permiten la multiplicacin de bacterias cuando la muestra obtenida es muy pobre. Medios de recuento: se utilizan para determinar el contenido bacteriano de sustancias como leche, agua, carnes, etc. El nmero de colonias resultantes del sembrado de la muestra se cuentan macroscpicamente y se aplican frmulas matemticas. Medios de transporte: se utilizan para asegurar la viabilidad de las bateras y evitar que se reproduzcan alterando el nmero de bacterias iniciales, desde el momento de la toma de la muestra hasta su posterior siembra en el laboratorio.

Las propiedades de cultivo proporcionarn datos sobre el modo de vida de la bacteria: la temperatura de desarrollo ptima, el crecimiento en aerobiosis o anaerobiosis, el aspecto del cultivo en lquido (cultivo turbio, homogneo o granuloso), o en medio slido (Pelczar, et al. 1982). El estudio de las propiedades bioqumicas permite conocer el equipamiento enzimtico del germen: sembrado en medios que con contengan azcares, se observar si se produce una oxidacin o una fermentacin. Todas estas reacciones indican la presencia o ausencia en la clula de diferentes enzimas activas sobre los glcidos. De igual forma, las enzimas que intervienen sobre las sustancias protenicas sern puestas en evidencia mediante siembra en leche, en agua peptonada, en medios con base de fenil-alanina. Como resultado de todas las pruebas, es posible asignar a la bacteria un nombre de especie, caracteres morfolgicos en general (Burdin y Lavergne. 1966).

Preparacin con los medios Para el cultivo de las bacterias se recurre a algunas sustancias naturales comunes. En relacin con esto, se usa la leche desnatada y no entera. Los materiales, en su forma natural, no presenta ningn problema para tomarlos como medios de cultivos ya que simplemente se depositan dentro de los envases adecuados tales como tubos de ensayo, o matraces, los cuales debern ser esterilizados antes de utilizarlos. Los medios que se presentan del tipo agar o caldo nutritivo se hacen mezclando los ingredientes individuales necesarios, o de manera ms prctica agregando agua a productos deshidratados que contienen todos los ingredientes. En el comercio podemos encontrar prcticamente todos los medios de cultivo en forma deshidratada (Pelczar, et al 1982). Segn Pelczar (1982) en la preparacin de medios de cultivo, deben seguir los siguientes pasos: - Cada ingrediente, o medio deshidratado completo, se debe disolver en un volumen adecuado de agua destilada. - Se determina el pH del medio y si es necesario se ajustar. El pH se determina por medio de indicadores.

Identificaciones fsicas necesarias para el desarrollo. Adems de conocer los nutrientes apropiados necesarios para el cultivo de bacterias, tambin conviene conocer las condiciones fsicas del medio en donde el microorganismo puede desarrollarse mejor. As como las bacterias varan ampliamente en relacin a sus necesidades nutricionales, tambin muestran respuestas diversas a las condiciones fsicas del medio. Dicho de otra manera, para un buen cultivo de las bacterias se necesita combinar apropiadamente (Pelczar. Et al 1982). Algunos factores segn Pelczar (1982) son: Temperatura: El proceso de desarrollo de las bacterias depende de reacciones qumicas y la velocidad con que se efectan estas reacciones es influida por la temperatura, el patrn de desarrollo bacteriano puede ser influido profundamente por esta condicin. La temperatura puede en parte, determinar la velocidad de crecimiento y el grado total de desarrollo de los microorganismo. Las variaciones en la temperatura, tambin puede influir en los procesos metablicos y en la morfologa celular. Cada especie de bacterias crece a temperatura que est dentro de ciertos lmites. De acuerdo con esto las bacterias se pueden dividir en los siguientes grupos: Psicrfilas: capaces de desarrollarse a 0C o menos, aunque crecen mejor a temperatura superiores, cercanas a 15 o 20C. Mesfilas: Crecen mejor en lmite de temperatura que estn entre 25 y 40C. Termfilas: crecen entre 45 y 60 C.

Necesidades de gases: Los gases principales que afecta el desarrollo bacteriano son el oxgeno y el Co2. Las bacterias presentan una respuesta amplia y variable al oxgeno libre, y sobre esta base se dividen en cuatro: 1. Aerobias: desarrollan en presencia de Oxgeno. 2. Anaerobias: se desarrollan en ausencia de oxgeno. 3. Anaerobias Facultativas: bacterias que se desarrollan tanto en presencia como ausencia de oxgeno. 4. Microaerfilas: bacterias que crecen en presencia de pequesimas cantidades de oxgeno. Acidez o alcalinidad En la mayor parte de las bacterias, el pH ptimo de crecimiento est entre 6.7 y 7.5, aunque algunas bacterias pueden desarrollarse a pH extremos, en la mayor parte de las especies los lmites mnimo y mximo corresponde a cualquier punto entre pH 4 y pH 9. Necesidades fsicas diversas Para establecer las condiciones adecuadas de desarrollo de la mayora de las bacterias, conviene considerar como factores fsicos principales, la temperatura, ambiente gaseoso y el pH; pero algunos grupos de bacterias tienen necesidades adicionales. Por ejemplo, organismos fotosintticos y autotrficos debern ser expuestos a una fuente de energa. El

