Anda di halaman 1dari 26

BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Didalam bidang ilmu mikrobiologi, untuk dapat menelaah bakteri khususnya dalam skala laboratorium.Yang melatar belakangi praktikum pembuatan biakan murni ini yaitu, populasi mikroba yang ada dialam sekitar kita ini sangatlah besar dan cukup kompleks. Banyaknya spesies mikroba menguasai setiap tubuh kita, alam disekitar kita baik itu tanah, air maupun udara juga dihuni oleh kumpulan mikroorganisme. Penelitian yang layak mengenai mikroorganisme dalam berbagai habitat ini memerlukan teknik untuk memisahkan populasi campuran yang rumit ini atau biasa dikenal dengan biakan campuran. Menjadi spesies yang berbeda-beda yang dikenal dengan istilah biakan murni. Biakan murni ini berawal dari satu populasi sel saja yang semuanya berasal dari satu sel induk. (Pelczar, 1988)

Mikroorganisme dapat diperoleh dari lingkungan air, tanah dan udara substrat yang berupa bahan pangan, tanaman dan hewan. Jenis mikroorganisme dapat berupa bakteri, jamur dan lain-lain. Populasi dari mikroba yang ada dilingkungan ini sangatlah beraneka ragam sehingga dalam mengisolasi diperlukan tahap penanaman sehingga berhasil diperoleh koloni yang tunggal pemindahan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru atau yang dikenal dengan istilah inokulasi bakteri memerlukan beberapa ketelitian. Terlebih dahulu kita harus mengusahakan alat-alat yang akan digunakan untuk pengerjaan medium dan pengerjaan inokulasi benar-benar steril. Hal ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi yaitu masuknya mikroba lain yang tidak diinginkan sehingga biakan yang tumbuh didalam medium adalah benar-benar biakan murni (Dwidjoseputro, 2005).

Pemindahan bakteri dari media yang lama ke media yang baru atau yang dikenal dengan istilah inokulasi bakteri memerlukan beberapa ketelitian. Terlebih dahulu kita harus

mengusahakan alat-alat yang akan digunakan untuk pengerjaan media dan pengerjaan inokulasi benar-benar steril. Hal ini untuk menghindari terjadinya kontaminasi yaitu masuknya mikroba lain yang tidak diinginkan sehingga biakan yang tumbuh di dalam media adalah benar-benar biakan murni karena dalam keadaan yang sebenarnya, dapat dikatakan bahwa tidak ada bakteri yang hidup secara tersendiri dan terlepas dari spesies yang lainnya. untuk memudahkan pemeriksaan pada bakteri ataupun juga jamur, perlulah diadakan pemiaraan atau biakan murni, sehingga saat diperlukan pada waktuwaktu tertentu, bakteri itu selalu tersedia (Dwidjoseputro, 2005).

Didalam keadaan yang sebenarnya dapat dikatakan bahwa tidak ada bakteri yang hidup secara tersendiri terlepas dari spesies yang lainnya. Kerap kali bakteri patogen kedapatan bersama-sama dengan bakteri saprob.

Oleh karena itu, praktikum pembuatan biakan murni kali ini dilakukan agar praktikan dapat mengetahui dan memahami teknik-teknik atau cara dalam pembuatan biakan murni yang benar dan tepat khususnya teknik pembuatan biakan murni menggunakan metode cawan gores (streak plate) agar terlihat pertumbuhan yang jelas dari bakteri dan jamur biakan murni yang dikehendaki setelah diinkubasi selama 24 jam.

1.2 Tujuan Praktikum

a. Untuk mengetahui yang dimaksud dengan biakan murni b. Untuk mengetahui prinsip dari biakan murni c. Untuk mengetahui macam-macam teknik dasar streak pada metode cawan gores

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

Pembiakan adalah proses memperbanyak mikroorganisme dengan memberikan keadaan lingkungan yang tepat. Menumbuhkan mikroorganisme adalah membuat replika dari mikroorganisme tersebut, dan memerlukan unsur-unsur yang ada dalam komposisi kimianya. Zat makanan harus meyediakan unsur-unsur tersebut dalam bentuk yang dapat diakses secara metabolik. Biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri satu populasi jenis mikroba yang berasal dari satu sel induk. Isolasi bakteri artinya memisahkan satu jenis bakteri dari biakan campuran menjadi biakan murni. Persyaratan utama bagi isolasi dan kultuvasi fage adalah harus adanya kondisi optimum untuk pertumbuhan organisme inangnya. Sumber bakteriofag yang paling baik dan paling utama adalah habitat inangnya. Sebagai contoh fage coli yang dijumpai di dalam pencernaan dapat diisolosi dari limbah atu pupuk kandang. Hal ini dilakukan dengan sentrifugasi atau filtrasi bahan sumbrnya dan penambahan kloroform untuk membunuh sel-sel bakterinya. Ada beberapa cara yang digunakan untuk bakteri, fungi, dan khamir dengan metode garis, metode tuang, metode sebar, metode penuangan, serta micromanipulator. Dua diantaranya yang paling sering banyak digunakan adalah teknik cawan tuang dan cawan gores. Kedua metode ini didasarkan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme sedemikian rupa sehingga individu spesies dapat dipisahkan (Dwijoseputro, 1990).

Mikroorganisme dibiakan di laboratorium yang terdiri dari bahan nutrient. Biasanya pemilihan medium yang dipakai bargantung pada banyak faktor seperti apa jenis mikroorganisme yang akan ditumbuhkan. Perbenihan untuk pertumbuhan bakteri agar dapat tetap dipertahankan harus mengandung sema zat makanan yang diperlukan oleh mikroorganisme tersebut. Faktor lain seperti pH, suhu, dan pendimginan harus dikendalikan dengan baik (Dwijoseputro, 1990).

