UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA FACULTAD DE INGENIERA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS DEPARTAMENTO ACADMICO DE ALIMENTOS

PRACTICA 8 : DETERMINACION DEL NUMERO DE BACTERIAS VARIABLES EN UNA MUESTRA DOCENTE : Blg. ALCEDO ROMERO, Margarita

CURSO

: MICROBIOLOGIA I

INTEGRANTES

CICLO

: 2013 I

TINGO MARA PER

I.

INTRODUCCION

En diversos estudios microbiolgicos (como anlisis de alimentos, de agua de bebida, de productos farmacuticos o del medioambiente entre otros), se requiere conocer el nmero de microorganismos presentes en un material con objeto de determinar su calidad. El procedimiento es esencialmente el mismo que para la medida del crecimiento de las poblaciones de bacterias El crecimiento de poblaciones microbianas puede determinarse mediante mtodos de medida de la masa total celular, que generalmente es directamente proporcional al nmero de clulas, (mtodos de determinacin del peso, de la actividad del cultivo o mtodos turbidimtricos) o por la determinacin del nmero de clulas.

II.

OBJETIVOS

Proporcionar conocimientos sobre la determinacin del nmero de microorganismos de una muestra problema (alimento) y as determinar su calidad microbiolgica.

III. 3.1.

MARCO TEORICO

TCNICAS DE RECUENTO BACTERIANO

Para el recuento de microorganismos presentes en una muestra de agua, suelo, aire, alimento, cultivos, entre otros, existen diferentes mtodos o tcnicas. Algunas tcnicas son directas y permiten un recuento de todas las clulas, tanto las vivas como las muertas. Las medidas directas incluyen los recuentos directos al microscopio o recuento electrnico, el recuento en placa, o el clculo del nmero ms probable (NMP). Otras son medidas indirectas y miden una propiedad de la masa de las clulas como son la turbidez, el peso seco, o una actividad metablica.

3.2.

FASES DEL CRECIMIENTO DE UN CULTIVO Se pueden distinguir cuatro fases en el cultivo: (1) la fase lag en la

que el microorganismo se adapta a las nuevas condiciones y pone en marcha su maquinaria metablica para poder crecer activamente. La duracin de esta fase es variable y en general es mayor cuanto ms grande sea el cambio en las condiciones en las que se encuentra el microorganismo. (2) La fase exponencial cuya cintica explicamos en la pgina anterior. (3) La fase estacionaria en la que no hay aumento neto de microorganismos, lo que no significa que no se dividan algunos, sin io que la aparicin de nuevos individuos se compensa por la muerte de otros. (4) La fase de muerte en la que el nmero de microorganismos vivos disminuye de forma exponencial con una constante k que depende de diferentes circunstancias.

3.3.

MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO Podemos medir el crecimiento microbiano siguiendo diferentes

parmetros algunos de los cuales presentar a continuacin. No debemos olvidar que en condiciones de crecimiento equilibrado todos los parmetros del cultivo evolucionan de forma proporcional y, por consiguiente, midiendo uno de ellos (el de medida ms fcil) podemos medir el resto. Entre los mtodos principales de recuento de microorganismos podemos destacar: 3.3.1. TURBIDEZ Se basa en la medida de la turbidez de los medios de cultivo en los que crecen microorganismos unicelulares. La turbidez es proporcional a la masa de las clulas en suspensin y su medida nos permite estimarla. Para ello se utiliza un espectrofotmetro que mide la cantidad de luz que transmite una solucin o un cultivo lquido de clulas microbianas. A mayor masa de clulas en un cultivo, mayor ser su turbidez, y menor la cantidad de luz que se transmitir de manera que la lectura en el espectrofotmetro ser mayor. Se utiliza en cultivos densos. Permite medir el crecimiento de poblaciones. Para medir la masa o el nmero de clulas con un espectrofotmetro, se debe preparar una curva patrn, o grfica en la que se relacionan las medidas del espectrofotmetro con la masa celular o el

nmero de clulas en un cultivo de un determinado y se expresa en unidades de absorbancia. 3.3.2. RECUENTO CELULAR MICROSCPICO DIRECTO Se basa en colocar un volumen determinado de clulas sin fijar y realizar el conteo utilizando microscopa de fase. Para ello se utiliza la cmara de recuento de Petroff-Hauser o de Newbauer consistente en un portaobjetos con una excavacin de 0.02 mm de profundidad en un rea de 1 milmetro cuadrado, con una rejilla dividida en 25 cuadrados grandes los cuales a su vez se subdividen en 16 cuadrados de 4X4 o sea que la muestra se distribuye en 400 celdillas.

