Mtodo para la determinacin de Salmonella spp. en alimentos.

OBJETIVOS Aplicar adecuadamente la tcnica descrita en la Norma Oficial Mexicana para la deteccin del gnero Salmonella. Explicar el fundamento de todas las etapas del mtodo de deteccin de Salmonella en alimentos.

GENERALIDADES Al inicio del siglo XIX, patlogos clnicos en Francia documentaron la asociacin de la ulceracin intestinal humana con un agente contagioso; la enfermedad fue denominada como fiebre tifoidea y posteriormente investigadores Europeos aislaron y caracterizaron al bacilo tifoideo responsable de sta, mientras que en los Estados Unidos, Salmon y Smith en 1885, aislaron de carne de puerco a Bacillus cholerae-suis, ahora conocido como Salmonella enterica serovar Cholaraesius. Salmonella spp. es un bacilo Gram-negativo anaerobio facultativo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae. Aunque los miembros de este gnero son capaces de moverse por medio de flagelos pertricos, existen variantes no mviles, S. enterica serovar Pullorum y S. enterica serovar Gallinarum, as como cepas no mviles debido a la presencia de flagelos disfuncionales. Las especies de Salmonella son quimioorgantrofas, con habilidad para metabolizar nutrientes por las vas fermentativa y respiratoria. Las bacterias crecen ptimamente a 37C y pueden catabolizar la Dglucosa y otros carbohidratos con produccin de cido y gas. Estos microorganismos son oxidasa negativos y catalasa negativos, crecen en citrato como nica fuente de carbono, generalmente producen cido sulfhdrico, descarboxilan la lisina y ornitina, y no hidrolizan la urea. La mayora de estas caractersticas se utilizan para la identificacin bioqumica de cepas aisladas de Salmonella. De acuerdo con la definicin contempornea, una cepa de Salmonella tpica produce cido y gas a partir de la glucosa en el agar hierro tres azcares, pero no es capaz de utilizar lactosa y sacarosa en ste medio, o en medios slidos selectivos tales como verde brillante, xilosa lisina desoxicolato y/o entrico de Hekten. Las especies tpicas de Salmonella producen en agar hierro lisina, una rpida reaccin alcalina por la descarboxilacin de la lisina y generan cadaverina. La variabilidad gentica observada en este microorganismo ha originado mutaciones, e intercambio intra e intergenrico de plsmidos lo cual ha reducido los biotipos tpicos de Salmonella. En muestras clnicas y de alimentos se han encontrado biotipos lac+ y/o sac+; biotipos que no descarboxilan la lisina, que incluso hidrolizan la urea, que producen indol y que crecen rpidamente en KCN. Esta situacin ha llevado a reevaluar el esquema de identificacin del gnero, e

incluso a utilizar tecnologas moleculares para establecer loci genticos y/o productos nicos para el gnero Salmonella. La identificacin bioqumica de Salmonella se realiza generalmente junto con una confirmacin serolgica. Esta tcnica laboriosa implica la aglutinacin de los antgenos superficiales bacterianos con anticuerpos especficos para el gnero. Estos incluyen los lipopolisacridos (LPS) somticos (O) en la superficie externa de la membrana externa, los antgenos asociados con los flagelos pertricos (H) y el antgeno capsular (Vi), este ltimo presente solamente en Salmonella serovar Typhi, Paratyphi C y Dubln. La amplia distribucin de Salmonella spp. en el medio ambiente, aunada a las prcticas agrcolas utilizadas en la industria crnica, pesquera, de moluscos, lctea y el reciclaje de la materia prima como alimento para ganado, ha favorecido la continua permanencia de este patgeno humano en la cadena alimenticia. El sector avcola se sita como la principal fuente de Salmonella spp. y enmascara la importancia como vehculos de infeccin de las carnes de puerco, de res, de cordero, leche y sus derivados. Las frutas y verduras han ganado notoriedad en aos recientes como fuentes de salmonelosis humana. Esto se presenta como una consecuencia de diversos factores como: la fertilizacin de sembrados con lodos sin tratamiento o efluentes de drenajes potencialmente contaminados con Salmonella spp. resistente a antibiticos, la irrigacin de los campos y el lavado de frutas y verduras con aguas contaminadas, la manipulacin excesiva por los trabajadores, la exposicin a la contaminacin ambiental de especies y condimentos durante el secado y la resistencia del microorganismo a valores de pH bajos. El desarrollo incompleto del sistema inmune en recin nacidos e infantes, el abatimiento en la respuesta inmunolgica en individuos de la tercera edad, y la baja produccin de cidos gstricos en estos sectores de la poblacin facilita la colonizacin intestinal y distribucin sistmica del microorganismo. Se ha demostrado que la ingesta de solamente algunas clulas de Salmonella pueden ser infecciosas. La dosis infectiva en humanos flucta entre 1 a 10 clulas. La composicin qumica del alimento es otro factor determinante en la salmonelosis adems de la heterogeneidad inmunolgica en la poblacin humana y la virulencia de las cepas infectivas. Un denominador comn de los alimentos involucrados, es la presencia de un alto contenido de grasa en alimentos como el chocolate, el queso y la carne. Se ha sugerido que las clulas de Salmonella englobadas en las micelas lipdicas pueden resistir el efecto ltico de los cidos gstricos. Las infecciones por Salmonella en humanos pueden originar varias condiciones clnicas, incluyendo fiebre entrica (tifoidea), enterocolitis e infecciones sistmicas por microorganismos no tifoides. La fiebre entrica es una infeccin grave asociada con las cepas tifoidea y paratifoidea, las cuales estn particularmente bien adaptadas para invadir y sobrevivir en los tejidos del husped. Las manifestaciones clnicas de la fiebre entrica aparecen despus de un periodo de incubacin de 7 a 28 das y pueden incluir diarrea, fiebre prolongada con variaciones en la misma, dolor abdominal, dolor de

