Adn Mitocondrial

ADN MITOCONDRIAL Y SU APLICACIN EN MEDICINA FORENSE
23 de noviembre de 2013
INDICE
INTRODUCCIN ............................................................................................................................ 3 1. 2. 3. 4. ORIGEN DE LA MITOCONDRIA ............................................................................................. 4 ESTRUCTURA DE LA MITOCONDRIA..................................................................................... 5 FUNCIN DE LA MITOCONDRIA ........................................................................................... 5 ADN MITOCONDRIAL:........................................................................................................... 7 4.1. 4.2. 5. CARACTERSTICAS DEL ADNmt ..................................................................................... 7 CARACTERISTICAS DE LA CARGA GENTICA MITOCONDRIAL ..................................... 8
ESTRUCTURA Y METABOLISMO DEL ADNMT ...................................................................... 9
6. REPLICACIN DEL DNA MITOCONDRIAL ................................................................................ 10 6.1 6.2 El modelo de desplazamiento de hebra ...................................................................... 10 El modelo de replicacin bidireccional y simtrica ..................................................... 11
7. EXPRESIN DEL mtDNA .......................................................................................................... 11 7.1.- Transcripcin del mtDNA ................................................................................................ 11 7.2.- Traduccin de los mRNAs mitocondriales ...................................................................... 12 7.3 Regulacin de la expresin del mtDNA : ........................................................................... 13 8. ENFERMEDADES GENTICAS DEL ADN MITOCONDRIAL (MITOCONDRIOPATIA)................. 14 8.1 Enfermedades asociadas a mutaciones puntuales en el mtDNA ................................. 15 Neuropata ptica hereditaria de Leber. .................................................................... 15 Sndrome de neuropata, ataxia y retinopata pigmentaria. ...................................... 17 Sndrome de Leigh de herencia materna .................................................................... 17 Sndrome de epilepsia mioclnica con fibras rojo-rasgadas (MERRF). ....................... 17
Sndrome de encefalomiopata mitocondrial con acidosis lctica y episodios de accidentes cerebro-vasculares (MELAS) ............................................................................. 17 Diabetes de herencia materna con sordera. ............................................................... 17
8.2 Enfermedades asociadas a reorganizaciones en el DNA mitocondrial........................... 18 Sndrome de mdula sea-pncreas de Pearson. ....................................................... 18 Oftalmoplejia progresiva externa crnica. . ................................................................ 18 Sndrome de Kearns-Sayre. ......................................................................................... 18
8.3 Enfermedades asociadas a depleciones de ADN mitocondrial ....................................... 19 Enfermedad de Huntington......................................................................................... 19 1
Universidad Nacional Federico Villareal - Escuela de Medicina Hiplito Unanue Blgo. Cesar Ortiz Rojas
Ataxia de Friedreich .................................................................................................... 20
9. ADN MITOCONDRIAL Y SU RELACION CON LA MEDICINA FORENSE .................................... 20 9.1 Importancia de la medicina legal ...................................................................................... 20 9.2 9.3 Aplicacin en En Medicina Forense: .......................................................................... 21 PROCEDIMIENTO ANALTICO. .................................................................................... 24 PREPARACIN DE LA MUESTRA ...................................................................................... 25 EXTRACCIN DEL ADN..................................................................................................... 25 AMPLIFICACIN DEL ADNMT. ......................................................................................... 25 PURIFICACIN DEL PRODUCTO DE PCR. ......................................................................... 26 SECUENCIACIN DEL ADNMT......................................................................................... 26 PURIFICACIN DEL PRODUCTO DE SECUENCIACIN. ................................................... 27 ELECTROFORESIS............................................................................................................. 27 GUA DE INTERPRETACIN. ............................................................................................ 28
10. ANEXOS : ............................................................................................................................... 29 BIBLIOGRAFIA ............................................................................................................................. 35

INTRODUCCIN
Las mitocondrias despus del ncleo, es uno de los organelos de mayor tamao es la mitocondria, mismo que, aparentemente derivado de otras clulas por medio de un proceso endosimbitico, constituye la central energtica celular, gracias a una nica disposicin de protenas que permiten una mayor extraccin de energa a partir del metabolismo. Las mitocondrias son orgnulos subcelulares cuya misin principal es la produccin de energa en forma de ATP. Aparte de su funcin energtica, la mitocondria cumple con otras importantes tareas, las cuales la convierten en un organelo nico, del cual tratar esta revisin. Estos orgnulos contienen su propio sistema gentico que codifica un nmero pequeo de protenas que forman parte del sistema de fosforilacin oxidativa. El resto de las protenas mitocondriales estn codificadas en el ncleo. La biognesis de la mitocondria requiere la expresin coordinada de los dos sistemas gen ticos celulares, el nuclear y el mitocondrial. Los genes estn dispuestos en el DNA mitocondrial humano de una forma compacta y no contienen intrones. Se conocen bastante bien los mecanismos bsicos de replicacin y transcripcin del DNA mitocondrial, as como los elementos y protenas implicadas. La mitocondria posee, asimismo, su propia maquinaria para la sntesis de las protenas codificadas en su genoma. La gen tica del DNA mitocondrial difiere de la del DNA nuclear en una serie de propiedades. En particular, el genoma mitocondrial se hereda exclusivamente de la madre que lo transmite a todos sus hijos. En los ltimos aos, se han descubierto mutaciones en el DNA mitocondrial que originan enfermedades causadas por defectos en el sistema de fosforilacin oxidativa. Nuestro grupo de investigacin ha tenido una participacin muy intensa y definitiva en la obtencin del conocimiento bsico sobre la expresin del genoma mitocondrial y en el estudio de las enfermedades mitocondriales. PALABRAS CLAVE: Mitocondria; DNA mitocondrial; Expresin Gentica; Herencia Materna; Enfermedades mitocondriales

MITOCONDRIA BIOGNESIS MITOCONDRIAL
La mitocondria es un orgnulo que est presente en el citoplasma de las clulas eucariotas, cuya funcin principal en la mayora de tejidos es la de proveer energa en forma de ATP, a partir de la oxidacin de sustratos energticos por parte de la cadena respiratoria. La poblacin mitocondrial es dinmica y muestra variaciones en el tamao, el nmero y la masa durante las diversas etapas del desarrollo, la diferenciacin celular y en respuesta a diversas situaciones fisiolgicas y patolgicas (Goffart and Wiesner, 2003). En el fenmeno de biognesis mitocondrial confluyen dos procesos ntimamente ligados: la proliferacin que consiste en el aumento del nmero de mitocondrias por clula, y la diferenciacin, mediante la cual el orgnulo adquiere las caractersticas estructurales y funcionales adecuadas para el desarrollo de las funciones especficas de las distintas clulas del organismo (Nisoli et al., 2004). En el control de la biognesis mitocondrial participan numerosos factores, como la regulacin de la expresin y la replicacin del genoma mitocondrial, la expresin y el transporte a la mitocondria de diversas protenas codificadas por genes nucleares, y la coordinacin de todos estos procesos. 1. ORIGEN DE LA MITOCONDRIA
1.1. Teora endosimbitica seriada: La cientfica estadounidense Lynn Margulis, junto con otros cientficos, recuper en torno a 1980 una antigua hiptesis, reformulndola como teora endosimbitica. Segn esta versin actualizada, hace unos 1.500 millones de aos, una clula procariota capaz de obtener energa de los nutrientes orgnicos empleando el oxgeno molecular como oxidante, se fusion en un momento de la evolucin con otra clula procariota o eucariota primitiva al ser fagocitada sin ser inmediatamente digerida, un fenmeno frecuentemente observado. De esta manera se produjo una simbiosis permanente entre ambos tipos de seres: la procariota fagocitada proporcionaba energa, especialmente en forma de ATP y la clula hospedadora ofreca un medio estable y rico en nutrientes a la otra. Este mutuo beneficio hizo que la clula invasora llegara a formar parte del organismo mayor, acabando por convertirse en parte de ella: la mitocondria. Otro factor que apoya esta teora es que las bacterias y las mitocondrias tienen mucho en comn, tales como el tamao, la estructura, componentes de su membrana y la forma en que producen energa, etc. Esta hiptesis tiene entre sus fundamentos la evidencia de que las mitocondrias poseen su propio ADN y est recubierta por su propia membrana. Otra evidencia que sostiene esta hiptesis es que el cdigo gentico del ADN mitocondrial no suele ser el mismo que el cdigo gentico del ADN nuclear.[21] A lo largo de la historia comn la mayor parte de los genes mitocondriales han sido transferidos al ncleo, de tal manera que la mitocondria no es viable fuera de la clula husped y sta no suele serlo sin mitocondrias. Esta explicacin del origen de las mitocondrias recibe el nombre de teora endosimbitica celular. La divisin mitocondrial se realiza igual que la divisin bacteriana, por biparticin. Las mitocondrias que contiene un organismo, son aportadas por la clula femenina que interviene en la fecundacin. La clula masculina no aporta mitocondrias.

2. ESTRUCTURA DE LA MITOCONDRIA
La mitocondria es un organelo apenas visible al microscopio ptico, formado por dos membranas, interna y externa, que determinan la existencia de dos compartimientos (ver representacin esquemtica adjunta), de los cuales el mayor y ms interno se conoce como matriz mitocondrial, la cual presenta una densidad mayor que el espacio intermembrana a la microscopa electrnica. Tiene una forma variable y se presenta como bastones, grnulos o filamentos, siendo la primera de las mencionadas la forma ms comn (forma de salchicha). Tamao: vara ampliamente segn la especie y el tipo celular, pudiendo oscilar entre 0,2 y 10 m. La membrana interna: presenta mltiples reticulaciones o invaginaciones llamadas crestas mitocondriales (lamelares, tubulares o reticulares), que permiten aumentar la superficie para realizar diversas reacciones y que se encuentran tapizadas de pequeos salientes llamados partculas elementales, que corresponden a molculas de sintetasa de ATP; esta doble membrana es parte de la evidencia que llev a la hiptesis endosimbitica de origen de estos organelos. Las mitocondrias poseen su propio material gentico (ADN mitocondrial o ADNmt) y sus propios ribosomas, los cuales son ms semejantes a los bacterianos que a los eucariticos; en particular, es de destacar que, aunque pueden presentarse algunas copias en forma lineal, el ADNmt es generalmente circular y no se relaciona con protenas de tipo histona y se presenta en pequeos acmulos puntiformes de 4-5 copias que se conocen como nucleoides. Dada la alta tasa de mutacin del ADNmt, a veces se produce una condicin conocida como heteroplasmia, con coincidencia de genomas salvajes y mutantes. El genoma de las mitocondrias humanas contiene unos 17 Kbp de ADN, con organizacin circular; este material codifica para los siguientes productos: 2 molculas de ARN ribosomal (12S, 16S). 22 molculas de ARN de transferencia 13 polipptidos, que participan en la composicin de diversos complejos protenicos de la membrana mitocondrial interna: 7 subunidades que contribuyen a la formacin de la NADH-CoQ reductasa mitocondrial Subunidades 1, 2 y 3 de la Citocromo oxidasa 2 subunidades de ATP sintetasa Apocitocromo b Todos estos productos genticos son usados en la mitocondria, pero la misma requiere tambin de protenas codificadas por genes nucleares (citocromo c, polimerasas, etc.), que son sintetizadas en el citosol, requiriendo de sofisticados procesos de importacin, los cuales son tambin necesarios para la obtencin de la mayor parte de los lpidos y para obtener una fraccin ribosomal 5S, cuya funcin se desconoce an (Childs, 1998; Kimball, 2001). La distribucin de las mitocondrias dentro de las clulas es generalmente bastante uniforme y aunque existen en promedio unas 2000 por clula en aquellas clulas que desarrollan trabajos muy intensos, como las musculares, tiene un nmero mucho mayo. 3. FUNCIN DE LA MITOCONDRIA
La funcin ms caracterstica que se asocia a estos organelos es la de la produccin aerbica de la energa, a travs de la oxidacin completa del AcetilCoA (ciclo de Krebs) y una subsecuente cascada de reacciones de xido-reduccin y transporte electrnico conocidas como fosforilacin oxidativa, las cuales generan un gradiente de protones en la membrana mitocondrial interna que se utiliza como fuerza motriz para la sntesis de ATP (Kowaltowski, 2000; Saraste, 1999). Este proceso no slo genera la energa necesaria para mantener el metabolismo celular a travs de la produccin de ATP, sino que medio el mantenimiento del propio metabolismo mitocondrial en formas que, en su mayor parte, estn asociados a los mismos gradientes protnicos que generan la fosforilacin.
