UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA FACULTAD DE INGENIERA

CURSO: MICROBIOLOGA GENERAL PROFESOR: ETERIO ALVA MUOZ

AO DE LA INTEGRACIN NACIONAL PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD ALIMENTARIA

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA

ESCUELA ACADMICA PROFESIONAL INGENIERIA AGROINDUSTRIAL

CURSO:
MICROBIOLOGA GENERAL

DOCENTE:
BLGO. MBLGO. ETERIO ALVA MUOZ

TEMA:
INFORME DE LABORATORIO N 02

ESTUDIANTE:
SIFUENTES PENAGOS GABRIEL OMAR

CODIGO:
0201212039

CICLO:
IV

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NUEVO CHIMBOTE 2013

PRACTICA DE LABORATORIO N 02 EXAMEN MICROSCPICO DE LAS BACTERIAS I. INTRODUCCIN El tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste entre la clula y el medio que la rodea es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse tambin para localizar estructuras especficas en la clula o para distinguir entre tipos diferentes de clulas. Las clulas generalmente son tratadas para coagular Para como un el

protoplasma antes de teirlas, proceso llamado fijacin. tambin puede en fijarse clulas con que sustancias han sido qumicas

las bacterias la fijacin por el calos es lo ms corriente, aunque formaldehido, cidos y alcoholes. Despus de la fijacin se realiza habitualmente secadas sobre portaobjetos, tratando despus este con el agente fijador y siguiendo inmediatamente el proceso de tincin. La fijacin produce generalmente el encogimiento de las clulas, la tincin, por el contrario, hace que las clulas aparezcan mayores que lo que es realmente, de manera que las medidas de las clulas que han sido fijadas o teidas no pueden realizarse con mucha precisin. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tiene alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Ejemplos de colorantes catinicos son el azul de metileno, el cristal violeta y la safranina.

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Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas protenas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina cida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles. Los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose a menudo para revelar la localizacin de las gotculas o depsitos de grasa. Un gran ejemplo de colorante liposoluble es negro de Sudn. Algunos colorantes teirn mejor solo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Esta sustancia se denomina mordiente. Un mordiente habitual es el cido tnico. El mordiente se combina con un constituyente celular y lo altera de modo que ahora el podr atacar el colorante. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopia son suficientes los procedimientos simples de tincin. El azul de metileno es un buen colorante simple que acta sobre todas las clulas bacterianas rpidamente y que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente til para detectar la presencia de bacterias en muestra naturales, puesto que la mayor parte del material no celular no se tie. II. OBJETIVOS. 2.1. OBJETIVO GENERAL 2.1.1. Observar las formas y estructuras de las bacterias a partir de muestras directas y de cultivo, utilizando coloraciones, simples, diferenciales y estructurales. 2.2. OBEJETIVOS ESPECFICOS 2.2.1. Observar bacterias. las formas fundamentales de las

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2.2.2. 2.2.3. 2.2.4. III.

Describir las tcnicas de coloracin simple y diferenciales. Identificar colonias bacterianas en forma macroscpica. Observar estructuras bacterianas por tcnicas de coloraciones especficas.

MATERIAL Y MTODOS. 3.1. MATERIAL 3.1.1. Cultivos puros Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Klebsiella sp. Escherichia coli. 3.1.2. Muestras: 3.1.3. 3.1.4. 3.1.5. Sarro dental. Mucosa labial. Cerumen. Laminas cubreobjetos. Laminas portaobjetos. Tubos de ensayo. Placa Petri. Microscopio ptico de luz. Coloraciones simples: o o o o o o Azul de metileno Cristal violeta Safranina Verde de Malaquita cido pcrico Fucsina cida Set de Wirtz Coloraciones de Maneval

Material de vidrio:

Equipos: Otros:

Coloraciones compuestas: o o

Aceite de cedro. Asa bacteriolgica.

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3.2.

Mecheros con un ron de quemar. Fsforo, etc.