cabeza, y debilitamiento. El diagnstico de la enfermedad radica en la deteccin del agente infectivo en etapas tempranas en la sangre o en heces al inicio de la sintomatologa clnica. El tratamiento incluye el uso de cloramfenicol, ampicilina, o trimetroprim con sulfametoxasol para eliminar la infeccin sistmica. En pases subdesarrollados como el nuestro, el uso indiscriminado de estos antibiticos ha originado la existencia de cepas resistentes que causan altas tasas de mortalidad cuando se presenta un brote de este tipo. La infeccin en humanos con Salmonella spp. no tifoide provoca enterocolitis, sta aparece de 8 a 72 h despus de tener contacto con el patgeno invasivo. La condicin clnica es auto limitante y la evacuacin de heces tpicas diarreicas no sanguinolentas y dolor abdominal se presentan a los 5 das. El tratamiento solo implica reemplazo de fluidos o electrolitos. El uso de antibiticos est contraindicado ya que prolonga la sobrevivencia y la excrecin intermitente del microorganismo. Este microorganismo se identific originalmente en hospitales y laboratorios clnicos y los mtodos empleados para su deteccin, se adaptaron posteriormente al anlisis de alimentos. Las modificaciones a los mtodos, consideraron dos aspectos principales, el primero es el debilitamiento o dao a las clulas bacterianas presentes, debido al proceso al que se somete el alimento (por ejemplo: tratamiento trmico, secado, etc.) y segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del producto bajo estudio. Para diferentes tipos de alimentos, existen distintos protocolos para el aislamiento de Salmonella, todos ellos son esencialmente similares en principio y emplean las etapas de preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo, aislamiento en medios de cultivos selectivos y diferenciales, identificacin bioqumica y confirmacin serolgica de los microorganismos.

FUNDAMENTO La presente tcnica para la deteccin de Salmonella en alimentos, describe un esquema general que consiste de 5 pasos bsicos: Preenriquecimiento, es el paso en donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las clulas de Salmonella daadas, logrando de esta manera una condicin fisiolgica estable. Enriquecimiento selectivo, se logra a partir de un medio de cultivo que conjunte dos condiciones, por un lado debe incrementar las poblaciones de Salmonella y por otro inhibir otros microorganismos presentes en la muestra. Seleccin en medios slidos, este punto se deriva directamente del anterior y se utilizan medios selectivos, que restringen el crecimiento de otros gneros diferentes a Salmonella y que permitan el reconocimiento visual caracterstico de colonias sospechosas. Identificacin bioqumica, este paso permite la identificacin genrica de los cultivos de Salmonella y la eliminacin de cultivos sospechosos falsos.

Serotipificacin, es una tcnica inmunolgica (antgeno-anticuerpo) que permite la identificacin especfica de un microorganismo.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES NOTA Los medios de cultivo que a continuacin se presentan son los utilizados en el procedimiento general. Para los medios de cultivo utilizados durante preenriquecimientos especficos consultar las modificaciones en el inciso 1.0. 1 matraz Erlenmeyer de 500 mL de capacidad, conteniendo 225.0 mL de caldo lactosado a. 1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 mL de caldo selenito-cistina b. 1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 mL de caldo tetrationato b. 1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 mL de caldo VassiliadisRappaport b. 1 caja de Petri estril con 20.0 mL de agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) c. 1 caja de Petri estril con 20.0 mL de agar bilis verde brillante (VB) c. 1 caja de Petri estril con 20.0 mL de agar entrico de Hekten (HE) c. 1 caja de Petri estril con 20.0 mL de agar sulfito de bismuto (SB) c. 1 caja de Petri estril con 20.0 mL de agar para Salmonella y Shigella (SS) c. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm conteniendo 3.0 mL de agar hierro-triple azcar (TSI) o agar hierro Kligler (KIA) solidificado e inclinado d. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de agar hierro-lisina (LIA) inclinado d . 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo urea o caldo Surraco e. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo urea rpido (puede utilizarse en sustitucin del caldo urea o Surraco) e. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de medio sulfuro-indol-manitol (SIM) e . 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de agar citrato de Simmons inclinado e . 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo manitol e. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo malonato e. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo rojo de metilo-Voges Proskauer (RM-VP) e. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 5.0 mL de caldo soya tripticasena e. 2 cajas de Petri con 20.0 mL de agar infusin cerebro corazn e.

SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES 1 frasco gotero con solucin salina isotnica estril d. 1 frasco gotero con solucin de verde brillante al 0.1% b 1 frasco gotero con solucin yodo yoduro de potasio b 1 frasco gotero con solucin salina formalizada e. 1 frasco gotero con reactivo de Kovacs f. 1 frasco gotero con solucin de rojo de metilo r. 1 frasco gotero con solucin reactivo de Voges-Proskauer N 1 (VP1; solucin etanlica de alfa-naftol al 5% P/V) f. 1 frasco gotero con solucin reactivo de Voges-Proskauer N 2 (VP2; hidrxido de potasio al 40% P/V) f. Juego de colorantes para la tincin de Gram d.

BIOLGICOS Suero anti Salmonella O (somtico) polivalente d. Suero anti Salmonella H (flagelar) polivalente d. Suero anti Salmonella Vi d.

MATERIAL Y EQUIPO Balanza granataria a. 1 caja de Petri de vidrio estril a. 1 bolsa de stomacher o un vaso de licuadora estril a. Utensilios necesarios para la manipulacin de muestras: cucharas, cuchillos, tenedores, estriles a. Stomacher o motor para licuadora a. Pipetas de vidrio de 1 mL, estriles con filtro de algodn b. Pipetas Pasteur estriles a, b, c, d, e, f Asa microbiolgica c, d, e. Mecheros de Bunsen a, b, c, d, e. Portaobjetos d. Pipetas Pasteur estriles con filtro de algodn d, e. Microscopio ptico d, e. Incubadora a 35C con termostato calibrado que evite variaciones mayores a 0.1C a, b, c, d, e . Incubadora a 42C con termostato calibrado que evite variaciones mayores a 0.1C b .

NOTAS a Material necesario al inicio de la prctica. b Material necesario a las 24 h. de iniciada la prctica. c Material necesario a las 48 h. de iniciada la prctica. d Material necesario a las 72 h. de iniciada la prctica. e Material necesario a las 96 h. de iniciada la prctica. f Material necesario a las 120 h. de iniciada la prctica.

DETERMINACIN DE Salmonella spp. EN ALIMENTOS

Incubar 18- 24 h a 37C

Pesar 25 g de muestra en condiciones de asepsia

Homogeneizar con 225 mL de solucin diluyente segn el tipo de muestra

Siembra con asa bacteriolgica en caldo tetrationato o Vassiliadis y Caldo Selenito cistina

Incubar 18- 24 h a 37C

Incubar 18- 24 h a 37C

Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (XLD, SS. Hecktoen, VB, Sulfito bismuto)

Incubar 18- 24 h a 37C

Bsqueda de colonias tpicas. Consultar cuadro 1

Resultados caractersticos Realizar bioqumicas presuntivas Kligler y LIA

Confirmacin serolgica

Resultados positivos para Salmonella

Incubar 18- 24 h a 37C Siembra de bioqumicas complementarias: malonato citrato, RM-VP, urea, SIM, manitol

PROCEDIMIENTO El siguiente mtodo se basa en el anlisis de 25.0 g de la muestra, que se considera como una unidad analtica, en una proporcin de 1:9 de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporcin de 1:9 en el medio de preenriquecimiento. La mnima muestra recomendada es de 25.0 g, es decir, una unidad analtica. Para algunos casos donde el riesgo es mayor, se utilizan dos unidades analticas (50.0 g) o ms. 1. Preenriquecimiento. 1.1. Procedimiento general para la preparacin de muestras NOTA IMPORTANTE El presente procedimiento se basa en la tcnica general para la deteccin de Salmonella en alimentos. Sin embargo, deben consultarse los siguientes incisos para realizar las modificaciones pertinentes al preenriquecimiento dependiendo del alimento a analizar, los cuales se presentan en el complemento de la presente prctica. 1. Pesar en una bolsa de Stomacher estril, en rea asptica 25.0 g de muestra a analizar. 2. Verter 225.0 mL de caldo lactosado estril en la bolsa. 3. Homogeneizar la muestra con el diluyente durante 30.0 seg a velocidad media en el Stomacher. 4. Transferir aspticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estril de boca ancha con tapn de rosca y dejar reposar por 60.0 min. a temperatura ambiente con la tapa perfectamente cerrada. 5. Mezclar bien y determinar el pH de la muestra con papel pH. 6. Ajustar si es necesario, a un pH de 6.8 0.2 con NaOH 1N o HCl 1N estriles. 7. Mezclar y cerrar suavemente la tapa del matraz 8. Incubar la muestra homognea a 35 2 C durante 24 h. 2. Enriquecimiento selectivo. 1. Cerrar firmemente el tapn de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y agitar suavemente. 2. Transferir 1.0 mL del cultivo de preenriquecimiento (con una pipeta de vidrio de 1 mL, estril) a un tubo con 10.0 mL de cada uno de los siguientes medios de enriquecimiento: Caldo tetrationato (antes de su uso, deber activarse aadiendo al medio base 0.2 mL de solucin yodo-yoduro de potasio y 0.1 mL de solucin de verde brillante al 0.1 %) Caldo selenito cistina