Figura 1: Cmara de Newbauer.

Figura 2: Partes a contar de la Cmara de Newbauer

3.3.3. RECUENTO EN PLACA POR SIEMBRA EN PROFUNDIDAD. Consiste en aadir medio de cultivo fundido y enfriado a 50C sobre placa de Petri que contiene una cantidad determinada de la muestra diluida. Se tapa la placa y se rota para mezclar la muestra en el agar. Cuando el agar solidifica se incuban las placas. Las colonias se desarrollan tanto dentro del agar como en la superficie. Es un mtodo generalmente utilizado para el recuento de microorganismos anaerobios facultativos o microaerofilos.

3.3.4. RECUENTO DE COLONIAS O RECUENTO ESTNDAR EN PLACA Se basa en contar las colonias de microorganismos que se desarrollan despus de inocular en un medio de cultivo adecuado e incubar a una temperatura y tiempo determinados un volumen determinado de muestra. Se utiliza para determinar el nmero de clulas aisladas o

microorganismos unicelulares viables como bacterias, levaduras, tambin se utiliza para el conteo de esporas fngicas presentes en la muestra.

Figura 3: Recuento en placa dilucin de la muestra.

3.3.5. RECUENTO EN FILTROS DE MEMBRANA En este mtodo el recuento se realiza por filtracin de un volumen de la muestra a travs de un filtro de membrana de tamao adecuado para retener a las bacterias (0.22-0.45 m). Una vez filtrada la muestra, el filtro se coloca sobre un medio de cultivo slido y se incuba. El recuento del nmero de colonias formadas sobre el filtro determina el nmero total de bacterias en la muestra filtrada. Es un mtodo til cuando el nmero de

bacterias presentes en la muestra es muy bajo. Se utiliza con frecuencia para determinar el nmero de bacterias en agua.

3.3.6. RECUENTO DIRECTO CON CONTADORES ELECTRNICOS Se utiliza el contador Coulter recuenta el nmero de clulas suspendidas en un lquido, a su paso por un orificio por donde fluye la corriente elctrica. Se puede determinar a su vez el tamao de las clulas pero tampoco distingue entre viables, muertas o partculas.

3.4.

MEDIDA DE PESO SECO. El sistema consiste en la filtracin del cultivo a travs de una

membrana que retenga las clulas y su posterior desecacin hasta peso constante. El sistema, obviamente, no diferencia clulas vivas de muertas y su sensibilidad es limitada.

3.5.

MEDIDA DEL ATP. Es una medida relativamente sencilla basada en la emisin de luz

por la luciferasa de lucirnaga (Photimus pyralis) en presencia de O2 y de ATP. De esta forma se puede medir la concentracin de ATP en un volumen dado de cultivo. Esta medida es interesante porque la concentracin de ATP decae rpidamente en las clulas muertas, de forma que esa medida indirecta detecta nicamente las clulas vivas.

IV.

MATERIALES Y METODOS

4.1.

RECUENTO ESTANDAR EN PLACA Materiales:

Placas de petri estriles. Tubos de ensayo son diluyente (9mL). Frascos de dilucin con diluyente (90mL). Pipetas estriles de 2 y de 5 mL. Gradillas/plumones. Mechero bunsen. Incubadora a Cuentacolonias. Agar plate count. Diluyente: agua peptonada al 0.1% Muestra de alimentos. Procedimiento: .