desarrollo bacteriano tambin es influido por las condiciones de presin osmtica e hidrosttica. Seleccin de los medios de cultivo y condiciones de incubacin Para obtener un buen desarrollo de las bacterias, el trabajador del laboratorio deber (Pelczar. Et al. 1982): a) Inocular (sembrar) las bacterias en un medio de cultivo que tenga los nutrientes necesarios. b) Incubar el medio ya sembrado en condiciones fsicas apropiadas. Para hacer una seleccin apropiada de los medios de cultivo y de las condiciones fsicas, de acuerdo con Pelczar (1982), se tendr que responder a preguntas como las siguientes: 1. Las bacterias que se van a aislar son aerobias o anaerobias? 2. Contiene el espcimen bacterias autotrficas y heterotrficas? En caso afirmativo, debern cultivarse los dos tipos? 3. Contiene el espcimen microorganismos termfilos, o aparece que los microorganismos son mesfilos? Cultivos puros y caractersticas del cultivo Las bacterias u otros organismos que se desarrollan en medios de laboratorio, se llaman cultivos. Las diferentes especies de bacterias que se desarrollan en la misma clase de medios de cultivo pueden tener aspectos muy diferentes, y por tanto, el conocimiento de la apariencia, o de las caractersticas de cultivo de las especies es til para reconocer a ciertos tipos de bacterias; as mismo, puede servir como un medio que haga posible identificar especies (Pelczar. Et al. 1982). - Cultivos mixtos. La poblacin microbiana de nuestro ambiente es grande y compleja. El ambiente se compone de toda una diversidad de bacterias y otros microbios. El estudio de los microorganismos de los diferentes hbitats exige que se conozcan los microbios especficos presentes. Para lograr esto es necesario aplicar tcnicas que ayuden a desenmaraar las poblaciones mixtas y complejas de microorganismos, o cultivos mixtos, y obtener cultivos puros de distintas especies y separadas. Un cultivo puro est formado de poblaciones de clulas derivadas de una sola clula (Pelczar. Et al 1982). - Cultivos puros El cultivo puro representa las condiciones artificiales para el desarrollo de las bacterias y otros microorganismos y las condiciones impuestas a los microorganismos mediante el manejo del laboratorio. A pesar de esto, para determinar las caractersticas de especies concretas de microorganismos, es imperativo que el organismo se asle y se desarrolle en el laboratorio y como un cultivo puro. Existe gran variedad de tcnicas por medio de las cuales las diferentes especies en una muestra natural pueden ser aisladas y desarrollarse como cultivo puro (Pelczar. Et al. 1982).

Mtodos para aislar cultivos puros: Tcnica de siembra por estras en placa y tcnica de siembra por difusin en placa. Con un asa bacteriolgica, se pasa una porcin de la muestra a la superficie de un medio de cultivo hecho a base de agar y se siembra en el medio ya sea por estras o por difusin. Para sembrar por difusin en placa, por lo comn se usa una varilla de cristal estril para esparcir la muestra. Esta operacin permite que las bacterias queden separadas unas de otras en la superficie del agar. Cuando se raya adecuadamente el agar con el asa las siembras, las clulas bacterianas quedan lo suficientemente separadas en algunas reas de la placa lo que permite estar seguros que la colonia que se desarrolla a partir de una clula se junte con la que est desarrollndose a partir de otra clula. Cabe suponer que cada colonia aislada es la descendencia de una sola clula, y por tanto, un cultivo puro. Una porcin de una colonia que se pase a un medio de cultivo en tubo viene a ser un cultivo puro. Despus de una incubacin apropiada, el desarrollo de cada cultivo se puede observar al microscopio o mediante cultivo para verificar que es un cultivo puro (Pelczar. Et al. 1982). Las tcnicas de siembra en placa por estras y por difusin se pueden hacer convenientemente y con equipo mnimo; stos son procedimientos de rutina que se efectan para aislar bacterias en cultivo puro. Aunque una de las limitaciones es que slo pequeas cantidades de las muestras pueden ser esparcidas sobe la superficie de cultivo (Pelczar. Et al. 1982). Tcnica de la placa vertida El principio de la tcnica de la placa vertida es la dilucin (adelgazamiento) de la muestra en tubos con agar fundido y enfriado. Se necesita hacer diluciones en ms de un tubo para obtener colonias bien aisladas, si es que no se conoce la magnitud de la poblacin bacteriana de la muestra antes de manejarla. El medio se mantiene al estado lquido a una temperatura a 45 C para permitir que el inculo se distribuya adecuadamente en el medio. Una vez sembrado el medio se pone en cajas de Petri, se deja solidificar y despus se incuba. Como algunos microorganismos quedan atrapados entre el agar, se observarn colonias tanto en la superficie como entre el medio cuando ste solidifica. Esta tcnica se hace de forma cualitativa y cuantitativa. Cuando se emplea el procedimiento cuantitativo, se podr determinar el nmero de bacterias (de un tipo particular) en la muestra, as como aislarlas en cultivo puro (Pelczar. Et al. 1982). Las tcnicas de siembra por estras (o por diseminacin) y las de placa vertida para aislar cierta clase de bacterias, pueden mejorarse con medios de cultivo selectivo o diferencial. Tambin es posible tratar el medio para eliminar otro tipo de bacterias diferentes de las que se desea aislar, antes de sembrar en las placas (Pelczar. Et al. 1982).

