AO DE LA INVERSIN PARA EL DESARROLLO RURAL Y LA SEGURIDAD ALIMENTARIA

UNIVERSIDAD ALAS PERUANAS ESCUELA ACADEMICA PROFESIONAL DE TECNOLOGIA MDICA LABORATORIO CLINICO

PRCTICA: PROFESOR: CURSO: CICLO: ALUMNOS:

MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES MG. JOSE ALBERTO DIAZ TELLO BACTERIOLOGIA V

Capillo Lpez, Lowis Crdenas Alarco, Patricia Quispe Tinco, Norma Trujillo Lpez, Caleb Valenzuela Albujar, Jonathan

2013

MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES

INTRODUCCION
Existen medios de cultivo, llamados selectivos, que permiten el crecimiento de determinadas bacterias e inhiben el desarrollo de otras porque poseen una sustancia inhibidora. Otros medios, llamados diferenciales, son usados para aislar los organismos dentro de una mezcla, por los caracteres diferenciales que presentan. Suelen ser medios slidos y se basan en la capacidad de fermentacin de un determinado azcar. En esta prctica hemos utilizado un medio denominado agar Mac conkey. Es un medio de color rosado que posee, entre otras sustancias, lactosa, peptonas, el colorante vital rojo neutro, sales biliares y violeta cristal. Este medio es selectivo contra Gram positivas debido al violeta cristal y a muchas Gran negativas debido a las sales biliares (agentes tenso activos que desorganizan muchas membranas externas). En cambio las entero bacterias, estn evolutivamente adaptadas a soportar las sales biliares en su hbitat natural (el intestino de vertebrados superiores) y pueden crecer en este medio. Es tambin un medio diferencial que permite visualizar dos tipos de bacterias segn que puedan fermentar o no la lactosa, con produccin de cidos. Las bacterias fermentadoras de la lactosa, excretan al medio gran cantidad de cidos orgnicos, lo que provoca que sus colonias y sus alrededores aparezcan de un color rojo intenso, debido al viraje del rojo neutro. En cambio, las bacterias incapaces de fermentar la lactosa, recurren como fuente de carbono a las peptonas a las que desaminan excretando iones NH4, que alcalinizan el medio de cultivo, lo cual se traduce en que el indicador rojo neutro vira a amarillo.

AGAR MACCONKEY
Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.

FUNDAMENTO
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las colonias, y la precipitacin de las sales biliares. Los microrganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

CARACTERISTICAS DEL MEDIO

Medio preparado: rojo prpura -Cuando la bacteria utiliza los carbohidratos se va producir acides, y por eso por eso la colonia se ve de color rosado.

AGAR SS (SALMONELLA SHIGELLA)

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia.

FUNDAMENTO
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayora de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa, y a la formacin de cido sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio. Los pocos microrganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obtenindose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes. La produccin de cido sulfhdrico se evidencia como colonias con centro negro debido a la formacin de sulfuro de hierro.

CARACTERISTICAS DEL MEDIO: medio preparado, rojo naranja

AGAR XLD
Es un medio moderadamente selectivo y de diferenciacin para el aislamiento y la diferenciacin de patgenos entricos gram negativos (Salmonella y Shigella) a partir de muestras clnicas. Es adecuado en especial para el aislamiento de la especie Shigella.

FUNDAMENTO
La degradacion de los carbohidratos presentes en el medio(xilosa,lactosa y sacarosa) genera la produccion de acido haciendo virar el indicador(rojo fenol) de rojo a amrillo en este medio se incorpora la xilosa por que es practicamente fermentada por todas las enterobacterias con excepcion de los microorganismo, pertenecientes al genero shigella. La lisina se incluye para aumentar la diferenciacion delos microorganismos pertenecientes al genero,salmonella, ya que sin lisina estos microorganismos rapidamente fermentan la xilosa produciendo la acidificacion del medio y no se pueden diferenciar de otras especies non patogenas. Como la cantidad de este carbohidrato es limitada,una ves que estos microorganismos lo consumen ,comienzan a utilizar la lisina lo cual produce la alcalinizacion del medio,este hecho se evidencia por que el rojo fenol nuevamente vira a un color rojo. En el caso de los coliformes lisin posetiva, para previnir la alcalinizacion del medio por la utilizacion de la lisina, se incorpora en el medio un exeso de lactosa y sacarosa. El medio tambien tiene la capacidad de detectar hidrogeno sulfurado atraves del sistema indicador tiosulfato de sodio y citrato ferrico amonio.cuando el microorganismo produce hidrogeno suifurado, se oooobservan colonias con el centro negro. Los microorganismos no patogenos productores de hidrogeno sulfurado no descarboxilan la lisina, cuando estan presentes estos micro organismos la reaccion acida producida por la utilizacion de los carbohidratos previenen el ennegrecimiento de colonias. El desoxicolato de sodio es utilizado como inhibidor de los micro organismos Gram posetivos.

AGAR TSI (TRES AZUCARES DE HIERRO)

Medio universalmente empleado para la diferenciacin de entero bacterias, en base a la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico.

FUNDAMENTO
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.

SIEMBRA
A partir de un cultivo puro, sembrar en TSI, picando el fondo y extendiendo sobre la superficie del medio.

INCUBACION
A 35-37C durante 24 horas, en aerobiosis.

