ELEMENTOS DEL OPERN Jacob, Monod y colaboradores analizaron el sistema de la lactosa en E.

coli, de manera que los resultados de sus estudios permitieron establecer el modelo gentico del Opern que permite comprender como tiene lugar la regulacin de la expresin gnica en bacterias. Jacob y Monod recibieron en 1965 el Premio Nobel pos estas investigaciones.

Francois Jacob

Jacques Monod

Un Opern es grupo de genes estructurales cuya expresin est regulada por los mismos elementos de control (promotor y operador) y genes reguladores. Los principales elementos que constituyen un opern son los siguientes: Los genes estructurales: llevan informacin para polipptidos. Se trata de los genes cuya expresin est regulada. Los operones bacterianos suelen contener varios genes estructurales, son polignicos o policistrnicos. Hay algunos operones bacterianos que tienen un solo gene estructural. Los operones eucariticos suelen contener un slo gen estructural siendo monocistrnicos. El promotor (P): se trata de un elemento de control que es una regin del ADN con una secuencia que es reconocida por la ARN polimerasa para comenzar la transcripcin. Se encuentra inmediatamente antes de los genes estructurales. Abreviadamente se le designa por la letra P. El operador (O): se trata de otro elemento de control que es una regin del ADN con una secuencia que es reconocida por la protena reguladora. El operador se sita entre la regin promotora y los genes estructurales. Abreviadamente se le designa por la letra O. El gen regulador (i): secuencia de ADN que codifica para la protena reguladora que reconoce la secuencia de la regin del operador. El gen regulador est cerca de los genes estructurales del opern pero no est inmediatamente al lado. Abreviadamente se le denomina gen i. Protena reguladora: protena codificada por el gen regulador. Est protena se une a la regin del operador. Inductor: sustrato o compuesto cuya presencia induce la expresin de los genes.

Elementos del opern lactosa

Elementos de control Elementos que intervienen en la regulacin de la expresin Molculas difusibles gnica en bacterias. Elementos del Opern. Genes Estructurales Gen regulador

Promotor Operador Protenas reguladoras Efectores Inductores Codifican para polipptidos Codifica para protena reguladora

EL OPERN LACTOSA: CONTROL NEGATIVO El Opern lactosa, que abreviadamente se denomina Opern lac, es un sistema inducible que est bajo control negativo, de manera que la protena reguladora, producto del gen regulador i, es un represor que impide la expresin de los genes estructurales en ausencia del inductor. El inductor del sistema es la lactosa. Como veremos ms adelante, el opern lac tambin est bajo control positivo, ya que existe otra protena que estimula la transcripcin de los genes estructurales. Los genes estructurales del opern lactosa son los siguientes: El gen z+: codifica para la -galactosidasa que cataliza la hidrolisis de la lactosa en glucosa ms galactosa. El gen y+: codifica para la galactsido permeasa que transporta -galactsidos al interior de la clula bacteriana.

El gen a+: codifica para la tiogalactsido transacetilasa que cataliza la transferencia del grupo acetil del acetil Coenzima A al 6-OH de un aceptor tiogalatsido. Este gen no est relacionado con el metabolismo de la lactosa.

El verdadero inductor del sistema es la Alolactosa y no la lactosa de manera que la galactosidasa transforma la lactosa en Alolactosa. En los estudios del opern lactosa se utiliza como inductor un anlogo sinttico de la lactosa que es el Isopropil tiogalactsido (IPTG). El IPTG no necesita ser transportado por la galactsido permeasa para entrar en la bacteria. Las cepas normales de E. coli son inducibles, de manera que en ausencia del inductor (la lactosa), la protena represora producto del gen i se encuentra unida a la regin operadora e impide la unin de la ARN-polimerasa a la regin promotora y, como consecuencia, no se transcriben los genes estructurales.

Opern lactosa en ausencia de lactosa Sin embargo, en presencia del inductor (la lactosa), este se une a la protena reguladora que cambia su conformacin y se suelta de la regin operadora dejando acceso libre a la ARNpolimerasa para que se una a la regin promotora y se transcriban los genes estructurales. Por consiguiente, la presencia del inductor hace que se expresen los genes estructurales del opern, necesarios para metabolizar la lactosa.