METODO: (PROCEDIMIENTO) 3.2.1. COLORACIN SIMPLE Son tcnicas en las que se emplean un solo colorante, por ejemplo, coloracin con el azul de metileno, con el violeta de genciana, la fucsina fenificada bsicas, el cido pcrico, etc. Y se utiliza para determinar formas bacterianas sin distincin de grupos. Hacer un de la muestra en lmina portaobjetos con ayuda del asa bacteriolgica y agua destilada o Solucin Salina Fisiolgica (SSF). Fijar el frotis por exposicin al calor suave cerca del mechero o a temperatura ambiente. Teir con cualquiera de los colorantes, proporcionado en los materiales, por un tiempo recomendado por especialistas (generalmente vara entre 0.5 a 5 minutos). Lavar con agua de cao a chorro suave (de preferencia agua destilada), para eliminar el exceso de colorante. Secar el preparado a calor suave o al medio ambiente (lograr que el secado sea uniforme en toda la lmina), para no tener interferencias en la observacin. Observar a menor y mayor aumento, teniendo en cuenta que la lmina este bien seca, sobre todo cuando se utiliza lente de inmersin. Es este ltimo caso usar aceite de cedro. Resultados: Las bacterias se observar de color azul si se colorea con el azul de metileno. Si se colorea con fucsina fenicada el procedimiento es el mismo solo vara el colorante, las bacterias se observan de color rojo. 3.2.2. COLORACIONES DIFERENCIALES:

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Son las coloraciones que emplean ms de un colorante y se utilizan para colorear las paredes celulares de las bacterias. Ejemplo: Coloracin Gram, Coloracin Ziehl Neelsen. COLORACIN GRAM Fue creada por Christian Gram, estudiante dans, entre 1884 y 1886. Se utiliza para diferenciar a las bacterias de acuerdo a la composicin qumica de su pared celular en dos grupos: Gram positivas y Gram negativas. Procedimiento. Realizar la extensin de la muestra. Secar la muestra a temperatura ambiente o el calor. Cubrir la muestra con la solucin fenicada de violeta de genciana o la de Hucker, por un tiempo de 30 a 60 segundos, aproximadamente. Lavar con agua a chorro. Cubrir con Lugol y dejarlo actuar de 2 a 3 minutos. Lavar con agua de cao a chorro suave. Decolorar con alcohol acetona hasta que ya no se desprenda ms colorante de la lmina. Lavar con agua de cao a chorro suave. Contrastar con safranina de 10 a 30 segundos. Lavar, secar y observar a inmersin. Resultado. Bacterias color violeta: Gram positivos. Bacterias color rosado: Gram negativos. Los grmenes Gram positivos son aquellos en los cuales se ha formado el complejo Cristal-VioletaYodo (CVI). Y, no son decolorados por accin de alcohol acetona, manteniendo por lo tanto la decoloracin violeta. Los grmenes Gram negativos son aquellos en los cuales no se forma el forma el complejo CristalVioleta-Yodo (CVI).Y, por tanto son decolorados por accin del alcohol acetona, y al quedar sin

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decoloracin estn aptos para ser teidos por la safranina. En trminos generales, en microbiologa clnica, son Gram positivos todos los cocos a excepcin de las neiserias, y son Gram negativos todos los bacilos a excepcin de los esporulados, los micobacterias y las corinebaterias. La tcnica original de Gram ha sufrido diversas modificaciones, pero su fundamento sigue el mismo. Una de las modificaciones consiste en el empleo de la safranina como colorante de fondo en lugar de Ziehl. COLORACION ZIEHL NEELSEN Se utiliza para colorear a las mico bacterias o llamadas tambin bacilos cidos alcohol resistentes (b.a.a.r) ya que estos al poseer cidos miclicos (ceras) como componentes de su pared celular, hacen que sea difcil la coloracin con el Gram, hacindose necesario el uso del mechero y mediante la emisin de vapores se permita el ingreso del colorante de Ziehl (fucsina fenicada bsica). La coloracin de Ziehl Neelsen se puede realizar de dos maneras en caliente (tcnica ms usual) o en frio (tincin de Kinyoun), que es ms simple y rpida que el mtodo en caliente. Facilita ms simple y rpida que el mtodo en caliente. Facilita adems el examen de gran nmero de muestras (por ejemplo, en las encuestas epidemiolgicas). Sin embargo, se utiliza una cantidad considerable de fucsina fenicada. Para el trabajo habitual, en un laboratorio general, es ms adecuado el mtodo en caliente. El bacilo causante de la tuberculosis en el ser humano pueden ser de dos tipos: bacterias tpicas (Mycobacterium tuberculosis) o bacterias atpicas. Estos bacilos son resistentes a los cidos; es decir, una vez que se han teido de rojo con la fucsina fenicada bsica no se pueden decolorar por medio del alcohol cido. La fucsina fenicada bsica tie de rojo todos los microorganismos que se encuentren en el esputo.