Fig. 4. La tcnica de la placa vertida se usa para el aislamiento de bacterias en cultivo puro. Etapa 1: En el tubo A (agar fundido y enfriado) se pone una parte proporcional de la suspensin original. Este tubo se pone entre las dos manos y se agita por rotacin para mezclar el medio con el inculo. Se hacen transferencias similares del tubo A al B y del B al C. Etapa 2: El contenido de cada uno de los tubos se vaca en cajas de Petri distintas. Etapa 3: Despus de la incubacin, las placas se examinan para buscar la que tenga colonias aisladas. De esta placa se pueden aislar cultivos puros de bacterias sembrando una porcin de colonias aisladas en un tubo con medio estril (Pelczar. Et al. 1982). Tcnica del enriquecimiento del cultivo Para mejorar las posibilidades de aislamiento de algunos tipos fisiolgicos poco frecuentes de bacterias, los procedimientos de siembra en placa debern de estar precedidos del desarrollo de las bacterias en un cultivo de enriquecimiento. Segn Pelczar (1982) el principio de esto, es procurar un ambiente de cultivo diseado (medio de composicin conocida y condiciones especficas de incubacin) que pueda favorecer el desarrollo de cierto tipo concreto de bacterias que se necesita pero que no sea adecuado para las dems. Los medios de enriquecimiento se usan generalmente cuando el tipo de bacteria que se quiere aislar se encuentra en muy pequeas cantidades y se desarrolla con mayor lentitud que muchas de las otras especies presentes en el inculo (Pelczar. Et al. 1982). Tcnica de las diluciones en serie Si el microorganismo que se busca en un cultivo mixto se encuentra en mayor cantidad de cualquiera de los otros microorganismos, es posible obtenerlo en cultivo puro mediante una serie de diluciones en tubo, del medio de cultivo apropiado. Cuando la muestra est muy diluida contendr solamente la bacteria que se busca. Aunque se recomienda

confirmar mediante el procedimiento de la siembra en placa la pureza del cultivo que se aisl de la manera descrita (Pelczar. Et al. 1982). Mantenimiento y preservacin de cultivos puros. Mtodos de preservacin: - Preservacin de cultivos con una capa de aceite mineral. Muchas bacterias se preservan bien cubriendo el agar en que estn creciendo con aceite mineral estril. Para cultivos en agar inclinado el aceite deber cubrir ms o menos 1.5 cm del pico del agar inclinado. Esta tcnica tiene la ventaja particular de que se puede tomar algo del desarrollo bacteriano que est abajo del aceite con un asa de siembra, inocular medios frescos y a un preservar el cultivo inicial (Pelczar. Et al. 1982). - Preservacin de cultivos por secado rpido en congelacin (liofilizacin). La liofilizacin es el procedimiento ms eficaz para la preservacin de cultivos. Muchas especies de bacterias preservadas por esta tcnica han permanecido viables e invariables por ms de 20 aos. En este procedimiento las clulas se secan rpidamente, mientras son congeladas, mediante las siguientes etapas: la suspensin de clular se ponen en pequeos frascos que se sumergen en una mezcla de hielo seco y alcohol (-78C). los frascos se conectan inmediatamente a una lnea de alto vaco, y una vez que se termin el secado cada frasco se sella bajo condiciones de vaco. Las ventajas ms significativas de este procedimiento son la gran longevidad, las menores oportunidades de cambio en las caractersticas del cultivo y lo pequeo de los recipientes donde se almacenan los cultivos (Pelczar. Et al. 1982). Caractersticas del cultivo Una de las caractersticas principales de las bacterias es su apariencia (caractersticas de desarrollo) seguida del crecimiento en diferentes medios de cultivo. Estas caractersticas generales como el color (o cromognesis), abundancia de crecimiento y aun el olor del cultivo puede servir de guas para la identificacin (Pelczar. Et al. 1982). Segn Pelczar (1982) para determinar las caractersticas de desarrollo de un cultivo puro es costumbre observar los siguientes aspectos del cultivo: 1. Tipos de colonias en agar 2. Desarrollo en agar inclinado 3. Desarrollo en caldo. 4. Desarrollo en gelatina por picadura. Los aspectos ms peculiares en cada uno de los medios se resumen as de acuerdo con Pelczar (1982): Colonias en placas de agar: - Tamao: los lmites de tamao de las colonias varan desde muy pequeas, que miden solamente una fraccin de mm de dimetro, hasta colonias muy grandes que miden 5 o 10 mm de dimetro. - Margen o borde: los bordes de las colonias bacterianas son de diferentes tipos, segn la especie de que se trate. Pueden formar un crculo perfecto, como las orillas de