Opern lactosa en presencia de lactosa Tambin es conveniente recordar que los tres genes estructurales del opern lactosa se transcriben juntos en un mismo ARNm, es decir que los ARN mensajeros de bacterias suelen serpolicistrnicos, polignicos o multignicos. Sin embargo, en eucariontes los mensajreos suelen sen monocistrnicos o monognicos, es decir, corresponden a la transcripcin de un solo gen estructural.

Opern lactosa: ARNm multignico o policistrnico

En la siguiente tabla se muestra la expresin de los genes del opern lactosa en ausencia y en + + + + presencia del inductor (lactosa) en una bacteria normal i p o z y a . SI = significa que se expresan, NO = significa que no se expresan. Bacteria normal Genotipo i poz y a
+ + + +

Expresin de los genes estructurales del Opern lactosa Ausencia de inductor (Sin lactosa) z
+

Presencia de inductor (Con lactosa) z

+

NO

NO

NO

SI

SI

SI

El conocimiento profundo del funcionamiento del opern lactosa se obtuvo gracias a la obtencin de mutantes que afectaban a los genes estructurales, a los elementos de control (promotor y operador) y al gen regulador. Adems, tambin fue muy importante el estudio del opern lactosa en bacterias diploides parciales o merocigotos. Bacteria diploide parcial o merocigoto: bacteria que tiene parte de sus genes en dos dosis. Lo habitual en las bacterias es que los genes estn en una sola dosis, ya que se trata de individuos + haploides. Sin embargo, a veces es posible mediante conjugacin entre una bacteria donadora F y una receptora F , obtener bacterias descendientes diploides parciales o merocigotos. Sin embargo, estos diploides parciales son inestables. Por tal motivo, fue muy importante el descubrimiento de bacterias F' que tienen en el factor sexual (plasmidio) parte del cromosoma principal bacteriano. En el caso del estudio del opern lactosa, se consiguieron factores F' que tenan incorporado exclusivamente los genes del opern lactosa. De esta forma, una bactera con un factor F' de estas caractersticas tiene dos veces los genes del opern lactosa, una en el cromosoma principal y otra en el factor F'. Los primeros mutantes fueron aislados por Lederberg y colaboradores y afectaban a los genes estructurales (z, y, a). Se dedujo que los estos genes estaban juntos y en el orden z-y-a. Los mutantes en estos genes se denominan z , y e a y ,dan lugar a alteraciones en la estructura de las enzimas codificadas por estos genes. Jacob y Monod aislaron bacterias mutantes i y O que afectan al gen regulador (i) que lleva informacin para la protena reguladora y a la regin operadora ( O), respectivamente. Ambos son mutantes de tipo constitutivo. Mutantes constitutivos: son aquellos en los que siempre se expresan o transcriben los genes del opern lactosa, independientemente de si est o no est presente el inductor. La mutacin constitutiva i altera la estructura de la protena reguladora o protena represora de manera que ya no es capaz de unirse a la regin operadora. Por tanto, esta alteracin afecta a la regin de la protena represora encargada de unirse al operador. Al no poder unirse la protena represora al operador, la regin promotora queda asequible para la ARN polimerasa y se produce la transcripcin de los genes estructurales en ausencia de inductor (lactosa). La protena represora es un tetrmero (cuatro cadenas polipeptdicas idnticas). C La mutacin constitutiva en el operador (O ), consiste en una alteracin en la secuencia de bases nitrogenadas de la regin del Operador que tienen como consecuencia que la protena reguladora producto del gen i ya no sea capaz de unirse al operador. Al no poder unirse la protena represora al operador, la regin promotora queda asequible para la ARN polimerasa y se produce la transcripcin de los genes estructurales en ausencia de inductor (lactosa). El estudio de diferentes mutantes del operador ha permitido determinar que el operador es una regin de 17 a 25 nucletidos situada justo antes del gen z y despus del promotor. Esta regin muestra una enorme especificidad por la protena represora.
C

Es importante destacar que tanto la mutacin i- como la O actan simultneamente sobre los tres genes estructurales del opern lactosa. En la siguiente tabla se indica la expresin de los genes del opern lactosa en los dos mutantes constitutivos estudiados, en el regulador constitutivo ( i- ) y C en el operador constitutivo (O ). Mutantes constitutivos Genotipo i PO z y a i PO z y a
+ C + + + + + +

Expresin de los genes estructurales del Opern lactosa Ausencia de inductor (Sin lactosa) z
+

Presencia de inductor (Con lactosa) z

+

SI SI

SI SI

SI SI

SI SI

SI SI

SI SI

Tambin es importante conocer lo que sucede en los diploides parciales o merocigotos que contienen una regin operadora normal y una regin operadora mutante constitutiva, es decir, C bacterias diploides parciales O/O .