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El alcohol cido realiza la decoloracin de todos los microorganismos y elementos celulares, exceptuando los bacilos cido alcohol resistente (bacilos de la tuberculosis). El azul de metileno tie de azul todos los microorganismos y decolorados por el alcohol cido alcohol resistente se conservan teidos de rojos. Al realizar esta coloracin se hace necesario aplicar medidas bioseguridad como es el uso de barbijos durante todo el proceso de coloracin. Se puede reemplazar el uso del asa bacteriolgica por un abate lenguas. Procedimiento Realizar la extensin del frotis con el asa bacteriolgica o con un abate lenguas. Secar a temperatura ambiente o al calor. Cubrir con el colorante de Ziehl de 3 a 5 minutos. Colocar el mechero de alcohol por debajo de las lminas preparadas y observar la emisin de vapores por 3 o 5 veces. Decolorar con alcohol cido. Lavar con agua a chorro. Agregar el azul de metileno (colorante de contraste) durante 30 segundos. Lavar, secar y observar a inmersin. Resultados. Las micro-bacterias se ven de color rojo sobre un fondo azul. 3.2.3. COLORACIONES ESTRUCTURALES. Son aquellas en los que se utilizan 1 o ms colorantes y se realizan para observar las estructuras bacterianas, como son: flagelos, cpsulas, esporas y corpsculos metacromticos. COLORACIN LEIFFSON) DE FLAGELOS (MTODO DE

Se deposita una gota de suspensin bacteriana en una lmina portaobjetos.

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Se agrega el colorante de Leiffson y se deja durante 5 minutos hasta que el alcohol se evapore. Lavar con agua, secar y observar a inmersin. Resultado El flagelo se observa de un color rojo a negruzco. COLORACIN MANEVAL) DE CAPSULA (MTODO DE

Realizar la extensin de la muestra en lmina portaobjetos. Secar Agregar una gota de rojo de Congo. Agregar el colorante de Maneval durante 1 minuto. Lavar con agua destilada y evitar que la suspensin se despegue. Secar y observar a inmersin. Resultado El cuerpo bacteriano de color rojo, cpsula y fondo azul. COLORACIN WIRTZ) DE ESPORAS (MTODO DE

Hacer la extensin de la muestra y fijarla al calor. Aadir verde de malaquita. Calentar hasta desprender vapores por 3 o 4 veces. Lavar Agregar safranina como colorante de contraste. Lavar, secar y observar. Resultados Espora de color verde y cuerpo bacteriano de color rojo. COLORACIN DE CORPSCULOS METACROMATICOS (MTODO DE LOEFFLER)

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Realizar la extensin de la muestra y fijarla al calor. Cubrir con colorante de Loeffler durante 3 minutos. Lavar con agua destilada. Secar y observar a inmersin. Resultado El corpsculo metacromatico se ve de un color azul oscuro y el cuerpo bacteriano de un color calor. IV. PROCEDIMIENTO Y RESULTADOS PROCEDIMIENTO o o o o o o o o Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequea alcuota de un cultivo bacteriano con el asa de siembra estril. Hacer el frotis, formando una pelcula homognea sobre el portaobjetos con el asa de siembra. Dejar secar. Fijar la preparacin, pasando a travs de la llama del mechero el portaobjetos. Cubrir con unas gotas de cristal violeta durante 1 minuto. Lavar el exceso de colorante con agua. Aadir el mordiente lugol, solucin de yodo-ioduro potsico, durante 1 minuto. Lavar el exceso de mordiente con agua. Lavar la preparacin con alcohol formando un ngulo con la preparacin, durante 30 segundos (el tiempo de decoloracin es clave para un resultado correcto). Lavar inmediatamente con abundante agua. Cubrir con el colorante de contraste, safranina durante 1 minuto. Lavar el exceso de colorante con agua. Dejar secar al aire. Aadir una gota de aceite de inmersin. Observar con objetivo de inmersin (100 x).

o o o o o o

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Tincin de Gram de Staphylococcus aureus. Apreciamos el color azul en esta bacteria, especficamente Staphylococcus aureus , un coco con coloracin gram positiva, este color nos indica que es un Gram positivo y se debe a que el alcohol acetona lo decolor ya que no form el complejo cristal-violeta-iodo.