Selain untuk tujuan diatas medium juga memiliki fungsi lain seperti tempat untuk mengisolasi, seleksi, evaluasi dan differensiasi biakan yang didapatkan. Agar tiap-tiap

medium memiliki karakteristik yang sesuai dengan tujuan sehingga seringkali digunakan beberapa jenis zat tertentu yang mempunyai pengaruh terhadap pertumbuhan dan perkembangbiakan mikroba. Beberapa Indikasi pembiakan bakteri pada laboratorium mikrobiologi meliputi 1. Pengasingan (Isolasi) mikroba pada biakan bakteri. 2. Menunjukkan sifat khas mikroba 3. Untuk menentukan jenis mikroba yang diisolasi dengan cara-cara tertentu 4. Untuk mendapatkan bahan bakteri yang cukup untuk membuat antigen dan percobaan serologi lainya 5. Menentukan kepekan kuman trhadap antibiotik 6. Menghitung jmlah kuman 7. Mempertahankan biakan mikroba (Dwijoseputro, 1990).

Penanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkan bakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Untuk melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusakan agar semua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini agar menghindari terjadinya kontaminasi (Dwijoseputro, 1990).

Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik penanaman bakteri (inokulasi) yaitu : 1. Menyiapkan ruangan Ruang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus steril agar tidak terjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaaan. Dalam labotarium pembuataan serum vaksin dan sebagainya. Inokulasi dapat dilakukan dalam sebuah kotak kaca (encast ) udara yang lewat dalam kotak tersebut dilewatkan saringan melalui suatu jalan agar tekena sinar ultraviolet. 2. Pemindahan dengan dengan pipet Cara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum atau pada penyelidikan untuk diambil1 ml contoh yang akan diencerkan oleh air sebanyak 99 ml murni. 3. Pemindahan dengan kawat inokulasi

Kawat inokulasi sebaliknya dari platina atau nikel. Ujungnya boleh lurus jugaboleh berupa kolongan yang diameternya 1 - 3 mm. Dalam melakukan penanaman bakterikawat ini terlebih dahulu dipijarkan sedangkan sisanya tungkai cukup dilewatkan nyala api saja setelah dingin kembali kawat itu disentuhkan lagi dalam nyala (Dwijoseputro, 1990).

Dalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh suatu biakan murni tetapi juga bagaimana memelihara serta mencegah pencemaran dari luar. Medium untuk membiakan mikroba haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaran

(kontaminasi) dari luar terutama berasal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme. Teknik Isolasi Dan Pemurnian Teknik isolasi mikroba untuk memisahkan dan mengidentifikasi, jenis mikroba dari biakan dapat diklasifikasikan berdasarkan sifat pertumbuhan yang nampak pada media. a. Cara penanaman pada agar Pada metode penanaman pada agar, jika sedikit saja sel diletakkan dalam medium agar, maka tiap sel akan tumbuh menjadi koloni yang terpisah. Jika suspensi sel cukup diencerkan, koloni akan terpisah dengan baik, sehingga masing-masing memiliki kemungkinan tinggi untuk diturunkan menjadi sel tunggal. Namun untuk membuat yang demikian, penting untuk mengambil satu tipe koloni yang diinginkan, memasukkan ke dalam air dan menanamnya kembali ke agar. Dengan mengulangi prosedur ini beberapa kali menjamin untuk memperoleh biakan murni (Waluyo, 2008).

b. Cara penggoresan Cara ini lebih menguntungkan bila ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan keterampilan yang diperoleh dari latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah tetapi kelemahan dari cara ini adalah bakteri - bakteri anareob tidak dapat tumbuh (Waluyo, 2008). a. Goresan T 1. Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada bagian luar dasar cawan petri 2. Inokulasi daerah satu sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung

3. Panaskan ose dan biarkan dingin kembali 4. Gores ualang daerah satu sebanyak 3-4 kali dan teruskan goresan didaerah kedua 5. Dipijarkan kembali ose dan biarkan dingin kembali 6. Prosedur diatas diulangi untuk daerah ketiga (Waluyo, 2008)

b. Goresan kuadran Teknik ini sama dengan goresan T hanya lempengan agar dibagi menjadi 4 (Waluyo, 2008)

c. Goresan radian 1. Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan 2. Pijarkan sengkelit dan dinginkan kembali 3. Putar lempengan agar lempengan 4. Putar lempengan agar dan buat goresan terputus diatas goresan sebelumnya 5. Pijarkan ose (Waluyo, 2008) dan buat goresan terputus dimulai dari bagian pinggir

d. Goresan sinambung 1. Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah prmukaan lempengan agar 2. Jangan pijarkan ose, putar lempengan , gunakan sisi mata ose yang sama dan gores pada sisa permukaan lempengan agar (Waluyo, 2008).

c. Cara penuangan Metode ini pertama kali dilakukan oleh Robert Koch (1843-1955). Cara lain untuk memperoleh biakan koloni murni dari populasi campuran mikroorganisme adalah dengan mengencerkan eksperimen dalam medium agar yang telah dicairkan dan didinginkan yang kemudian dicawankan. Karena konsentrasi sel-sel mikroba didalam eksprimen pada umumnya tidak diketahui sebelumnya, maka pengenceran perlu dilakukan beberapa tahap sehingga sekurang-kurangnya satu diantara cawan-cawan tersebut mengandung koloni-koloni terpisah baik diatas permukaan maupun didalam

agar. cara ini memboroskan waktu namun tidak memerlukan keterampilan yang terlalu tinggi (Waluyo, 2008).

