UNIVERSIDADE DO PORTO FACULDADE DE MEDICINA

MESTRADO EM MEDICINA DESPORTIVA DISSERTAO

EXERCCIO FSICO E LESO OXIDATIVA

RELAO COM A CAPACIDADE AERBIA (AVALIAO DA L1POPEROX1DAO DA MEMBRANA ERITROC1TRIA)

Paulo Cunha e Silva 1992

UNIVERSIDADE DO PORTO FACULDADE DE MEDICINA

MESTRADO EM MEDICINA DESPORTIVA DISSERTAO

EXERCCIO FSICO E LESO QXIDATIVA

RELAO COM A CAPACIDADE AERBIA
(AVALIAO DA LIPOPEROXIDAO DA MEMBRANA ERITROCITRIA)

Paulo Cunha e Silva 1992

Agradecimentos:
Ao Prof. Dr. Alexandre Quintanilha que me orientou. Orientar mostrar o Oriente, o sentido do percurso, e fazer luz sobre aquilo que parecia muito escuro. Ao Prof. Dr. Nuno Grande que me ensinou e me mostrou como se ensina. Ao Prof. Dr. Moradas Ferreira que desde sempre me abriu as portas da sua casa cientfica, o seu laboratrio, onde balbuciei os primeiros "experimentos". Ao Prof. Dr. Jorge Bento e ao Prof. Dr. Antnio Marques pela conscincia que tm que no h escola sem cultura. Ao Prof. Dr. Jos Soares pela conscincia que tem que no h escola sem investigao. Aos trs como representantes de uma Faculdade e um Gabinete onde me sinto bem e orgulho de pertencer. Ao Prof. Dr. Falco de Freitas e ao Prof. Dr. Ovdio Costa, respectivamente, como exDirector e actual Director do Centro de Medicina Desportiva do Porto onde decorreu parte da investigao aqui apresentada. Ao Prof. Dr. Sieuve Monteiro e Dr. Alda de Sousa pela preciosa ajuda na procura de um sentido matemtico para os resultados encontrados, mas com a convico de que aqui a Biologia era rainha e a Matemtica sua serva. Ao Dr. Joaquim Armando que me ajudou a encontrar um suporte fsico apresentvel para os resultados e para as ideias. A todos os alunos e atletas que por mim generosamente correram at exausto. E por ltimo, mas seguramente no em ltimo, Maria Strecht: pela solidariedade, pela inteligncia, pela perspiccia, pela conscincia da cincia, pela saudvel ironia, pelo bom senso... enunciar toda a tua ajuda seria escrever uma outra tese, e como tenho de me limitar s escassas pginas regulamentares... Obrigado.

NDICE:
1) RESUMO 2) INTRODUO 2.1) O Problema do Oxignio 2.2) O Desporto e o Oxignio 2.3) O Eritrcito como Modelo Celular 2.4) A Peroxidao Lipdica 3) MATERIAL E MTODOS 3.1) Caracterizao da Populao 3.2) Exerccio Experimental e Colheita de Sangue 3.3) Isolamento dos Eritrcitos (populao total) 3.4) Isolamento dos Eritrcitos (fraces de densidade) 3.5) Avaliao da Peroxidao Lipdica 3.6) Anlise Estatstica 4) RESULTADOS 5) DISCUSSO 5.1) As Vantagens da Fluorescncia 5.2) Uma Relao entre o Consumo de Oxignio e a Leso Oxidativa (Papel do Treino) 5.3) Exerccio Fsico e Envelhecimento Eritrocitrio 6) REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS 24 27 30 23 13 14 15 15 16 17 18 5 6 8 10 4

1) RESUMO:
sabido que o exerccio fsico, realizado em condies aerbias, constitui um "stress oxidati vo", na medida em que impe aumentos do consumo de oxignio at 1000% do valor de repouso, em humanos, levando a uma hiperproduo de radicais livres de oxignio (RLO). A membrana do eritrcito um alvo importante da agresso peroxidativa, provocada pelo ataque de radicais livres de oxignio aos seus cidos gordos poliinsaturados, e nesta medida pode fornecer uma boa visibilidade sobre a relao entre o consumo de oxignio e a extenso da leso oxidativa. No nosso trabalho, a 10 indivduos do sexo masculino com diferentes capacidades aerbias, diferentes consumos mximos de oxignio (V0 2 max), foram colhidas duas amostras de sangue, antes e imediatamente depois de um exerccio progressivo at exausto realizado em cicloergmetro. Os eritrcitos foram isolados e separados num gradiente descontnuo de densidades. A lipoperoxidao da sua membrana foi avaliada, na populao total e nas fraces de densidade, atravs da medio da fluorescncia relativa no extracto lipdico. Os resultados demonstraram um aumento da fluorescncia de 15%, na mdia dos 10 indivduos (p<0.01), aps o exerccio e nas amostras correspondentes ao sangue total. Demonstraram ainda a existncia de uma correlao exponencial altamente significativa (p<0.001; R2=0.773) entre a quantidade total de oxignio consumida durante o exerccio (V02T) e a percentagem do aumento dos nveis de lipoperoxidao. de assinalar que este aumento acontece em flecha a partir de valores de V02T s atingidos por indivduos muito bem treinados sob o ponto de vista aerbio, como se este treino fornecesse condies fisiolgicas para atingir nveis de consumo que escapam ao controlo antioxidante. Relativamente s fraces eritrocitrias (em que foi, por outros, demonstrada uma relao directa entre densidade e idade), s foram encontradas diferenas significativas entre os valores de peroxidao naquelas que correspondiam aos indivduos pior treinados e colhidas antes do exerccio. Para estes, depois do exerccio, e para os melhor treinados antes e depois do exerccio, deixou de se verificar um aumento significativo dos nveis de peroxidao como se o exerccio e o treino alterassem a relao entre densidade e idade.

2) INTRODUO:
2.1) O PROBLEMA DO OXIGNIO Com o aparecimento, na escala evolutiva, da respirao celular aerbia, isto , com a possibilidade da reduo completa do oxignio a gua, revelaram-se as potencialidades energticas dos compostos de carbono que os processos de fermentao (de respirao anaerbia) tinham camuflado at a. A biosfera ganhou uma grande mobilidade e os primitivos seres vivos adquiriram uma plasticidade que permitiu o aparecimento de seres mui ti celulares. No entanto, o aproveitamento biolgico do oxignio depende da sua capacidade em assumir estados excitados atravs de uma alterao na configurao electrnica (1). o conceito de "activao do oxignio". De acordo com Michelis cada oxidao ou reduo s pode acontecer em degraus de oxidao ou reduo univalente resultando os radicais livres (2). Os radicais livres de oxignio formam-se atravs de um processo em que o dioxignio sofre sucessivas redues, ou seja, ganha electres, um de cada vez, dando origem a fragmentos moleculares com um electro desemparelhado na ltima orbital atmica (3,4). As orbitais atmicas so preenchidas, de acordo com o Princpio da Excluso de Pauli, por dois electres de nmeros qunticos de spin opostos, antiparalelos, (+1/2, 1/2). O incompleto preenchimento da orbital de maior energia empresta ao radical uma grande reactividade, da a sua toxicidade (5,6). Embora s em 1954 Rebecca Gershman e Daniel L. Gilbert (7) tenham proposto que muitos dos efeitos lesivos do oxignio pudessem ser atribudos aos radicais livres, j desde a sua descoberta por Priestley (1775) e Scheele (1777) que se vinha acumulando evidncia de natureza emprica acerca da sua toxicidade, reforada a partir do momento em que se reconheceu ao oxignio hiperbrico, ou em concentraes elevadas, utilidade teraputica. O que passou a ser inquietante foi a constatao de que o oxignio que consumimos naturalmente a 21% , tambm ele, txico. E com a descoberta de uma metaloenzima, a superxido dismutase (SOD), por McCord e Fridovich (8) em 1969, que removia um dos radicais, o superxido, a importncia deste tema no mais deixou de entusiasmar a Cincia Biomdica. Esta descoberta tem como consequncia um duplo reconhecimento: o de que os radicais existem e se formam em condies biolgicas e que por outro lado existe um sistema defensivo que os neutraliza (1 ). A evoluo biolgica passaria a ser entendida como o conjunto de solues possveis entre estas duas balizas. Importa neste momento dizer que alm de terem consequncias patolgicas os radicais livres de oxignio tm tambm 5

importncia fisiolgica e so usados como protagonistas de muitos processos biolgicos, o caso das reaces de destoxificao promovidas pelo sistema do citocromo P450, da fagocitose e da sntese de prostaglandinas (9,10). Pode, ento, questionar-se o facto de o oxignio ter sido escolhido pela Natureza como o oxidante terminal da cadeia respiratria. No haveria alternativas menos txicas? No existiria uma fonte energtica disponvel com as mesmas virtudes mas sem as contrapartidas negativas deste? A esta pergunta respondeu cabalmente Gilbert em 1964. Para ser uma boa fonte ter que ser abundante; o oxignio o terceiro elemento mais abundante no Universo s sendo ultrapassado pelo hlio, que quimicamente no reactivo e por isso no serve e pelo hidrognio. A fonte dever ser facilmente acessvel; a menos que a temperatura seja inferior a -183 C, o oxignio um gaz. Outras substncias com pontos de ebulio semelhantes so o hidrognio, o nitrognio, o monxido de carbono, o metano. Por outro lado, a fonte de energia, para alm de ter um alto potencial de oxidao, deve reagir de uma forma relativamente lenta. H outros compostos que tm potenciais superiores como o fluor, o ozono, o oxignio atmico, mas s o dioxignio reage de uma forma suficientemente lenta para que as perdas de energia sejam mnimas. Por tudo isto o oxignio a fonte de energia, em termos biolgicos, melhor qualificada do Universo (11). 2.2) O DESPORTO E O OXIGNIO O consumo de oxignio revelou-se, ento, uma necessidade incontornvel para todos os seres vivos com algum projecto evolutivo mais ambicioso que a unicelularidade. O praticante desportivo, como eucariota multicelular, um consumidor de oxignio e tem sobre os consumidores sedentrios um suplemento de consumo que acarretar os seus custos. Durante um exerccio de caractersticas aerbias o consumo de oxignio pode atingir um valor 10 vezes superior ao valor de repouso. Como afirma Jenkins, nunca na histria da humanidade houve um envolvimento de tanta gente com doses to elevadas de consumo de oxignio durante uma poro to grande das suas vidas (12). Da que o recorrer-se ao exerccio (em humanos) para melhor se tentar compreender a leso oxidativa (em humanos), nosso propsito, no tenha s interesse metodolgico, mas tambm porque estamos quase, ousaramos dizer, perante um problema de sade pblica dada a quantidade crescente de pessoas praticando exerccio fsico. Ou seja, o exerccio um bom modelo para avaliar as consequncias do consumo exagerado de oxignio, mas tambm uma situao que importa caracterizar sob o ponto de vista da extenso da leso oxidativa. O aumento do consumo de oxignio imposto pelo exerccio aerbio deve-se ao 6

aumento do metabolismo celular, mas tem como consequncia alguma perca da eficcia do controle respiratrio mitocondrial com aumento do fluxo de protes atravs da membrana interna (13). O acoplamento da fosforilao oxidativa deixa de se fazer de forma to ntima, havendo um dficit de produo de ATP para a quantidade de oxignio consumida ou, doutra forma, um excesso de consumo de oxignio para a quantidade de ATP formada (14), podendo a energia assim desperdiada dissipar-se sob a forma de calor e os produtos intermedirios da reduo do oxignio, sobretudo o superxido (0 2 ), formados em excesso, difundir para o citosol (12). Aqui poderiam encontrar quantidades suficientes de metais de transio, ferro e cobre, capazes de iniciarem a reaco de Haber-Weiss e catalisarem a produo do altamente reactivo hidroxilo (HO ) (5,15,16). Ora estes produtos, radicais livres de oxignio (RLO), que em situao de metabolismo basal seriam rapidamente neutralizados pelas defesas antioxidantes, numa situao de produo excessiva, podem ultrapassar os nveis de defesa originando uma descompensao do equilbrio oxirredutor da clula conhecida pelo nome de "stress oxidativo". Que o exerccio fsico um "stress oxidativo" parece j no restarem dvidas. Acumula-se evidncia experimental que denuncia um aumento directo da concentrao de RLO (13) medido atravs do recurso ressonncia paramagntica electrnica (RPE) (17-20), ou um aumento indirecto medido atravs de produtos indicadores de agresso celular promovida pelos RLO como o caso dos produtos de peroxidao lipdica (13,21-23), ou ainda atravs do gasto de substncias tidas como antioxidantes, caso do glutatio reduzido (GSH) (24,25). Sabendo que o exerccio fsico de caractersticas aerbias um indutor de "stress oxidativo" pelo aumento do consumo de oxignio, ser importante verificar de que forma o treino de resistncia poder modelar a resposta a essa situao. O treino de resistncia, desenvolvendo a capacidade aerbia, desenvolve a possibilidade de se realizarem trabalhos que exijam maior consumo de oxignio. Em resposta a incrementos da quantidade de trabalho, tanto indivduos treinados como no treinados aumentam o seu consumo de oxignio. E a maior habilidade que os indivduos treinados mostram para suportar uma carga elevada devida ao facto de apresentarem um maior consumo mximo de oxignio (maior V0 2 max) (14). O treino funcionaria, ento, de uma forma perversa na medida em que, permitindo um maior V0 2 max, agravaria o fenmeno da produo de RLO. Simplesmente, o aspecto imediatamente visvel do treino que a melhoria das prestaes, tem um suporte bioqumico que se manifesta, tambm, ao nvel das defesas antioxidantes celulares. Ou seja, a capacidade da clula se defender da leso oxidativa passvel de ser "treinada". Como os indicadores da leso radical esto relacionados com a
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intensidade do exerccio medida em termos da percentagem do V0 2 max (22) fcil admitir que a indivduos bem treinados corresponda, para o mesmo exerccio, um menor ndice de leso que a indivduos mal treinados pois, para os primeiros, o mesmo exerccio equivale a uma menor percentagem do seu V0 2 max. Na medida em que conseguem consumir mais oxignio, os indivduos com melhor capacidade aerbia, tm que estar melhor apetrechados em termos de defesas antioxidantes. Isto foi constatado, em ratos, para as defesas enzimticas ao nvel muscular superxido dismutase e catalase (26,27), glutationa peroxidase e redutase (26) e em humanos para a superxido dismutase e catalase musculares (28). No eritrcito foi tambm demonstrado um aumento, com o treino, da actividade e concentrao da catalase e da concentrao da glutationa redutase em humanos (29) que se ajusta com a exibio de menores nveis de hemlise verificados em ratos treinados (26). Ao nvel dos antioxidantes no enzimticos, nomeadamente do glutatio, o treino reduz significativamente a depleco dos nveis de glutatio reduzido (GSH) que se verifica com o exerccio fsico (24), o que concorre para substantivar a ideia de que o treino de resistncia protege do "stress oxidativo" atravs de um apuramento das defesas antioxidantes. 2.3) O ERITRCITO COMO MODELO CELULAR Grande parte da ateno que recai sobre os efeitos da leso oxidativa toma a clula muscular como modelo, como terreno excelente de investigao, sobretudo quando essa leso associada ao exerccio fsico. A clula muscular , e com razo, uma clula mtica para o fisiologista do exerccio, a clula do exerccio. Mas uma outra clula, de colheita muito mais fcil em humanos, no pode ser descurada, at pelas relaes histricas (em termos de Histria Natural, bem entendido) que tem com o oxignio. Estamos a falar, obviamente, do eritrcito. E se pretendermos construir um tringulo que tenha por vrtices o exerccio, o oxignio e o envelhecimento, teremos que contar, necessariamente, com esta clula. A relao do exerccio fsico com a alterao de parmetros hematolgicos (30,31), hemorreolgicos (32,33) e, particularmente, dos ndices globulares, nomeadamente o volume globular mdio (34), apontam para o facto de o eritrcito se apresentar como um barmetro, um indicador sensvel, das alteraes fisiolgicas sentidas pela sua vizinhana, o plasma, que por sua vez reflecte o que se passa em territrios mais distanciados. Por outro lado, embora seja o msculo o executor do trabalho fsico e, portanto, o principal consumidor de oxignio, o eritrcito quem o transporta. Alm disso, sabendo que em condies fisiolgicas 3% da oxihemoglobina sofre, diariamente, um processo de
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autoxidao com formao de anio superxido e metahemoglobina (35-37) fcil vislumbrar a fonte de radicais no interior desta clula (38). Portanto, embora no tenha mitocndria, no tenha cadeia transportadora de electres, sobrevivendo com um metabolismo do tipo glicoltico, o eritrcito pode ser usado para estudar os efeitos da convivncia celular com os radicais livres de oxignio. Numa clula com esta simplicidade estrutural e funcional, fcil planificar o quadro da leso oxidativa. Os alvos preferidos dos radicais livres de oxignio so, aqui, os cido gordos poliinsaturados da membrana celular e os grupos tilicos (-SH) das protenas (39-41). E os principais agentes antioxidantes so a SOD Cu /Zn que neutraliza o anio 02" e depende do cobre e do zinco , a glutatio peroxidase Se que actua sobre o perxido de hidrognio (H,0 2 ) e tem o selnio como cofactor, a catalase que actua tambm sobre o Hf)2 em condies de sobrecarga oxidativa , o glutatio reduzido (GSH) e finalmente a vitamina E que se manifesta sobre os radicais peroxilo formados em zonas de grande concentrao de cidos gordos poliinsaturados como o caso da membrana celular (42,43). Numa clula sem ncleo e sem outros organelos, a membrana, no seu todo lipoproteico, apresenta-se como o territrio privilegiado da agresso radical (44,45), manifestando-o quer atravs de alteraes na sua fluidez (46,47), quer atravs do comprometimento dos sistemas de transporte (48,49). A hemlise aparece como o ltimo patamar da leso oxidativa (50) sofrida pela membrana eritrocitria e s acontece quando o material peroxidado, resultante de agresso radical aos cidos gordos poliinsaturados, atinge um nvel crtico (51). Ainda o facto de o eritrcito ser uma clula desnuclearizada, sem material gentico, e consequentemente sem sntese proteica, faz com que o contingente enzimtico do seu sistema antioxidante no seja reposto, se v gastando, v envelhecendo. Ou seja, o eritrcito nasce com uma bateria antioxidante particularmente vigilante, mas como nos seus 120 dias de vida no substituda, vai perdendo eficcia no combate agresso radical, instalandose progressivamente uma situao de "stress oxidativo", assumindo que o estmulo oxidativo se mantm. por isso que esta clula se apresenta, tambm, como o modelo celular de eleio para o estudo do envelhecimento celular na perspectiva da agresso radical (52-56). Aps a separao dos eritrcitos por idades (57) foi possvel constatar uma relao inversa com a actividade enzimtica global (58) e com as enzimas mais directamente envolvidas na defesa antioxidante, como o caso do sistema do glutatio, ao mesmo tempo que se verificava um aumento do glutatio oxidado (GSSG) e metahemoglobina (59), indicando um aumento do "stress oxidativo" com a idade celular. A diminuio 9

da actividade de enzimas antioxidantes eritroeitrias, no aconteceu s quando foram avaliadas fraces mais velhas de indivduos (neste caso ratos) do mesmo grupo de idades, mas tambm quando fraces de indivduos mais velhos o foram com fraces homlogas de indivduos mais novos (60), como se o envelhecimento celular mimetizasse o envelhecimento do indivduo. Mas de que forma intervm o exerccio fsico na definio de um "stress oxidativo" e consequente precipitao do envelhecimento eritrocitrio? No exerccio, um ritmo acelerado de desoxigenao e reoxigenao da hemoglobina proporciona uma oportunidade para a intensificao da produo de metahemoglobina e anio superxido (61), podendo a bateria antioxidante do eritrcito ser insuficiente para o neutralizar cabalmente, nestas circunstncias, ou reparar os seus estragos. Concorrendo para esta situao, a descida do pH plasmtico, por aumento do lactato, e o aumento da temperatura, provocam um desvio da curva de dissociao da hemoglobina para a direita com diminuio da afinidade desta para o oxignio (14) e aumento da possibilidade de formao de metahemoglobina e superxido (37). Pelo que vimos, a extenso da agresso radical ser funo do estado das defesas, da que, aps o exerccio, a diminuio da Alterabilidade (por aumento da rigidez) afecte sobretudo os eritrcitos mais velhos, pois so aqueles cuja resistncia metablica ao "stress" est mais comprometida (62). 2.4) A PEROXIDAO LIPDICA A peroxidao lipdica um processo complexo atravs do qual cidos gordos poliinsaturados, reagindo com RLO, sofrem a subtraco de um tomo de hidrognio, originando lipoperxidos que podem, por sua vez, funcionar como radicais e iniciar uma reaco de propagao em cadeia (6,63,64). O local de maior concentrao de cidos gordos poliinsaturados so as membranas celulares, s quais conferem grande fluidez e flexibilidade, mas tornando-as, em contrapartida, alvo preferencial da agresso oxidativa (65). Alm de funcionarem como indicadores da leso radical os lipoperxidos tem vindo a ser implicados como causa directa de um nmero crescente de doenas, nomeadamente doenas do envelhecimento, (66) assumindo simultaneamente o estatuto de causa e consequncia, de indicador e iniciador. A evidncia de que um "estado de stress oxidativo" (OSS - oxidative stress status) est associado, seno a uma situao de doena, pelo menos a uma situao de risco (67,68) tem introduzido a discusso acerca da importncia do doseamento rotineiro e no invasivo de indicadores deste estado, com clara vantagem para os produtos da peroxidao lipdica dado o facto, somando ao j dissemos, de serem
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facilmente doseveis no plasma ou sangue, na urina, no ar expirado o que refora a sua acessibilidade (69). Uma das primeiras investigaes que associa exerccio com peroxidao lipdica deve-se a Dillard e col. (21 ) que encontraram nveis elevados de pentanojuntamente com o etano um dos dois alcanos produzidos na peroxidao sendo, pela sua volatilidade, dosevel no ar expirado (70,71) em humanos aps um exerccio a 50% do seu V02 max. Vimos tambm que a presena de produtos de peroxidao acompanhava o aumento do sinal radical (medido atravs de RPE) em ratos aps exerccio (13). Depois disso tem havido numerosa investigao nesta rea mas os resultados permanecem algo controversos. Viinka no encontrou diferenas na concentrao plasmtica de produtos de reaco com o cido tiobarbitrico o mais divulgado e doseado o MDA (malondialdedo) e tambm um produto da peroxidao lipdica (72) em corredores antes e depois de 30min de um exerccio fatigante e tambm quando comparados com sujeitos controle (72). Mas Lovlin e col. podem ter contribudo para clarificar esse aspecto quando demonstraram que um exerccio submximo inibia a peroxidao lipdica e um exerccio mximo resultava num aumento de 26% do MDA plasmtico (22). Relativamente ao treino verificou-se que ratos treinados, quando comparados com ratos controle, apresentam menor ndice de leso peroxidativa aps um exerccio at exausto, situao tanto verificvel na fibras musculares do tipo 1 (de metabolismo oxidativo) como do tipo 2 (de metabolismo glicoltico) (12). O eritrcito continua a ser um modelo de eleio para o estudo da peroxidao lipdica. As trs condies que a favorecem quantidade elevada de cidos gordos poliinsaturados no contingente lipdico, altas concentraes de oxignio molecular e a presena de metais de transio que podem funcionar como catalisadores combinam-se aqui como em nenhuma outra clula (6). Contudo, apesar da sua membrana ser particularmente rica em cidos gordos poliinsaturados est protegida por um sistema antioxidante muito eficaz, redundante at, como vimos (42,43). Da que s um estmulo oxidativo muito forte ou um sistema antioxidante muito fragilizado teriam capacidade de induzir lipoperoxidao nos glbulos rubros. Entender-se o exerccio fsico como um estmulo oxidativo forte pode ser uma generalizao ligeira se esse mesmo exerccio no for correctamente caracterizado sob o ponto de vista do consumo do oxignio. Por outro lado a peroxidao lipdica eritrocitria agrava-se com o envelhecimento celular e acompanha o declneo da bateria antioxidante (60). O que impe a necessidade da separao dos eritrcitos em gradientes de densidade para se ter uma maior visibilidade sobre as populaes mais sensveis agresso oxidativa.
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Por tudo isto a membrana eritrocitria af irma-se como um bom modelo para o estudo da leso oxidativa associada ao exerccio fsico, o que reforado pela constatao de que, mesmo antes do aparecimento de de quaisquer ndices de peroxidao no plasma, se verifica um aumento da sua susceptibilidade peroxidao lipdica (74). De que forma o exerccio mimetiza ou acelera o envelhecimento? Tentar compreender o que se passa durante um "stress oxidativo" e de que forma nveis diferentes de capacidade oxidativa (disponibilidade para consumir oxignio) condicionam a resposta a este "stress", passa, muito vantajosamente, pela caracterizao da peroxidao da membrana eritrocitria e da sua correlao com o estado de treino aerbio.

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3) MATERIAL E MTODOS:
3.1) CARACTERIZAO DA POPULAO Cinquenta indivduos do sexo masculino, de idade compreendida entre os 19 e os 24 anos, recrutados voluntariamente entre os alunos dos trs primeiros anos dos cursos de Bioqumica e de Educao Fsica da Universidade do Porto, constituram a amostra de partida para este estudo. Todos eles foram previamente informados do protocolo experimental a que seriam submetidos e de todas as eventuais consequncias que poderiam decorrer. Foi-lhes feita um exame mdico sumrio e dirigido no sentido de despistar antecedentes ou patologia impeditiva. Indivduos com histria clnica ou outra evidncia de problema mdico que pudesse limitar um exerccio mximo seriam excludos deste estudo. No fim desta avaliao inicial todos se revelaram aptos o que no constituiu surpresa pois o grande contingente de voluntrios (90%) eram praticantes desportivos regulares sendo, portanto, uma populao autosseleccionada e submetida a exames mdicos com regularidade. No sentido de avaliar a capacidade aerbia atravs da determinao do consumo mximo de oxignio (V0 2 max) foi-lhes aplicado um protocolo de exerccio em ciei oergmetro que consiste em incrementos de carga de 20 W cada minuto partindo de uma carga inicial de tambm 20 W mantendo uma frequncia pedalar de 60 rpm (rotaes por minuto), tomando o critrio de desistncia na exausto como ponto de finalizao do exerccio. Estando certos de que os resultados obtidos dependem, num grau de quantificao difcil, seno de todo impossvel, da motivao do indivduo este , no entanto, um dos protocolos que parece receber um apoio mais consensual pelas suas caractersticas relacionadas com o incremento progressivo da carga e de durao do prprio exerccio. Apesar disso, e de acordo com Martin e col. (32) foram tomados como critrios objectivos de esforo mximo: o alcance de um plateau na frequncia cardaca e no consumo de oxignio e um quociente respiratrio (R) maior que 1. Embora exista alguma controvrsia relativamente utilizao do cicloergmetro versus tapete rolante para a determinao do V0 2 max, ora reportando a inexistncia de diferenas entre os resultados obtidos (75) ora notando um aumento mdio de 8% no valor dos resultados quando utilizado o tapete rolante (76,77), o certo que a mesma controvrsia se torna irrelevante quando o nosso interesse na determinao dos V0 2 max relativo (comparativo) e no absoluto e todos os indivduos so sujeitos ao mesmo protocolo. Contudo, para assegurar que o mais alto consumo de oxignio seja obtido em cada
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protocolo, a inclinao dever ser de 3 graus ou mais, no caso do tapete rolante, ou a frequncia pedalar entre 60 e 70 rpm, no caso do cicloergmetro (76). O consumo de oxignio, juntamente com outros parmetros respiratrios e calorimtricos, foi determinado atravs do recurso a um "2900 Energy Expenditure System" (SensorMedics Corp., Anaheim, USA). Durante o exerccio cada indivduo foi monitorizado sob o ponto de vista electrocardiogrfico, atravs de cinco derivaes precordials, tendo-se preservado o registo da sua frequncia cardaca para, juntamente com os parmetros supracitados, se avaliar do estado de esforo mximo. Destes cinquenta indivduos foram seleccionados dez no sentido de obter um grupo com grande diversidade de V0 2 max. As suas caractersticas fsicas (idade, peso, altura), V0 2 max, consumo total de oxignio durante a prova (V0 2 T), tempo de prova (TP) e capacidade mxima de trabalho na prova (WcP), esto registados na tabela 1.
Tabela 1 Caractersticas fsicas e ndices de capacidade

Idade Indivduo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Mdia SEM*

(anos)

Peso
(kg)

Altura
(cm)

V 0 2 max
(ml/min/kg)

V02T
(ml/kg)

TP
(min)

WcP (W) 340 360 360 360 240 320 260 260 260 280 304 15.4

19 21 19 21 21 24 19 23 21 21 21 0.5

75 83 64 63 82 77 70 59 61 65 70 2.8

179 185 175 173 193 180 174 170 173 180 178 2.2

65.49 48.77 63.13 67.39 33.36 56.22 49.55 55.99 54.29 51.90 54.61 3.12

577.01 492.89 597.86 644.93 227.90 436.00 322.64 394.70 386.63 399.64 448.03 41.25

16 17 17 17 11 15 12 12 12 13 14 0.8

Legenda: V0 2 max: consumo mximo de oxignio; V0 2 T: quantidade total de oxignio consumida durante a corrida; TP: tempo de prova; WcP: capacidade mxima de trabalho na prova. *SEM: Erro-Padro.

3.2) EXERCCIO EXPERIMENTAL E COLHEITA DE SANGUE Estes dez indivduos realizaram um exerccio mximo de caractersticas idnticas ao usado na determinao do V0 2 max, com nveis de prestao semelhantes aos conseguidos anteriormente (mesmo TP e WcP), tendo-lhes sido colhida uma amostra de 10 ml de sangue 14

venoso por puno antebraquial imediatamente antes e imediatamente depois do mesmo exerccio. As colheitas foram feitas na posio supina (em cima do cicloergmetro) para minimizar efeitos posturais sobre o volume sanguneo e o sangue correspondente foi imediatamente colocado em tubos contendo EDTA potssico. 3.3) ISOLAMENTO DOS ERITRCITOS (POPULAO TOTAL) Depois de breve agitao, com o recurso a um agitador mecnico, cada uma das amostras foi filtrada atravs de uma suspenso de alfa-celulose anidra e celulose microcristalina anidra (Sigmacell type, Sigma Chem. Co., St. Louis, USA) que remove leuccitos e plaquetas do sangue total (78). Os eritrcitos obtidos aps filtrao foram lavados trs vezes (2500xg, 5 min) numa soluo de NaCl 0.155M e finalmente ressuspensos a um hematcrito de 30% na mesma soluo. 3.4) ISOLAMENTO DOS ERITRCITOS (FRACES DE DENSIDADE) 1 ml da populao eritrocitria total foi guardado a 4 C e o restante foi separado num gradiente descontnuo de densidades de arabinogalactano ("Larex-LO", Larex International Corp., Tacoma, WA, USA) em quatro fraces. Os gradientes descontnuos produzem bandas celulares distintas separadas por interfaces bem marcadas tornando mais fcil o isolamento de cada fraco quando comparados com os gradientes contnuos. Alm disso os gradientes de arabinogalactano oferecem um compromisso aceitvel entre a fidelidade dos gradientes de albumina e a simplicidade dos obtidos a partir de preparados macromoleculares (79). O objectivo da separao dos eritrcitos em gradientes de densidade , mais do que separar densidades, separar idades, partindo da evidncia de que existe uma correlao ntima entre estas duas variveis (57). Se ultimamente tem havido alguma controvrsia e at relutncia em aceitar esta correlao tal parece dever-se proliferao de resultados que, obtidos em condies no isopcnicas, a contrariam. Da que seja fundamental uma correcta definio e observao das condies de centrifugao em equilbrio isopcnico (79). No presente trabalho prepararam-se trs solues com as seguintes densidades 1.100,1.105,1.110 e uma quarta de 1.200. 2.5 ml de cada uma foram colocados, por ordem decrescente de densidade e com cuidado para prevenir a ruptura das interfaces, num tubo de ultracentrfuga. (O objectivo da utilizao da camada mais densa (1.200) impedir a agregao dos eritrcitos contra o fundo do tubo). 2.5 ml de suspenso de eritrcitos com hematcrito a 30% foram colocados no topo do tubo. O gradiente foi centrifugado a 4 C numa ultracentrfuga IEC-M60, a 20000 rpm durante 30 min, equipada
15

com um rotor SW-40. Quatro fraces eritroeitrias foram recolhidas, com uma pipeta Pasteur, em cada uma das amostras, correspondendo a mais leve s clulas situadas acima da camada de Larex de densidade 1.100 e a mais pesada s clulas colocadas imediatamente acima da camada de densidade 1.200. Cada fraco eritrocitria foi lavada trs vezes, como j descrito para a populao total, com o objectivo de remover o Larex. A concentrao globular de cada uma das fraces, bem como da amostra previamente guardada e correspondente ao sangue total, foi determinada atravs de um contador Coulter electrnico. 3.5) AVALIAO DA PEROXIDAO LIPDICA A peroxidao lipdica da membrana eritrocitria foi avaliada pelo mtodo de Rose e Oklander (80) modificado por Jain (81). A fluorescncia foi usada como indicador de peroxidao e medida nos extractos lipdicos das clulas vermelhas obtidos depois do tratamento com isopropanol-clorofrmio 3:2 (v:v). Tcnica: 0.4 ml de uma suspenso de eritrcitos de concentrao globular determinada previamente e correspondendo a cada uma das fraces obtidas para cada indivduo antes e depois do exerccio foram colocados num tubo de ensaio de vidro. (Num estudo por ns efectuado previamente chegamos concluso que, para a tcnica que estamos a descrever, a concentrao globular no dever ser inferior a 2.0 xlO6 clulas/mm 3 caso contrrio a percentagem de fluorescncia fornecida pelo espectrofluormetro apresenta, surpreendentemente, um valor distorcido relativamente quantidade de material peroxidado deixando de ser linear a relao entre estas duas grandezas). Adicionaram-se 3 ml de isopropanol a cada um dos tubos que foram agitados imediatamente. Logo de seguida adicionaram-se 2 ml de clorofrmio e fez-se nova agitao, como no caso da anterior, atravs de um vortex. Depois de 30 min de repouso temperatura ambiente os tubos so agitados e centrifugados a 2000 rpm durante 15 min numa centrfuga refrigerada. Com o objectivo de eliminar partculas em suspenso que possam interferir com a leitura da fluorescncia o sobrenadante de cada tubo foi cautelosamente depositado noutro tubo que foi por sua vez submetido a nova centrifugao de 2000 rpm durante 5 min, tambm em centrfuga refrigerada. A fluorescncia foi lida num Espectrofluormetro Jasco (modelo FP-770) com um comprimento de onda de excitao de 400 nm e um comprimento de onda de emiso de 455 nm. Estes comprimentos de onda so caractersticos dos produtos resultantes das ligaes entre os grupos aldedicos do malonaldedo (MDA) e os os grupos amino da fosfatidilserina e fosfatidiletalolamina (81) e correspondem, tambm, ao valor mais alto do 16

espectro de fluorescncia quando os eritrcitos so tratados com MDA exgeno (82) o que corrobora a especificidade e a vantagem deste mtodo de avaliao da peroxidao lpidica quando comparado com outros mtodos. Outros produtos fluorescentes decorrentes da peroxidao lipdica membranar podem tambm formar-se (83) mas com picos de leitura correspondentes a comprimentos de onda diferentes daqueles por ns utilizados. Os valores relativos de fluorescncia apresentados correpondem aos que decorrem da leitura dos resultados com uma fenda de 10 nm e uma sensibilidade de 10% para o espectrofluormetro Jasco nas condies experimentais acima descritas. 3.6) ANLISE ESTATSTICA A anlise estatstica dos resultados foi feita, quando se compararam os efeitos do exerccio na mesma populao (no treinados ou treinados), atravs do teste t de Student para variveis emparelhadas; e quando se compararam populaes diferentes (no treinados e treinados) atravs do teste t de Student para variveis desemparelhadas. Para a correlao entre variveis (V0 2 max, V0 2 T e WcP) com a variao da fluorescncia (AFT) recorreu-se a mtodos de regresso simples.

17

4) RESULTADOS:
Os parmetros antropomtricos correspondentes aos dez indivduos seleccionados foram j apresentados no captulo MTODOS (Tab. 1). A percentagem de fluorescncia verificada em cada fraco de densidade eritrocitria e no sangue total foi dividida pela concentrao globular que a respectiva amostra apresentava no momento em que lhe foi adicionado isopropanol-clorofrmio com o objectivo de corrigir diferenas causadas por diferente quantidade de material celular. Os resultados sero expressos em unidades arbitrrias (correspondendo estas %fluorescncia/ 1.0x1 (^clulas/mm3) e apresentados como a mdiaerro-padro de 10 amostras eritrocitrias como consta da tabela 2. Os resultados obtidos foram para as quatro fraces de densidade
Tabela 2 % de fluorescncia por concentrao globular nas 4 fraces de densidade e no sangue total.

Fraces de densidade 1 B.E.* A.E.* 2 0.4810.101 0.436+0.055 3 0.4770.068 0.4910.080 4 0.5420.097 0.6900.124 Sangue total 0.434+0.053 0.496+0.059

0.458+0.067 0.478+0.057

Nota: *: B.E. antes do exerccio; A.E. aps o exerccio. Nmeros nas fracesde densidade (1,2,3,4) significam densidade crescente. Os resultados so a mdia oerro-padrodelO amostras eritrocitrias. As diferenas entre cada uma das fraces no so significativas quer quando comparadas horizontalmente isto , diferentes fraces na mesma circunstncia (B.E. ou A.E.), quer verticalmente, isto , fraces homlogas (1 ou 2 ou 3 ou 4) antes e depois do exerccio. J as diferenas de fluorescncia antes para o sangue total A.E. e D.E. so estatisticamente muito significativas (p <0.01).

crescente e antes do exerccio respectivamente: 0.4580.067, 0.481 0.101, 0.4770.068, 0.5420.097; depois do exerccio as mesmas fraces de densidade eritrocitria apresentavam os seguintes valores: 0.4780.057, 0.4360.055,0.4910.080, 0.6900.124. Embora a olho n (em termos estatsticos) parea haver um aumento da percentagem de fluorescncia com o aumento da densidade, quer antes quer aps o exerccio, e tambm um aumento da percentagem de fluorescncia quando comparamos fraces homlogas (da mesma densidade) antes e aps o exerccio (excepto para a segunda fraco), tais diferenas, contudo, no so estatisticamente significativas quando as avaliamos atravs do teste t de Student. Como sugere a figura 1 tal ausncia de significado estatstico pode dever18

se grande disperso dos resultados encontrados

1.2
1.8j

u a
U

en

.6-

< .

6?

.4.

.2.

. 0
1 1 1 1

F1B

F2B F3B Fraces de densidade

F4B

z- ! 1. 8en
eu
{_

o
3

.6-

ee

.4.2-

< >

'

n.
FIA F2A F3A Fraces de densidade F4A

Figura 1. Percentagem de fluorescncia por fraco eritrocitria de densidade crescente (Fl, F2, F3, F4). No grfico de cima esto representadas as fraces correspondentes colheita anterior ao exerccio fsico e no de baixo as correspondentes colheita posterior. Os traos verticais correspondem aos desvios-padro. As diferenas no so estatisticamente sigificativas.

Relativamente diferena de fluorescncia encontrada antes e aps o exerccio fsico para os eritrcitos correspondentes ao sangue total, respectivamente 0.4340.053 e 0.496 0.059 (aumento de 14%) ela j estatiticamente muito significativa (p<0.01) e os valores apresentam um menor grau de disperso do que no caso das fraces de densidade como se pode verificar na figura 2.
19

18c
D
CO CD

642-

<

n. FTB FTA Sangue total antes(FTB)e aps(FTA) o exerccio fsico

Figura 2. Percentagem de fluorescncia nas amostra eritrocitrias de sangue total antes (FTB ) e aps (FTA) o exerccio fsico. Os traos verticais correspondem ao desvio-padro. As diferenas entre o primeiro grupo de amostras (antes do exerccio) e o segundo (depois do exerccio) so estatisticamente muito significativas (p<0.01)

Na tentativa de estabelecermos uma correlao entre este aumento significativo da fluorescncia nos eritrcitos correspondentes ao sangue total aps o exerccio fsico e algum dos parmetros indicativos do estado de treino, avaliamos a variao da fluorescncia para cada indivduo com a capacidade mxima de trabalho (WcP) (Fig. 3), com o consumo mximo de oxignio (V02max) (Fig. 4) e com o consumo total de oxignio (V0 2 T) (Fig. 5) ocorridos na respectiva prova.
ou
D

50 -

40 DQ

hLl_

\ 30 hu_ <

2010 o 200 *"" a

i '

JU--Ef
250

_-^--^t3

'

'

300

350

400

WcP
Figura 3. Correlao entre a capacidade mxima de trabalho (WcP) (watts) durante o exerccio fsico e o aumento relativo da fluorescncia eritrocitria aps o mesmo exerccio (AFT/FTB). Cada ponto representa um indivduo diferente. R=0.761; R2=0.579; p<0.05.
20

DU ~

50 40 CD hu_

h<

30 D

Ll_

g 20O 10 -

o 30 40
50

>

60

70

V02 max
Figura 4. Correlao entre o consumo mximo de oxignio (V 0 2 max) (ml/kg/min) atingido durante o exerccio fsico e o aumento relativo da fluorescncia eritrocitria aps o mesmo exerccio (A FT/FTB). Cada ponto representa um indivduo diferente. R=0.845; R2=0.713; p<0.01.

CO

<
X

o o

200

300

400

500

600

700

V02 T
igura 5. Correlao entre o consumo total de oxignio (V0 2 T) (ml/kg) ocorrido durante o exerccio fsico e o aumento relativo da fluorescncia eritrocitria ( AFT/FTB) aps o mesmo exerccio. Cada ponto representa um indivduo diferente. R=0.879; R2=0.773; p<0.001.

O consumo total de oxignio foi calculado somando os consumos parcelares de oxignio fornecidos pelo oxmetro. Estes trs valores para cada indivduo constam da tabela 1. A percentagem da variao da fluorescncia foi calculada dividindo a diferena
21

entre a fluorescncia aps e antes o exerccio (AFT) pela fluorescncia antes do exerccio (FTB) (A FT/FTB). As melhores correlaes encontradas so do tipo exponencial, e por uma questo de leitura grfica multiplicamos o valores em ordenada por 100. As correlaes encontradas apresentaram, como consta das legendas das respectivas figuras, um coeficiente R2 de 0.579 para a WcP, 0.713 para o V0 2 max e 0.773 para o V0 2 T, a que corresponde respectivamente um p<0.05, um p<0.01e um p<0.001. Por outra palavras a correlao entre a variao da fluorescncia estatisticamente significativa com a WcP, muito significativa com o V0 2 max e altamente significativa com o V0 2 T. Confrontados com a diferena de significado estatstico entre a correlao do V 0 2 T e do V0 2 max com a variao da fluorescncia fomos verificar a correlao entre os dois primeiros indicadores e verificamos que, apesar de ser alta (R2=0.79; p<0.001), no total (Figura 6).

650600550, 500CM O

X X

^ y ^ ^

'

450, 400350, 300. 250.

?00

>

^ ^ X
C

^ S ^

X
1 ^ [

- X ^
1 1

30

35

40

45

50 V02 max

55

60

65

70

Figura 6. Correlao entre o consumo mximo de oxignio (V0 2 max) (ml/kg/min) durante o exerccio fsico e o consumo total de oxignio (V0 2 T) (ml/kg) ocorrido no mesmoexerccio. Cada ponto representa um indivduo diferente. R=0.889; R2=0.790; p<0.001.

Ou seja estes dois parmetros no podem ser usados indistintamente pois tm significados diversos. E isso particularmente vivo quando na figura encontramos para valores muito prximos de consumo mximo de oxignio valores substancialmente diferentes de consumo total.

22

5) DISCUSSO:
5.1) AS VANTAGENS DA FLUORESCNCIA Os nossos resultados confirmam, atravs do recurso tcnica de fluorescncia (ver MTODOS), resultados j obtidos com mtodos diferentes(13,21,22), isto , o exerccio fsico induz um "stress oxidativo" que leva peroxidao lipdica das membranas biolgicas. Mas este mtodo tem sobre os outros as vantagens da especificidade e da facilidade. Quanto determinao do pentano no ar expirado (13), embora este seja, juntamente com o etano, um hidrocarboneto voltil originvel da peroxidao dos cidos gordos poliinsaturados das membranas celulares, tem sobre o etano a desvantagem de ser metabolizado no fgado dificultando assim a avaliao do verdadeiro significado da sua concentrao (70). O doseamento dos alcanos (etano e pentano) tem a vantagem de ser no invasivo, no requerendo a extraco de tecidos nem o uso de marcadores internos (como o caso dos marcadores de spin para o RPE) e, na medida em que a avaliao da sua concentrao imediata, eliminam a possibilidade da peroxidao que se mede ser, em grande parte, consequncia da manipulao laboratorial das amostras de tecido recolhido. Mas, em contrapartida, o facto de serem produtos laterais e formados em muito pequenas quantidades impede o estabelecimento de uma relao quantitativa directa com os nveis de peroxidao, por um lado, e a existncia de um limiar de prova em muitas situaes, por outro lado (71 ). Alm disso a exequibilidade deste mtodo em humanos est comprometida pelas dimenses que a cmara de recolha de gases deveria ter. Quanto ao chamado "teste do TBA" (13,22), ele sem dvida o mtodo mais divulgado e usado para determinao da peroxidao lipdica e pressupe uma reaco de adio nucleoflica entre o MDA (malondialdedo um produto final da peroxidao lipdica) e o cido 2-tiobarbitrico (TBA) gerando um complexo corado, o 1:2 MDA-TBA que tem um mximo de absorvncia a 532 nm (72). Acontece que este teste intrinsecamente no especfico para o MDA. A lista de molculas no lipdicas que reagem com o TBA originando complexos com a absorvncia mxima no mesmo comprimento de onda do MDA-TBA, vai desde os pigmentos biliares, aos aminocidos, passando pelos lcoois, os aucares, etc. Da que s fornea um janela estreita sobre o entendimento do processo complexo que a peroxidao e nunca poder ser visto como um sinal diagnstico da ocorrncia e da extenso da agresso oxidativa associada a este processo (84). Por outro lado o facto de o malondialdedo (MDA) ser um composto muito reactivo implica que
23

grande parte do que se forma reaja com grupos qumicos disponveis, sobretudo grupos amina, ficando pouca quantidade livre e disponvel para reagir com o TBA como o demonstrou Jain (81) quando, comparando a leso peroxidativa nos eritrcitos atravs da medio da fluorescncia nos extractos lipdicos (mtodo por ns usado) com o "teste do TBA" nas mesmas amostras, verificou que no encontrava alteraes para o TBA enquanto a fluorescncia denunciava um alterao significativa do padro de peroxidao. Devemos confessar que chegamos a montar a tcnica do MDA-TBA e a aplic-la no incio do nosso trabalho, mas a morosidade da mesma, pois implica o isolamento prvio de membranas celulares, sem qualquer vantagem adicional e com todas as desvantagens supracitadas sobre a medio da fluorescncia nos extractos lipdicos, cedo nos levou a troc-la. 5.2) UMA RELAO ENTRE O CONSUMO DE OXIGNIO E A LESO OXIDATIVA (PAPEL DO TREINO) O marcador universal da capacidade aerbia tem sido o V0 2 max e quando se correlacionam parmetros indicadores do estado oxidativo com o nvel de treino toma-se o V0 2 max como a melhor medida deste (25,28,74). No entanto a existncia de indivduos que num exerccio at exausto, apresentam consumos totais de oxignio muito diferentes para um consumo mximo semelhante (Fig. 6), deve fazer-nos rever a pertinncia da utilizao do V0 2 max quando procuramos uma correlao entre a leso oxidativa e a quantidade de oxignio consumida e disponibilizada pelo nvel de treino aerbio. E de facto a melhor correlao que obtivemos entre a leso oxidativa aqui medida atravs do aumento de produtos fluorescentes na membrana do eritrcito e o parmetro associado intensidade do exerccio ( WcP/Fig. 3, V0 2 max/Fig. 4, V0 2 T/Fig. 5) foi com o V0 2 T, o que compreensvel se pensarmos que este a medida directa da quantidade de agente txico, oxignio. Importa reforar a ideia de que embora todos os indivduos tenham feito um esforo at exausto esta diferente, em termos de consumo de oxignio, tempo de prova e trabalho realizado, para indivduos com diferentes nveis de treino, isto , com diferentes possibilidades de consumo de oxignio. Embora no conheamos estudos que corrrelacionem a leso oxidativa com a quantidade de oxignio consumida, eles existem para a intensidade de exerccio medida como % do V0 2 max. Lovlin e col. (22) encontraram para um exerccio mximo (100% do V0 2 max) um aumento de 26% do MD A plasmtico, medido atravs do TBA, enquanto que a 40% e 70% do V0 2 max os nveis so inferiores aos valores de repouso. Explicam-no
24

dizendo que o exerccio submximo, na medida em que promove uma utilizao/ consumo do lactato pela clula muscular com produo de equivalentes redutores (N ADH/NADPH), estimularia a actividade das enzimas antioxidantes e atenuaria o processo de peroxidao lipdica. Isto atribui intensidade do exerccio um papel regulador da agresso radical atravs da modelao da concentrao de NADH/NADPH via lactato, o que corroborado pela descrio de uma correlao altamente significativa (p<0.001) entre a concentrao de lactato e a de MDA para pequenos perodos de exerccio intermitente com intensidade varivel. Paradoxalmente Gohil e col. (28) demonstram que justamente para exerccios submximos (65% do V02 max) que se encontra, no sangue total, maior comprometimento do sistema do glutatio (o principal sistema antioxidante eritrocitrio), com uma descida significativa do glutatio reduzido (60% do controlo) e um aumento tambm significativo do glutatio oxidado (100% do controlo), enquanto que num exerccio at exausto (100% do V0 2 max) no verificam alteraes significativas quer do glutatio reduzido, quer do total. Estes resultados sugerem que o exerccio submximo seria um estmulo mais agressivo em termos oxidativos do que o exerccio mximo, na medida em que o desgaste do sistema protector (oxidao do glutatio reduzido) acontece na primeira modalidade. Simplesmente trata-se de dois tipos diferentes de exerccio feitos pelos mesmos indivduos em tempos diferentes e com duraes diferentes: o exerccio submximo a 65% do V0 2 max teve a durao constante de 90 min e o exerccio mximo terminou voluntariamente na exausto mas, como acontece estarmos perante indivduos com capacidades aerbias moderadas (mdia do V0 2 maxerro-padro: 47.822.73), o valor do consumo total de oxignio (V02T) ter sido muito maior no exerccio submximo, do que no mximo. Esta observao est de acordo com a intensidade de "stress oxidativo" avaliada atravs do consumo de glutatio reduzido e refora a importncia da medio do V0 2 T. O "stress oxidativo" tanto maior quanto maior for a quantidade de oxignio consumida. E isto ter repercusses no s nos indicadores directos de leso ou no gasto das defesas, mas tambm nas concentraes catinicas eritrocitrias, tendo sido demonstrado, durante um exerccio progressivo, que a 60% do V0 2 max no havia alterao nos valores do potssio enquanto a 80% havia uma descida significativa (49); e ainda no volume globular mdio que regista variaes durante o exerccio, diminuindo para exerccios submximos e aumentado para mximos (34), levantando a possibilidade de uma alterao dos mecanismos de transporte celular. A melhor correlao por ns encontrada do tipo exponencial, o que indica um crescimento abrupto dos indicadores de leso oxidativa acima de determinados valores de
25

consumo e sugere a falncia dos agentes antioxidantes primrios na conteno desta agresso suplementar. E primeira vista esta verificao entra em conflito com os dados da literatura que responsabilizam o treino pela aquisio de um sistema antioxidante eritrocitrio mais eficaz (27,29) com proteco contra a hemlise (26). So de facto os indivduos com melhores nveis de treino aerbio, com melhor capacidade aerbia, aqueles a apresentarem maiores ndices de leso peroxidativa provavelmente porque durante o esforo mximo eram os que estavam mais disponveis, em termos fisiolgicos, para consumir oxignio, tendo apresentado maiores VOz T. E se dividirmos a meio a nossa amostra considerando que os cinco indivduos de menor V0 2 T sero os pior treinados e os cinco com maior V0 2 T sero os melhor treinados encontramos, como consta da tabela 3, um aumento muito significativo (p<0.01) da variao da fluorescncia (AFT) com o exerccio quando comparamos o grupo bem treinado (em que se verifica um aumento de 18%) com o mal treinado (aumento de 7%), o que refora a ideia de que o treino proporciona condies para uma maior agresso oxidativa.

Tabela 3 Relao entre a fluorescncia e o nvel de treino aerbio

V0 2 T NT (5) T (5) 346.332.7 549.7+37.6 p<0.001

FTB 0.3260.023 0.542+0.079

FTA 0.3500.021 0.6420.066

AFT 0.0240.00 p<0.05 0.100+0.01 p<0.05 p<0.01

Legenda: V0 2 T: consumo total de oxignio durante a prova (ml/kg). FTB: fluorescncia correspondente ao sangue total antes do exerccio. FTA: fluorescncia correspondente ao sangue total depois do exerccio. NT: indivduos menos treinados (com menor capacidade aerbia). T indivduos mais treinados (com maior capacidade aerbia) Os valores so a mediai o erro-padro de cinco amostras eritroei trias para ambos os grupo. Os valores da significncia (p) so os que constam da tabela.

O consumo de oxignio seria, assim, o parmetro determinante da agresso oxidativa, sobrepondo-se aos mecanismos protectores induzidos pelo treino, que se revelariam insuficientes para lidar com a quantidade de oxignio por este disponibilizada. O praticante desportivo teria um nus a pagar pela sobrecarga oxidativa que lhe permite melhores prestaes desportivas. Contudo, se procurarmos uma curva que se aproxime melhor dos mesmos pontos da figura 5, ela sugere que o incremento nos nveis de peroxidao aps o exerccio se mantm grosseiramente estacionrio at um valor que se situaria pelos 575 ml/kg de consumo de 26

oxignio, disparando em flecha a partir deste valor (Fig. 7). Estes dados reafirmam o papel do treino na aquisio de um sistema antioxidante mais eficaz, pois para consumos de oxignio muito superiores, indivduos com nveis de treino relativamente altos, apresentam um grau de leso aproximado ao de indivduos pior treinados.

60 50
QQ

40 30

\ hX O

Ll_

<I

20 10.
-i

200

250

300

350

400

450 V02 T

500

550

600

650

700

Figura 7. Correlao entre o consumo total de oxignio (V0 2 T) (ml/kg) ocorrido durante o exerccio fsico e o aumento relativo da fluorescncia erirrocitria (AFT/FTB). Cada ponto representa um indivduo diferente. A curva um polinmio de grau 4 com R=0.98, R2 =0.959 e p<0.01.

Assim sendo, volta a haver acordo com a observao, feita por outros, de um menor ndice de peroxidao lipdica quando se compararam fibras musculares de ratos treinados e no treinados aps o exerccio (12), e com a observao de que para a mesma corrida os ratos treinados apresentaram valores mais baixos de glutatio oxidado (GSSG) no plasma e no fgado (85). No entanto, o grfico continua a demonstrar que para valores muito altos de consumo (acima de 600 ml/kg) deixa de se manifestar a proteco antioxidante induzida pelo treino e sobrevm uma situao de "stress oxidativo" com os nveis da peroxidao a subirem dramaticamente. 5.3) EXERCCIO FSICO E ENVELHECIMENTO ERITROCITRIO. Embora parea haver um aumento dos nveis de peroxidao lipdica com o aumento da densidade eritrocitria quer para as amostras colhidas antes quer para aquelas colhidas depois do exerccio, bem como para as fraces de densidade homloga aps o exerccio (Tab. 2), estas diferenas no so, contudo, estatisticamente significativas. Mas se continu27

armos a considerar os cinco indivduos com menor V0 2 T os pior treinados e os cinco com maior V0 2 T os melhor treinados, ou seja, se subdividirmos o nosso grupo inicial em dois grupos com estados de treino aerbios diferentes, j a situao se altera (Tab. 4).
Tabela 4. Relao entre o treino, o exerccio e a fluorescncia em cada fraco de densidade

NT B Fl F2 F3 F4 0.2800.016 0.3160.015 0.3660.031 0.38610.021 A 0.33810.012 0.31610.019 0.31210.016 0.37810.026 B 0.63610.064 0.64610.178 0.58810.117 0.69810.173

T A 0.61810.067 0.55610.079 0.67010.130 0.84010.206

Legenda: Fl, F2, F3 e F4 representam a fluorescncia nas fraces eritrocitrias de densidade crescente. NT: indivduos pior treinados. T: indivduos melhor treinados. B: antes do exerccio. A: aps o exerccio. Os valores so a mdia o erro-padro de cinco amostras eritrocitrias para ambos os grupos.

As diferenas que agora se verificam para as fraces de densidade so muito significativas (p<0.01) quando comparamos fraces no contguas (Fl com F3, Fl com F4 e F2 com F4) dos indivduos pior treinados antes do exerccio fsico, assinalando-se um aumento de 38% do valor da fluorescncia entre Fl e F4. Estes dados esto de acordo com as observaes feitas por outros que, usando eritrcitos de ratos (60) ou humanos (81), demonstraram tambm um aumento dos produtos de peroxidao lipdica com a idade do eritrcito acompanhado de um adormecimento do sistema protector antioxidante (60). Mas o facto de estas diferenas entre fraces de densidade deixarem de ser significativas aps o exerccio, no nos permite afirmar que este actuaria promovendo uma acelerao do envelhecimento eritrocitrio com maior expresso nas clulas mais densas (mais velhas) e com remoo preferencial destas (62). Alm disso, quando comparamos as diferenas de fluorescncia entre camadas homlogas para os indivduos pior treinados antes e aps o exerccio, elas so significativas para Fl, para F3, mas nunca para F4, justamente a camada mais densa (mais velha). Ou seja, se assumimos que h uma corrrespondncia entre densidade e idade (ver MTODOS) e que a idade se acompanha de um aumento dos produtos de peroxidao lipdica, no podemos (com os nossos resultados) imputar ao exerccio um papel na eliminao das clulas mais velhas, no rejuvenescimento celular, como outros fizeram (62).
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Por outro lado a ausncia de diferenas estatisticamente significativas entre as fraces de densidade para os indivduos melhor treinados, quer antes quer aps o exerccio, quer quando comparamos fraces homlogas antes e aps o exerccio, no nos permite estabelecer um perfil de distribuio caracterstico do treino. Ao contrrio de Mairbaurl e col. (86) que demonstraram que o treino induzia uma translaco unidireccional das densidades celulares no sentido das clulas menos densas, ou seja, que os indivduos melhor treinados apresentavam um maior nmero de eritrcitos jovens, faltando os eritrcitos mais velhos. Com os nossos resultados de acreditar que o exerccio e o treino intervm na redistribuio das diferentes populaes eritrocitrias, mas no de uma forma linear promovendo uma translaco simples no sentido das clulas mais velhas ou das mais jovens. Haveria a perda das relaes entre densidade e idade que foram observadas para os indivduos pior treinados antes do exerccio, como se tudo fosse novamente baralhado exigindo do investigador uma ateno suplementar.

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