una gota, o mostrar gran variedad de irregularidades como salientes redondos, hendiduras irregulares, etc. Elevacin: Las colonias puede ser muy finas (planas) o gruesas (elevadas). Pigmentacin: Las colonias pueden estar coloreadas o si color. Algunas especies se caracterizan por los matices que presentan de rojo, amarillo, caf y violeta. Caractersticas pticas: Las hay opacas, transparentes u opalescentes. Desarrollo en agar (inclinado) por estras: Cantidad: Escaso, moderado o abundante. Margen o borde: Uniforme o incluso presentando varias irregularidades en cierta manera similares a las irregularidades descritas para las colonias. Consistencia de la masa desarrollada: consistencia mantecosa o de mantequilla, fcilmente removibles con una aguja de siembras, viscosas o filamentosas, secas y brillantes. Pigmentacin: Similar a la descrita para las colonias. Desarrollo en caldo nutritivo: Cantidad de desarrollo: Escaso, moderado o abundante. Distribucin del desarrollo en el caldo: uniformemente distribuido, desarrollo confinado a la superficie del caldo como nata o pelusa, o desarrollo que se acumula como sedimento, que es granular o viscoso. Olor: Ptrido, a frutas o aromtico, o imperceptible. Desarrollo en gelatina por picadura: Desarrollo (sin licuefaccin) a lo largo de la lnea de inoculacin: el desarrollo puede estar limitado a la zona de la picadura o puede haberse expandido ms all de la picadura. Licuefaccin de la gelatina: Se puede presentar desde arriba suavemente o adquirir aspectos variados de embudos al licuar la gelatina.

4. Metodologa propuesta: Para el desarrollo del presente proyecto se seguir los siguientes pasos: 4.1. Recoleccin de las muestras (bacterias) en el centro de Investigacin Macagual. Se llevaran aproximadamente 12 cajas de Petri estriles destapadas y se colocaran en diferentes lugares de la zona, donde hallan rboles. Despus de 30 min se recogern y se llevaran al laboratorio. 4.2. En las cajas de Petri, las bacterias forman acumulaciones visibles de clulas conocidas como colonias. 4.3. Se realiza un estudio morfolgico a nivel macro, para identificar caractersticas generales de las colonias de bacterias que se formaron como el color, el olor, el tamao. 4.4. Traslado y tcnica de seleccin de colonias (medio de cultivo Agar BHI). 4.5. Seleccionadas las colonias se realiza un estudio a nivel micro, para identificar la morfologa (cocos, bacilos, etc.) y el tipo de bacteria segn la tincin de Gram (Gram + y

Gram -). 4.6. Aislamiento de bacterias segn la morfologa (cocos, bacilos, etc.), en diferentes medios de cultivos (Macconkey, Agar BHI, etc.) En los primeros medios de cultivo se prepara un medio de cultivo de 300 ml, compuesto de Agar (4.5 g) y BHI (11.1 g) en un Erlenmeyer, se transfiere a otras 12 cajas de Ptri esterilizadas en una autoclave, cada una contiene 20 ml de medio de cultivo, se deja solidificar a temperatura ambiente. Con la ayuda de un asa metlica estril, se pasa bacterias de la colonia a otro medio de cultivo de agar, aqu se utiliza el mtodo para aislar cultivos a partir de la siembra por estras en placa.

Fig.5. Siembra por estras. (Wistreich.1997)

Fig. 6. Mtodo de hacer una extensin en placa para obtener cultivos puros. a) Se esteriliza el asa y luego se toma una muestra. b) Se realiza una siembra por estra sobre una palca de agar con medio estril, extendiendo bien los organismos. Despus de una estra inicial se hacen estras subsiguientes en ngulo, y al final se vuelve a esterilizar el asa. c) Aspectos de la palca sembrada tras incubacin. De las colonias que crecen aisladas se pueden obtener normalmente cultivos puros (Madigan, et al. 2004).

Cada caja de Ptri debe ir rotulada, con el nombre de la colonia segn el morfotipo. Se incuba el medio ya sembrado en condiciones fsicas apropiadas.