Diploide parcial: opern lactosa En estos diploides parciales, se ha comprobado que el operador constitutivo es dominante en posicin CIS, es decir, ejerce su efecto solamente sobre los genes estructurales que estn en su misma molcula de ADN que la mutacin del operador, pero no acta sobre los genes estructurales de otra molcula de ADN. Esto significa que el operador es una secuencia de bases + en el ADN que no codifica para ninguna molcula difusible. En el siguiente diploide parcial i P O + + + + C + + + z y a / i P O z y a tanto en ausencia como en presencia de lactosa se produce la expresin de los tres genes estructurales del opern. Esto se debe a que los genes estructurales que estn en la C misma molcula de ADN que la mutacin constitutiva O se van a expresar siempre. En el C siguiente esquema se indica lo que sucede en un diploide parcial O/O en ausencia de inductor.

Diploide parcial O/O : Sin Inductor (lactosa) En el siguiente esquema se indica lo que sucede en un diploide parcial O/O en presencia de inductor. Sin embargo, en los diploides parciales con un gen regulador normal y un gen regulador mutante + + constitutivo, es decir, en baterias diploides parciales i /i , el gen regulador normal i esdominante en posicin TRANS, es decir, ejerce su efecto sobre los genes estructurales de la misma molcula de ADN en que est la mutacin del gen regulador y tambin sobre los genes estructurales de otra molcula de ADN diferente. Por tanto, el gen regulador codifica para una protena o producto difusible que puede ejercer su efecto en diferentes molculas de ADN. En el + + + + + + + siguiente diploide parcial i P O z y a / i P O z y a en ausencia de lactosa no hay expresin de los genes estructurales mientras que en presencia de lactosa si se expresan. Esto se debe a que la + protena represora normal producida por el gen i al ser difusible se puede unir a ambas regiones + operadoras. En el siguiente esquema se indica lo que sucede en un diploide parcial i /i en ausencia de inductor de inductor.
C

Diploide parcial i /i : Sin Inductor (lactosa) En la siguiente tabla se indica la expresin de los genes del opern lactosa en los dos diplides C parciales, uno con en el regulador constitutivo (i- ) y el otro con en el operador constitutivo (O ). Expresin de los genes estructurales del Opern lactosa Diploides parciales Genotipo i POz y a /i PO z y a i POz y a /i POz y a
O + + + + + + + + + + + + C + + +

+ -

Ausencia de inductor (Sin lactosa) z

+

Presencia de inductor (Con lactosa) z

+

SI NO

SI NO

SI NO

SI SI

SI SI

SI SI

Mutantes del Promotor (O ): estos mutantes presetan una alteracin en la secuencia de bases nitrogenadas de la regin promotora, como consecuencia la ARN-polimerasa no reconoce la secuencia promotora y, por consiguiente, no se produce la transcripcin de los genes estructurales. O A estos mutantes se les ha denominado "Operador cero" (O ), pero es necesario recordar que afectan a la regin promotora. Adems de los mutantes anteriormente indicados tambin se han obtenido otros tipos de mutantes que afectan al gen regulador. Entre estos mutantes se encuentran los siguientes: Mutante i : la primera mutacin que hemos visto es el mutante i que ya hemos dicho que + + es recesivo con respecto al i en los diploides parciales(i /i ). Da lugar a un represor que es inactivo. Q Mutante i : mutacin en el promotor del gen regulador que codifica para la protena Q reresora (i ): la consecuencia es que no aparece protena represora y, por tanto, siempre se estn expresando los genes del opern lactosa tanto en ausencia como en presencia del inductor. Se trata, por consiguiente, de un mutante de tipo constitutivo. -d Mutante i : afecta al gen estructural de la protena represora en la regin que codifica para el extremo amino terminal (NH2). Esta regin es la encargada de reconocer la regin operadora. La protena represora mutante se une al inductor (al IPTG) pero no es capaz de + + -d unirse al operador. Esta mutacin es dominante sobre la i en los diploides parciales (i /i ).
-