Preparacin de las diluciones: Si la muestra es lquida, previamente homogenizar (agitar varias veces) y luego tomar con una pipeta serolgica 1mL de la solucin (muestra original) y colocar en un tubo de ensayo conteniendo 9mL de diluyente. Si la muestra es slida, pesar 10g y colocarlo en los frasco de diluciones con 90mL de diluyente, proceder a homogenizar la muestra con el diluyente (en caso de que la muestra sea dura proceder a triturado o licuado segn requiera el caso). Cambiar la pipeta y pipetear 10 veces el contenido del tubo para homogenizar la muestra. Este correspondera a la dilucin ambos casos. Tomar 1mL del primer tubo o frasco de dilucin e introducirlo en un segundo tubo de ensayo conteniendo 9mL de diluyente y proceder igual a los descritos anteriormente. Este tubo corresponde a la dilucin . para

Para las dems diluciones repetir lo descrito anteriormente. Realizar tantas diluciones como corresponde de acuerdo el estado de contaminacin de la muestra.

Recuento estndar en placas: Tomar 1mL de las tres ltimas diluciones y colocarlas en placas de petri vacas identificadas, hacerlo por duplicado (de acuerdo al grfico). Realizar de igual modo con las otras diluciones. Adicionar a cada placa petri con el inoculo, 15mL de medio de cultivo fundido y temperado a , entre la preparacin de la dilucin y

de la adicin del agar no debe transcurrir ms de 10min. Mezclar inmediatamente el inoculo con el agar, mediante movimientos de va y ven y rotacin. Espera que solidifique el medio de cultivo. Y adicionar una capa delgada de agar (5mL) sobre el medio solidificado y dejar secar. Invertir las placas e incubar 35 2 / 24- 28 h.

Despus del tiempo transcurrido realizar la lectura correspondiente con la ayuda de un cuentacolonias.

4.2.

PUEBA DE LA REDUCTASA Materiales:

Tubos de ensayo estriles. Pipetas de 10mL estriles/gradillas. Bao mara a 36 con tapa o estufa de 36 -37 .

Muestra de alimento: Leche cruda. Reactivo: azul de metileno. Procedimiento:

Colocar 1mL de solucin de azul de metileno en un tubo de ensayo esterilizado. Agregar 10mL de leche cruda. Colocar los tubos con la muestra en bao mara asegurando que el agua cubra toda la muestra. a 36 - 37

Cronometrar el inicio del periodo de la prueba de reduccin del azul de metileno e invertir los tubos a cada 30min para redistribuir las bacterias y la grasa.

Hacer la siguiente lectura 1h despus y as sucesivamente hasta que la leche presente decoloracin. Despus de cada observacin invierta, lentamente en su posicin inicial.

V.

RESULTADOS Y DISCUSIN

En el conteo de colonias se utiliz la maquina cuenta colonias Figura 4: Maquina cuenta colonias Figura 5: Conteo de colonias

La regla a utilizar es el siguiente. Si:

Utilizaremos los dos por que las dems colonias sobrepasan la cantidad de ; ; en los dems grupos. La frmula a utilizar es:

Donde el factor de dilucin es:

Eje: Dilucin =

Cuadro 1: Conteo de colonias y su promedio.

Numero de microorganismos placa 1 placa 2 Promedio Promedio en base 105 98 101,5* 101,5* 65 49 570* 57* Media Aritmtica 335.75

Diluciones

El inoculo que se utilizo fue de 1 mL. Entonces Si:

Si:

VI.

CONCLUSIONES

Se aprendi correctamente el conteo de colonias y tambin el mtodo con las reglas para obtener los resultados de UFC. Existen diversos mtodos para contar colonias, el que se utiliza ms es el Pour Plate; sirva para hacer el anlisis cuantitativo como el cualitativo. Con la cmara de Newbauer se cuenta en cinco partes ce toda los cuadro que tiene la cmara y se cuenta en el microscopio.

VII.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

http://www.pomif.com/pages/practicas/bacteriologia/recuento-debacterias-viables/recuento-text http://www.buenastareas.com/ensayos/Recuento-DeColonias/6099513.html http://www.unad.edu.co/fac_ingenieria/pages/Microbiologia_mutimedia/3 _4_3recuento.htm http://es.scribd.com/doc/38138496/Recuento-y-Cuantificacion-deMicroorganismos#download http://www.unavarra.es/genmic/micind-2-3.htm