Caldo Vassiliadis-Rappaport (en sustitucin del caldo tetrationato) 3. Incubar los tubos inoculados en caldo selenito-cistina, caldo tetrationato y/o caldo Vassiliadis-Rappaport a 35 1 C durante 24 h. Para alimentos altamente contaminados debern incubarse los medios de enriquecimiento a 42C por el mismo periodo 3. Aislamiento diferencial. NOTA La metodologa descrita en esta seccin deber realizarse para cada uno de los caldos de enriquecimiento descritos en el inciso 2, es decir para los cultivos desarrollados en caldo selenito-cistina, caldo tetrationato y/o caldo VassiliadisRappaport. 1. Homogeneizar el tubo con caldo de enriquecimiento ya incubado. 2. Tomar una muestra del cultivo anterior con asa microbiolgica estril y sembrar en estra por agotamiento en cuadrantes en cajas de Petri, en cada uno de los siguientes medios selectivos: a) Agar XLD b) Agar VB c) Agar HK d) Agar SB e) Agar SS f) Agar Mac Conkey 3. Incubar las cajas ya sembradas en posicin invertida a 35 2 C durante 24 2 h. 4. Observar las caractersticas macroscpicas de las colonias en los medios slidos selectivos. 5. Seleccionar al menos 2 colonias sospechosas de cada medio selectivo, de acuerdo con las caractersticas especficas de desarrollo en cada uno de los medios (Consultar el Cuadro 1). 6. Almacenar en refrigeracin de 5 a 8C, las placas con medios selectivos por si es necesario tomar ms colonias. 7. Realizar una tincin de Gram a las colonias sospechosas. 8. Registrar las caractersticas morfolgicas tanto macroscpicas como microscpicas; anotando la forma de la colonia, su color, color del medio circundante, morfologa al Gram, etc. 9. Realizar una purificacin de las colonias seleccionadas, sembrando nuevamente en estra por agotamiento en cuadrantes en cajas de Petri conteniendo un medio idntico del que se tom la colonia. 4. Pruebas bioqumicas preliminares

NOTA

Se recomienda identificar seis cultivos por cada unidad analtica (25.0 g). Seleccionar colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento. 4.1. Agar triple azcar hierro o agar Kligler hierro 1. Registrar las caractersticas del medio TSI o KIA antes de la inoculacin (color del medio). 2. Por duplicado tomar suavemente una porcin del centro de la colonia con asa bacteriolgica recta y estril e inocular por picadura y estra en un tubo con agar triple azcar hierro (TSI) o agar de Kligler (KIA) inclinado. 3. Incubar el medio TSI o KIA a 35 2 C durante 24 h. 4. Consultar el Cuadro 2 para la interpretacin de los resultados. 4.2. Agar lisina hierro. 1. Hacer la misma operacin que se hizo para KIA o TSI (inciso 4.1.), tomando la asada de la misma colonia con la que se sembr en estos medios, pero sembrando ahora en el agar lisina hierro (LIA). 2. La interpretacin de resultados puede ser consultada en el Cuadro 2. 3. Retener todos los cultivos que muestren las reacciones caractersticas de Salmonella en los medios TSI (o KIA) y LIA para realizar las pruebas bioqumicas complementarias. 4. Los cultivos desarrollados en TSI o KIA que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA tpicos deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitir detectar S. arizonae y cepas atpicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos que muestre reacciones atpicas en ambos medios. 5. Pruebas bioqumicas complementarias 5.1. Caldo urea (convencional) 1. Con asa bacteriolgica recta estril, tomar del crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e inocular en el tubo con caldo urea o caldo Surraco. 2. Incubar a 35 2 C durante 24 2 h. 3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2). 4. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Conservar los cultivos que den la prueba negativa. 5.2. Caldo urea (rpida) 1. Con asa bacteriolgica estril, tomar dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI/KIA o LIA e inocular tubos de caldo urea (rpida). 2. Incubar a 37 0.5 C durante 2 h en bao de agua.