En los diploides parciales la protena represora mutante no se une a las regiones operadoras y se produce siempre la trasncripcin de los genes estructurales. S Mutante i : afecta al gen estructural de la protena represora modificando la parte central de la protena encargada de unirse al inductor (al IPTG). La protena represora mutante se une al operador pero no es capaz de reconocer al inductor (IPTG). Se trata de un mutante que est siempre reprimido en el que no se expresan los genes del opern lactosa ya que la protena represora est permanentemente unida a la regin operadora y no se suelta a + pesar de aadir el inductor. Este mutante es dominante sobre i en los diploides parciales + S (i /i ). En los diploides parciales el represor mutante se une a ambas regiones operadoras bloqueando la transcripcin de los genes estructurales.
-d S

El comportamiento de las mutaciones i e i en los diploides parciales se explica mejor sabiendo que la protena represora del opern lactosa es un tetrmero (protena constituida por cuatro cadenas polipptdicas idnticas con un peso molecular cada una de 38.000). En el diploide parcial + S (i /i ) ,los tetrmeros con polipptidos mutantes estaran unidos a las regiones operadora + -d acaparndolas de forma permanente e impidiendo la transcripcin. En el diploide parcial (i /i ) los polipptidos normal y mutante se unen al azar para formar tetrmeros, de manera que la mayora de los tetrmeros tienen al menos un polipptido mutante (15/16) y solamente una pequea fraccin de los tetrmeros tiene todos los polipptidos normales (1/16), por tanto, la inmensa mayora de los tetrmeros no son capaces de unirse a las regiones operadoras y se transcribiran los genes estructurales. OPERN LACTOSA: CONTROL POSITIVO Como ya he mencionado anteriormente, el opern lactosa tambin est sujeto a un control de tipo positivo, de manera que existe una protena que estimula la transcripcin de los genes estructurales. En los sistemas de control negativo existe una protena que que impide la transcripcin de los genes estructurales, en los sistemas de control positivo existe una prtena activadora que estimula la transcripcin de los genes. En principio existen cuatro tipos de sistemas posibles de regulacin de la expresin gnica: Tipo 1: Inducible, control negativo (opern lactosa y opern galactosa) Tipo 2: Inducible, control positivo (opern arabinosa y opern maltosa) Tipo 3: Represible, control negativo (opern triptfano y opern histidina) Tipo 4: Represible, control positivo (no se han descrito)

Por supuesto, un opern pude estar sujeto a ms de un tipo de control, como sucede en el caso del opern lactosa que esta bajo control negativo ejercido por la protena represora y bajo control positivo ejecutado por una protena activadora por catabolitos (CAP) tambin llamada protena activadora del AMP cclico (CRP). El control positivo del opern lactosaa como veremos est estrechamente relacionado con la Represin catablica. REPRESIN POR CATABOLITOS Cuando la bacteria E. coli crece en un medio que contiene glucosa, prefiere este azcar como fuente de energa y como consecuencia los operones que ponen producen las enzimas necesarias para obtener energa de otros azcares estn bloqueados. Uno de los catabolitos del metabolismo de la glucosa acta sobre el AMP cclico (AMPc). El AMP cclico (AMPc) es necesario para la transcripcin de todos los operones que son inhibidos por el catabolismo de la glucosa. Es decir, para que se transcriban los genes del opern lactosa se necesitan niveles elevados de AMPc. Esto mismo sucede con los operones de arabinosa, maltosa, galactosa, etc.. Se trata. por tanto de un sistema general de control positivo que se denomina represin catablica. Cuando E. coli crece en un medio con glucosa, los niveles de AMPc son muy bajos y como consecuencia no se