Tincin de Gram de Bacillus cereus (bacilos gram positivos). Microscopa de campo claro (100x). Apreciamos el color azul en esta bacteria, especficamente un bacilo cereus, un bacilo con coloracin positiva, este color nos indica que es un Gram positivo y se debe a que el alcohol acetona lo decolor ya que no form el complejo cristal-violeta-iodo.

Tincin de Gram de Escherichia coli (bacilos gram negativos). Microscopa de campo claro (100x). Apreciamos el color rojo en esta bacteria, especficamente E. coli, un bacilo con coloracin negativa, este color nos indica que es un Gram negativo y se debe a que el alcohol acetona no lo decolor ya que form el complejo cristalvioleta-iodo.

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Podemos afirmar que existen tanto cocos como bacilos con coloraciones gram positivas y gram negativas. Es nuestra prctica de laboratorio N 02. Apreciamos un bacilo Gram(+) como el Bacillus cereus y un bacilo Gram(-) como el E.coli V. CONCLUSIONES

Observamos las formas y estructuras de las bacterias a partir de muestras directas y de cultivo, utilizando la coloracin compuesto o directa para obtener las coloraciones Gram (+) y Gram (-), utilizando como colorantes al cristal violeta, la safranina y el azul de metileno. Tambin usamos un reactivo que fue la solucin yodada. Comprendimos el principal fundamento de las coloraciones Gram en bacterias. Todos los cocos y bacilos cuando se aade el cristal violeta, ambos se tien de un color azul, es por ello que se lavan. Despus de proceder al lavado, se agreg la solucin yodada la cual contena el Lugol, es as como el Lugol y el Cristal violeta forma un compuesto complejo llamado Cristal-violetayodo, el cual hace que las bacterias resalten. Al lavar otra vez las muestras se procedi a decolorar con el alcohol de acetona. El principal fundamente es que los bacilos no forman un complejo cristal-violeta-yodo y es por ello que se decoloran, pero a un coco no lo decolora porque si se forma un compuesto cristal-violeta-yodo. Para finalizar se aadi el colorante contraste safranina que nos da el color rojo y tenemos as bacterias rojas (Gram -) y bacterias azules (Gram +).

VI.

DISCUSIONES

1. La ausencia de colorantes provocara la ausencia de contraste entre las clulas y el medio que lo rodea, as, no se podra analizar las clulas bacterianas porque resultaran difciles de en el microscopio ptico. 2. Los mtodos de tincin pueden conducir a errores. Las molculas de colorante forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen

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estructuras

celulares

autnticas,

pero

que

son

formaciones

completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. 3. Los colorantes se emplean para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. 4. Los colorantes cargadas positivamente se combinan con intensidad con los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos cidos. Mientras que los colorantes protenas. 5. La pared de la clula bacteriana sirve para dar su tamao y forma al organismo as como para prevenir la lisis osmtica. El material de la pared celular bacteriana que confiere rigidez es el peptidoglicano. 6. La ausencia de calor en algn mtodo de tincin como por ejemplo la espora, jams el colorante no podr permeabilizar a este microorganismo en anlisis ni la entrada del colorante a travs de sus capas externas. 7. Las bacterias gram positivas mantienen y conservan el complejo cristal violeta-iodo, las bacterias gram negativas se decoloran rpidamente con la aplicacin del alcohol. 8. Si un microorganismo cuya coloracin resiste la accin de alcoholes y cidos suaves (cido-alcohol resistente) de otros que no resisten la decoloracin (no cido-alcohol resistente) se utiliza la coloracin de Ziehl Neelsen. cargados negativamente se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como muchas

VII.

RECOMENDACIONES

1. Seguir estrictamente el procedimiento de tincin porque pueden conducir a errores. 2. Durante las sesiones, siempre deber usar un guardapolvo bien abotonado, que deber quitarse antes de abandonar el laboratorio.