Sin embargo, a pesar lo indiscutible de esta funcin como la principal ejercida por las mitocondrias, estos organelos poseen otras que son dignas de mencin (Kowaltowski, 2000). Entre ellas, se encuentra la termognesis, funcin que se da aparentemente a travs del desacoplamiento parcial de la cadena respiratoria, mediado por protenas desacopladoras especficas y que se manifiesta principalmente en el neonato. En segundo lugar, aparte de mantener el eflujo de energa necesario para mantener el intercambio de calcio con el medio extracelular y mantener la concentracin intracelular a niveles relativamente constantes, la mitocondria participa directamente en la homeostasis de este in, por medio de intercambiadores con protones. Como consecuencia del transporte electrnico, la mitocondria es el principal sitio celular de origen de especies reactivas de oxgeno, las que pueden participar en el desencadenamiento de la muerte en las clulas necrticas. Adems, las mitocondrias tienen una participacin muy activa en el proceso de muerte celular programada, la apoptosis (Susin y col, 1998). 3.1. Papel de las Mitocondrias en la Obtencin de Energa: Ciclo de Krebs - Fosforilacin Oxidativa. El producto ms importante de la degradacin de carbohidratos, lpidos y protenas es el acetilCoA, que contina su proceso de oxidacin hasta convertirse en CO2 y H2O, mediante un conjunto de reacciones que constituyen el ciclo de Krebs, punto central donde confluyen todas las rutas catablicas de la respiracin aerobia. Este ciclo se realiza en la matriz de la mitocondria. En este ciclo se consigue la oxidacin total de los dos tomos de carbono del resto acetilo, que se eliminan en forma de CO2; los electrones de alta energa obtenidos en las sucesivas oxidaciones se utilizan para formar NADH Y FADH2, que luego entrarn en la cadena respiratoria. Para que se pueda producir la sntesis de ATP acoplada a la oxidacin del NADH y la reduccin del O2, se requiere que se produzca la secuencia de los siguientes pasos clave (Latham y col, 2001; Saraste, 1999): Transferencia de electrones desde el NADH, a travs de una serie de transportadores, hasta el oxgeno molecular. Estos transportadores de electrones son protenas incluidas en la membrana mitocondrial interna, a saber: NADH-Q reductasa, Ubiquinona (Q), citocromo reductasa, citocromo c, y citocromo oxidasa. Generacin de un gradiente protnico a travs de la membrana mitocondrial interna, lo que se logra gracias al hecho de que tres de los componentes de la cadena de transporte (NADH-Q reductasa y citocromo oxidasa) funcionan tambin como bombas protnicas. Difusin exergnica de protones hacia la matriz mitocondrial, acoplada a la sntesis de ATP (esquema)
3.2. Papel de las Mitocondrias en la Homeostasis del Calcio. En primera instancia, las mitocondrias tienen participacin en la homeostasis celular del Calcio por medio del aporte de energa para los intercambiadores de la membrana plasmtica y del retculo endoplsmico. Sin embargo, tambin pueden tener un papel directo en la homeostasis del in, ya que la mitocondria puede acumular Calcio gracias a un la presencia de un unitransportador, cuya energa viene aportada por un adecuado potencial de membrana. 3.3. Papel de las Mitocondrias en la Termorregulacin. Las mitocondrias en el tejido adiposo pardo se comportan de manera diferente a las de otros tejidos, ya que sus membranas internas son especialmente permeables a los protones, por la presencia de protenas desacopladoras (UcP); esto hace que parte de la energa almacenada por el transporte electrnico y almacenada como potencial de membrana se libere en forma de calor al regresar los protones a la matriz mitocondrial, con disminucin de sntesis de ATP. 3.4. Papel de las Mitocondrias en la Apoptosis.
En general, la apoptosis se puede considerar como dividida en cuatro fases principales, aunque las mismas ocurren realmente sin solucin de continuidad, en el curso de 30 a 60 minutos. Estas fases son las siguientes: Inicio de seales de estrs, proceso que incluye la sensibilizacin de un arreglo muy diverso de molculas regulatorias que ulteriormente transmitirn esas seales hacia la mitocondria. Decisin a nivel molecular en la mitocondria acerca de la muerte o no de la clula; este paso est mediado por el grupo especial de protenas de la familia Bc1-2 La (Adams y Cory, 1998). Esta decisin es irreversible. La tercera fase est mediada por los ejecutores de la apoptosis, las caspasas (Cohen, 1997; Thornberry y Lazebnik, 1998), que inducen cambios morfolgicos y bioqumicos que a su vez originan una sealizacin mltiple que permite a las clulas vecinas el reconocer a la clula apopttica como material fagocitable. La ltima fase, rpida y difcil de observar in situ, es la remocin de la clula apopttica, producida sin desencadenar respuesta inflamatoria. La apoptosis puede desencadenarse por procesos inductores , como la liberacin de mediadores (TNF-alfa, corticoides, neurotransmisores como la glutamina y el NMDA), el shock trmico, infecciones, activacin de oncogenes y diversos efectos txicos de drogas (quimioterpicos diversos, etanol, pptido beta-amiloide); tambin puede inhibirse por factores mltiples, como factores de crecimiento o de hormonas sexuales, la accin de algunos genes virales (adenovirus E1B, Baculovirus) y ciertos agentes farmacolgicos (Hidalgo y Vieiro, 1999). Los mecanismos generales por los cuales las mitocondrias median la muerte celular son los siguientes: Disrrupcin del transporte electrnico y del metabolismo energtico: esto implica la cada de la produccin de ATP, aunque es un evento relativamente tardo en la apoptosis, ocurriendo mucho despus de la disrrupcin propiamente dicha.
Liberacin de protenas activadoras de caspasas: entre otras, el citocromo C, que formar parte luego de los apoptosomas (cuerpos citoslicos vesiculares), que adems contienen Apaf-1 (factor 1 activador de proteasas antiapoptticas) y procaspasa-9. La liberacin masiva de Citocromo c es el punto de no retorno de la apoptosis. ADN MITOCONDRIAL:
4.
El ADN mitocondrial (ADNmt) es una molcula circular y cerrada que se localiza en el interior de las mitocondrias celulares, orgnulos responsables del metabolismo energtico celular generando ATP a travs del proceso de fosforilacin oxidativa. La secuencia completa del genoma mitocondrial fue descrito por primera vez por Anderson et. al. en 1981 (Anderson et. al. en 1981). Su tamao es de aproximadamente 16.569 pb, y est formado por dos hebras complementarias: la cadena pesada o H (Heavy), ricas en bases pricas; y la cadena ligera o L (ligth), con mayor proporcin de bases pirimidnicas (Figura 8). 4.1. CARACTERSTICAS DEL ADNmt Es circular, carece de histonas y se replica a partir de un solo punto de origen. Es muy pequeo. En casi todos los tipos celulares la suma de los ADN tomados de todas las mitocondrias representa no ms del 1 % del ADN nuclear. Posee muy pocas y la vez muy cortas secuencias no escenciales.

No posee intrones. Genera 22 tipos de ARN, en lugar de ellos 31 transcribe el ADN nuclear.
Los dos tipos de ARN, que codifica (12s y 16s) da lugar a ribosomas con un coeficiente de redimentacin de 55s, inferior al de los ribosomas citosolicos (80s) y el de los procariotas (70s). Se transcriben sus dos cadenas. Casi todos los ARNm, 14 ARNt y los ARNr residen en una de las cadenas, mientras que 8 ARNt y las restantes ARNm pertenecen a la otra. Apenas las molculas de ARN se sintetizan son procesados. Las mitocondrias poseen varias copias de un mismo ADN y nos dos como el ADN nuclear.
4.2. CARACTERISTICAS DE LA CARGA GENTICA MITOCONDRIAL La transmisin del ADNmt es un fenmeno complejo que es an bastante poco conocido. El alto nmero de copias, su compartimentalizacin en organelas y su organizacin en nucleoides dentro de la mitocondria, contribuye a su complejidad. Son varias las caractersticas que diferencian la gentica mitocondrial de la nuclear, descritas a continuacin: 4.2.1. Herencia materna
La herencia del ADNmt es exclusivamente materna. Normalmente el ADNmt paterno es etiquetado con una cola de ubiquitina que involucra un rpido proceso de proteolisis cuando ste entra en el oocito. Debido al tipo de herencia, una mutacin en el ADNmt puede afectar a ambos sexos por igual. En general, una madre que porte una mutacin en su ADNmt puede transmitirla a su descendencia, pero slo sus hijas la transmitirn a la siguiente generacin. Hay, sin embargo, un nico caso de un paciente con una enfermedad mitocondrial que procede del ADNmt paterno. En este caso los niveles de ADNmt paterno en msculo esqueltico del paciente eran del 90%, suficientemente alto para la manifestacin de la patologa. 4.2.2. Poliplasmia, homoplasmia y heteroplasmia
Cada clula humana, dependiendo de su requerimiento energtico, contiene cientos de mitocondrias, y cada una de ellas un nmero de copias que vara de 5 a 10, por tanto existen en cada clula de 1.000 a 10.000 copias de ADNmt, fenmeno llamado poliplasmia. Durante la divisin celular, si una clula posee dos poblaciones de mitocondrias, con ADNmt con la secuencia consenso y ADNmt mutado, las clulas hijas podrn ser de 3 tipos: clulas hijas normales, todas ellas con un ADNmt normal, en cuyo caso hablaremos de homoplasmia normal; clulas en las que todas sus mitocondrias porten ADNmt mutado, en cuyo caso hablaremos de homoplasmia mutante y clulas que porten los dos tipos de mitocondrias, normales y mutantes, en cuyo caso las definiremos como heteroplsmicas. El grado de heteroplasmia es el producto de una aparente segregacin al azar de ambos tipos de ADNmt durante la embriognesis temprana. 4.2.3. Segregacin mittica y transmisin del ADNmt
Cuando las clulas se dividen, las mitocondrias se transmiten a las clulas hijas de forma aleatoria, fenmeno conocido como segregacin mittica. La segregacin de las mitocondrias se crea que era un proceso estrictamente al azar, pero algunos autores han demostrado que ocurre de una forma especfica, en funcin del tejido y bajo un control nuclear. Poco es conocido sobre los mecanismos de transmisin de ADNmt en humanos. Se sabe que en ratones hembra con un ADNmt heteroplsmico ste se transmite de forma neutral a su descendencia, y la variabilidad de dicha descendencia est en gran medida determinada por una segregacin aleatoria. Se cree que una restriccin en el nmero de molculas de ADNmt en la ovognesis temprana est detrs
de este proceso, lo que se conoce como hiptesis de cuello de botella. La teora de cuello de botella fue propuesta por Ashley y colaboradores (Ashley MV et al., 1989). Ellos encontraron en vacas Holstein que el grado de heteroplasmia podra cambiar en una sola generacin y que en dos o tres generaciones puede llegar a dar lugar a un ADNmt homoplsmico. De acuerdo con esta teora, el ADNmt de una pocas mitocondrias seran selectivamente amplificado en el proceso de ovognesis y, por tanto, un genotipo puede llegar a ser predominante y fijo en futuras generaciones (Brown DT et al., 2000). Como resultado, una mujer puede albergar un defecto en su ADNmt que sea patognico y puede transmitir bajos niveles de dicho ADNmt mutante a algunos descendientes y los altos niveles a otros. Algunos de los descendientes pueden verse gravemente afectados, mientras algunos se quedan asintomticos durante toda su vida. 4.2.4. Efecto umbral
La expresin fenotpica de una mutacin patognica del ADNmt no sigue las reglas de la gentica mendeliana y depende generalmente de la proporcin de ADNmt mutado que existen en un tejido en particular. El efecto umbral representa la proporcin mnima de ADNmt mutado necesaria para alterar el metabolismo oxidativo y suficiente para que se produzca una disfuncin en un determinado rgano o tejido. Este concepto es un tanto relativo ya que el nmero de genomas mitocondriales necesarios para producir una disfuncin celular vara de tejido a tejido, en funcin de su dependencia del metabolismo oxidativo. 5. ESTRUCTURA Y METABOLISMO DEL ADNMT
La mitocondria posee su propio genoma independiente del ADN nuclear (ADNn), en un nmero de copias que vara de 5 a 10. El ADNmt humano es una molcula circular de doble cadena de 16.569 pares de bases (pb) (Anderson S, 1981) cuya composicin de nucletidos de las dos cadenas es diferente; una de ellas es rica en residuos de guanina y timina y se denomina cadena pesada (H), mientras que la otra se denomina ligera (L). Esta nomenclatura viene dada por la diferente movilidad que presentan las cadenas separadas en un gradiente desnaturalizante de cloruro de cesio. El genoma mitocondrial es compacto: los genes estructurales no poseen zonas ni 5 ni 3 no traducidas (UTRs), no contienen intrones y los espacios intergnicos son mnimos, llegando, en algunos casos, al solapamiento de genes consecutivos. Slo existen dos regiones no codificantes en el ADNmt: Una regin de ~1 Kilobases que se denomina D-loop o bucle-D, en mamferos, donde se localizan el origen de replicacin de la cadena pesada (OH) y los promotores a partir de los cuales se inicia la transcripcin mitocondrial (ITL1, ITH1 y ITH2) Y otra regin de ~30 nucletidos localizada en el interior de un cluster a dos tercios desde el Dloop.