Fig. 7. Procedimiento para la identificacin de bacterias Gram positivas y Gram negativos. Tincin de Gram (Madigan, et al. 2004) Procedimiento de la Tincin de Gram (Tortora. Et al. 2007) 1) Un extendido fijado con calor se cubre con un colorante violeta bsico (Cristal Violeta). Como el colorante violeta imparte su color a todas las clulas se le denomina colorante primario. 2) Despus de un breve lapso (un minuto) se escurre el colorante violeta, se lava el extendido y se le cubre con lugol . cuando se lava el lugol, tanto las bacterias Gram positivas como las Gram negativas aparecen de color violeta oscuro o purpura. 3) Se lava el porta objeto con alcohol o una solucin de alcohol cetona (8 segundos)

esta solucin es un agente de colorante que elimina el color violeta de algunas especies pero no de otras. 4) Se elimina el alcohol con agua y si tiene el porta objeto con safranina, un colorante bsico luego se vuelve a lavar el extendido y se deja secar. Luego se mira en el microscopio.

5. Resultados Discusin (conclusiones inmersas): En el Centro de Investigacin Macagual, situado a veinte kilmetros (20 Km), departamento del Caquet, localizado geogrficamente en la amazonia colombiana 1o37N y 75o36W, a 300 msnm con un clima AF segn la clasificacin de Copen y con una temperatura de 25.5 C, se realiz la primera recoleccin de bacterias, en donde se utilizaron cajas de Ptri con medio de cultivo agar y se colocaron en el bosque de este centro destapadas y despus de media hora (30 min) se cerraron; cada caja fue ubicada en un sitio diferente (especficamente debajo de especies diferentes de plantas) a una distancia de seis metros (6 m), para as obtener diversos tipos de bacterias.

Fig.8. Cajas de Ptri destapadas y esterilizadas, colocadas en diferentes sitios del bosque del CIMAZ. Imagen tomada por: Lina Marcela Bolvar Pineda. Despus de haber obtenido las bacterias en las cajas de Ptri (con medio de cultivo agar BHI) se llevaron al laboratorio de microbiologa de la Universidad de la Amazonia, para detectar que muestras eran tiles para dar inicio a la investigacin. Transcurrido dos das se observ en las placas colonias de bacterias. El crecimiento de los microorganismos no se puede estudiar individualmente debido a su tamao, por lo que fue necesario recurrir a mtodos nutritivos artificiales donde se puedan desarrollar rpidamente y producir grandes poblaciones. En estas condiciones se pueden manipular y efectuar la investigacin deseada (Olivas, 2004). Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio (Madigan, Et al. 2004). Los materiales nutritivos en donde se desarrollan y multiplican los microorganismos contienen los nutrientes necesarios para el crecimiento y se denominan medios de cultivos cuyos componentes son muy variados (Olivas, 2004) y su utilizacin tiene como objetivo aislar diferentes especies bacterianas para proceder a su identificacin, en este caso. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son la temperatura, grado de humedad, acidez entre otros. Los medios para identificar las bacterias contienen sustratos especficos de prueba para diferenciar especies de otras, con base en su capacidad enzimtica. Cada especie presenta

un equipo enzimtico caracterstico de su especie (Olivas, 2004). Como existen diferentes medios de cultivo segn su consistencia, origen, composicin y utilizacin: lquidos, slidos y semislidos, en este proyecto se trabaj con medios de cultivos slidos, la cual se obtiene al manipular agar (sustancia polisacrida e inerte de algas marinas) (Montoya, 2008); Cuando se inocula un medio solidificado de agar contenido en una caja de Ptri (medio en placa), las bacterias pueden esparcirse en la superficie mediante una tcnica de rayado (estriado) con el asa, en tal forma que las clulas queden separadas individualmente, lejos unas de otras. Durante la incubacin, cada clula bacteriana se reproduce tan rpidamente que entre 18 y 24 horas se producen masas bacterianas visibles y a simple vista, denominadas colonias (Olivas, 2004). Cada colonia presumiblemente procede de una bacteria progenitora, cuyos individuos son de una sola especie. Una colonia que se desarrolla separada de las otras, al ser transferidas a un medio de cultivo nuevo dar lugar a un cultivo puro, es decir con individuos de una sola especie (Olivas, 2004). Las colonias bacterianas pueden ser de formas y tamaos variable dependiendo del organismo, las condiciones del cultivo, el suministro de nutrientes (como la cantidad de oxigeno presente), y otros parmetros fisiolgicos. Algunas materias producen pigmentos que dan color a las colonias independientemente de su posible pigmentacin, las colonias permiten reconocer la pureza del cultivo; las placas que contengan ms de un tipo de colonia no fueron sembradas con un cultivo puro (Madigan, Et al. 2004). En el estudio morfolgico a nivel macro se visualiz el color, tamao y olor de las clulas que se hallaron en acumulaciones. En las siguientes tablas se muestran las caractersticas de las colonias de bacterias que se encontraron en las dos cajas de Ptri: Tabla 3. Descripcin de las colonias encontradas en la Placa # 2, en la primera observacin Caja Ptri 1 Colonias (Color) Nmero encontradas Forma y tamao Amarillas 9 Circulares, diferentes tamaos Blancas con punto negro en 6 Circulares, diferentes el centro. tamaos Blancas 5 Redondas