d. Cara pengenceran Cara ini pertama kali dilakukan oleh Lister (1865). Lister berhasil memelihara murni streptococcus lactis yang diisolasi dari susu yang sudah masam. Caranya adalah dengan mengencerkan suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam spesies kemudian diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Pengenceran ini kemudian diambil 1 ml untuk diencerkan lagi kalau perlu, dari enceran yang kedua ini diambil 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut. Langkah selanjutnya adalah pengenceran yang ketiga diatas diambil 0,1 ml untuk disebarkan pada suatu medium padat, kemungkinan besar kita dapat memperoleh beberapa koloni tumbuh dalam medium tersebut tetapi mungkinjuga kita memperoleh satu koloni saja (Waluyo, 2008).

e. Cara penyebaran (agar sebar) Pengenceran sampel sama seperti pada cara penuangan dengan memipet sebanyak 0,1 ml cairan dari botol pengencer dan biakan cairan mengalir keatas permukaan agar. Cairan sample disebarkan dengan penyebar yang terbuat dari gelkan. Pada tehnik ini steririlasi penyebar dilakukan dengan mencelupkan kedalam alkohol dan kemudian dipanaskan sehingga terbakar habis. Penyebar didinginkan dahulu sebelum dugunakan untuk menyebar cairan sampai pada prmukaan agar lempengan tersebut (Waluyo, 2008).

f. Cara tusuk Cara tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan ujung jarum ose yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke dalam media (Waluyo, 2008).

Perbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri

1. Inokulasi jamur menggunakan jarum ose bentuk batang. Hifa yang berbentuk seperti benang mudah diambil dengan jarum ose batang dan mudah sekali tumbuh di dalam suatu media. 2. Inokulasi bakteri menggunakan jarum ose bentuk bulat. Pada ujung jarum ose yang berbentuk bulat, bakteri akan dapat terambil dalam jumlah yang relatif banyak (Dwijoseputro, 1990).

Terdapat berbagai cara mengisolasi mikroba yaitu, (Dwijoseputro, 1990) 1. Isolasi pada cawan agar Prinsip pada metode isolasi cawan agar adalah mengencerkan mikroorganisme sehingga diperoleh individu spesies yang dapat dipisahkan dari organis lainnya. Setiap koloni yang terpisah yang tampak pada cawan tersebut setelah inkubasi berasal dari sel tunggal terdapat beberapa cara dalam metode isolasi pada agar cawan yaitu, metode gores kuadran dan metode agar cawan tuang. 2. Isolasi pada medium cair Metode isolasi pada medium cair dilakukan bila mikroorganisme tidak dapat tumbuh pada agar cawan (medium padat), tetapi hanya dapat tumbuh pada medium cair. Metode ini juga perlu dilakukan pengenceran dengan beberapa sosial pengenceran. Semakin tinggi pengenceran peluang untuk mendapatkan satu se mikroba semakin besar 3. Isolasi sel tunggal Metode isolasi tunggal dilakukan untuk mengisolasi mikroorganisme berukuran besar yang tidak dapat diisolasi dengan metode agar cawan atau medium cair. Sel mikroorganisme dilihat dengan menggunakan perbesaran sekitar 100x kemudian sel tersebut dipisahkan dengan menggunakan pipet kapiler yang sangat halus ataupun menggunakan mikromanipulator yang dilakukan secara aseptis. Usaha untuk mencegah masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan dan untuk menanam suatu spesies terdapat beberapa cara: 1) Penanaman dengan penggoresan Cara ini untuk mengasingkan kuman agar didapatkan biakan murni 2) Penanaman lapangan

Berguna untuk penentuan jenis kuman dengan bakterrofage dan uji kepekaan erhadap antibiotik 3) Biakan agar tabung Biasanya dipergunakan untuk menunjukan adanya pertumbuhan murni mikro untuk agultinasi gelas alas 4) Biakan tusukan Biasanya digunakan untuk menunjukan adanya pencairan gelatin dan

mempertahankan biakan baru 5) Biakan agar tuang Menunjukan jumlah koloni mikroba hidup yang terdapat pada suspensi 6) Biakan cairan Kegunaan untuk menunjukan biakan yang banyak dsn cepat. Kerugiannya adalah tidak dapat membuat biakan murni dari bahan yang mengandung berbagai mikroorganisme. (Waluyo, 2008)

Faktor-faktor yang mempengaruhi pertumbuhan mikroba yaitu : 1. Suplai zat gizi Mikroorganisme membutuhkan makanan sama seperti mahkluk lainnya. Jadi dengan adanya zat gizi yang cukup maka pertumbuhan mikroba akan sangat cepat. 2. Waktu Tentu saja seriap makhluk hidup termasuk mikroba membutuhkan waktu untuk berkembang biak. Pertumbuhan bakteri membentuk suatu kurva atau fase logritmik. 3. Suhu Suhu sangat penting bagi pertumbuhan mikroba, apabila suhu naik maka metabolisme naik dan pertumbuhan dipercepat atau apabila suhu naik atau turun sel berhenti melakukan kegiatan metabolisme. 4. Nilai pH Nilai pH untuk pertumbuhan bakteri adalah sekitar atau berkisar antara pH 6,0 - 8,0. 5. Aktifitas air Semua organisme membutuhkan air pada proses metabolisme. Aktifitas air adalah jumlah air yang terdapat dalam bahan pangan. Jenis mikroba yang berbeda membutuhkan air yang berbeda.