El genoma mitocondrial codifica 37 genes, 28 de los cuales son codificados por la cadena pesada y 9 por la ligera. Estos genes codifican: 13 polipptidos que forman parte del sistema OXPHOS, 2 ARN ribosmicos (ARNr 12S y 16S) y 22 ARN de transferencia (ARNt). El resto de los aproximadamente 1500 genes que dan lugar al proteoma mitocondrial estn codificados en el ncleo, son traducidos por ribosomas citoplsmicos y transportados a la mitocondria a travs de diversos sistemas de importacin de protenas. El ADNmt se encuentra formando parte de complejos nucleoproteicos asociados a la membrana interna mitocondrial denominados nucleoides. Dichos nucleoides se consideran la unidad de transmisin y herencia del ADNmt. El factor de transcripcin mitocondrial A (TFAM o mtTFA), la protena
de unin al DNA de hebra nica (mtSSB), la helicasa Twinkle y la DNA polimerasa gamma (POLG), adems de otras protenas todava no identificadas, forman parte de estos nucleoides. El genoma mitocondrial se replica y transcribe en el organelo. Los elementos cis-responsables de la regulacin de estos procesos estn localizados en la regin D-loop del ADNmt. Sin embargo, todos los factores trans-activadores son codificados en el ncleo.
6. REPLICACIN DEL DNA MITOCONDRIAL 6.1 El modelo de desplazamiento de hebra Este modelo, segn el cual la replicacin del mtDNA es unidireccional y asimtrica, fue propuesto para explicar los datos obtenidos a partir de estudios de microscopia electrnica (8). El modelo sugiere que las dos hebras del mtDNA se replican, de forma continua, a partir de dos orgenes de replicacin (OH y OL) ampliamente separados y requiere un desplazamiento extenso de una de las hebras del DNA parental durante la sntesis de la hebra H. Este proceso comenzara con la sntesis de un RNA cebador por la RNA polimerasa (RNApol) (9). Para que esta pueda acceder al DNA molde y comience la replicacin del mtDNA, se requiere un cambio conformacional en la molcula de DNA que consiste en su inclinacin y desenrollado inducido por la unin del factor de transcripcin mtTFA (TFAM) al dplex de DNA. La topoisomerasa de tipo I, especifica de organelo, relaja entonces el DNA superenrrollado rompiendo temporalmente enlaces en el esqueleto del DNA y la helicasa mitocondrial desenrolla la doble hebra, rompiendo los enlaces de hidrogeno que mantienen ambas cadenas juntas, para producir moldes de hebra nica. Una protena de unin al DNA de hebra nica (mtSSB) mantiene la integridad de los intermediarios replicativos previniendo su renaturalizacin y acelera la velocidad de sntesis de DNA. Recientemente, se han descrito dos nuevos factores de transcripcin (TFMB1 y 2), que forman heterodmeros con la RNApol activndola. Para el cebado de la replicacin, RNApol transcribe un fragmento empezando en el promotor de la hebra L. La transicin de RNA a DNA tiene lugar en el origen de replicacin de la hebra H (OH) donde el cebador precursor se escinde por una endonucleasa procesadora del RNA mitocondrial (RNase MRP). La elongacin de la hebra naciente de DNA se lleva a cabo por la DNA polimerasa gamma (DNApol gamma POLG) que consta de dos subunidades, una cataltica con actividades de polimerizacin 5 -3 y exonucleoltica 3-5, y una segunda, la subunidad accesoria pequea (b), que se une al DNA de doble hebra, incrementando la afinidad de la enzima por el DNA confirindole prosesividad a la subunidad cataltica y, adems, est implicada en el reconocimiento del cebador. La mayora de eventos de inicio de la sntesis de la hebra H terminan prematuramente despus de aproximadamente 700 nucletidos y tras una secuencia conocida como secuencia asociada a la terminacin (TAS). As, parece que los niveles de terminacin de la replicacin juegan un papel importante en la regulacin del nmero de copias de mtDNA. La terminacin prematura de la replicacin provoca la aparicin de una estructura conocida como bucle de desplazamiento (D-loop) que consiste de la porcin de DNA dplex recin sintetizada ms la hebra H parental desplazada. Cuando la hebra H naciente es capaz de pasar a travs de la regin de terminacin prematura, su elongacin contina de forma unidireccional hasta que, despus de recorrer dos tercios de la molcula, desplaza una secuencia de la hebra H parental capaz de establecer una estructura lazo-tallo que constituye el origen de replicacin de la hebra L (OL) y sirve como regin de reconocimiento de una DNA primasa, especifica de mitocondrias, que sintetizar un cebador corto de RNA y despus la POLG alongar la cadena de forma unidireccional y en sentido contrario al de la hebra
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H naciente(10,11). Al final del proceso de replicacin, la topoisomerasa de tipo II introduce los superenrollamientos que mantendrn la molcula en un estado funcional. En este modelo de replicacin asimtrica, la sntesis de DNA es continua en ambas hebras y carece de fragmentos de Okazaki. 6.2 El modelo de replicacin bidireccional y simtrica La investigacin sobre los procesos fundamentales que tienen lugar en la mitocondria no se pueden dar por concluidos. Una prueba importante es que, recientemente, se ha puesto en duda el modelo de replicacin de desplazamiento de la hebra y que ahora, basndose en una tcnica que utiliza geles bidireccionales, se ha propuesto que el mtDNA se replica de un modo bidireccional y simtrico desde un nico origen de replicacin, a semejanza con el DNA bacteriano (12,13). Este nuevo modelo, que est tomando bastante fuerza, no explica la mayora de datos que hasta ahora se haban obtenido explicando el modelo anterior.