3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2). 4. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Conservar los cultivos que den la prueba negativa. 5.3. Agar citrato de Simmons 1. Con asa bacteriolgica recta estril tomar crecimiento del tubo de TSI/KIA o LIA e inocular por estra en el tubo con agar citrato de Simmons. 2. Incubar a 35 2 C durante 96 2 h. 3. Interpretar los resultados (Consultar Cuadro 2). 5.4. Medio SIM (Sulfuro-indol-movilidad) 1. Con asa bacteriolgica recta estril tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e inocular por puncin vertical en el tubo con medio de SIM. 2. Incubar a 35 2 C durante 24 h. 3. Para verificar la produccin de indol, adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento de 0.2 a 0.3 mL de reactivo de Kovacs. 4. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2). 5.5. Caldo RM-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer) 1. Con asa bacteriolgica recta estril tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e inocular el tubo con caldo RM-VP. 5.5.1. Prueba de Voges-Proskauer (VP) 1. Para la prueba de Voges-Proskauer incubar a 35 2 C durante 48 2 h. 2. Transferir a un tubo de 13 x 100 mm estril un mililitro de cultivo. 3. Adicionar a este cultivo, 0.6 mL de reactivo de VP1 (alfa-naftol etanlico al 5 %), agitar y agregar 0.2 mL del reactivo VP2 (hidrxido de potasio al 40%). 4. Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional). 5. Agitar nuevamente y dejar reposar el tubo en forma inclinada, con el objeto que la reaccin se lleve a cabo en presencia de oxgeno. 6. Interpretar los resultados despus de 2 h. de incubacin a temperatura ambiente (Consultar Cuadro 2).

5.5.2. Prueba de Rojo de Metilo 1. Para la prueba de rojo de metilo (RM) incubar a 35 2 C el resto del medio RMVP durante 48 h ms (96 h. de incubacin en total a partir de la inoculacin del medio RMVP). 2. Adicionar al medio de cultivo dos a tres gotas de solucin indicadora de rojo de metilo. 3. Agitar e interpretar los resultados en forma inmediata (Consultar Cuadro 2).

5.6. Caldo malonato (para confirmar la presencia de S. arizonae) 1. Con asa bacteriolgica recta estril, tomar crecimiento del medio TSI/KIA o LIA e inocularlo en el tubo que contiene caldo malonato. 2. Incubar a 35 2 C durante 40 2 h. 3. Interpretar los resultados despus de incubar (Consultar Cuadro 2). 5.7. Caldo manitol 1. Con asa bacteriolgica recta estril, tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e inocular en el tubo que contiene caldo manitol. 2. Incubar a 35 2 C durante 24 2 h. 3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2). NOTA Las pruebas bioqumicas se pueden interpretar en el Cuadro 2, sin embargo se sugiere que se consulten otras referencias, adems de las ya expresadas aqu, con el fin de determinar la especie del gnero en cuestin, esto quiere decir que no necesariamente se encuentre en el alimento analizado la Salmonella, pero s puede encontrarse otra Enterobacteria, el que es indispensable identificar. En este cuadro solamente se encuentran las pruebas bioqumicas ms generales de Salmonella. 6. Identificacin serolgica. 6.1. Investigacin de los antgenos somticos de Salmonella (suero anti Salmonella O polivalente). 1. Colocar con una asa bacteriolgica, dos gotas separadas de solucin salina estril (NaCl 0.85%) sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinacin. 2. Suspender en cada una de las gotas, una porcin del cultivo desarrollado en TSI/KIA o LIA. 3. Agregar a una de ellas una gota del suero anti Salmonella O polivalente y mezclar con el canto del asa o empleando aplicadores de madera. 4. Agitar inclinando la lmina, hacer girar las gotas durante aproximadamente un minuto. 5. Observar bajo una buena iluminacin y sobre un fondo oscuro la reaccin. 6. Considerar cualquier grado de aglutinacin como positiva. 7. Consultar el Cuadro 3 para la interpretacin de los resultados.