6. Ketersediaan Oksigen Mikroba terbagi atas beberapa kelompok yaitu: a) Aerobik membutuhkan udara unutk kegiatan metabolismenya. b) Anaerobik tidak dapat tumbuh dengan adanya oksigen, bahkan oksigen merupakan racun baginya. c) Anaerobik fakultatif dimana oksigen digunakan akan dipergunakan apabila tersedia, jika tidak tersedia maka akan terus anaerobik. d) Mikroerofilik mikroba yang lebih dapat tumbuh dengan kadar oksigen daripada yang di atmosfer. 7. Faktor-faktor kimia Karbon, nitrogen, hidrgen dan oksigen 8. Radiasi Sinar ultra violet, sinar x dan lain-lain (Hadioetomo, 1985).

Macam-Macam Media

Ada beberapa macam media yang digunakan untuk inokulasi yaitu : 1. Mixed culture berisi dua atau lebih spesies mikroorganisme 2. Plate culture adalah media padat dalam petridish 3. Slant culture adalah media padat dalam tabung reaksi 4. Stap culture adalah media padat dalam tabung reaksi, tetapi penanamannya dengan cara penusukan 5. Liquid culture adalah media cair dalam tabung reaksi. 6. Shake culture adalah media cair dalam tabung reaksi yang penanamannya dikocok. (Hadioetomo, 1985).

Beberapa metode yang ada dalam melakukan isolasi mikroorganisme adalah : 1. Dengan pengenceran Suatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam spesies diencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari enceran ini kemudian diambil 1 ml untuk diencerkan lagi. Bila perlu, dari enceran yang kedua ini diambil 1 ml untuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 ml untuk

disebarkan pada suatu media padat, kemungkinan besar akan didapatkan beberapa koloni tumbuh dalam media tersebut, tetapi mungkin juga hanya diperoleh suatu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini diperoleh satu koloni murni, dan selanjutnya spesies ini dapat dijadikan biakan murni. Bila belum yakin, bahwa koloni tunggal yang diperoleh itu murni, dapat diulang kembali pengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel (Dwidjoseputro, 1994).

2. Dengan penuangan Metode ini dilakukan dengan cara mengambil sedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan dan sampel ini kemudian disebarkan di dalam suatu media dari kaldu dan gelatin encer. Dengan demikian diperoleh suatu biakan adukan. Setelah media itu mengental, maka selang beberapa jam kemudian nampaklah koloni-koloni yang masing-masing dapat dianggap murni. Dengan mengulang pekerjaan seperti diatas ini, maka akhirnya akan diperoleh biakan murni yang lebih terjamin.

3. Dengan cara penggesekan Metode ini sekarang banyak digunakan, karena tidak begitu memakan waktu, hanya saja dengan metode ini maka bakteri anaerob tidak dapat tumbuh. Jika ujung kawat inokulasi dibengkokkan, kemudian ujung itu disentuhkan pada media padat, maka beberapa waktu kemudian (kurang lebih setelah 12 jam) akan tampaklah koloni-koloni yang letaknya tersebar di permukaan media. Jika diadakan pemindahan sampel dari suatu koloni yang letaknya terpencil, maka akan diperoleh suatu biakan murni (Dwidjoseputro,1994).

4. Dengan mengisolasi satu sel (single cell isolation) Dengan mikropipet dibuat beberapa tetesan bergantung pada suatu kaca penutup. Jika tampak suatu tetesan hanya mengandung satu bakteri, maka dengan menggunakan blue tip/yellow tip baru, tetesan tersebut dipindahkan ke suatu media encer dengan maksud supaya bakteri tersebut berbiak dulu. Kemudian dari sini dapat diperoleh biakan murni. Metode ini sangat memerlukan kesabaran dan micromanipulator memiliki harga yang mahal (Dwidjoseputro,1994).

5. Penanaman pada agar (plating) Tidak seperti sel-sel dalam media cair, sel-sel dalam atau pada media gel dibuat menetap. Oleh karenanya, cukup sedikit sel saja yang diletakkan dalam atau pada media gel, maka sel akan tumbuh menjadi koloni yang terpisah. Bahan gel ideal untuk kebanyakan media mikrobiologi adalah agar atau polisakarida asam dari ekstrak alga merah tertentu.

Untuk mempelajari sifat-sifat pada suatu mikroorganisme, adalah penting untuk melakukan hal tersebut. Sel yang tunggal harus diisolasi dari keberadaan seluruh sel lainnya dengan cara sedemikian rupa sehingga patogen yang terkumpul dapat terpisah. Koloni yang tumbuh terpisah ditumbuhkan kembali untuk mendapatkan isolat murni. Isolasi murni dilakukan dengan mengoleskan ose steril pada koloni dalam kultur campuran yang benar-benar terpisah satu sama lain. Olesan tersebut digores pada media padat agar miring dalam tabung reaksi atau cawan petri. Koloni yang tumbuh dalam media ini merupakan isolat murni, yang hanya berasal dari satu jenis bakteri saja (Hadioetomo, 1985).

Biakan murni bakteri adalah biakan yang terdiri atas satu spesies bakteri yang ditumbuhkan dalam media buatan. Media buatan tersebut berfungsi sebagai media pertumbuhan. Pada media ini bakteri dapat tumbuh dan berkembang biak. Bahan dasar yang digunakan untuk media pertumbuhan ini adalah agar-agar. Untuk bakteri heterotrof, media dilengkapi dengan air, molekul makanan (misal gula), sumber nitrogen, dan mineral. Untuk hasil yang lebih baik agar bakteri tumbuh, alat dan bahan yang digunakan harus disterilkan terlebih dahulu. Ilmuan yang berjasa dalam rangka pengembangan teknik biakan murni adalah Robert Koch yang merupakan penerima hadiah nobel pada tahun 1905. Robert Koch menyadari perlunya suatu bahan pemadat dalam teknik biakan murni. Bahan pemadat yang digunakan olehnya adalah gelatin.