7. EXPRESIN DEL mtDNA 7.1.- Transcripcin del mtDNA El modelo de expresin de la informacin codificada en el mtDNA fue establecido a comienzos de los 80, fundamentalmente en el laboratorio del Dr. Giuseppe Attardi en el Instituto de Tecnologa de California (Caltech). De acuerdo con este modelo, la transcripcin del mtDNA se inicia a partir de tres promotores diferentes, uno para la cadena ligera (L) y dos para la cadena pesada (H1 y H2), que darn lugar a tres molculas policistrnicas largas que se procesarn por cortes endonucleolticos precisos delante y detrs de los tRNAs, que actuando como seales de reconocimiento para las enzimas de procesamiento, al adquirir la configuracin en hoja de trbol en las cadenas nacientes de RNA, dan lugar a los rRNAs, tRNAs y mRNAs maduros(14-18). La cadena ligera se transcribe mediante una nica unidad de transcripcin que empieza en el lugar de iniciacin L, cerca del extremo 5 del RNA 7S (poli(A) -RNA 18) (19), dando lugar a 8 tRNAs y al nico mRNA(ND6) codificado en esa cadena. El inicio de la sntesis de DNA depende tambin de la actividad de esta unidad de transcripcin que sintetiza el cebador de la replicacin. La poliadenilacin de este corto RNA quizs pueda participar en la regulacin de la frecuencia de inicio de la sntesis de mtDNA. La cadena pesada se transcribe mediante dos unidades de transcripcin solapadas en la regin de los rRNAs(20). La primera, que se transcribe muy frecuentemente, comienza en el lugar de iniciacin H1, situado por delante del gen tRNAPhe, termina en el extremo 3 del gen para el rRNA 16S y es responsable de la sntesis de los rRNAs 12S y 16S, del tRNAPhe y del tRNAVal. Un factor de terminacin (mTERF) acta unindose en el gen del tRNALeu en una secuencia inmediatamente posterior al gen del rRNA 16S.El segundo proceso de transcripcin, mucho menos frecuente que el anterior, comienza en el punto de iniciacin H2, cerca del extremo 5 del gen rRNA 12S, se extiende ms all del extremo 3 del gen rRNA 16S (21-23) y produce un RNA policistrnico que corresponde a casi la totalidad de la cadena pesada. Los mRNAs de los 12 pptidos y 14 tRNAs, codificados en esta cadena, se originan por procesamiento de este RNA policistrnico. Para llevar a cabo este proceso de transcripcin se necesita una RNA 15polimerasa especifica (h-mtRPOL), codificada en el DNA nuclear (nDNA) (24,25), dos factores de transcripcin implicados en la iniciacin (mtTFA y mtTFB) (26,27), y uno determinacin (mTERF) todos ellos codificados en el nDNA. El modelo de transcripcin descrito muestra como la iniciacin juega un papel muy importante en la regulacin de la expresin gnica y explica el modo de sntesis diferencial de rRNAs y mRNAs. En esta regulacin parece jugar tambin un papel muy importante la fosforilacin del factor de terminacin Mterf(28)
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Como se deduce del modelo anterior, las dos cadenas del DNA se transcriben completa y simtricamente y los productos de transcripcin del DNA mitocondrial humano aislados incluyen los 2 rRNAs (rRNA 12S y 16S), su precursor, los tRNAs y 18 RNAs poliadenilados en el extremo 3 (poli(A) RNAs), la mayora de los cuales corresponden a los RNA mensajeros (mRNAs). La mayor parte de los RNAs maduros corresponden a un nico gen. Sin embargo dos de ellos, los mRNAs de los genes para las subunidades 6 y 8 de la ATP sintasa y ND4 y 4L, contienen dos genes cada uno con el marco de lectura solapado. Los tres poli(A)-RNAs mayores (RNAs 1, 2 y 3) y el menor (RNA 18), as como 8 tRNAs, son productos de transcripcin de la cadena ligera del DNA mitocondrial mientras que el resto lo son de la cadena pesada.El anlisis estructural de los RNAs mitocondriales mostr unas caractersticas muy nicas. As, los rRNAs se caracterizan por estar metilados, aunque el grado de metilacion es ms bajo que el de los rRNAs citoplsmicos, y por estar oligoadenilados en su extre mo 3 con 1 a 10 adeninas no codificadas en el DNA. Los tRNAs, en general ms pequeos que sus homlogos del citoplasma, tienen un tamao que vara entre 59 y 75 nt y su estructura presenta numerosas desviaciones con respecto al modelo considerado como invariable de los sistemas no mitocondriales. As, la mayora de los tRNAs carecen de los nucletidos constantes y el tamao del bucle DHU vara considerablemente llegando incluso a desaparecer en el tRNASer(AGY). Aparte del CCA del extremo 3, no codificad o en el DNA, la nica regin que ha conservado las caractersticas generales de los tRNAs es la regin del anticodn. Con la excepcin del tRNASer(AGY), todos los tRNAs mitocondriales pueden plegarse en la caracterstica hoja de trbol. Sin embargo, parece que estos tRNAs se estabilizan con menos interacciones terciarias que los tRNAs citoplsmicos. Los 13 polipptidos codificados en el mtDNA tienen un tamao que vara entre 70 y 610 aminocidos. Los mRNAs que los codifican contienen exclusivamente la secuencia del patrn de traduccin y una cola de unos 55 adenosinas en el extremo 3. Los mRNAs mitocondriales humanos comienzan directamente por el codn de iniciacin AUG, AUA o AUU o tienen muy pocos nucletidos delante de los mismos. Carecen por tanto de uno de los caracteres tpicos de los mRNA de otros sistemas, como es la presencia de un tramo no codificante en el extremo 5. Tampoco contienen la capucha en el extremo. 7.2.- Traduccin de los mRNAs mitocondriales Los mRNA mitocondriales se traducen en el interior de las mitocondrias. Estos orgnulos contienen ribosomas especficos con los componentes proteicos (78 protenas ribosmicas) codificados en el nDNA y los RNA en el mtDNA. La economa gentica del mtDNA tambin ha propiciado otras caractersticas especiales en los sistemas de traduccin. Los rRNAs son ms pequeos que los citoslicos o procariticos y se han reclutado nuevas protenas para sustituir las funciones perdidas con los segmentos de rRNA eliminados. As, los ribosomas mitocondriales son especialmente ricos en protenas. Por otra parte, el cdigo gentico utilizado por la mitocondria es algo diferente del cdigo universal. As, en la mitocondria humana el codon UGA codifica triptfano en lugar de ser uno de los codones de terminacin, los codones AUA y AUU se utilizan, al igual que AUG, como codones de iniciacin, y AGA y AGG, codones de arginina en el cdigo universal, son seales de terminacin. Los polipptidos sintetizados en la mitocondria interaccionan con los componentes del sistema OXPHOS codificados en el nDNA, sintetizados en ribosomas del citosol e importados a la mitocondria para producir el sistema OXPHOS. As, la biognesis de este sistema depende de la expresin coordinada de los genomas mitocondrial y nuclear. Muchas protenas de localizacin mitocondrial se traducen en polisomas unidos a la membrana externa mitocondrial. Las secuencias 3-UTR de estos genes contienen seales que dirigen estos mRNAs
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a la mitocondria. Curiosamente, estos genes tienen mayoritariamente un origen procaritico mientras que los genes traducidos en polisomas libres son de origen eucaritico. De un modo anlogo, los mRNAs mitocondriales tambin parecen que se traducen en ribosomas unidos a la membrana interna mitocondrial. Se ha demostrado que el dominio carboxi terminal de la protena Oxa1 se une al ribosoma mitocondrial y acopla fsicamente el aparato de traduccin mitocondrial al complejo de insercin en la membrana interna. 7.3 Regulacin de la expresin del mtDNA : A pesar del gran conocimiento que se ha llegado a obtener sobre el mtDNA y su expresin, se tiene muy poca informacin acerca de la regulacin de su expresin y de la coordinacin con la expresin del genoma nuclear. Para el estudio de la regulacin de la expresin del genoma mitocondrial se puso a punto una metodologa de trabajo consistente en utilizar a las mitocondrias aisladas como modelo de trabajo in vitro. Esta tcnica permita trabajar con mitocondrias libres de la influencia del ncleocitoplasma y, por tanto, poder estudiar la accin directa de distintos efectores sobre la transcripcin mitocondrial. En primer lugar se comprob que las mitocondrias aisladas transcriben el mtDNA y procesan el RNA de un modo similar a como sucede in vivo. Con este modelo se ha demostrado que las mitocondrias son capaces de mantener su capacidad transcripcional durante varias horas despus de ser aisladas de su entorno celular, y de modular la transcripcin en respuesta a situaciones fisiolgicas tales como la demanda energtica celular, la falta de aporte de factores citoplsmicos, u hormonas (29,30). En particular se ha demostrado que las hormonas tiroideas tienen un efecto directo sobre la transcripcin mitocondrial regulando los niveles de mRNA y rRNA mediante la seleccin del lugar de iniciacin de la transcripcin en H1 o H2. Asimismo, se ha visto que la regulacin posttranscripcional de la expresin gnica mitocondrial incluye el procesamiento de los transcritos primarios (3) y la estabilidad diferencial de los transcritos maduros (31). Como se ha indicado, la regulacin transcripcional puede realizarse a nivel de iniciacin pero tambin a nivel de terminacin del proceso.
En este ltimo aspecto, recientemente se ha demostrado que el control de la sntesis de rRNA se verifica tambin por fosforilacin del factor de terminacin mTERF y su posible unin a la zona de los promotores, As, el factor estara siempre unido a su secuencia de unin en el tRNALeu, justo despus de la regin del rDNA, y provocara la terminacin de la unidad de transcripcin pequea cuando estuviera fosforilado, sintetizando fundamentalmente los rRNAs. La desfosforilacin del mismo permitira a la RNA polimerasa avanzar y transcribir la cadena H completa. La unin simultnea, o a travs de otras protenas, de mTERF a la zona de los promotores formando un bucle en el DNA, hara en su forma fosforilada, provocase la iniciacin en H1 y terminacin en el extremo 3 de la zona de los rRNAs, de este modo, la frecuencia de eventos de la unidad de transcripcin pequea seria ms elevada que cuando comienza en H2.
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8. ENFERMEDADES GENTICAS DEL ADN MITOCONDRIAL (MITOCONDRIOPATIA)
Las enfermedades originadas por daos en el genoma mitocondrial tienen en comn el estar producidas por una deficiencia en la biosntesis de ATP, ya que toda la informacin que contiene este DNA est dirigida a la sntesis de protenas componentes del sistema Oxphos. Las manifestaciones de estas enfermedades son muy variadas y pueden afectar a todos los rganos y tejidos, ya que la sntesis de ATP se produce en todos ellos y a cualquier edad. Estas pueden presentar una serie de aspectos clnicos, morfolgicos y bioqumicos muy concretos que dan lugar a sndromes bien caracterizados pero, en la mayor parte de los casos, principalmente en edad peditrica, los sntomas son muy poco informativos y es slo la presencia de anormalidades neurolgicas, a veces acompaadas de aumento de cido lctico y de otros sntomas clnicos secundarios que afectan a diversos rganos, lo que da alguna orientacin en 17 el diagnstico de una enfermedad mitocondrial. Entre las manifestaciones clnicas ms comunes se encuentran una o varias de las siguientes: desrdenes motores, accidentes cerebrovasculares, convulsiones, demencia, intolerancia al ejercicio, ptosis, oftalmoplejia, retinopata pigmentaria, atrofia ptica, ceguera, sordera, cardiomiopata, disfunciones hepticas y pancreticas, diabetes, defectos de crecimiento, anemia sideroblstica, pseudo obstruccin intestinal, nefropatas, acidosis metablica y otras ms secundarias. La presencia de uno o ms de estos sntomas requiere a continuacin de un estudio morfolgico, histoqumico y bioqumico para asegurar la naturaleza de estas enfermedades. As, con mucha frecuencia se encuentran: fibras rojo-rasgadas (acumulacin de mitocondrias anormales en tamao y nmero) en biopsias musculares teidas con tricromo de Gomori y fibras no reactivas a la tincin histoqumica de la citocromo c oxidasa; defectos en uno o varios complejos de la cadena respiratoria; y desarreglos metablicos con elevacin de lactato, piruvato o una aminoaciduria generalizada causados por una disfuncin de la cadena respiratoria que conlleva un aumento de equivalentes reductores en la mitocondria y citoplasma, y una alteracin del funcionamiento del ciclo de Krebs debido al exceso de NADH, lo que provoca una acumulacin de piruvato y su posterior conversin a lactato que difunde a la sangre. Sin embargo, la ausencia de algunos de estos caracteres no debe descartar la posibilidad de enfermedad mitocondrial, especialmente en pacientes en edad peditrica. Adems, los estudios familiares pueden ser decisivos si se comprueba la existencia de herencia materna de la enfermedad. El estudio gentico del paciente y familiares relacionados por va materna pueden asegurar finalmente que nos encontramos ante este tipo de trastornos. De hecho, hoy en da, el desarrollo y rapidez de las tcnicas de gentica molecular permiten, en ocasiones, una confirmacin de la enfermedad antes de haber realizado muchas de las pruebas anteriormente citadas. La complejidad del diagnstico de estas enfermedades hace preciso que los pacientes tengan que acudir a centros muy especializados donde se pueda llevar a cabo evaluaciones clnicas, metablicas, patolgicas, bioqumicas y genticas, y a que en su diagnstico estn implicados especialistas de muy diverso origen. Desde que en 1988 se describieran las primeras enfermedades causadas por daos en el ADNmt, se han encontrado ms de 150 mutaciones (ms 100 deleciones y unas 50 mutaciones puntuales) asociadas a enfermedades humanas. El inters por su estudio ha crecido enormemente debido al gran aumento de pacientes diagnosticados con estos trastornos y a que se presentan desde en recin nacidos hasta en adultos de todas las edades. Adems, muchas de estas mutaciones se trasmiten por lnea materna, como se ha indicado anteriormente, lo que hace que el diagnstico en un individuo pueda tener implicaciones en muchas generaciones de una familia. A pesar de la importancia que las enfermedades mitocondriales tienen ltimamente y de ser responsables de una considerable morbilidad, hasta ahora no se han realizado estudios exhaustivos sobre su prevalencia en la poblacin general. Las razones son mltiples: complejidad de las manifestaciones clnicas, necesidad de biopsias musculares para su diagnstico (no siempre se pueden detectar las mutaciones en muestras de sangre); necesidad de secuenciar todo el genoma mitocondrial para poder localizar mutaciones no detectadas hasta ahora, problemas ticos para realizar anlisis genticos presintomticos en nios, diagnstico errneo de muchos pacientes al no ser atendidos en centros especializados, etctera. Sin embargo, a pesar de todas estas dificultades, el grupo del doctor Turnbull, en Newcastle, Reino Unido, ha publicado muy recientemente los primeros datos epidemiolgicos de las enfermedades del ADNmt, centrados en la poblacin blanca de Europa del Norte
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residente en el noreste de Inglaterra. As, ha mostrado que los defectos en el ADNmt son la causa de enfermedad en 6.57 de cada 100 000 individuos de la poblacin adulta trabajadora y que 7.59 por cada 100 000 adultos y nios no afectados corren el riesgo de desarrollar una de estas enfermedades. En total, 12.48 por 100 000 individuos (1 de cada 8 000) tienen o presentan un riesgo de padecer una enfermedad causada por daos en el ADNmt. Estos datos representan un mnimo de prevalencia porque, muy probablemente, el nmero de pacientes que han quedado sin diagnosticar es elevado por haber sido atendidos por mdicos de asistencia primaria, y no en clnicas neurolgicas, y que hayan podido pasar desapercibidos por presentar solamente algunos de los sntomas acompaantes de estas enfermedades como diabetes o ptosis. La heterogeneidad de las manifestaciones clnicas, morfolgicas y bioqumicas de las enfermedades del ADNmt, hace que su clasificacin se base muy frecuentemente en las caractersticas genticas de las mutaciones, a pesar de que, en algunos casos, una misma mutacin pueda dar lugar a fenotipos clnicos muy diversos. As, las enfermedades del mtDNA se pueden dividir en tres grandes grupos segn estn asociadas a mutaciones puntuales, a reorganizaciones o a disminucin de nmero de copias del ADNmt. En la severidad de la manifestacin de la enfermedad intervienen varios factores: la naturaleza de la mutacin, el grado de heteroplasmia, los requerimientos energticos del tejido y la capacidad del tejido para compensar el dao celular. A continuacin se presenta un resumen de las enfermedades ms comunes asociadas a estos tipos de mutaciones. 8.1 Enfermedades asociadas a mutaciones puntuales en el mtDNA Dado el alto ndice de mutacin del ADNmt, como se ha indicado anteriormente, es posible encontrar un gran nmero de mutaciones puntuales. Sin embargo, la mayora son mutaciones silenciosas que no causan ningn tipo de defecto. Las mutaciones patolgicas se pueden encontrar tanto en los genes de ARNt, de ARNr, como en los codificantes de protenas, y responden siempre a un tipo de herencia materna. Neuropata ptica hereditaria de Leber. La neuropata ptica hereditaria de Leber (LHON) se caracteriza por la prdida bilateral de la visin central, originada por atrofia del nervio ptico. Aparece en la segunda o tercera dcada de la vida y afecta a ms hombres que a mujeres. Aunque normalmente slo la visin est afectada, hay casos en los que tambin aparecen trastornos en la conduccin cardiaca, neuropata perifrica y ataxia cerebelar.