NOTAS La suspensin del cultivo en la que no se adicion el suero anti Salmonella O polivalente se considerar como el control negativo para poder interpretar el resultado. Cuando la aglutinacin es positiva con el suero anti Salmonella O polivalente, puede determinarse el subgrupo empleando sueros inmunes para los diferentes subgrupos (los mas frecuentes son B, C, D y E). Si la aglutinacin con el suero anti Salmonella O polivalente es negativa, utilizar el suero anti Salmonella Vi polivalente y efectuar la p rueba en las mismas condiciones ya descritas. Si hay aglutinacin con Vi calentar a ebullicin y repetir nuevamente la prueba con el suero anti Salmonella O polivalente. 6.2. Investigacin de los antgenos flagelares de Salmonella (suero anti Salmonella H polivalente) . 1. Para ensayo el antgeno flagelar en el mismo da, inocular el crecimiento del cultivo de TSI/KIA o LIA en agar infusin cerebro corazn (BHI). 2. Incubar a 35C durante 4 a 6 h. 3. Para ensayo del antgeno flagelar al da siguiente inocular una asada del cultivo desarrollado en el tubo de TSI o KIA, en un tubo de 13 x 100 mm conteniendo 5.0 mL de caldo soya tripticasena. 4. Incubar a 35 2 C durante 24 h. 5. Adicionar al cultivo (ya sea de agar infusin cerebro corazn o caldo soya tripticasena), 2.5 mL de solucin salina formalizada. 6. Colocar 0.5 mL del suero antiflagelar H polivalente en un tubo de ensayo para serologa (12 x 75 mm). 7. Adicionar 0.5 mL del cultivo formalizado (el obtenido en el punto 5 de este inciso). 8. Preparar un control de solucin salina mezclando 0.5 mL de solucin salina formalizada con 0.5 mL del antgeno formalizado. 9. Incubar las mezclas en bao de agua a una temperatura entre 48 y 50 C. 10. Observar en intervalos de 15 minutos por espacio de 1 hora. 11. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinacin en la muestra de prueba pero no en el control. 12. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre aglutinacin. 13. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecfica. 14. La interpretacin de los resultados se puede observar en el Cuadro 3.

CUADRO 1. Colonias tpicas de Salmonella spp. en medios slidos selectivos. MEDIO SELECTIVO Color antes de la Caractersticas inoculacin coloniales de Salmonella spp. Agar Verde Brillante Oscuro, color marrn Rosas o rojas pueden ser (VB) transparentes, rodeadas de medio enrojecido. Las bacterias fermentadoras de lactosa son amarillas Agar Sulfito Bismuto Opaco, verde plido Caf, grises o negras; con (SB) o sin brillo metlico. Algunas veces presencia de halo caf o negro. Agar Xilosa Lisina Claro, color rojo brillante Rosas o rojas pueden ser Desoxicolato (XLD) transparentes, con o sin centro negro. En algunos casos completamente negras Agar para Salmonella y Claro, color rosa Translcidas en ocasiones Shigella (SS) opacas. Algunas con centro negro. Las colonias fermentadoras de lactosa son rojas Agar entrico Hekten Oscuro, color verde Verdes o azul verdes con o sin centro negro. En algunos casos completamente negras

CUADRO 2. Reacciones bioqumicas de Salmonella.

Medio Kligler: Fermentacin Glucosa Kligler: Fermentacin Lactosa Kligler: Produccin de H2S Agar LIA: Lisin descarboxilasa Agar LIA: H2S Agar LIA: Fermentacin Glucosa Caldo Surraco: Ureasa Caldo Surraco: Fermentacin sacarosa Medio SIM: Movilidad Resultado +
c a

Color antes de inocular/incubar Naranja

Color despus de inocular/incubar Fondo tubo amarillo Crecimiento Pico de flauta naranja. Crecimiento Ennegrecimiento Crecimiento Prpura intenso Crecimiento Ennegrecimiento Crecimiento Fondo tubo amarillo Crecimiento Rosa-violeta Crecimiento Amarillo Crecimiento Crecimiento en superficie y picadura, turbiedad/difusin fuera de picadura Con reactivo Kovacs: Formacin de anillo rojo en superficie Ennegrecimiento Crecimiento Con indicador rojo de metilo: Rojo Con reactivos VP1 y VP2: Anillo rojizo Azul Crecimiento Azul Amarillo Amarillo Desarrollo Amarillo

Naranja

+ + + +

Naranja Prpura tenue Prpura tenue Prpura tenue

Rosa mexicano Rosa

Amarillo tenue. Semislido, translcido Amarillo tenue. Semislido, translcido Amarillo tenue. Semislido, translcido Amarillo tenue, translcido Amarillo tenue, translcido Verde Verde Rojo Rojo Sin desarrollo Rojo

Medio SIM: Indol

Medio SIM: H2S

Caldo RMVP: Prueba de rojo de metilo Caldo RMVP: Prueba Voges-Proskauer Agar Citrato Simmons Caldo malonato Caldo manitol rojo fenol Caldo dulcitol rojo fenol Caldo KCN Caldo manitol rojo fenol Observacin microscpica
a

+ V
a+ c

+ +

Bacilos cortos Gram-negativos, no esporulados

+,90% o ms positivos en 1 2 das;- 90% o ms negativos en 1 2 das; v, variable. b La mayora de los cultivos de S. arizonae son negativos. c La mayora de los cultivos de S. arizonae son positivos.