RESULTADOS
A: cido K: alcalino 1-Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): K/A, el microrganismo solamente fermenta la glucosa. 2-Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): A/A, el microrganismo fermenta glucosa, lactosa y/o sacarosa. 3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): K/K, el microrganismo es no fermentador de azcares. 4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microrganismo produce gas. 5-El ennegrecimiento del medio indica que el microrganismo produce cido sulfhdrico. -Los azucares del TSI lo utilizan por fermentacin en anaerobiosis, con produccin de cidos, gas y acido sulfhdrico, valorndose de 1+ a 4+

T SI

UTILIZACION DE AZUCARES

A/A 2+ -

K/A 1+ -

K/A 4+

K/K - -

MEDIO SIM
Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

FUNDAMENTO
El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehdo del reactivo de Kovac o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

SIEMBRA
A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio slido, sembrar por puncin profunda con aguja de inoculacin recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el centro del tubo, y la puncin debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la superficie. Es importante que la siembra se realice en lnea recta.

INCUBACION
Durante 24 horas, a 35-37 C, en aerobiosis. Luego de la incubacin, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovac o de Erlich.

RESULTADOS
Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se extiende ms all de la lnea de siembra. Cepas inmviles: el crecimiento se observa solamente en la lnea de siembra. Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la lnea de siembra o en todo el medio. Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color. Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac o de Erlich. Cepas indol negativas: sin cambio de color.

LIMITACIONES
-En las bacterias aerobias estrictas, que slo crecen en superficie, la movilidad puede ser difcil de observar. -Algunas bacterias productoras de melanina como M. morganii, pueden dar un color parduzco, que no debe confundirse con el color negro debido a la produccin de cido sulfhdrico.

CARACTERISTICAS DEL MEDIO

Medio preparado: mbar.

Detecta la liberacin del indol en un cultivo bacteriano, se debe ala degradacin del triptfano por la enzima triptofanasa y se detecta por accin del reactivo covak o Erich

AGAR LIA (LISINA DE HIERRO)

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la produccin de cido sulfhdrico.

FUNDAMENTO
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decasrboxilasa y desaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesaria que la glucosa sea previamente fermentada. Los microrganismos que no producen lisina descarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro de hierro. Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del medio.

SIEMBRA
Por puncin profunda con aguja de inoculacin.

INCUBACION
En aerobiosis, durante 24 horas a 35-37 C.

RESULTADOS
1- Decarboxilacin de la lisina: -Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. K/K -Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo/A 2- Desaminacin de la lisina: Pico rojizo/fondo amarillo. R/A

Esto sucede con cepas del gnero Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp. 3-Produccin de cido sulfhdrico: -Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente en el lmite del pico y fondo)

CARACTERISTICAS DEL MEDIO

Medio preparado: color violeta.

MEDIO UREA
Medio utilizado para diferenciar microrganismos en base a la actividad uresica. Se utiliza para identificar bacterias que hidrolizan urea, tales como Proteus spp., otras entero bacterias y estafilococos.

FUNDAMENTO
En el medio de cultivo, la triptena y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el rojo de fenol es el indicador de pH. Algunas bacterias hidrolizan la urea por medio de la enzima ureasa liberando amonaco y dixido de carbono. Estos productos alcalinizan el medio haciendo virar el rojo de fenol del amarillo al rojo. En este medio, la fermentacin de la glucosa activa la enzima ureasa, acelerando la velocidad del metabolismo en aquellos organismos que hidrolizan lentamente la urea, como especies de Enterobacter o Klebsiella.

SIEMBRA
A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, estriar la superficie del pico de flauta. Algunos microrganismos pueden requerir mayor tiempo de incubacin. Se recomienda no punzar la capa profunda para controlar el color.

INCUBACION: En aerobiosis, durante 24-48 horas a 35-37 C. RESULTADO: Ureasa (+), color rosado; Ureasa (-), sin cambio de color CARACTERISTICAS DEL MEDIO
Medio preparado: amarillo

La ureasa desdobla la urea en dos molculas de amoniaco y bicarbonato, puede ser detectado por cambio de color del medio de cultivo.

MEDIO AGAR CITRATO DE SIMONS

Medio utilizado para la diferenciacin de entero bacterias, en base a la capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y energa.

FUNDAMENTO
En el medio de cultivo, el fosfato Mono amnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de bromo timol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino. El medio de cultivo es diferencial en base a que los microrganismos capaces de utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la consiguiente produccin de alcalinidad. El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa.

SIEMBRA
Por estras

RESULTADO
-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. -Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.

LIMITACIONES
Verde-Si se usa un inculo denso para sembrar el medio de cultivo, puede variar el color del pico del al amarillo-amarronado. Esto no afecta el color verde del resto del medio de cultivo, pero puede afectar la visualizacin Azul de un resultado positivo. -Inculos muy densos, pueden originar resultados falsos positivos. -Cuando se siembra una serie de pruebas bioqumicas a partir del mismo cultivo, se debe esterilizar la aguja de inoculacin antes de inocular la prueba del citrato o sino inocularla primero. Cualquier arrastre de materia orgnica puede originar resultados falsos positivos.

CARACTERISTICAS DEL MEDIO

Medio preparado: verde.

MEDIO CITRATO

(-)

(+)

Evala la utilizacin de citrato como nica fuente de carbono y de compuestos amoniacales como nica fuente de nitrgeno.