Esta fue la primera enfermedad humana de herencia materna que se asoci a una mutacin en el ADNmt. Despus se lleg a asociar hasta con 16 mutaciones puntuales, localizadas todas ellas en genes codificantes de protenas, y que se clasificaron en primarias, secundarias o intermedias segn su relacin con la aparicin de la enfermedad. Sin embargo, ltimamente slo tres, G3 460A, G11 778A y T14 484C, estn consideradas como primarias o patognicas verdaderas, siendo la G11 778A la responsable en 50% de los casos y la que provoca la forma ms severa de la enfermedad. Las tres se encuentran en genes que codifican algn polipptido del complejo I del sistema Oxphos. La deteccin de estas mutaciones se suele hacer en clulas sanguneas donde se encuentran tanto en forma homo como heteroplsmica. El resto de las mutaciones se consideran como secundarias, suelen acompaar a las anteriores en forma homoplsmica y se desconoce su relacin directa con la enfermedad. Entre estas ltimas vale la pena mencionar que la mutacin G15257A, considerada como intermedia por algunos autores, se ha encontrado en varias familias analizadas en nuestro laboratorio por lo que pensamos que puede contribuir de forma decisiva a la aparicin de la enfermedad.
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La prevalencia de la enfermedad en hombres ha sugerido la influencia de un gen nuclear, y aunque se ha descrito un ligamiento de la enfermedad con el locus (DXS7) situado en el cromosoma X en familias finlandesas, no se ha podido confirmar en familias de otro origen. Sndrome de neuropata, ataxia y retinopata pigmentaria. Este sndrome est caracterizado por debilidad muscular neurognica, ataxia y retinitis pigmentosa. Suele ir acompaado de demencia, convulsiones y neuropata sensorial axonal, presenta una herencia materna y se ha asociado a una mutacin puntual, T8993G, en el gen de la subunidad 6 de la ATPasa. La mutacin aparece normalmente en forma heteroplsmica y en todos los tejidos estudiados: leucocitos, fibroblastos, msculo, rin y cerebro. Existe una alta correlacin entre la proporcin del DNA mutado y la severidad de la enfermedad. Sndrome de Leigh de herencia materna. El sndrome de Leigh de herencia materna (MILS) es una enfermedad muy heterognea que se puede presentar asociada a diferentes tipos de herencia, autosmica recesiva, ligada al cromosoma X o materna (mitocondrial) segn el gen que est daado. Es una enfermedad devastadora que se caracteriza por trastornos degenerativos multisistmicos que aparecen en el primer ao de vida, disfunciones del tallo cerebral y de los ganglios basales, desmielinizacin, regresin psicomotora, retraso en el desarrollo, ataxia, convulsiones, neuropata perifrica. El diagnstico se confirma por la presencia de lesiones necrticas cerebrales focales en el tlamo, tallo cerebral y ncleo dentado. La forma de la enfermedad, que se hereda por va materna, est producida por la mutacin en el gen de la subunidad 6 de la ATPasa, T8993G, la misma que produce el sndrome de neuropata, ataxia y retinopata pigmentaria, pero con un porcentaje de la mutacin superior a 90%. Sndrome de epilepsia mioclnica con fibras rojo-rasgadas (MERRF). Este sndrome de herencia materna, est caracterizado por epilepsia mioclnica, convulsiones generalizadas y miopata con presencia de fibras rojorasgadas. Otros sntomas clnicos que pueden acompaar a los anteriores son demencia, sordera, neuropata, atrofia ptica, fallo respiratorio y cardiomiopata. Aparece tanto en la infancia como en edad adulta y es de curso progresivo. Lys Est asociado a la presencia de mutaciones en el gen del ADNmt para el ARNt . En la mayora de los casos (80%-90%) se debe a una mutacin A8344G, pero tambin se han encontrado otras minoritarias como T8356C, todas en forma heteroplsmica. El porcentaje de heteroplasmia necesario para la afectacin vara entre individuos jvenes (95%) e individuos por encima de los 60-70 aos (60%) del ADN mutado. La presencia de estas mutaciones en ARNt daa la sntesis de protenas. Sndrome de encefalomiopata mitocondrial con acidosis lctica y episodios de accidentes cerebro-vasculares (MELAS). Se trata de una encefalomiopata mitocondrial, de herencia materna, caracterizada por accidentes cerebrovasculares producidos a edad temprana que provocan una disfuncin cerebral subaguda y cambios en la estructura cerebral, y por acidosis lctica. Estos caracteres suelen ir acompaados de convulsiones generalizadas, dolor de cabeza, sordera, demencia y, a veces, presenta fibras rojo-rasgadas.
Leu(UUR)
Esta enfermedad ha sido asociada fundamentalmente con mutaciones en el gen del ARNt del ADNmt. La mayor parte de los casos (80%) est asociada a la mutacin A3.243G, pero tambin se han encontrado otras con menor incidencia y alguna en genes codificantes de protenas, todas en forma heteroplsmica. Al igual que en la epilepsia mioclnica, las mutaciones en el ARNt daan la sntesis de protenas mitocondriales. Diabetes de herencia materna con sordera. Adems de los dos tipos clsicos de diabetes dependiente y no dependiente de insulina (tipo 1 y 2, respectivamente), se ha descrito recientemente un nuevo tipo de diabetes asociada a sordera, que no encuadra dentro de la clasificacin de la Organizacin Mundial de la Salud. Esta diabetes, de herencia materna, est Leu(UUR) producida por la mutacin A3.243G en el gen del ARNt , la misma descrita para el sndrome de (MELAS). La frecuencia de diabetes y sordera es aproximadamente de un 1.5% de la poblacin diabtica total. Por otra parte, la diabetes es una de las enfermedades que se han descrito asociadas a otros sndromes mitocondriales como la encefalomiopata mitocondrial,
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oftalmoplejia progresiva externa crnica, Kearns-Sayre, Pearson y diabetes inspida, diabetes mellitus, atrofia ptica y sordera (DIDMOAD). *Otras enfermedades del mtDNA asociadas a mutaciones puntuales Adems de las enfermedades descritas anteriormente, hay otras muchas que se han asociado a otras mutaciones puntuales. Entre ellas, se pueden citar las cardiomiopatas de herencia materna Ile relacionadas fundamentalmente con mutaciones en el ARMt : la sordera inducida por aminoglicsidos que est producida por una mutacin en el ARNr 12S (A1555G), y otros tipos de sordera sindrmica o no sindrmica de herencia materna; LHON y distona; miopatas de herencia materna unidas a mutaciones Leu Pro Asn Tyr en ARNt , ARNt , ARNt , ARNt ; oftalmoplejia progresiva externa crnica; anemia sideroblstica; deficiencia fatal de la cadena respiratoria infantil; lipomatosis si mtrica mltiple asociada a la mutacin Lys A8.344G del gen del ARNt y, recientemente, se ha relacionado la intolerancia al ejercicio, como entidad propia, a mutaciones puntuales en el gen del citocromo b. As, se han descrito mutaciones en este gen que crean un codn de terminacin, que cambian un aminocido o, incluso, una delecin de 24 pares de bases. Asimismo, cabe mencionar que alguna de las mutaciones, como la A3.243G, puede estar relacionada con muy diversos fenotipos clnicos como sindromes de encefalopata mitocondrial con acidosis lctica y episodios de accidentes cerebrovasculares de epilepsia mioclnica con fibras rojorasgadas y solapados, cardiomiopatas, CPEO, etctera. Actualmente, se estudia la posible implicacin del ADNmt en enfermedades neurodegenerativas como Parkinson y Alzheimer. 8.2 Enfermedades asociadas a reorganizaciones en el DNA mitocondrial Adems de las mutaciones puntuales, el ADNmt puede sufrir otro tipo de daos como son la prdida de parte del mismo (deleciones) o la adicin de un nuevo fragmento del DNA (duplicaciones), que, como en los casos anteriores, afectan a la biognesis del sistema Oxphos y, por tanto, a la sntesis de ATP. En la actualidad hay descritos ms de 100 tipos de deleciones y slo unos cuantos casos de inserciones. Este tipo de mutaciones suelen ser espontneas, probablemente causadas por daos en genes nucleares que 75 controlan la replicacin del ADNmt, aunque hay descritos casos de herencia materna. Se presentan siempre en forma heteroplsmica, ya que la homoplasmia sera incompatible con la vida, y se sabe que la gravedad de los casos aumenta con la edad debido a la ventaja replicativa de estas molculas de DNA ms pequeas en relacin con la de tamao normal. Los tres tipos de sndromes ms comunes en los que se presentan deleciones son los de Pearson, oftalmoplejia progresiva externa crnica y Kearns-Sayre. Sndrome de mdula sea-pncreas de Pearson. Es una enfermedad que aparece en los primeros aos de vida y que afecta a la hematopoyesis y a la funcin pancretica exocrina. Las caractersticas clnicas ms comunes son anemia sideroblstica con vacuolizacin de precursores de la mdula sea que se manifiesta con una anemia macroctica, trombocitopenia y neutropenia. Los nios afectados suelen morir antes de los tres aos de edad y los que sobreviven suelen desarrollar posteriormente el fenotipo de Kearns-Sayre, que veremos ms adelante. Estos pacientes presentan deleciones grandes nicas del ADNmt, en general son espordicas aunque se ha descrito algn caso de herencia materna. Oftalmoplejia progresiva externa crnica. Esta enfermedad est caracterizada por oftalmoplejia, ptosis bilateral de los prpados y miopata. Suele ir acompaada tambin de intolerancia al ejercicio y debilidad muscular. En el msculo se encuentran fibras rojo-rasgadas COX negativas. En general, es una enfermedad benigna que suele aparecer en la adolescencia o en adultos jvenes. Aparece de forma espordica sin historia familiar. Se ha asociado fundamentalmente a deleciones grandes y nicas en el ADNmt (ver ms adelante). Asimismo, se han encontrado otras formas de CPEO con mutaciones puntuales de herencia materna o con deleciones mltiples de herencia autosmica recesiva o dominante. Sndrome de Kearns-Sayre. Este sndrome es, por otra parte, una enfermedad multisistmica progresiva caracterizada clinicamente por CPEO, retinopata pigmentaria atpica, ataxia, miopata mitocondrial, bloqueo de la conduccin cardiaca, elevados niveles de protena CSF