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3. No deber sacar del laboratorio ningn equipo, medios o cultivos microbianos. 4. Evitar la acumulacin sobre la mesa de trabajo de objetos no relaciones con la prctica de laboratorio. Colocar todos los objetos personales (libros, mochilas, etc.) en la zona especfica por el profesor. 5. Se prohbe ingerir y/o almacenar cualquier tipo de alimentos o bebido dentro del laboratorio de microbiologa. 6. No se admite limpiar el lente de los objetivos con cualquier material, en caso de requerirse, se realizara cuidadosamente con un papel. VIII. ANEXOS. NUEVAS METODOLOGAS EN MICROSCOPA CON FLUORESCENCIA En la actualidad, se estn desarrollando principalmente tres tcnicas distintas de microscopa de fluorescencia de alta resolucin, cuyo fundamento y aplicaciones comentaremos muy brevemente. La primera tcnica de imgenes de alta resolucin, caracterizada en 1994, es la denominada STED. Esta tcnica combina dos fuentes de iluminacin lser, con el fin de romper el ndice de difraccin. El primer lser, denominado de excitacin, emite a la longitud de onda necesaria para excitar el flor-cromo utilizado. El segundo lser STED se fija a una longitud de onda ms larga, que inactiva rpidamente al flor-cromo. Utilizando este esquema se ha conseguido hasta un poder de resolucin de 20 nm. Otra alternativa tecnolgica es FPALM que consigue resoluciones de 10 nm y se emplea generalmente en la localizacin gnica proteica, utilizando como sonda la GFP (Green fluorescent protein) sus derivados. El mtodo FPALM se ha aplicado, por ejemplo, para estudiar la dinmica de cito esqueleto bacteriano. Por ltimo, otra metodologa de alta resolucin es STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) que, al igual que la anterior, tiene resolucin a nivel de nano escala y proporciona imgenes en tres dimensiones. Sin duda, esta microscopa de fluorescencia de superresolucin es una herramienta eficaz, alternativa a la microscopa electrnica de transmisin, que proporcionara detalles inditos de la estructura sub-celular y funcionamiento de las clulas procariotas.

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Azul de metileno

Nombre qumico

3,7-bis (dimetilamino)Cloruro de fenazationio Cloruro de tetrametiltionina Frmula qumica C16H18N3ClS Masa molar 319,85 g/mol Nmero CAS [61-73-4] Nmero EC 200-515-2 Densidad 1.757 g/cm Punto de fusin 100 C Punto de ebullicin Se descompone SMILES CN(C)c3ccc2nc1ccc(N(C) C)cc1[s+]c2c3.[Cl-] CRISTAL VIOLETA

El violeta de metilo, comnmente denominado cristal violeta o violeta de genciana, es el nombre dado a un grupo de compuestos qumicos empleados como indicadores de pH y colorantes. En la forma pura, el violeta de cristal se presenta como lustrosos cristales azul verdosos que funden a 137 Celsius (279Fahrenheit). Los violeta de metilo son solubles en agua, etanol, dietilenglicol, y dipropilenglicol. En particular, el violeta de metilo 6B es soluble en agua al 2.93% y soluble en etanol al 15.21%. Los violetas de metilo son mezclas de: N-tetra, N-penta y N-hexametil prosanilinas. Por la mezcla de diferentes versiones, el fabricante puede crear diferentes tonos de violeta en el colorante final. Cuanto ms metilado est el colorante, su color ser de un violeta ms oscuro:

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o o o

Tetrametilo (cuatro metilos) es conocido como Violeta de metilo 2B, encuentra usos especficos en qumica y medicina. Pentametilo (cinco metilos) es conocido como Violeta de metilo 6B, es ms oscuro como colorante que 2B. Hexametilo (seis metilos) es conocido como Violeta de metilo 10B, especficamente violeta cristal. Es mucho ms oscura que la 2B, an ms oscura que la 6Bk

y y o y

Safranina Frmula estructural

Cl Nombre comn CAS Sinnimos Safranina 477-73-6 Safranina T, Safranina O, Safranina B, 3,7-Diamino-2,8-dimetil-5-fenil-fenaziniumcloro, rojo bsico 2 Frmula qumica Peso molecular Punto de fusin Densidad IX. C20H19ClN4 350,85 g/mol g/cm3

CUESTIONARIO

1. FUNDAMENTO DE LA COLORACIN DE GRAM Y DE ZHIEL NEELSEN COLORACIN GRAM. Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas. La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de pptido glucano, adems de dos clases de cidos: o o Anclado en la cara interna de la pared celular y unida a la membrana plasmtica, se encuentra elcido lipoteicoico. En la superficie, el cido teicoico que est anclado solamente en el pptido glucano (tambin conocido como murena).