Excepto S. entrica serovar Pullorum y S. entrica serovar Gallinarum y cepas con flagelos disfuncionales

CUADRO 3. Reacciones serolgicas de Salmonella. Reacciones bioqumicas Reacciones serolgicas Interpretacin Tpica Antgeno O, Vi o H Cepas consideradas como Salmonella Positivo Tpica Todas las reacciones positivas Puede ser Salmonella Tpica No probada Reacciones atpicas Antgeno O, Vi o H Positivo Reacciones atpicas Todas las reacciones No debe ser considerada Salmonella negativas

RESULTADOS 1. Interpretacin de resultados. Consultar los resultados obtenidos en los cuadros para la identificacin de los gneros y especies de las bacterias investigadas. 2. Informe de resultados. Reportar presencia o ausencia de Salmonella spp. o la especie identificada en 25.0 g o mL de alimento, o en la cantidad de muestra inicialmente pesada (mayor a 25.0 g o mL).

COMPLEMENTO Preenriquecimientos especficos en diversos grupos de alimentos para la deteccin de Salmonella spp. (contina de inciso 1)
1.2. Preenriquecimiento para huevo en polvo, claras de huevo en polvo, huevos lquidos pasteurizados y congelados, frmulas infantiles y mezclas preparadas en polvo como harinas para hot cakes, galletas, donas, biquets y pan. Si el alimento est congelado, no descongelar sino hasta el momento del anlisis. Descongelar en un bao de agua a 45C agitando continuamente en un lapso de 15.0 min. aproximadamente, o bien se somete a una temperatura entre 2 y 5C durante 18.0 h.

1.2.1. Productos lquidos Realizar el preenriquecimiento como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.2.2. Productos en polvo 1. Pesar 25.0 g de muestra y transferirla a una porcin del caldo lactosado (aproximadamente 15.0 mL), para permitir la humectacin lenta del alimento. 2. Homogeneizar poco a poco con una varilla de vidrio estril y agregar ms caldo lactosado hasta completar 225.0 mL 3. Continuar igual que el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.3. Preenriquecimiento para productos no pasteurizados congelados de huevo 1. Descongelar la muestra como se indica en 1.2. 2. Pesar aspticamente y por duplicado 25.0 g de muestra. 3. Colocar una de las muestras en un matraz que contenga 225.0 mL de caldo selenito cistina 4. Colocar la segunda muestra en un matraz que contenga 225.0 mL de caldo tetrationato, sin verde brillante. 5. Ajustar si es necesario el pH a 6.8 0.2 con hidrxido de sodio 1N o cido clorhdrico 1N. 6. Al matraz que contiene el caldo tetrationato, adicionarle 2.25 mL de verde brillante al 0.1% y 4.5 mL de solucin yodo-yoduro. Mezclar bien. 7. Incubar a 35C durante 18 a 24 h, o en caso de tratarse de alimentos fuertemente contaminados incubar a 42C por el mismo periodo. 1.4. Productos que contienen huevo en su formulacin: (pastas para sopa, rollos chinos, etc.); ensaladas preparadas (jamn, huevos, pollo, atn, pavo); frutas frescas, congeladas o secas; crustceos (camarones, cangrejos, jaibas, langostinos, langostas) y pescado 1. Preferentemente no descongelar la muestra antes de su anlisis, si esto es necesario, proceder igual que en el inciso 1.2. 2. Pesar 25.0 g de muestra y adicionar 225.0 mL de caldo lactosado estril. 3. Licuar el alimento durante 2.0 min. 4. Transferir la mezcla homogeneizada en el matraz que contena el medio de preenriquecimiento. 5. Continuar con la incubacin como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.5. Leche en polvo, entera, semidescremada o descremada.

1. Seguir el procedimiento general para el pesado de la muestra y adicionarla lentamente a un matraz Erlenmayer con 225.0 mL de solucin verde brillante al 0.1%, procurando que el polvo quede en la superficie del lquido y se hidrate suavemente. 2. Dejar la mezcla en reposo por 60 min. 3. Incubar como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.6. Queso 1. Preenriquecer como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.), utilizando solucin amortiguadora de peptona como medio de cultivo. 1.7. Casena 1. Seguir la metodologa sealada en el procedimiento general (inciso 1.1.). 2. Licuar durante 2 min. 3. Ajustar cuidadosamente el pH a 6.8 0.2 1.8. Coco 1. Proceder como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.), ajustar el pH a 6.8 0.2. 2. Adicionar hasta un mximo de 2.25 mL de tergitol aninico 7 estril (121 1C/15 min.) y mezclar bien. Tambin puede utilizarse tritn X-100 estril. Usar la cantidad necesaria de estos detergentes utilizando el volumen mnimo para que se inicie la formacin de espuma. Puede ser para el tritn X-100 de dos a tres gotas. 3. Incubar como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.)