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(fluido cerebro espinal, por sus siglas en ingls), sordera y demencia. Aparece antes de los 20 aos de edad. Estas tres enfermedades estn causadas por deleciones (de 2 a 9 kb) en el ADNmt que suelen aparecer de forma espontnea. En general, la delecin es nica, pero tambin se han descrito casos de deleciones mltiples. La gravedad de la enfermedad depende del porcentaje de DNA mutado en el individuo. En general estn localizadas en el arco grande comprendido entre los orgenes de replicacin del DNA y mantienen siempre las secuencias requeridas para la replicacin del DNA y los promotores de la transcripcin. Entre todas las deleciones conocidas, hay una que aparece con ms frecuencia (hasta en 50%), la llamada delecin comn, que elimina un tramo de DNA de 4 977 pares de bases (entre los nucletidos 8 483 a 13 460), que comprende los genes localizados entre la subunidad 8 de la ATPasa y ND5. No existe una clara relacin entre el fenotipo y el tipo, tamao o porcentaje del DNA delecionado ya que la misma delecin puede dar lugar a varios fenotipos diferentes. La mayor parte de las deleciones encontradas estn flanqueadas por repeticiones directas de longitud variable (3-13 nt). Este hecho sugiere que la deleccin se produce por errores sucedidos en el proceso de replicacin dependientes de la presencia de estas repeticiones. La prdida de genes, especialmente la de los ARNt, hace que estos genomas no se puedan traducir y, por tanto, que sean dependientes de complementacin con molculas de ADNmt normales en la misma mitocondria. El umbral se suele alcanzar cuando el porcentaje de molculas delecionadas supera 60%. Existen otras enfermedades como una diabetes con sordera y atrofia ptica; miopatas en general; el sndrome de encefalomiopata mitocondrial neurogastrointestinal; el de diabetes mellitus, diabetes inspida, atrofia ptica y sordera, etctera, que estn asociadas a la presencia de deleciones en el ADNmt. Como se ha mencionado anteriormente, entre las reorganizaciones del ADNmt se pueden encontrar duplicaciones en pacientes con defectos en el sistema Oxphos. Estas pueden ser tambin espordicas o de herencia materna. Se han encontrado en pacientes de Kearns-Sayre, Pearson, diabetes mellitus, tubulopata renal y miopata mitocondrial e incluso en individuos normales. El mecanismo por el cual pueden causar la patogenicidad no est nada claro todava. 8.3 Enfermedades asociadas a depleciones de ADN mitocondrial El tercer tipo de daos en el genoma mitocondrial que puede causar enfermedades no se debe a mutaciones propiamente dichas sino a una disminucin de los niveles del ADNmt. El espectro clnico que produce la deplecin es muy variado. Los casos descritos hasta ahora afectan fundamentalmente a nios con combinaciones variables de miopata, nefropata o hepatopata, miopata infantil fatal por fallo respiratorio y algn otro con implicacin multisistmica. La deplecin puede estar producida por mutaciones en genes nucleares que controlan el nmero de copias del ADNmt. Es, por tanto, un trastorno de herencia mendeliana que afecta a la coordinacin ncleo-mitocondria, y que parece ser autosmico recesivo. Enfermedad de Huntington
La enfermedad de Huntington es la causa mar frecuenta de corea hereditaria. Su herencia es autosomica dominante, con penetrancia completa, y el defecto gentico es conocido. Desde el punto de vista clnico, la forma clsica de Enfermedad de Huntington se caracteriza por la presencia de transtornos del movimiento de los cuales el mas frecuenta es la corea-, alteraciones psiquitricas. Muchas veces son la primera manifestacin e incluyen cambios de personalidad, depresin-mania, ilusiones y alucionaciones, paranoia y cuadros esquizofreniformes, etc.- , y demencia, siendo la edad de comienzo habitual a partir de los 40. El hallazgo anatomopatologico mas caracterstico es la atrofia de neoestriado (sobre todo de la cabveza del caudado), el cual presenta perdida neuronal (fundamentalmente de neuronas pequeas espinosas) y gliosis. Las alteraciones neuroqumicas mas importantes son la deprecion de GABA, glutamato-descarboxilasa y acetilcolina en estriado, aunque
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tambin se han descrito cambios en las concentraciones de algunos neuropeptidos como encefalinas, sustancia P y enzima convertidora de angiotensina, asi como disminucin de receptores de GABA, benzodiacepinas y acetilcolina en caudado y putamen. El descubrimiento del gen HD y el desarrollo de los modelos transgnicos han permitido una seria de nuevos conocimientos acerca de la patognesis causada por la huntingtina mutante. Se ha involucrado la muerte neuronal como resultado de sobre actividad de la neurotransmisin del glutamato, llamado excitotoxicidad. En cuanto al dao o disfuncin mitocondrial se ha reportado disminucin en la actividad del complejo II en los ganglios basales. Ataxia de Friedreich
En este enfermedad se presenta una mutacion en el gen que codifica a la frataxina; en modelos experimentales se ha documentado disminucin en las actividades de las protenas que contienen grupos Fe-S, incluyendo complejo I, II y III. Ante la presencia de Fe libre se generan radicales libres de oxigeno, con lo que presenta dao oxidativo e inactivacin de enzimas mitocondriales y acumulacin de hierro.
9. ADN MITOCONDRIAL Y SU RELACION CON LA MEDICINA FORENSE Qu es la medicina legal?
La medicina legal es una ciencia, porque consta de un mtodo de estudio, el cual, tiene dentro de sus caractersticas formas que van a iniciarse, etapas, procesos, etc, que van a identificar la comisin de un hecho o la alteracin cometida sobre alguna persona o cosa. Es una ciencia auxiliar del derecho Penal. Cuando se comete un hecho punible debemos determinar si estamos en presencia de un homicidio, un suicidio o de un accidente. Si estamos frente a un accidente no existe delito que sancionar, tampoco habr delito si fuese un suicidio, en este caso lo que si podra sancionarse es la induccin para que el occiso se quitara la vida. Pero si fuera un homicidio, se deben investigar las causas en las cuales se cometi el mismo, para que se determine si ese homicidio es doloso, culposo, concasual o preterintencional, etc. Y as determinar la culpabilidad e imputabilidad de la persona que lo cometi; ya que podemos hablar de personas inimputables o con responsabilidad disminuida, lo que hara que el proceso sea diferente al de una persona que tenga pleno conocimiento de su responsabilidad penal. 9.1 Importancia de la medicina legal La medicina legal es importante porque va a determinar si una persona est o no involucrada en un hecho punible que se haya cometido. En la medicina legal intervienen los abogados, los jueces, los defensores pblicos, etc. Y, por ello hay que determinar a travs de la medicina forense lo ocurrido. Los jueces no saben de experticias, de peritajes, los cuales se le deben llevar y explicrselos, analizrselos, detallarle por que el experto lleg a esa conclusin, para que el Juez pueda saber con certeza si est en presencia de un suicidio, de un homicidio o de un accidente; para que en base a esos elementos de juicio el Juez pueda determinar o no la responsabilidad penal de una o de varias personas involucradas en el hecho.
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De igual manera la medicina legal es importante para el fiscal del Ministerio Pblico, por ser este quien lleva adelante el proceso penal, es decir, es quien debe realizar las investigaciones para que se pueda realizar el proceso en un acto decisivo, conclusorio o decisorio dentro del debate procesal penal, por lo tanto necesita ayudarse, auxiliarse con esa prueba pericial que le aporta la medicina legal. Tambin, la medicina legal es importante para los abogados, porque estos necesitan apoyarse en los exmenes peritajes o probar que los mismos desviaron el sentido de las investigaciones y si este es el caso pueden eliminar, tachar o desvirtuar el examen pericial si existen circunstancias de duda razonable que puedan probar como tal. La medicina legal es importante para la sociedad, porque la comunidad debidamente constituida se rige por normas y el estado debe garantizar que las instituciones cumplan con sus funciones y que la comunidad sea protegida, por lo que aquella persona que cometa un hecho punible debe ser sancionada; pero, si la persona es imputable total o parcialmente debe ser sometida a medidas de seguridad especiales como sera el caso de los orates o de los locos que deben ser recluidos en sanatorios especiales. EL OBJETO DE ESTUDIO DE LA MEDICINA FORENSE:
El objeto de estudio de la medicina forense es el hombre; porque es sobre el hombre sobre quienes se cometen los hechos delictivos y es el hombre tambin quien comete el hecho punible; que tambin pueden ser cometidos sobre sus objetos o cosas que le pertenecen. Lo que quiere decir, que la medicina legal tiene su radio de accin, de aplicacin o de estudio sobre las personas, objetos y cosas; por ejemplo, se pueden robar un vehculo y en dicho acto daarlo, caso en el que el hecho punible se estar cometiendo sobre un objeto. El hombre puede ser tanto sujeto activo como pasivo en la comisin de un delito o hecho punible. De lo que hemos dicho podemos conceptuar a la medicina legal como: La parte de la medicina que fundamenta una serie de conocimientos mdicos y biolgicos, que pueden ayudar a esclarecer un hecho punible.