Fig.9. Caja de Ptri # 1. Colonias encontradas despus de dos das. Imagen tomada por Lina Marcela Bolvar Pineda. Tabla 4. Descripcin de las colonias encontradas en la Placa # 2, en la primera observacin Caja de Ptri 2 Colonias (Color) Nmero encontradas Forma y tamao Amarilla 14 (12 con hongos y 2 limpias) Circulares y muy pequeas Negra 7 (5 con hongos y 2 limpias) Puntos

Fig. 10. Caja de Ptri # 1. Colonias encontradas despus de dos das. Imagen tomada por Kiara Zulay Quiones Posteriormente se seleccionaron o aislaron las colonias de bacterias que ms sobresalan y se llevaron a otro medio de cultivo de agar BHI (traslado y seleccin de colonias), es decir que se separaron las colonias de acuerdo a las caractersticas que presentaban, aqu se utiliz el mtodo para aislar cultivos a partir de la siembra por estras en placa. En la fig. 11 y 12, se visualiza las colonias que crecieron en el cultivo.

Muestra 2

Muestra 1

Muestra 3
Fig. 11. Caja Ptri #1 divida en tres secciones, en cada una de estas se encuentra las colonias observadas por primera vez. En la cual aparecen nuevas colonias con diferentes morfotipo. Imagen tomada por Gustavo Adolfo Gallego.

Muestra 5

Muestra 4

Fig. 12 Caja Ptri #2 divida en dos secciones, en cada una de estas se encuentra las colonias observadas por primera vez. En la cual aparecen nuevas colonias con diferentes morfotipo. En esta se puede observar la siembra por estras. Imagen tomada por Kiara Zulay Quiones. La siguiente tabla muestra las caractersticas macro de las colonias que se formaron despus del traslado y seleccin de las primeras colonias de bacterias.

Tabla 5. Morfotipo de las segundas Colonias. Muestra Color 1 Amarillo caf Amarillo claro Blanco Amarillo Naranja 2 3 4 Rosado Caf claro Amarillo Amarillo Amarillo claro Beige claro Beige Naranja claro Beige Caf claro Amarillo claro Naranja claro Amarillo con naranja

Forma Un ocho (dos circulares unidas) Circular Circular Circular Circular muy pequea Circular Irregular Circular muy pequea Circular muy pequea Circular irregular Irregular Circular con un punto negro en el centro Ovalada Irregular Forma de frijol, Irregular Circular Circular

Para identificar bacterias se utiliza las tinciones diferenciales que son aquellas que no tien del mismo modo todos los tipos de clulas, como la tincin de Gram. Dependiendo del resultado de esta tincin las bacterias pueden dividirse en dos grandes grupos, Gram positivas y Gram negativas. Una vez determinada la tincin de Gram las bateras Gram positivas aparecern de color morado, violeta, mientras que las Gram negativas presentan color rojo o rosado. Estas diferencias en la tincin se debe a diferencias en la estructura de la pared celular de las bacterias Gram + y Gram --, de tal modo que el alcohol es capaz de decolorar las clulas Gram pero no las Gram +. La tincin de Gram es uno de los procedimientos de tincin ms tiles para identificar bacterias (Madigan, Et al. 2004). Las diferencias estructurales entre las paredes celulares de las bacterias Gram + Y Gram son las responsables del diferente comportamiento de las clulas a la tincin de Gram. En dicha tincin, se forma dentro de las clulas un complejo cristal insoluble violeta-yodo que en el caso de las Gram puede extraerse con alcohol, pero no en las Gram +. El alcohol deshidrata las bacterias Gram + que poseen paredes celulares muy gruesas con varias capas de peptidoglicano. Esto provoca el cierre de los poros de las paredes impidiendo la salida del complejo cristal violeta-yodo. En las bacterias Gram --, el alcohol penetra rpidamente en la capa externa que es rica en lpidos y la fina capa de peptidoglicano no impide el paso del solvente, por lo que el complejo se extrae fcilmente (Madigan, Et al. 2004). Como las bacterias Gram son incoloras despus del lavado con alcohol o acetona, dejan de ser visibles. Por ese motivo se aplica el colorante bsico Safranina, que las convierte en rosadas. Los colorantes como la safranina que tienen un color que contrasta

con el colorante primario se denominan colorantes de contraste. Dado a que las bacterias Gram + conservan el colorante violeta original y no son afectadas por la safranina (Tortora. Et al. 2007). Para realizar el estudio micro se realiz la tincin de Gram, con una muestra de bacterias de las colonias que se formaron (Tabla 5). Esta tincin permiti detallar los dos tipos de bacterias segn la coloracin de la pared celular y la forma, aunque la mayora fueron Gram positivas. A continuacin en la fig. 13 se contempla la morfologa de las bacterias que se hallaron en las diferentes muestras del cultivo.