Cara lain yang sering juga dilakukan dalam pembuatan biakan murni adalah dengan menggunakan kultur khusus, artinya sebuah media khusus yang bersifat memberi kemudahan bagi tumbuhnya galur mikroba. Tetapi cara kultur khusus masih dimungkinkan tumbuhnya galur yang lain namun dengan sifat yang hampir bersamaan

Teknik Aseptik

Sebelum benar-benar dilakukan proses kultur mikroorganisme, pertama kali kita harus mempertimbangkan bagaimana agar tidak terjadi kontaminasi. Mikroorganisme ada dimana-mana. Karena ukurannya yang sangat kecil, mereka mudah lepas dalam udara dan permukaan. Maka dari itu, kita harus mensterilisasikan medium kultur secepatnya setelah preparasi untuk pemindahan mikroorganisme siap dikontaminasikan, ini biasanya terbunuh. Bagaimanapun, itu sama pentingnya untuk tindakan pencegahan sampai penanganan berikutnya mediun kultur harus tetap steril. Demikian materi yang lain yang akan kontak juga harus tetap terjaga kesterilannya (Hadioetomo, 1985).

Teknik yang digunakan dalam pencegahan kontaminasi hingga kultur manipulasi dan media kultur steril disebut teknik aseptik. Keunggulan itu dibutuhkan keberhasilan dalam laboratorium mikrobiologi, dan salah satu cara belajar dengan pendamping mikrobilogi. Kontaminasi udara paling sering menjadi masalah karena udara selalu kontak dengan partikel debu dan umumnya banyak komunitas mikroorganisme didalamnya. Ketika wadah dibuka maka segera ditangani agar tidak terkontaminasi dengan udara sekitar. Transfer aseptik pada kultur dari salah satu medium ke medium yang lain harus lihai dengan loop inokulasi atau jarum harus disterilkan oleh pembakaran pada nyala api. Dalam pertumbuhan kultur dibutuhkan tempat yang mudah dipindahkan ke permukaan agar datar,dimana pertumbuhan suatu koloni berasal dari pertumbuhan dan pembelahan sel tunggal.

Teknik Pembiakan

Pembiakan adalah proses perbanyakan organisme melalui penyediaan kondisi lingkungan yang sesuai. Mikroorganisme yang sedang tumbuh membuat replika dirinya, membutuhkan adanya elemen-elemen dalam komposisi kimia mereka. Nutrisi harus menyediakan elemen ini dalam bentuk yang mudah dimetabolisme. Faktor-faktor yang harus dikontrol selama pertumbuhan meliputi nutrisi, pH, temperatur, aerasi, konsentrasi garam dan kekuatan ionik medium. Teknik pembiakan dilakukan berdasarkan tujuan melakukan pembiakan mikroorganisme. Umumnya tiga situasi dapat ditemukan yaitu :

1. Memperbanyak atau menumbuhkan spesies tertentu 2. Menentukan jumlah dan tipe organism yang ada pada sample 3. Mengisolasi organisme tertentu dari sumber alami. Untuk memperbanyak spesies tertentu harus disiapkan media yang mengandung bahan dan kondisi yang sesuai untuk pertumbuhan spesies tersebut. Untuk hal ini cukup dibutuhkan satu jenis media tetapi bersifat selektif dan kaya nutrient sehingga pertumbuhan akan berjalan baik (Waluyo, 2004).

1. Teknik Penggoresan Agar a. Agar miring Pembuatan agar miring tidak boleh menyentuh tutup tabung saat dimiringkan. Agar ini mempunyai permukaan luas sehingga sering digunakan untuk menumbuhkan atau menyimpan biakan murni. Beberapa teknik goresan yang biasa digunakan adalah goresan T, goresan kuadran, goresan radix dan goresan sinambung b. Agar tegak Tabung yang berisi agar dibiarkan tegak hingga beku. Agar tegak ini digunakan untuk membiakkan bakteri dengan cara tusuk (Hadioetomo, 1985).

2. Identifikasi Setelah diperoleh koloni yang terpisah, dapat dilakukan berbagai uji biokimia. Uji biokimiadidasarkan pada berbagai hasil metabolisme yang disebabkan oleh daya kerja enzim. Jarang sekali dapat ditentukan suatu genus berdasarkan sifat morfologi atau biakan saja. Karena uji biokimia memerlukan berbagai media, maka dari koloni yang terpisah perlu dibuat dahulu biakan harian dari koloni tersebut. Cara membuat preparat basah a. Kaca obyek dibersihkan dengan kapas yang diberi alkohol b. Pindahkan dua mata ose suspensi biakan ke kaca objek. Untuk preparat biasa digunakan kaca obyek biasa. c. Tutuplah dengan kaca penutup d. Periksa dengan pembesaran 10x atau 40x (Hadioetomo, 1985).