9.2 Aplicacin en En Medicina Forense: El ADNmt humano es una molcula de ADN circular, cerrado y de doble cadena y relativamente pequeo, ya que mide 16.569 bp y fue secuenciado en su totalidad por primera vez en 1981 por Anderson y colaboradores. Se hereda prcticamente slo por va materna y, aunque representa menos del 1% del ADN celular total, posee un gran nmero de copias. Se estima que las clulas de mamferos
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contienen varios miles de copias de ADNmt dependiendo del tipo de tejido. Esta caracterstica es la que le confiere ms posibilidades de xito en muestras degradadas. Hay dos regiones principales en el genoma mitocondrial: una gran regin codificante (90%) y una regin pequea de aproximadamente 1.2 kb conocida como regin control. Esta regin es muy polimrfica y contiene dos regiones hipervariables bien caracterizadas, conocidas como la regin hipervariable I (HVI) y la regin hipervariable II (HVII), de aproximadamente 400 bp cada una. Todos estos elementos de control hacen que esta regin no sea en conjunto selectivamente neutra. La identificacin forense mediante ADNmt se basa fundamentalmente en el estudio de esta regin no codificante. De la misma manera, dada su alta variabilidad, es de gran utilidad en el estudio antropolgico de la evolucin humana ya que las diferencias interpoblacionales a nivel mitocondrial son un reflejo molecular de acontecimientos histricos que se han venido sucediendo durante los ltimos milenios. Toda la molcula de ADNmt ha sido secuenciada en toda su longitud y la numeracin de la molcula del ADNmt es aquella establecida por Anderson y colaboradoresen 1981. Empieza arbitrariamente cerca del punto medio de la regin control, de forma que esta regin se extiende desde la posicin 16024 a la 16569 y luego se contina desde la 1 hasta la 576. Las dos regiones hipervariables se extienden aproximadamente desde las posiciones 16024 a la ~16365 HVI y desde la 73 hasta la ~340 (los lmites no estn en cualquier caso rgidamente establecidos y varan segn los estudios). El ADNmt evoluciona de 5 a 10 veces ms rpidamente que un segmento medio del ADN nuclear y una de sus consecuencias es la heteroplasmia, esto es, una mezcla intracelular de molculas mutantes y normales que puede dificultar la interpretacin forense pero tambin proporcionar un dato de inters en la identificacin. Tambin est cobrando un valor cada vez mayor el estudio de variaciones nucleotdicas simples en regin codificante (SNP) del ADNmt. Estas variaciones permiten definir con mayor precisin el haplogrupo al que pertenece una muestra, lo que aumenta su valor identificativo. Por ejemplo, un porcentaje importante de las muestras europeas pertenecen al haplogrupo H (esto es, a un mismo linaje) sin posibilidad de diferenciar unos individuos de otros si no se recurre al anlisis de SNP de regin codificante, que aumenta sensiblemente el poder del test. El ADNmt es importante en gentica forense en dos circunstancias: en el anlisis de pelos y cabellos y en el anlisis de muestras degradadas. Por su mejor comportamiento en muestras degradadas el ADNmt es esencial para muchos casos de identificacin a partir de restos seos. Se han obtenido secuencias de ADNmt en muestras de miles de aos y la prueba ha servido para solucionar numerosos enigmas histricos como la identificacin de los restos de la familia Romanov, los ltimos zares de Rusia, asesinados durante la revolucin bolchevique de 1918. Qu haba pasado con los restos era un misterio y numerosas leyendas, como la de la princesa Anastasia, circulaban y an circulan por todo el mundo. Un grupo de espelelogos, gelogos y mdicos hallaron los restos de la familia imperial en 1991. En 1998, y gracias a las pruebas demostradas con el ADN, se supo que todos los cadveres encontrados pertenecan a la familia imperial. Los siete componentes eran, sin dudarlo, el zar Nicols II, su esposa y todos sus hijos. Para la confirmacin pidieron muestras de ADN a diferentes miembros de la realeza europea ms cercana a los Romanov, a miembros de las casas reales danesa, britnica y a la griega. El ADN mitocondrial fue decisivo en este caso para la resolucin del caso. La mayora de los laboratorios de gentica forense utilizan hoy da el ADNmt; el mayor problema que plantea es el control de la contaminacin y la valoracin estadstica. La Sociedad Internacional de Gentica Forense (ISFG) ha publicado recomendaciones estrictas para que se haga un uso apropiado. La
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valoracin estadstica exige que se disponga de bases de datos poblacionales muy amplias (es decir, perfiles de ADNmt totalmente annimos con el fin de estimar la frecuencia) y en este sentido se est haciendo un esfuerzo colaborativo importante a escala mundial. ADN mitocondrial Existen numerosas mitocondrias en cada clula (entre 250 y 1000 segn el tipo celular, las necesidades metablicas y el tipo funcional) y varias copias de ADN mitocondrial en cada mitocondria, es decir, existen mayor cantidad de copias de ADNmt que de ADN nuclear por clula, de forma que hay una sola copia de ADN nuclear en una clula mientras que puede haber miles de copias de ADNmt. Este hecho hace que en muestras forenses muy crticas (con escasa cantidad de ADN o con ADN en mal estado) tenga ms xito el anlisis de ANDmt que el de ADN nuclear. Sin embargo, el ADNmt presenta una peculiaridad, se hereda nica e ntegramente de la madre, sin que exista ninguna combinacin con el material del padre. Por este motivo se dice que es un genoma haploide. La causa de que no exista mezcla con el material del padre es la siguiente: las mitocondrias del espermatozoide se localizan en el cuello (entre la cabeza y la cola), con el fin de aportar la energa que esta clula necesita para mover la cola y desplazarse en busca del vulo. Al producirse la fecundacin solo penetra en la clula femenina la cabeza del espermatozoide (con el ADN nuclear) quedando fuera la cola y el cuello, y con l todas las mitocondrias. Esto hace que el padre no aporte dicho material a su descendencia. Las caractersticas bsicas que lo hacen til en investigacin forense y antropolgica son: 1. El elevado nmero de copias por clula que hace alguna de ellas resista las condiciones adversas sin ser degradada. Su pequeo tamao. Esto facilita la conservacin en el tiempo a pesar de que las condiciones no sean apropiadas: al ser ms pequeo que el ADN nuclear la probabilidad de verse afectado es menor.
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Estas 2 caractersticas garantizan las estabilidad postmortal y una mayor resistencia que el nuclear. Pero tambin tiene desventajas o puntos dbiles como: 1. No es especfico de cada persona, sino que se asocia a todas las personas que proceden de la misma madre, abuela materna, etc. Slo es til cuando se trata de hacer estudios por va materna, de modo que permite identificar a cualquier persona (hombre o mujer) frente a su madre, no frente a su padre. Presenta gran dificultad tcnica por lo que restringe su uso a laboratorios especializados.
2.
3.
El poder de discriminacin (capacidad de diferencias entre dos muestras), es mucho menor. Hoy da an no se tienen datos poblacionales suficientes (frecuencias) como para poder realizar estimaciones probabilsticas. El ADN-Mt se transmite nicamente por va materna. Todas las personas emparentadas por va materna comparten idntica secuencia de ADN-Mt y por lo tanto no pueden ser diferenciadas con este anlisis. Esta caracterstica sin embargo es de gran utilidad cuando se trata de
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establecer y/o rechazar relaciones familiares. Es decir no identificamos individuos sino lneas familiares maternas. Por otro lado la tcnica de ADN-Mt es de gran complejidad, incluyendo posibles variaciones (heteroplasmias) entre diferentes clulas. Por ello la decisin de realizar analtica de ADN-Mt, ser tomada exclusivamente por el laboratorio, bajo criterios estrictos y restrictivos como son: Ausencia de ADN-nuclear. Disponibilidad de muestras conocidas de referencia. Necesidad de establecer relaciones familiares. Este tipo de ADN se utiliza sobre todo en los casos siguientes:
1. Cuando existe una gran degradacin de las muestras por las malas condiciones de conservacin en que permanecieron hasta que fueron encontradas en lugar del crimen o por la antigedad que tienen. En este caso el ADN mitocondrial se encontrar en mejor estado que el nuclear debido a su mayor nmero de copias por clula. Tal es el caso de restos seos y dientes antiguos o sometidos a condiciones extremas. 2. Cuando la cantidad de muestra de que se dispone es mnima (pelos sin bulbo por ejemplo). Un pelo con bulbo caduco o un fragmento de pelo contendr una cantidad de ADN nuclear tan escasa que en principio los anlisis de estas muestras mediante ADN nuclear resultar negativo. 3. En la identificacin de restos biolgicos y el establecimiento de una relacin familiar cuando no se dispone de los progenitores y no queda ms remedio que realizar una comparacin con familiares ms lejanos. Si se trata de familiares va materna tendrn exactamente el mismo ADN mitocondrial aunque se trate de familiares lejanos. Un estudio de ADN nuclear en estos casos sera poco informativo ya que cuanto ms alejada sea su relacin familiar, menos alelos compartirn. 4. Cuando existe un sospechoso en un hecho delictivo pero se dispone de muestra de la cual no se conoce su procedencia, se puede recurrir al estudio del ADN mitocondrial de un familiar relacionado matrilinialmente para excluirlo. Determinados tipos de vestigios o indicios biolgicos, como por ejemplo huesos y dientes antiguos, cabellos no arrancados, y muestras muy degradas, amenudo contienen muy poco ADN-nuclear, lo que hace imposible la obtencin de un perfil gentico completo de STRs. Debido sin embargo a que hay un elevado nmero de mitocondrias por clula y cada mitocondria posee varias copias de ADN, es posible su obtencin y estudio mediante secuenciacin de las denominadas regiones HV1 y HV2 donde se acumula variabilidad, reflejando la misma como variaciones sobre la denominada secuencia base o consenso de Anderson. 9.3 PROCEDIMIENTO ANALTICO. El anlisis de ADNmt, es de los anlisis forenses, el mas costoso, no-solo a nivel econmico sino de tiempo y esfuerzo, ya que por un lado se aplican multitud de tcnicas de biologa molecular para obtener un resultado y porque las muestras suelen ser degradadas y/o mnimas, requiriendo muchas reacciones y procedimientos de control. El esquema bsico del proceso analtico sera el siguiente:
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PREPARACIN DE LA MUESTRA En muestras como hueso y diente es necesario una etapa de limpieza previa. Este proceso se realiza lijando la superficie externa de estas muestras con objeto de eliminar los restos que estn adheridos a la superficie. Esto se puede conseguir mediante un procedimiento manual con una lima o con alguna herramienta como la Dremel. Posteriormente y una vez limpiada la muestra se procede a tomar una porcin para pulverizarla, este proceso puede realizarse como se ha descrito e incluso con equipos mas sofisticados como el Freezer Mill (que utiliza Nitrgeno lquido). EXTRACCIN DEL ADN Hay distintos mtodos de extraccin en funcin de: TIPO DE MUESTRA (sangre, pelos, saliva, semen, etc...) ESTADO DE LA MUESTRA (en buen estado degradada) CANTIDAD DE MUESTRA (indicios mnimos, o cantidad suficiente)
Tiene como objetivo, liberar el ADN del interior del ncleo de la clula. Sirva como ejemplo el proceso de extraccin de ADN a partir de hueso. Esquema resumen del proceso de extraccin de AND a partir de hueso. AMPLIFICACIN DEL ADNMT. Las bases tericas de la reaccin de PCR son simples. En la reaccin intervienen tres segmentos de ADN: el segmento de doble cadena que queremos amplificar, y dos pequeos fragmentos de cadena sencilla, los oligonucletidos (primers u oligos), que tienen la misma secuencia que los extremos flanqueantes del ADN molde. Adems, participan en la reaccin el enzima Taq polimerasa (Taq), deoxinucletidostrifosfato (dNTPs), sales, y un tampn. Los oligos se aaden a la reaccin en exceso con respecto al ADN que desea amplificarse. Los oligos hibridarn con las regiones complementarias del ADN, quedando orientados con sus extremos 3 enfrentados, de modo que la sntesis mediante la ADN polimerasa (que cataliza el crecimiento de nuevas cadenas 5 3) se extiende a lo largo del segmento de ADN que queda entre ellas. El primer ciclo de sntesis producir nuevas cadenas, de longitud indeterminada, las cuales, a su vez, son capaces de hibridar con los oligos. Este tipo de productos se ir acumulando de forma geomtrica, con cada ciclo de sntesis, utilizando como moldes las molculas de ADN parental de la reaccin. Durante el segundo ciclo de sntesis, estas cadenas hijas servirn a su vez como moldes, generndose en este caso fragmentos cuyo tamao ser el del fragmento que engloba los extremos de ambos oligos. Estas nuevas cadenas hijas servirn de molde a su vez para sucesivos ciclos de sntesis. La cantidad de estos productos se duplica con cada ciclo, por lo que se van acumulado de forma exponencial. Al cabo de 30 ciclos, habrn aparecido 270 millones de estas molculas, por cada una de ADN original que hubiese. El primer paso necesario en este proceso de la sntesis es la desnaturalizacin del ADN. Puesto que el molde es una molcula de ADN de doble cadena, ser necesaria la separacin de estas para que los oligos puedan acceder a sus secuencias complementarias y unirse a ellas en el siguiente paso, llamado de alineamiento ("annealing"). Una vez que los oligos se han unido a las cadenas, sirven como cebadores para la accin de la ADN polimerasa, la cual comienza a crear a partir de ellos nuevas cadenas de ADN complementarias, en el proceso de elongacin. Estos tres pasos consecutivos (desnaturalizacin, alineamiento y elongacin) constituyen un ciclo de sntesis.