Fig.13. morfologa de las bacterias obtenidas en la recoleccin de Macagual y tincin de Gram. Tabla 6. Microorganismos aislados que se observaron en la tincin de Gram. Muestra 1 2 3 4 Microorganismos aislados Estafilococos Ttradas de cocos Bacilos en capsula Bacilos Estafilococos Sarcinas Cocos en paquetes de 8, sarcina Bacilos Cocobacilos Cocobacilos Bacilos con esporas Estreptobacilos Gram + X X X X X X X X X X x x Gram -

La forma de las clulas bacterianas depende de la pared celular que les proporciona rigidez y algo de elasticidad. Individualmente las bacterias pueden aparecer como elementos esfricos, elipsoidales, alargadas (cilndricas) o en espiral (helicoidales). Cada una de estas formas es propia de una especie determinada, por esto las bacterias se clasifican en cocos, bacilos y espirales (Montoya. 2008).

El ordenamiento de las bacterias es un mecanismo por el cual ellas pueden adoptar ciertas formas cuando estn en grupos. El ordenamiento puede depender de un factor gentico, como ocurre con las clulas esfricas o cocos, o bien a un al azar como ocurre en las clulas rectas, cilndricas o alargadas: bacilos (Montoya. 2008). Los cocos son clulas bacterianas cuya forma habitual es esfrica, pero en algunas ocasiones se pueden presentar en forma lancolas das u ovoides. Cuando estas aparecen en agrupaciones se organizan en formas diferentes segn la especie. Este tipo de ordenamiento obedece a un patrn gentico propio de cada especie (Montoya. 2008). Los cocos tienen una clasificacin dependiendo de cmo estn agrupados, a continuacin se explica exclusivamente los que se observaron en las diferentes muestras (Montoya. 2008): - Ttradas: tambin se llaman tetracocos. Se observan en grupos conformados cada uno, por cuatro unidades celulares y presentan dos planos de divisin perpendicular, esto se pudo observar en la muestra 1. - Estafilococos: Esta agrupacin bacteriana se presenta en forma de masas irregulares que se parecen a los racimos de uvas y posee los 3 planos del espacio, en las muestras 1, 3, 5 se visualizaron. - Sarcinas: esta agrupacin bacteriana se ordena en forma bastante regular, donde aparecen ocho o ms unidades celulares organizadas en forma de cubos. Los cocos con esta forma de agrupacin muestra diferentes divisiones sucesivas en los 3 planos del espacio en forma perpendicular. Raramente todas las clulas bacterianas de una especie dad, estn ordenadas exactamente segn el mismo patrn. El ordenamiento predominante es la caracterstica ms importante (Montoya. 2008). Los bacilos son formas bacterianas alargadas que pueden ser cortas, rectas o cilndricas y a veces son tan cortas y difciles de identificar que se denominan cocobacilos. La agrupacin de los bacilos es diferente a la de los cocos, pues al contrario de estos, aquellos casi nunca se agrupan. Algunas especies, sin embargo muestran tendencia a un ordenamiento de sus clulas, que no obedece a un patrn gentico sino que depende de las etapas de desarrollo de las condiciones del cultivo (Montoya. 2008). En algunas observaciones que se realizaron en este proyecto estos aparecieron en forma individual, separados y en cadenas (estreptobacilos).

Estreptobacilos Gram 7% Bacilos en capsulados 7%

Bacilos con esporas 7%

MICROORGANISMO AISLADOS

Estafilococos 33% Bacilos 13%

Cocobacilos Gram 13%

Sarcinas 13%

Tetradas de cocos 7%

Fig. 14. Porcentaje de los microorganismos aislados. Medios de Cultivos Puros: los microorganismos aislados son llevados a cultivos puros, y esto se hizo de acuerdo al tipo de bacteria segn la tincin de Gram (G+ y G -), es decir dependen de la morfologa. Estafilococos: EL Agar sal manitol Cocobacilos Gram - : Medio de cultivo : Agar Macconkey Bacilos: Agar BHI Sarcina: Agar BHI El mtodo de aislamiento empleado con ms frecuencia para obtener cultivos puros es el mtodo siembra por estra en placa (Tortora. Et al. 2007.) Existen varios procedimientos y tipos de equipo empleado de la microbiologa para el aislamiento, cultivo e identificacin de microorganismo. En donde se requieren cultivos puros para la determinacin de actividades biolgicas y bioqumicas de microorganismos (Wistreich, 1997). Mantener un cultivo puro es esencial evitar la entrada de los otros organismos. Los organismos no deseados, llamados contaminantes, son muy ubicuos, por lo que se han