transcriben los operones de otros azcares. An no se conoce el motivo por el que los niveles de AMPc son bajos cuando E. coli crece en un medio con glucosa como fuente de energa. Cuando E. coli crece en un medio sin glucosa pero con lactosa los niveles de AMPc son altos, el AMPc se une a la protena receptora receptora de AMPc (CRP) activndola y la protena activada CRP-AMPc a su vez estimula la transcripcin de los genes estructurales del opern lactosa y de otros operones de azcares. La protena activadora por catabolitos (CAP) es un dmero que al unirse al AMPc se activa y estimula la transcripcin de los genes del opern lactosa, de manera que la protena activadora CAP-AMPc es necesaria para la unin de la ARN-polimerasa al promotor de los genes del opern lactosa. La protena activadora CAP-AMPc parece ser que se une a la regin promotora cerca del nucletido que ocupa la posicin -60 (60 nucletidos antes del comienzo del gen z). Los mutantes que afectan a la adenilato ciclasa, enzima que transforma el ATP en AMPc, muestran niveles muy bajos de expresin de los genes del opern lactosa, debido a que los niveles de AMPc son muy bajos en ausencia de glucosa. Los mutantes que afectan a la protena CRP o CAP tambin presentan niveles muy bajos de expresin de los genes del opern lactosa en ausencia de glucosa. EL OPERN TRIPTFANO El opern triptfano (opern trp) es un sistema de tipo represible, ya que el aminocido triptfano (Correpresor) impide la expresin de los genes necesarios para su propia sntesis cuando hay niveles elevados de triptfano. Sin embargo, en ausencia de triptfano o a niveles muy bajos se transcriben los genes del opern trp. Los elementos del opern trp son en esencia semejantes a los del opern lactosa: Genes estructurales: existen cinco genes estructurales en el siguiente orden trpE-trpDtrpC-trpB-trpA. Elementos de control: promotor (P) y operador (O). El promotor y el operador estn al lado de los genes estructurales y en el siguiente orden: P O trpE-trpD-trpC-trpB-trpA. Curiosamente, las enzimas codificadas por estos cinco genes estructurales actan en la ruta metablica de sntesis del triptfano en el mismo orden en el que se encuentran los genes en el cromosoma. Gen regulador (trpR): codifica para la protena reguladora. Este gen se encuentra en otra regin del cromosoma bacteriano aunque no muy lejos del opern. Correpresor: triptfano.

En el siguiente esquema se indican los elementos del Opern Triptfano:

Elementos del Opern Triptfano Los genes estructurales del opern triptfano se encuentran en el mismo orden que actan las productos codificados por ellos en la ruta biosinttica del triptfano (ver el siguiente esquema).

Orden de los genes estructurales del opern triptfano y ruta de sntesis del triptfano En ausencia de triptfano, o cuando hay muy poco, la protena reguladora producto del gen trpR no es capaz de unirse al operador de forma que la ARN-polimerasa puede unirse a la regin promtora y se transcriben los genes del opern triptfano.

Opern triptfano: en ausencia de triptfano En presencia de triptfano, el triptfano se une a la protena reguladora o represora cambiando su conformacin, de manera que ahora si puede unirse a la regin operadora y como consecuencia la ARN-polimerasa no puede unirse a la regin promotora y no se transcriben los genes estructurales del opern trp.

Opern triptfano: en presencia de triptfano Por tanto, la diferencia esencial entre el opern lac (inducible) y el opern trp (represible), es que en este ltimo el represor del triptfano solamente es capaz de unirse al operador cuando previamente est unido al trp.

Al estudiar ms profundamente el opern trp se encontr que adems del mecanismo de regulacin represor-operador exista otro mecanismo de regulacin que se denomin regulacin por atenuacin. EL OPERN TRIPTFANO: REGULACIN POR ATENUACIN Cuando Yanosfky analiz mutantes que afectaban al gen trpR que codifica para la protena represora y que continuaban produciendo ARNm del opern trp an en presencia de triptfano, observ que la eliminacin del triptfano del medio produca un aumento casi de 10 veces en la produccin del ARNm del opern trp, incluso aunque el represor estuviera inactivo. Yanofsky identific la regin del ADN responsable de este aumento en la produccin del ARNm del opern trp. Demostr que estos mutantes tenan una delecin entre el operador y el primer gen estructural, el gen E.