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Para las reacciones de PCR de secuenciacin se ha diseado una Taq polimerasa especfica, Taq FS (fluorescente sequencing), a partir de la Taq polimerasa de Thermus aquaticus y modificada genticamente de forma que posee muy baja actividad exonucleasa 5->3 con lo que los resultados son ms limpios con menos ruido de fondo y apenas falsas terminaciones. Adems este enzima incorpora los ddNTPs marcados fluorescentemente ms eficientemente, con lo cual son necesarios menos ddNTPsfluorescentes y menos ADN molde para conseguir la misma seal. En los ltimos aos, tambin se ha avanzado notablemente en la obtencin de sondas fluorescentes cuyos espectros de emisin de fluorescencia presentan un mnimo solapamiento Como se ha indicado anteriormente, son las regiones hipervariables (HV1 y HV2), dentro de la regin control, las zonas de especial inters con fines de identificacin humana. Son varias las estrategias que se siguen para realizar la amplificacin por PCR de estas zonas estando en funcin de dos variables: Tipo de muestra Estado de degradacin
Cuando las muestras son frescas y estn en buenas condiciones es posible realizar una amplificacin de la regin control completa (1122 pb), para ello basta con utilizar los primers adecuados. No obstante si la muestra esta degradada o se sospecha la escasa cantidad de ADN que pueda contener se van reduciendo los fragmentos a amplificar llegando, en los casos ms extremos, a ir amplificando regiones de unos 100 pares de bases. Hay un hecho que llama poderosamente la atencin y es la cantidad de parejas de primers que se utilizan hoy en da para la amplificar por PCR y como no hay an unanimidad en la nomenclatura que se sigue para nombrarlos. Algunos autores los nombran como F o R (en funcin de que amplifiquen o secuencien en direccin Forward o Reverse) otros en cambio utilizan una nomenclatura que alude a la cadena donde hibridan, as se denominan L o H (de Light o Heavy). Otro diferencia radica en nombrar la base (siguiendo la secuencia de Anderson) donde terminan o empiezan a hibridar los primers es decir en funcin de su extremo 3 o 5. En cualquier caso de estas nomenclaturas no se puede deducir la secuencia de los primers. PURIFICACIN DEL PRODUCTO DE PCR. Tiene por objeto eliminar los dNTPs y primers que no se han utilizado en la reaccin de PCR y que podran interferir en la reaccin de secuenciacin. Hay distintos mtodos para realizar esta operacin, pero uno de los ms empleados es el que usa los filtros Microcon 100. SECUENCIACIN DEL ADNMT Tiene por objeto determinar el orden de nucletidos que componen el fragmento de ADNmt a estudiar. Hay varios mtodos para secuenciar, pero l ms extendido es el mtodo que emplea los dideoxinucletidos como terminadores de cadena, tambin llamado mtodo de Sanger, que es utilizado para la secuenciacin cclica del ADNmt. La clave en este mtodo est en la utilizacin de nucletidos modificados llamados dideoxinucletidos (ddNTPs). Estos son idnticos a los nucletidos normales o deoxinucletidos (dNTPs) utilizados durante
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la sntesis del ADN, exceptuando la falta de un grupo OH en la posicin 3 de la molcula de desoxirribosa. Durante la sntesis del ADN, un dideoxinucletido puede ser aadido a la cadena de ADN en crecimiento, pero debido a la falta del grupo OH, el siguiente nucletido no podr incorporarse. Por esta razn a los dideoxinucletidos se les llama tambin terminadores. La secuenciacin cclica es el nombre dado al proceso que utiliza sucesivos ciclos de desnaturalizacin, hibridacin de primer, y polimerizacin para formar grandes cantidades de producto en una nica reaccin de secuenciacin. Este proceso de amplificacin (similar a una PCR), utiliza un nico primer, incrementndose linealmente el producto de ADN con el nmero de ciclos. (Se distingue de una reaccin de PCR en que esta utiliza dos primers, de manera que la cantidad de producto se incrementa exponencialmente con el nmero de ciclos) PURIFICACIN DEL PRODUCTO DE SECUENCIACIN. Tiene como objeto, eliminar los terminadores no incorporados y que de no eliminarlos convenientemente podran enmascarar la secuencia de ADN obtenida complicando as la interpretacin de los resultados. Purificacin del producto secuenciado mediante la precipitacin con etanol (mtodo de eleccin cuando se usa el kit de Big Dye V.3.0 de Applied Biosystems). Hay que tener en cuenta que durante la fase de precipitacin los ddNTPs se encuentran en el etanol. Por lo que hay que eliminar todo el etanol sin evaporarlo. El etanol absoluto ha de ser de calidad y recin abierto. Antes de colocar las muestras en el equipo que las analizar (como ejemplo ABI PRISM 310) hay que prepararlas convenientemente, hidratando la muestra con TSR (Template Suppresion Reagent). ELECTROFORESIS. La electroforesis capilar es una tcnica relativamente novedosa en el campo de la Gentica Forense pero que est poco a poco sustituyendo a los sistemas de electroforesis vertical. En este caso el proceso electrofortico es llevado a cabo en un capilar de silica de unas 50 mm de dimetro, lo cual hace que la cantidad de calor generado sea menor y que puedan aplicarse voltajes mayores. Para que puedan ser analizados por electroforesis capilar los primers o los dideoxinucletidos (en el caso de la secuenciacin) deben ser marcados fluorescentemente con unas molculas denominadas fluorocromos que emiten fluorescencia a una determinada longitud de onda cuando son excitados por lser. El equipo en el que se realiza el proceso lleva acoplado un ordenador encargado de traducir los datos de emisiones fluorescentes en secuencias o fragmentos con sus correspondientes alelos asignados.
1. ANLISIS DE LOS RESULTADOS.

Una vez analizadas las muestras en el equipo, es necesario ver los resultados obtenidos bajo el software Squense Navigator (p.ej.) que nos va a permitir no solo editar la secuencia (en algunas posiciones el ordenador interpreta mal o no sabe cmo interpretar) sino tambin comparar nuestra secuencia con la secuencia de referencia (secuencia de Anderson) para mostrar las diferencias existentes. Por tanto finalizada la fase de lectura, antes de ser analizados, a los datos se les aplica un filtro matemtico que corrige cualquier solapamiento de los espectros de emisin ya que, aunque los
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terminadores presentan mximos de emisin a diferentes longitudes de onda, los espectros se solapan en cierta medida. El software utilizado procesa automticamente los datos recogidos en una secuencia de bases, los analiza y los visualiza en el monitor. GUA DE INTERPRETACIN. Cuando se observan diferencias entre la secuencia de referencia y la secuencia de una muestra, solo se tiene en cuenta la posicin y el nucletido que difiere. Por ejemplo Anderson describi que en la posicin 263 (HV2) haba una A, sin embargo, es frecuente que haya un cambio de esa A por una G, por tanto ser nombrada esa diferencia como 263G. Las diferencias no son solo cambios de nucletidos, tambin hay inserciones (se denominan colocando la posicin seguida de un punto y de un nmero que alude a las inserciones producidas, ejemplo 309.1C (una insercin de ese nucletido en la posicin 309), 309.2C (si son 2 las citosinas) y as sucesivamente) tambin hay delecciones (se denominan colocando la posicin seguida de una d, ejemplo 16240d). Cuando en una dete rminada posicin no se sabe que nucletido es el que la ocupa se coloca una N, ejemplo 16345N. En otras ocasiones y debido a las heteroplasmias de secuencia se puede observar que en una determinada posicin hay una mezcla de 2 nucletidos y en estos casos se debe de seguir el cdigo IUPAC, por ejemplo una mezcla de A/G se denomina como R, ejemplo 16110R. Tambin podra ocurrir que no hubiese ninguna diferencia con respecto a la secuencia de referencia. Cuando se comparan dos muestras como por ejemplo una muestra de referencia y un indicio o se comparan dos individuos, se observarn los resultados finales obtenidos y si hay 2 o ms nucletidos de diferencia se concluye que la muestra de referencia y el indicio son diferentes o que no hay relacin por va materna entre dos individuos analizados. No obstante, cuando no hay diferencias en la secuencia entre muestras se puede decir que no se pueden excluir la relacin existente entre ambas. Hoy en da se estn generando bases de datos de ADNmt que poseen datos relativos a las secuencias analizadas (concretamente a las diferencias encontradas entre cada muestra con la secuencia de referencia), y se estn haciendo grandes esfuerzos para que engloben el mayor nmero posible de secuencias y as poder realizar un abordaje estadstico que permitan establecer el clculo de las frecuencias que unas determinadas secuencias tienen en la poblacin.
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10. ANEXOS :
Figura 1. Estructura de la mitocondria.
Figura 2. Teora endosimbitica segn cientfica estadounidense Lynn Margulis.
Figura 3. Papel de la mitocondria en la obtencin de energa (ATP) Universidad Nacional Federico Villareal - Escuela de Medicina Hiplito Unanue Blgo. Cesar Ortiz Rojas 29
Figura 4. Papel de la mitocondria en la muerte celular o apoptosis.
Figura 5. Papel de la mitocondria en la termorregulacin.
Figura 6. Papel de la mitocondria en la regulacin del Ca+
Figura 7. Esquema del ADNmt humano. Se representan las dos cadenas con los genes que se codifica. OL y OH simbolizan los orgenes de la replicacin
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Fig 8. Esquema cromosoma mitocondrial
Figura 9. Genoma mitocondrial humano. La cadena pesada se representa en el exterior, indicando su origen de replicacin (OH) y la ligera en el interior, indicando tambin su origen de replicacin (OL). Los ARNt se representan por el cdigo de letra del aminocido correspondiente.
Figura 10. Genoma mitocondrial humano. La cadena pesada se representa en el exterior, indicando su origen de replicacin (OH) y la ligera en el interior, indicando tambin su origen de replicacin (OL). Los ARNt se representan por el cdigo de letra del aminocido correspondiente.
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Figura 11. Expresion de
ARNm.
Figura 12. MAPA GENTICO y DE TRANSCRIPCION del ADN mitocondrial humano.
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ADN MITOCONDRIAL Y SU APLICACIN EN MEDICINA FORENSE

ESTRUCTURA Y METABOLISMO DEL ADNMT ...................................................................... 9

8.3 Enfermedades asociadas a depleciones de ADN mitocondrial ....................................... 19 Enfermedad de Huntington......................................................................................... 19 1