Alat-alat yang digunakan dalam praktikum adalah sebagai berikut:

a. Cawan Petri Cawan petri berfungsi untuk membiakan (kultivasi) mikroorganisme. Medium dapat dituang ke cawan bagian bawah dan cawan bagan atas sebagai penutup. Cawan petri tersedia dalam berbagai macam ukuran, diameter cawan yang biasa berdiameter 15 cm dapat menampung media sebanyak 15 - 20 ml, sedangkan cawan berdiameter 9 cm kira-kira cukup diisi media sebanyak 10 ml. b. Tabung Reaksi Didalam mikrobiologi tabung reaksi digunakan untuk uji-uji biokimiawi dan menumbuhkan mikroba. Tabung reaksi dapat diisi media padat maupun cair. Tutup tabung reksi dapat berupa kapas, tutup metal, tutup plastik atau alumunium foil. Media yang padat dimasukkan ke tabung reaksi dapat diatur menjadi 2 bentuk menurut fungsi yaitu media agar tetap tegak dan agar miring. Untuk membuat agar miring, perlu diperhatikan tentang kemiringan media yaitu luas permukaan yang kontak dengan udara tidak terlalu lebar dan hindari jarak media yang terlalu dekat dengan mulut tabung karena memperbesar resiko kontaminasi. Untuk alasan efisiensi, media yang ditambahkan berkisar 10 - 12 ml tiap tabung. c. Laminar Air Flow Cabinet Laminar Air Flow Cabinet adalah alat sterilisasi yang menggunakan prinsip filtrasi udara dan penggunaan radiasi ultraviolet. Laminar air flow digunakan sebagai tempat untuk melakukan kegiatan laboratorium yang membutuhkan kondisi steril, seperti membuka alat yang telah disterilisasi dan menyiapkan samel mikrobia. Lingkungan dalam laminar air flow disterilisasi dengan 2 cara. Sebelum digunakan, laminar air flow ditutup dan lampu UVR dinyalakan sehingga mikrobia di udara dan permukaan ruang mati, lalu saat bekerja, kondisi udara dijaga stabil dengan filtrasi udara. Komponen laminar air flow antara lain ruang kaca steril yang dilengkapi dengan tutup, filter udara di bagian belakang, lampu UVR di langit-langit ruang, lampu biasa untuk membantu proses kerja, serta panel tombol untuk menyalakan lampu UVR, filter dan lampu biasa. d. Jarum Inokulum Jarum inokulum berfungsi untuk memindahkan biakan untuk ditanam/ditumbuhkan ke media baru. Jarum inokulum biasanya terbuat dari kawat platinum sehingga dapat berpijar jika terkena panas. Bentuk ujung jarum dapat berbentuk lingkaran dan ada

yang berbentuk lurus. Yang berbentuk lingkaran cocok untuk melakukan streak di permukaan agar, sedangkan yang berbentuk lurus cocok digunakan untuk inokulasi secara tusukan pada agar tegak (Hadioetomo, 1985).

Jadi akan lebih baik bila dilanjutkan dengan melakukan pengenceran sehingga hasil yang didapatkan akan lebih meyakinkan terutama dalam hal kemurniannya. Cara ini disebut pula sebagai cara kultur pemerkaya dari istilah inggrisnya enrichment culture.

Membiakkan bakteri dapat dilakukan dengan berbagi cara, yaitu pengembangbiakan dalam media cawan petri dan dalam tabung reaksi. Pengembangbiakan dalam cawan petri ada beberapa metode, yaitu metode cawan gores (streak plate), metode cawan tuang (pour plate), dan metode cawan sebar (spread plate).

Kesulitan dari metode cawan gores adalah proses penggoresan yang cukup lama dan sulit, sehingga memudahkan terjadinya kontaminasi dan kegagalan. Prinsip metode ini yaitu mendapatkan koloni yang benar-benar terpisah dari koloni yang lain, sehingga mempermudah proses isolasi. Metode cawan gores terdapat 3 tahap, yaitu : first streak, second streak, dan third streak. Pada tahap-tahap tersebut mepunyai goresan yang berbeda, yaitu first streak dengan goresan lebih rapat, pada second streak dengan goresan yang agak renggang, dan pada third streak dengan goresan yang lebih renggang lagi (Hadioetomo, 1985).

Metode cawan tuang sangat mudah dilakukan karena tidak membutuhkan keterampilan khusus dengan hasil biakan yang cukup baik. Metode ini dilakukan dengan mengencerkan sumber isolat yang telah diketahui beratnya ke dalam garam fisiologis (NaCl) atau larutan buffer fosfat. Larutan ini berperan sebagi penyangga pH agar sel bakteri tidak rusak akibat menurunnya pH lingkungan. Pengenceran dapat dilakukan beberapa kali agar biakan yang didapatkan tidak terlalu padat atau memenuhi cawan (biakan terlalu padat akan mengganggu pengamatan). Penuangan dilakukan secara aseptik atau dalam kondisi steril agar tidak terjadi kontaminasi atau tumbuh atau masuknya organisme yang tidak diinginkan (di laboratorium, kontaminasi biasanya terjadi akibat tumbuhnya kapang, seperti Penicilium dalam biakan). Media yang dituang

hendaknya tidak terlalu panas, karena selain mengganggu proses penuangan (media panas sebabkan tangan jadi panas juga), media panas masih mengeluarkan uap yang akan menempel pada cawan penutup, sehingga mengganggu proses pengamatan. pada metode ini, koloni akan tumbuh di dalam media agar. Kultur diletakkan terbalik, dimasukkan di dalam plastik dengan diikat kuat kemudian diletakkan dalam inkubator (Hadioetomo, 1985).