diseado tcnicas microbiolgicas para evitarlos, un mtodo importante para obtener cultivos puros y asegurar la pureza de un cultivo es el uso de medios slidos en cajas de Ptri (Madigan, Et al. 2004). Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo slido donde las clulas que se multiplican no cambian de localizacin; tras muchos ciclos reproductivos, cada bacteria individual genera por escisin binaria una colonia macroscpica compuesta por decenas de millones de clulas similares a la original. Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecer como cultivo puro de un solo tipo de bacteria (Wistreich, 1997; Tortora. Et al. 2007). . Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfolgicamente que es imposible diferenciarlas slo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus caractersticas bioqumicas sembrndolas en medios de cultivo especiales. As, algunos medios contienen un producto que inhibe el crecimiento de la mayora de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que desea averiguar si est presente. Otras veces el medio de cultivo contiene determinados azcares especiales que slo pueden utilizar algunas bacterias. En algunos medios se aaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catablicos cidos. Si las bacterias son capaces de producir fermentacin, generan gases que pueden ser apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado (Tortora. Et al. 2007). El agar Manitol sal es un medio de cultivo altamente selectivo, pues tiene una alta concentracin de cloruro de sodio, que impide el crecimiento de la mayora de las bacterias pero, tolerada por el grupo de los estafilococos. Adems el medio contiene manitol como nico carbohidrato y rojo de fenol como indicador de pH. Cuando hay produccin de cido a causa de la fermentacin del manitol, las colonias aparecen rodeadas de un halo amarillo; el medio permanecer sin cambio de color o acentuar el rojo del medio, cunado las colonias no fermentan el manitol (Rodrguez. Et al. 2005). El agar Macconkey es un medio selectivo de aislamiento primario que habitualmente se emplea para la diferenciacin de presuntiva de miembros fermentadores de lactosa y no fermentadores de lactosa de la familia; en si se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo, aerobios y anaerobios. (Rodrguez. Et al. 2005). Los diferentes medios y tcnicas de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiologa, pues sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y los antibiticos a los que son sensibles esas bacterias. Las tcnicas de coloracin son necesarias para el estudio microscopio de las muestras de los microorganismos (bacterias), ya que permiten mirar con detalle la morfologa bacteriana y proporcionan informacin sobre su comportamiento frente algunos o determinados colorantes.

6. Agradecimientos Los autores desean expresar sus ms sinceros agradecimientos a la Universidad de la amazonia por prestar las instalaciones (laboratorios) y a los docentes Luis Ortegn (Microbilogo) y Katherine Valderrama (Quimica) por las asesoras y el trabajo en grupo desarrollado. 7. Referente bibliogrfico Burdin J, C. Lavergne, E. 1966. Caractersticas de las bacterias. Las Bacterias. Pars. Francia. 115 pg. Ingraham, J, L. Ingraham, C, A. 1998. Biotecnologa microbiana. Introduccin a la microbiologa. Tercera Edicin. Revert. S.A. Barcelona. Espaa. 733 pg. Madigan, M, T. Martinko, M,J. Parker J. 2004. Nutricin, cultivo y metabolismo. Biologa de los microorganismos. Dcima Edicin. Pearson Prentice Hall. 1096 pg. Montoya, H, H. 2008. Nutricin y metabolismo de las bacterias. Microbiologa bsica para el rea de la salud y afines. Segunda edicin. Universidad de Antioquia. Antioquia. Colombia. 255 pg. Murray, P, R. Rosenthal, K, S. Pfaller, M, A. 2000. Principios bsicos de la microbiologa mdica. Microbiologa mdica. Quinta Edicin. Gea consultora Editorial S. II. Madrid. Espaa. 473 pg. Olivas, E. 2004. Medios de Cultivo de bacterias y tcnicas de aislamiento. Manual de Prcticas de Microbiologa I y II y parasitologa. Primera edicin. Universidad autnoma de ciudad de Jurez. Ciudad Jurez. Mxico. 105 pg. Pelczar, M, J. Reid, R, D. 1982. Caractersticas de las bacterias. Microbiologa. Segunda Edicin en espaol. Libros McGraw- Hill de Mxico S.A. Naucalpan. Mxico. 803 pg. Rodrguez, E. Gamboa, M. Hernndez, F. Garca, J. D. 2005. Medios selectivos y diferenciales. Bacteriologa General: Principios y prcticas del laboratorio 475 pg. Tortora, G, J. Funke, B, R. y Case, C, L. 1993. Bacterias. Introduccin a la Microbiologa. Tercera Edicin. Acribia S.A. Zaragoza. Espaa. 765 pg Tortora, G, J. Funke, B, R. y Case, C, L. 2007. Bacterias. Introduccin a la Microbiologa. Novena Edicin. Medica Panamericana S.A. Buenos Aires. Argentina. 959 pg Walker, T, S. 2000. Clasificacin, estructura y funcionamiento de las bacterias. Microbiologa. Tercera Edicin. McGraw- Hill interamericana editores. S.A. de C.V. Mxico. 532 pg. Wistreich, G. A. 1997. Tcnicas de cultivo. Laboratorio microbiologa. Prentice-Hal. Estados Unidos. 676 pg.