La secuencia atenuadora se encuentra en la regin lder

Secuencia de bases de la regin atenuadora y comienzo de la secuencia del gen trpE Yanofsky aisl el ARN-m multignico del opern trp y secuenci la regin del extremo 5 encontrando una regin lder del 160 bases que no se traduce a aminocidos. Esta secuencia se encuentra antes del primer triplete que se transcribe. Cuando analiz la secuencia correspondiente en el mutante que siempre produce niveles mximos de trp, detect una delecin de una 30 bases que se extenda desde la posicin 130 a la 160. Yanofsky llam atenuador a la regin del ADN inactivada por la delecin, ya que su presencia conduce aparentemente a disminuir la tasa de transcripcin. Yanofsky comprob utilizando mutantes trpR que incluso en presencia de altos niveles de trp, que deberan hacer que la regin atenuadora redujera en 10 veces la tasa de transcripcin, se seguan transcribiendo las primeras 141 bases de la regin lder del ARN-m del opern trp, aunque el ARNm de longitud normal solo apareca a un nivel 10 veces menor. De forma, en presencia de altos niveles de trp las primeras 141 bases se transcriben al mximo, pero por el mecanismo de atenuacin que tiene lugar en esa regin, solamente uno de cada 10 ARNm se transcribe hasta el final. Por consiguiente, la regin atenuadora acta como una regin terminadora de la transcripcin en presencia de triptfano, mientras que en ausencia de triptfano el atenuador se desactiva y todas las molculas de ARNm se completan. La regin lder del opern triptfano se caracteriza por tener una sede de reconocimiento para los ribosomas y los codones de 14 aminocidos, entre ellos dos residuos de triptfano. Adems, la siguiente regin puede formar una estructura secundaria palindrmica en forma de lazo u horquilla. Cuando los niveles de triptfano son altos, la traduccin de la primera parte del segmento lder del mensajero impide de alguna manera la transcripcin ms all de la estructura secundaria. Cuando
-

los niveles de triptfano son bajos disminuye o cesa la traduccin del polipptido sintetizado por la secuencia lder, permitiendo que la ARN polimerasa transcriba el opern completo. Aunque no se conoce la forma en la que tiene lugar la terminacin anticipada, es posible que los ribosomas que traducen la regin lder produzcan la desaparicin de la estructura secundaria de la segunda parte de la regin lder y se produzca el reconocimiento de esta regin por el factor de terminacin.

Estructura secundaria de la regin lder

Esquema de lo que sucede con niveles altos (b) y bajos (c) de triptfano La regulacin por atenuacin probablemente tiene lugar en otros operones bacterianos relacionados con la sntesis de aminocidos, ya que en todos los casos el segmento inicial del polipptido transrcito es rico en el aminocido que controla dicho opern. Cuando hay poca cantidad del aminocido correspondiente la traduccin del pptido lder se detiene en los codones correspondientes al mismo el tiempo suficiente para que se formen las estructuras secundarias que permiten que la ARN polimerasa pueda continuar con la transrcipcin.

Porcin que se traduce de la regin lider del opern triptfano

Porcines que se traducen de las regiones lder de los operones de Fenilalanina (a) e Histidina (b)

INTERACCIN ENTRE OPERONES Es obvio que en las clulas existen muchos genes que estn sometidos a diferentes sistemas de regulacin. Si nos fijamos en dos sistemas enzimticos cualesquiera, puede darse los siguientes casos: Que ambos sean dependientes: de manera que la presencia de uno de ellos sea necesaria para la presencia del otro. Que sean excluyentes: la presencia de uno impide la presencia del otro. Que sean alternativos: la presencia de uno no depende de la presencia del otro.

Esta situacin puede explicarse suponiendo que los productos finales catalizados por los diferentes enzimas acten como inductores o correpresores del otro sistema. Por ejemplo, el producto de un enzima induce la expresin de los genes de otro sistema enzimtico, o por el contrario, el producto de otra enzima impide la expresin de los genes de otro sistema enzimtico. Por consiguiente, las interacciones entre operones son algo frecuente en los seres vivos y hacen ms complejo el entendimiento de la regulacin de la expresin gnica.