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Por el contrario, la capa de pptido glucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (decomposicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipo-polisacrido. Conclusin: Ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas. La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin de pptido glucano, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violcea.

Bacterias Escherichia coli (Gram negativas) vistas al microscopio tras ser teidas con la tincin de Gram.

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Bacterias Clostridium perfringens (Gram positivas).

PRODUCTOS QUE SE UTILIZAN

REACCIN Y COLORACIN DE LAS BACTERIAS GRAM + GRAM Clulas color violeta Se forma el complejo CV-I. Las clulas continan teidas de color violeta. Eliminacin por extraccin de grasas de las paredes celulares. Aumenta la porosidad. El complejo CV-I se separa de la clula. Clulas decoloradas; se tien de color rosado.

CRISTAL VIOLETA LUGOL SOLUCIN IODADA ALCOHOL

Clulas color violeta Se forma el complejo CV-I. Las clulas continan teidas de color violeta. Se deshidratan las paredes celulares. Se contraen los poros. Disminuye la permeabilidad. El complejo CV-I no sale de las clulas que continan teidas de color violeta. Clulas no decoloradas; quedan teidas de color violeta.

SAFRANINA

COLORACIN DE ZIEHL NEELSEN Las paredes celulares de ciertas bacterias contienen cidos grasos (cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol resistente. Las micobacterias como Mycobacterium tuberculosis y M. marinum se caracterizan por sus propiedades de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el

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calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificacin de los cidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energa cintica de las molculas del colorante lo cual tambin facilita su entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloracin son de color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de metileno como tincin de contraste.

Visualizacin de Mycobacterium tuberculosis usando la tincin de ZiehlNeelsen. 2. SE PUEDEN REEMPLAZAR LOS COLORANTES DE CONTRASTE EN LAS DIVERSAS COLORACIONES. No, porque el tamao de la mayora de las clulas bacterianas es tal que resultan difciles de ver con el microscopio ptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la clula y el medio que la rodea, y el medio ms simple de aumentar el contraste es la utilizacin de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de clulas o para revelar la presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas, cpsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc. La mayora de los colorantes son compuestos orgnicos que tienen alguna afinidad especfica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son molculas cargadas positivamente (cationes). Otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones). Algunos colorantes teirn mejor slo despus de que la clula haya sido tratada con otra sustancia qumica, que no es un colorante por s mismo. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las clulas para la microscopa, son suficientes los procedimientos simples de tincin. Los mtodos de tincin son de gran utilidad, pero deben usarse siempre con precaucin, ya que pueden conducir a errores. Las molculas de colorante

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forman en ocasiones precipitados o agregados que parecen estructuras celulares autnticas, pero que son formaciones completamente artificiales inducidas por el mismo colorante. Tales estructuras se denominan artefactos, y deben tomarse muchas precauciones para tener la seguridad de que no nos estamos equivocando al creer que un artefacto es una estructura realmente existente. Examen microscpico directo de las muestras clnicas Sin Tincin

Examen microscpico de las muestras clnicas levemente modificadas Tincin Simple

Examen microscpico de las muestras clnicas muy modificadas Tincin Diferencial

3. QUE SUCEDE SI EN LA COLORACION DE ESPORAS Y EN LA ZIEHL NEELSEN SE OVBIA EL CALENTAMIENTO POR TRES VECES CONSECUTIVAS.

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Se aplica el mismo fundamento para ambos, es decir, si a una espora no se somete al calor jams el colorante no podr permeabilizar a este microorganismo en anlisis ni la entrada del colorante a travs de sus capas externas, ya que la principal funcin del colorante es para contrastar entre la clula y el medio que la rodea, y sin esto, no se podr analizar en el microscopio.

4. QUE SUCEDERA SI LA LMINA PORTAOBJETOS AL TRMINO DE LA COLORACIN HAY PRESENCIA DE GOTAS DE AGUA.

No se observara varios campos ni encontrar aqul que permita una identificacin de la morfologa, estructura y reaccin al Gram.