Levadura seca 1. Seguir el procedimiento general (inciso 1.1.), utilizando como medio de preenriquecimiento caldo soya tripticasena estril. 2. Mezclar para formar una suspensin homognea 3. Ajustar el pH a 6.8 0.2 4. Terminar el procedimiento como se indica en el inciso 1.1. 1.9.1. Levadura seca inactiva.

1. Continuar el enriquecimiento selectivo como se indica en el inciso 2 1.9.2. Levadura seca activa 1. Mezclar la muestra incubada (inciso 1.9.) 2. Transferir 1.0 mL a cada tubo de 10.0 mL de caldo tetrationato (con 0.2 mL de solucin yodo-yoduro de potasio y 0.1 mL de solucin de verde brillante al 0.1%) y 10.0 mL de caldo lauril-triptosa. 3. Incubar los medios de enriquecimiento a 35C por 24 h 2 h 1.10. Carnes, sustitutos de carnes, derivados crnicos, sustancias de origen animal, productos glandulares y harinas (pescado, carne y hueso) 1.10.1. Productos procesados trmicamente y productos secos. 1. 2. 3. 4. Seguir el procedimiento general (inciso 1.1.) hasta la homogeneizacin. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse. Despus de reposar, mezclar bien y ajustar el pH a 6.8 0.2. Para emulsionar las grasas, agregar los detergentes en las similares proporciones y con las mismas recomendaciones que para el coco (inciso 1.8.) La cantidad de los mismos depender en gran medida de la composicin del alimento. Los detergentes no sern necesarios en los productos glandulares en polvo. 5. Incubar las muestras como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.10.2. Productos crudos o altamente contaminados. 1. Pesar porciones de 25.0 g de producto por duplicado en dos vasos para licuadora o en dos bolsas de Stomacher. 2. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse y pesar directamente el producto en matraces Erlenmayer estriles de 500 mL. 3. Adicionar 225.0 mL de caldo selenito-cistina o 225.o mL de caldo tetrationato (sin verde brillante) a cada muestra pesada. 4. Licuar por dos min. y pasar aspticamente a matraces Erlenmayer de 500 mL. 5. Dejar reposar y ajustar el pH a 6.8 0.2 6. Adicionar al caldo tetrationato, 2.25 mL de solucin de verde brillante 0.1% y 4.5 mL de solucin yodo-yoduro de potasio 7. Mezclar el matraz con los reactivos aadidos. 8. Incubar como se describe en el procedimiento general (inciso 1.1.).

9. Continuar el enriquecimiento selectivo como se indica en el inciso 2. para muestras en general. 1.11. Dulces y dulces cubiertos (incluyendo chocolate) 1. Pesar aspticamente 25.0 g de muestra en un vaso de licuadora o bolsa de Stomacher, y agregar 225.0 mL de leche descremada reconstituida estril. 2. Licuar por dos min. 3. Continuar igual que en el procedimiento general (inciso 1.1.) hasta despus de ajustar el pH. 4. Adicionar 0.45 mL de la solucin de verde brillante al 0.1% y mezclar bien. 5. Incubar como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.12. Especias 1.12.1. Pimienta negra, pimienta blanca, semilla de apio, comino, perejil seco, romero, tomillo, chile en polvo, pprika o pimentn, ajonjol, hojuelas de vegetales (vegetales secos) 1. Pesar aspticamente 25.0 g de muestra y verter en un matraz Erlenmeyer con tapn de rosca de 500 mL con 225.0 mL de caldo soya tripticasena estril y mezclar bien. 2. Continuar con el procedimiento como en el inciso 1.1. 1.12.2. Ajo en polvo u hojuelas; cebolla en polvo u hojuelas 1. Pesar aspticamente 25.0 g de la muestra y verter en un recipiente de tapn de rosca de 500 mL con 225.o mL de caldo soya tripticasena estril adicionado con sulfito de potasio y mezclar bien. 2. Continuar con el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.12.3. Pimienta de Jamaica (Pimienta Inglesa), clavo de especia, canela y organo 1. No se conoce un mtodo para neutralizar la toxicidad de estas cuatro especias. Diluir por lo tanto ms all de su poder de toxicidad. 2. Examinar la pimienta, canela y organo en una proporcin 1:100 muestra/caldo, y el clavo a 1:1000 muestra/caldo. 3. Continuar con el procedimiento descrito en el inciso 1.12.1. 1.13. Gelatina

1. Pesar aspticamente 25.0 g de muestra en un recipiente de boca ancha y tapn de rosca de 500 mL. 2. Adicionar 225.0 mL de caldo lactosado estril con 5.0 mL de solucin acuosa de gelatinasa al 5.0% y mezclar bien. 3. Dejar reposar 60 min. 4. Continuar como en el procedimiento general (inciso 1.1.)

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