Pada metode cawan sebar, suspensi bakteri yang telah diencerkan disebar pada media penyubur steril yang telah disiapkan. Selanjutnya, suspensi dalam cawan diratakan dengan drygalski stick agar koloni tumbuh merata pada media dalam cawan tersebut, kemudian diletakkan dalam inkubator pada suhu 37oC selama 1 - 2 hari. Metode ini cukup sulit terutama saat meratakan suspensi dengan drygalski stick. Alih-alih koloni tumbuh merata, tapi biakan justru terkontaminasi. Oleh karena itu, drygalski stick harus benar-benar steril, yaitu dengan mencelupkannya terlebih dahulu dalam alkohol kemudian dipanaskan dengan api bunsen. Perlu diingat, drygalski stick yang masih panas akibat pemanasan dengan api bunsen, dapat merusak media agar, sehingga harus didinginkan terlebih dahulu dengan meletakkannya di sekitar api bunsen ( 15 cm). Dengan metode ini, satu sel bakteri akan tumbuh dan berkembang menjadi satu koloni bakteri. Satu koloni bakteri yang terpisah dengan koloni lainnya dapat diamati tipe pertumbuhan pada masing-masing media, diantaranya dilakukan terhadap konsistensi, bentuk koloni, warna koloni, dan permukaan koloni (Hadioetomo, 1985).

BAB III METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat


Praktikum tentang Pembuatan Biakan Murni yang dilakukan pada hari Kamis, tanggal 8 November 2012 pukul 15.30 - 17.00 WITA dan pengamatan dilakukan pada hari jumat 9 November 2012, pukul 16.00 16.30 di Laboratorium Rekayasa Lingkungan, Fakultas Teknik, Universitas Mulawarman, Samarinda.

3.2 Alat dan Bahan


3.2.1 Alat 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. Jarum Ose Cawan Petri Tabung reaksi Rak tabung reaksi Incubator Lampu Bunsen Laminar air flow cabinet Alat tulis Korek api

10. Mikro pipet 11. Pipet volum 12. Beaker Glass 13. Batang pengaduk 14. Pipet tetes 15. Hot Plate 16. Stirrer

3.2.2 Bahan 1. Media PDA (Potato Dextrose Agar)

2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Media NA (Nutrient Agar) Bakteri Kertas label Alkohol 70% Aquades Sabun cuci tangan Serbet Tisu

10. Alumunium Foil 11. Spiritus 12. Sarung tangan

3.2 Cara Kerja


3.3.1 Metode cawan gores pada cawan petri (media NA) 1. 2. 3. 4. Disterilkan tangan dengan menggunakan sabun dan alkohol 70% Dibakar jarum ose menggunakan lampu bunsen hingga pijar Didinginkan terlebih dahulu jarum ose sebelum mengambil bakteri Diambil cawan petri yang telah berisi media NA kemudian dipanaskan pinggiran cawan petri dekat lampu bunsen 5. Dibuka perlahan cawan petri sambil menggesekkan jarum ose yang telah disterilkan untuk mengambil bakteri 6. Dibuka cawan petri yang kosong lalu digesekkan jarum ose pada cawan dengan metode cawan gores 7. Ditutup cawan petri lalu dimasukkan ke dalam inkubator dengan suhu 37oC selama 24 jam

3.3.2 Metode cawan gores pada tabung reaksi (Media PDA miring) 1. 2. 3. Disterilkan tangan dengan menggunakan sabun dan alkohol 70% Dibakar jarum ose / disterilkan menggunakan lampu bunsen hingga pijar Diambil cawan petri yang telah berisi bakteri lalu dipanaskan menggunakan lampu bunsen mengenai pinggiran cawan petri tersebut

4. 5.

Diambil bakteri dengan menggunakan jarum ose yang telah disterilkan Diambil tabung reaksi yang berisi media PDA miring dibuka alumunium foil dan di dekatkan pada lampu bunsen

6.

Digoreskan jarum ose yang sudah ada bakterinya pada tabung reaksi dengan metode cawan gores

7.

Ditutup kembali tabung reaksi dengan alumunium foil, lalu dimasukkan ke dalam inkubator dengan suhu 37oC selama 48 jam

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan


Tabel pengamatan pembuatan biakan murni

No. 1.

Media

Keterangan 1. Terdapat streak pada media NA

Media NA

2. Terdapat kontaminan 3. Terdapat pertumbuhan bakteri

2. Media PDA

1. Tidak

terdapat

streak

pada

media PDA miring 2. Tidak bakteri 3. Terdapat kontaminan terdapat pertumbuhan

4.2 Pembahasan

Laminar digunakan pada saat kita akan menanam tanaman ke dalam botol. Pada saat itu kondisi botol terbuka, berarti kita harus menyediakan kondisi lingkungan yang steril, karena kita harus bekerja serba steril semua baik tanamannya, alat, bahan. Di dalam ruang Laminar Air Flow kondisi steril karena Laminar Air Flow menggunakan filter steril HEPA 99,99% ditambah dengan prefilter lannya. Jadi kita dapat menanam kultur tanpa takut terkontaminasi Laminar Air Flow adalah alat sterilisasi yang menggunakan prinsip filtrasi udara dan penggunaan radiasi ultraviolet. Laminar air flow digunakan sebagai tempat untuk melakukan kegiatan laboratorium yang membutuhkan kondisi steril, seperti membuka alat yang telah disterilisasi dan menyiapkan samel mikrobia. Lingkungan dalam laminar air flow disterilisasi dengan 2 cara. Sebelum digunakan, laminar air flow ditutup dan lampu UVR dinyalakan sehingga mikrobia di udara dan permukaan ruang mati, lalu saat bekerja, kondisi udara dijaga stabil dengan filtrasi udara. Komponen laminar air flow antara lain ruang kaca steril yang dilengkapi dengan tutup, filter udara di bagian belakang, lampu UVR di langit-langit ruang, lampu biasa untuk membantu proses kerja, serta panel tombol untuk menyalakan lampu UVR, filter dan lampu biasa.

Faktor-faktor kesalahan yang sering terjadi saat praktikum pembuatan biakan murni ini adalah praktikan kurang berhati-hati dalam menggoreskan dan menyebarkan bakteri di atas permukaan media. Sehingga media tercongkel dan retak. Dan praktikan tidak yakin dan sedikit gugup saat menggoreskan dan menyebarkan bakteri di atas media, sehingga penyebaran dan penggoresan yang tidak merata.

Yang digunakan dalam praktikum ini adalah metode gores. Teknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapi memerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yang sempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaan media agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antara garisgaris goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuh menjadi koloni. Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng.

Bila dilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadang berbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaitu untuk membuat goresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan. Ada beberapa teknik dalam metode goresan, yakni : a. Goresan T 1. Lempengan dibagi menjadi 3 bagian dengan huruf T pada bagian luar dasar cawan petri 2. Inokulasi daerah satu sebanyak mungkin dengan gerakan sinambung 3. Panaskan ose dan biarkan dingin kembali 4. Gores ualang daerah satu sebanyak 3-4 kali dan teruskan goresan didaerah kedua 5. Dipijarkan kembali ose dan biarkan dingin kembali 6. Prosedur diatas diulangi untuk daerah ketiga

b. Goresan kuadran Teknik ini sama dengan goresan T hanya lempengan agar dibagi menjadi 4 c. Goresan radian 1. Goresan dimulai dari bagian pinggir lempengan 2. Pijarkan sengkelit dan dinginkan kembali 3. Putar lempengan agar dan buat goresan terputus dimulai dari bagian pinggir lempengan 4. Putar lempengan agar dan buat goresan terputus diatas goresan sebelumnya 5. Pijatkan ose d. Goresan sinambung 1. Ambil satu mata ose suspensi dan goreskan setengah prmukaan lempengan agar 2. Jangan pijarkan ose, putar lempengan , gunakan sisi mata ose yang sama dan gores pada sisa permukaan lempengan agar

Untuk pecobaan pertama, yaitu media NA pertama-tama cuci tangan terlebih dahulu menggunakan sabun dan bilas dengan aquadest dan semprotkan alkohol 70%. Kemudan diambil media NA dan PDA serta bakteri dari inkubator lalu kemudian Dibakar jarum ose dilampu bunsen dengan posisi tegak lurus hingga pijar, kemudian didinginkan.

kemudian diambil bakteri dari cawan petri dengan menggunakan jarum ose Sebelum cawan petri dibuka, cawan petri harus dibakar terlebih dahulu kemudian setelah itu digoreskan perlahan dicawan petri sesuai dengan urutan penggoresan secara zig zag pada media NA secara 3 streak. First Streak, menggunakan jarum ose digoreskan pada media NA dicawan petri dengan goresan pertama digores secara rapat Second streak, menggunakan jarum ose digoreskan pada media NA dicawan petri dengan goresan kedua digores agak jarak. menggunakan jarum ose Third streak digoreskan pada media NA dicawan petri dengan goresan ketiga digores jarang ketiga goresan dilakukan secara tidak terputus dan selalu menyambung dari goresan pertama hingga goresan ketiga Setelah itu cawan petri dimasukkan ke dalam inkubator dengan posisi terbalik. Agar uap air tidak terjatuh ke media saat penguapan dan agar tidak terjadi kontaminasi yang menyebabkan bakteri tidak dapat tumbuh.

Untuk percobaan kedua yaitu media PDA. Pertama cuci tangan terlebih dahulu menggunakan sabun dan bilas dengan aquadest dan semprotkan alkohol 70%. Dibakar terlebih dahulu jarum ose didekat lampu bunsen hingga pijar kemudian diambil bakteri dari cawan petri lalu digoreskan secara zig zag pada tabung reaksi yang berisi PDA. Setelah itu, tabung reaksi dibakar agar steril. Dan terakhir, tabung reaksi ditaruh di dalam inkubator dengan posisi terbalik.

Pembiakan adalah proses memperbanyak mikroorganisme dengan memberikan keadaan lingkungan yang tepat. Menumbuhkan mikroorganisme adalah membuat replika dari mikroorganisme tersebut, dan memerlukan unsur-unsur yang ada dalam komposisi kimianya. Zat makanan harus meyediakan unsu-unsur tersebut dalam bentuk yang dapat diakses secara metabolik. Biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri satu populasi jenis mikroba yang berasal dari satu sel induk. Isolasi bakteri artinya memisahkan satu jenis bakteri dari biakan campuran menjadi biakan murni.

BAB V PENUTUP

5.1 Kesimpulan

a. Biakan murni adalah biakan yang hanya terdiri satu populasi jenis mikroba yang
hanya berasal dari satu sel induk saja. b. Prinsip dari biakan murni ialah memisahkan satu jenis (spesies) mikroba (bakteri dan jamur) dengan mikroba lain yang berasal dari campuran bermacam-macam mikroba. c. Cara menggores yang benar adalah streak pertama (first streak) dengan kisaran goresan lebih rapat dibandingkan streak kedua dan ketiga, streak kedua (second streak) harus lebih besar sedikit ukuran goresannya terhadap goresan pertama dan streak ketiga (third streak) goresan yang dilakukan harus lebih renggang dibandingkan goresan pertama dan kedua.

5.2 Saran
Diharapkan sebelum melaksanakan praktikum tangan dicuci bersih dan dibilas dengan alkohol, sehingga alat tidak terkontaminasi.

DAFTAR PUSTAKA

1. Dwidjoseputro.1990. Dasar-dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan

2. Hadioetomo, R. S. 1985. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Gramedia: Jakarta..

3. Waluyo, Lud. 2004. Mikrobiologi Umum. Malang:Universitas Muhammadiyah