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ENZIMI
Gli enzimi sono catalizzatori evolutisi in natura per velocizzare e coordinare la moltitudine di reazioni chimiche necessarie a sviluppare e a mantenere la vita. Le razioni sarebbero troppo lente nelle normali condizioni di un sistema vivente: mezzo acquoso con pH neutro e temperatura tra i 20 e i 40C. La specie umana ha utilizzato fin dai tempi antichi gli enzimi per la produzione e il mantenimento dei cibi.

Tabella 1. Breve storia degli enzimi e loro applicazioni A. C. Chimosina dallo stomaco di giovani cavalli, pecore e capre fu usata per la produzione di formaggio in molte antiche culture approssimativamente 7000 anni fa Fu dimostrata lidrolisi della carne mediante succo gastrico Fu osservata la degradazione dellamido e produzione di zucchero dal malto dorzo Il principio attivo del malto viene chiamato diastasi ed descritta la sua applicazione industriale Viene osservata lattivit dellinvertasi Viene coniato il termine enzima per descrivere lattivit catalitica non legata alle cellule viventi (fermenti non-organizzati). Il nome esteso pi tardi anche ai catalizzatori intracellulari (fermenti organizzati come definiti da Pasteur) Viene data la definizione di catalizzatore includendendo gli enzimi Viene teorizzata la stereospecificit enzimatica Viene prodotta commercialmente la Taka distasi da culture di Aspergillus niger Viene dimostrata la conversione di glucosio in etanolo da estratti di cellule di lievito Viene separata preparativamente la L-leucina dal racemato attraverso idrolisi dellestere propilico con estratti di fegato Viene descritta la sintesi di cianidrine otticamente attive, usando D-ossinitrilasi estratta dalle mandorle come catalizzatore Applicazione degli enzimi pancreatici nellindustria del cuoio per conciare le pelli Viene descritta la sintesi di glucoside in presenza di alte concentrazioni di etanolo o acetone Applicazione degli enzimi pancreatici per pulire lavanderie: il primo prodotto commerciale Viene dimostrata limmobilizzazione di invertasi su carbone di legna con ritenzione di attivit Ureasi da fagioli in scatola Viene migliorata la sintesi enzimatica di esteri utilizzando lipasi pancreatica in presenza di benzene Viene stabilita la prima sequenza primaria di una proteina (insulina), provando lidentit chimica delle proteine Inizia la coltivazione di Bacillus licheniformis in coltura sommersa per la produzione su larga scala di proteasi Applicazione di tecniche di ingegneria genetica per migliorare la produzione enzimatica e per modificare le propriet enzimatiche con proteine ingegnerizzate

1783 1814 1833 1846 1867

Spallanzani Kirchhoff Payen e Persoz Dubonfout Kuhne

1893 1894 1894 1897 1906 1908 1908 1911-1913 1923-1915 1916 1926 1936 1953 1960 Dopo il 1980

Ostwald Fischer Takamine Buchner Warburg Rosenberg Rohm Bourquelot, Bridel, Verdon Rohn Nelson e Griffin Sumner Sym Sanger NOVO Vari autori

2 Come catalizzatore lenzima cambia la velocit con cui si raggiunge lequilibrio, ma non cambia lequilibrio termodinamico. Questo implica che lenzima lavori in maniera reversibile. Laccelerazione della velocit di reazione si ottiene abbassando lenergia di attivazione di tutto il processo. Considerando che lo schema di una reazione enzimatica:

E + S

ES

EP

E + P

il profilo di energia su coordinata di reazione risulta essere il seguente:

Il profilo coinvolge la formazione dei complessi enzima-substrato ed enzima-prodotto. Il meccanismo passa attraverso tre stati di transizione con energia di attivazione standard Gc*. Lo stadio che determina la velocit di reazione quello che porta da complesso ES a complesso EP . La reazione non catalizzata prevede di solito un unico stato di transizione con energia di attivazione pi elevata. Gli enzimi legano i substrati con molteplici interazioni non-covalenti su una superficie specifica. Gli enzimi spesso legano meglio il substrato nello stato di transizione che nello stato finale e questo abbassa lenergia di attivazione. Vediamo alcuni esempi di confronto di velocit di reazione enzimatica rispetto a quelle non-catalizzate.

3 Gi dal lavoro pionierismo di Buchner (1897) si sapeva che gli enzimi non necessitano la presenza delle cellule per essere attivi. Questo ha aperto molte applicazioni nella tecnologia alimentare, conciaria, tessile e della carta, nella diagnostica e nellanalisi degli alimenti e da ultimo, ma non certamente meno importante, nella sintesi di prodotti chimici mediante biotrasformazioni. Vedremo successivamente quali sono i pro e i contro dellutilizzo di enzimi e di cellule.

Struttura e funzione degli enzimi Tutti gli enzimi sono proteine, tranne i ribozimi, recentemente scoperti, che sono speciali DNA che hanno funzioni catalitiche nella sintesi di RNA. Abbiamo gi visto quali sono le caratteristiche delle proteine e quindi non ci soffermeremo pi a lungo. Abbiamo visto quali sono le interazioni che determinano la struttura terziaria e quaternaria che sono quelle direttamente responsabili della attivit degli enzimi. Sappiamo anche che nel processo di ripiegamento le catene laterali idrofobiche degli amminoacidi sono preferenzialmente orientate verso linterno della molecola in modo da diminuire la superficie di contatto con lacqua e abbassare lenergia. I gruppi polari sono orientati preferenzialmente verso la superficie che interagisce con lacqua. