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EXTRACCIN Y PURIFICACIN DE CIDO GIBERLICO A PARTIR DE CALDOS DE

CULTIVO
Cristian Alarid Garca
a
, Carmen Chvez Parga
b
, Omar Gonzlez Ortega
a
, Eleazar Mximo Escamilla
Silva
a
*
a
Departamento de Ingeniera Qumica, Instituto Tecnolgico de Celaya, Av. Tecnolgico y Garca
Cubas S/N, Celaya, Guanajuato, C.P.38010, Mxico
b
Universidad Michoacana de San Nicols de Hidalgo. Posgrado en Ingeniera Qumica. Francisco J.
Mjica S/n, Col. Felicitas del Ro, 58060, Morelia Michoacn.
Resumen
En la actualidad el cido giberlico (GA
3
) se produce mediante fermentacin sumergida, y con el objeto de recuperarlo del
medio de cultivo acuoso, donde es inestable, se utilizan diversos procedimientos destacando entre ellos la extraccin lquido-
lquido y la adsorcin en carbn activado o en resinas sintticas. En este trabajo se presentan los estudios realizados en la
adsorcin de GA
3
en las Amberlitas XAD-4S, XAD-4R e IRA 400. Los resultados experimentales mostraron que las tres
resinas utilizadas adsorben el GA
3
y con base en esta premisa se procedi a disear y operar adecuadamente el proceso de
adsorcin en lecho fijo para lo cual se determinaron las isotermas de adsorcin de GA
3
a 20 C y se ajustaron adecuadamente
al modelo de Freundlich. Se observ que la resina XAD-4S present la mayor capacidad de adsorcin. Se encontr que, para
la resina XAD-4S, el mejor eluente fue una solucin de metanol en agua al 85%, y una solucin al 80% para las otras dos
resinas. Finalmente, se hicieron pruebas con caldos de medios de cultivo obtenindose recuperaciones por encima del 95%
del GA
3
inicial presente para la resina XAD-4S.
Introduccin
Las operaciones que comprenden los procesos biotecnolgicos a escala comercial se han dividido
tradicionalmente en operaciones previas (procesos upstream) y operaciones posteriores o
bioseparaciones (procesos downstream). Los procesos de bioseparacin involucran la recuperacin y
purificacin de productos provenientes del biorreactor y comprenden todos los tratamientos que requiere
el caldo de cultivo para la obtencin del producto en las condiciones de pureza y actividad deseadas.
La dificultad para recuperar y purificar un producto biotecnolgico depende, en gran medida, tanto de la
naturaleza del mismo como del grado de pureza deseado; de cualquier forma, se requiere de varias
etapas de procesamiento. Estas etapas de procesamiento, debido a la labilidad de los productos y a que
normalmente stos se encuentran en soluciones acuosas diluidas, estn constituidas por procesos y
operaciones de separacin no convencionales de la ingeniera qumica que pueden representar ms del
60% de los costos fijos.
En general, la estrategia para la obtencin del producto contempla cuatro pasos, a saber: 1) separacin
de productos insolubles, 2) aislamiento, 3) purificacin o eliminacin de contaminantes qumicos y 4)
acabado o preparacin final del producto [1]. Una operacin, comprendida en el proceso de
bioseparacin, ampliamente utilizada para el aislamiento de productos biolgicos es la adsorcin en
resinas sintticas [4]. En el mercado pueden encontrarse una gran variedad de resinas sintticas entre las
que destacan las resinas derivadas del estireno-divinilbenceno que son utilizadas para aislar una gran
cantidad de sustancias.
El cido giberlico (GA
3
) es una hormona vegetal de gran importancia en la agricultura, ya que,
proporciona una gran variedad de beneficios como la elongacin de tallos y el aumento en el tamao de
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algunos frutos. En la actualidad, el GA
3
es producido mediante fermentacin microbiana y con el objeto
de recuperarlo del medio acuoso, donde es inestable, se han utilizado diversos procesos como carbn
activado, resinas sintticas de adsorcin en lecho fijo para su aislamiento y purificacin propsito de
este trabajo.
Metodologa
Resinas. Las resinas sintticas utilizadas en este trabajo para el aislamiento del GA
3
son tres. Los
nombres comerciales son Amberlita XAD-4 (referida en el presente trabajo como XAD-4S), distribuida
por Supelco, Amberlita XAD-4 (referida en el presente trabajo como XAD-4R), distribuida por Rohm
and Haas, y Amberlita IRA 400 (referida en el presente trabajo como IRA 400), distribuida por Supelco.
Las dos primeras son resinas de adsorcin y la tercera es una resina de intercambio inico.
Preparacin de las resinas. Las resinas se embarcan como un producto hmedo que contiene NaCl y
Na
2
CO
3
para retardar el crecimiento bacteriano. Estas sales deben eliminarse del adsorbente antes de
usarlas por primera vez. Para esto se lavaron las resinas, colocadas previamente en la columna, con agua
a un flujo lineal de 1.4x10
-3
m/s hasta que el pH del agua de salida fue el mismo que el pH del agua de
entrada. Para remover cualquier impureza orgnica se hizo pasar por la resina un poco de metanol y
finalmente se lav con agua para eliminar el alcohol.
Estudios de equilibrio. El objetivo de los estudios de equilibrio es determinar una relacin funcional
entre la cantidad de GA
3
adsorbido en la resina y su concentracin de equilibrio en la solucin (isoterma
de adsorcin). El procedimiento que se sigui se muestra a continuacin:
1. Se colocaron pesos distintos de la resina seca en matraces de 500 ml.
2. Se agregaron a cada matraz 100 ml de una solucin de GA
3
de concentracin conocida.
3. Se colocaron los matraces en un bao a temperatura constante y se agitaron a 200 rpm por 4 horas.
4. Se filtr el contenido del matraz y se tom una muestra de 6 ml.
5. Se tomaron 3 ml del filtrado y se determin la concentracin de GA
3
.
El tiempo de contacto para alcanzar el equilibrio se determin previamente para cada resina. La
concentracin de GA
3
en la resina, q, se calcul a partir de las concentraciones inicial y final del GA
3
en
la solucin, el volumen de lquido y la masa de resina. Los experimentos se efectuaron a 20 C y a pH
de 2.5.
Eluente ptimo. Una vez que se adsorbe el GA
3
en las resinas es necesario removerlo de las mismas
para completar el aislamiento del producto. El eluente que se utiliz fue una solucin acuosa de metanol
de diferente concentracin.
Aislamiento de GA
3
de medios de cultivo. En el laboratorio Biotecnologa y Bioingeniera en donde se
desarroll este trabajo, el GA
3
se produce mediante fermentacin con el hongo Gibberella fujikuroi y se
utilizan para ello dos biorreactores, uno de tanque agitado y el otro del tipo air lift. Los medios de
cultivo que se utilizan para la produccin contienen dextrosa o aceite vegetal como fuente de carbono.
La metodologa que se desarroll para el aislamiento y purificacin del GA
3
se describe a continuacin.
Independientemente de la fuente de carbono el primer paso para el aislamiento del GA
3
es la remocin
del material insoluble, biomasa principalmente. Para esto se tom el caldo de cultivo y se centrifug
para despus filtrarlo a travs de una membrana de 0.45 mm. Al caldo filtrado, que present una
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coloracin amarillenta, se le ajust el pH a un valor de 2.5 y se hizo pasar a travs de la resina dispuesta
en la columna. Una vez que se realiz el cargado de la resina se hizo pasar el eluente por la misma para
desorber el GA
3
. Para cuando el medio de cultivo contiene aceite vegetal es necesario un paso adicional
para su remocin previo al cargado de la resina, para esto se realiz una extraccin lquido-lquido con
hexano.
Factor de concentracin. El factor de concentracin, F, es la relacin entre la concentracin de GA
3
presente en el eluente y la concentracin de GA
3
presente inicialmente en el medio de cultivo. El factor
de concentracin calculado cuando se ha logrado desorber el 80% del GA
3
presente inicialmente se
identifica como F
80%
.
Cromatografa en capa fina. La identificacin de GA
3
y otras giberelinas se realiz mediante
cromatografa en capa fina en placas Kieselgel marca Merck utilizando como fase mvil una mezcla de
acetato de etilo, cloroformo y cido actico (15:5:1). Como revelador se utiliz una solucin de H
2
SO
4
al 5% en etanol [2].
Cuantificacin de GA
3
. El equipo que se utiliz para la cuantificacin de GA
3
fue un cromatgrafo de
lquidos de alta resolucin marca Varian con detector Uv-Vis de longitud de onda variable modelo 9050,
bomba modelo 9012 y automuestrador modelo 9100. La columna que se emple fue una C
18
de 15 cm
de longitud. El mtodo que se utiliz es el reportado por Negrete [3].
Resultados y discusin
Isotermas de adsorcin. En las Figuras 1, 2 y 3 se muestran las isotermas de adsorcin de GA
3
sobre
las resinas XAD-4R, XAD-4S e IRA 400, respectivamente, a una temperatura de 20 C y pH de 2.5. Las
isotermas obtenidas son del tipo favorable y los datos obtenidos fueron ajustados a los modelos de
isoterma lineales, de Langmuir y de Freundlich.
Figura 1. Isoterma de adsorcin de GA
3
sobre XAD-4R.
Figura 2. Isoterma de adsorcin de GA
3
sobre XAD-4S.
Datos
Experimentales
Freundlich
Langmuir
Lineal
Datos
Experimentales
Freundlich
Lineal
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Figura 3. Isoterma de adsorcin de GA
3
sobre IRA 400.
En las Figuras 1, 2 y 3 se puede observar que la isoterma de Freundlich es la que ajust de manera
satisfactoria los datos experimentales para las tres resinas, ya que la concentracin de GA
3
a la que se
est trabajando es baja.
Eluentes ptimos. En la Figura 4 se presenta el porcentaje de recuperacin de GA
3
, adsorbido
previamente en la resina, para las diferentes concentraciones de metanol en agua y para cada una de las
resinas empleadas.
Figura 4. Porcentaje de recuperacin para el aislamiento de GA
3
.
De la Figura 4 se desprende que con la resina XAD-4S y el eluente empleado se desorbi ms
fcilmente el GA
3
que con las resinas XAD-4R e IRA 400. La concentracin del eluente ptimo para
esta resina fue del 85% de metanol en agua y del 80% para las otras dos resinas estudiadas.
Aislamiento y purificacin de GA
3
de medios de cultivo. Las resinas que se utilizaron para el
aislamiento de GA
3
de los caldos de cultivo fueron la XAD-4S y la XAD-4R. Los resultados del
aislamiento de GA
3
de caldos de cultivo provenientes de cinco fermentaciones se muestran en la Tabla
1. Para todos los caldos tratados con la resina XAD-4S los porcentajes de recuperacin son mayores al
95% y los factores de concentracin son mayores a 1.
Datos
experimentales
Freundlich
Langmuir
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Tabla 1. Aislamiento de GA
3
de medios de cultivo.
Caldo
Resina
Concentracin
inicial de GA
3
(g/l)
F
80%
F %R
1 XAD-4S 0.109 5.6 2.7 97.4
2 XAD-4R 0.090 2.7 1.6 86.1
3 XAD-4S 0.165 3.2 1.4 97.4
4 XAD-4S 0.120 9.6 5.4 97.5
5 XAD-4S 0.106 5.2 2.3 96.9
Cuando la etapa de aislamiento se realiza mediante una extraccin del caldo de cultivo con acetato de
etilo es necesario utilizar hasta tres veces el volumen del caldo de acetato de etilo para lograr que todo el
GA
3
presente en la fase acuosa se transfiera a la fase orgnica. Un anlisis de algunas de las sustancias
presentes en el caldo que abandona la columna durante el cargado de la resina revel que ni la dextrosa
ni otras sustancias inorgnicas presentes (como sulfatos o fosfatos) son adsorbidas por la resina. Una vez
que termin la elucin se evapor a vaco el eluente a 40 C. Despus de la evaporacin se obtuvo un
residuo acuoso amarillento que fue extrado con acetato de etilo. El acetato de etilo extrajo a las
giberelinas presentes, incluido el GA
3
, pero extrajo muy poco de la sustancia que da la coloracin
amarilla al residuo acuoso. Una vez que se obtuvo el extracto orgnico se trat con sulfato de sodio
anhidro y se evapor nuevamente a vaco a 40 C. El residuo se resuspendi en metanol y se coloc en
un medio fro. Esto indujo la cristalizacin de parte del GA
3
presente. Se removieron estos cristales de la
solucin y se volvieron a disolver para realizar una cromatografa en capa fina. El resultado que se
obtuvo se representa en la Figura 5 donde solamente se encuentran presentes las giberelinas GA
3
y GA
7
.
Figura 5. Cromatografa en capa fina de cristales redisueltos de GA
3
.
Tomando en cuenta los resultados anteriores se propone el esquema de recuperacin y purificacin de
GA
3
que se presenta en la Figura 6.
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Figura 6. Esquema propuesto de recuperacin y purificacin de GA
3
.
Conclusiones
Las tres resinas estudiadas adsorben el GA
3
de los caldos de cultivo aunque difieren en su capacidad de
adsorcin. La resina XAD-4S result ser la ms adecuada para el aislamiento de GA
3
, no slo por su alta
capacidad de adsorcin sino tambin por su capacidad de desorcin con el eluente probado. Su
capacidad de adsorcin en el tiempo de rompimiento result ser dos veces mayor a la capacidad de
adsorcin de la resina XAD-4R. Los porcentajes de recuperacin durante el aislamiento de GA
3
de
caldos de cultivo son superiores al 95% para el caso de la resina XAD-4S. El eluente ptimo para esta
resina es una solucin de metanol en agua al 85% y se requiere de un volumen de eluente menor al
volumen de caldo tratado para completar el aislamiento y la regeneracin de la resina. Adems, esta
resina no adsorbe la dextrosa presente en los caldos ni otras sustancias inorgnicas lo que implica que es
un tanto selectiva para la adsorcin de GA
3
. El estudio de la etapa de purificacin arroj que la
induccin de la cristalizacin por enfriamiento de la solucin es la tcnica que acelera y facilita esta
etapa. Adicionalmente se plante la cromatografa por elucin para purificar parcialmente el GA
3
obtenindose recuperaciones superiores al 95%.
Agradecimientos
Al CONACyT (33973-B) y a la DGEST (648.02-P) por el apoyo financiero otorgado durante el
desarrollo de esta investigacin.
Referencias
1. Belter, P. A., Cussler, E. L. and Hu, W. S. Bioseparations, Downstream Processing for
Biotechnology. New York, NY: John Wiley & Sons, (1988).
2. Cavell, B. D., MacMillan, J., Pryce, R. J. and Sheppard, A. C. Thin-Layer Chromatography of
the Gibberellins. Phytochemistry, 2, 867-874, (1966).
3. Negrete, X. R. Produccin de cido Giberlico (GA
3
) en Biorreactor de Tanque Agitado con
Gibberella fujikuroi Empleando Aceite de Maz como Fuente de Carbono. Tesis de maestra,
Instituto Tecnolgico de Celaya, Gto., Mxico, (2002).
4. Tejeda, A., Montesinos, R. M. y Guzmn R. Bioseparaciones. Sonora, Mxico: Editorial Unison,
(1995).
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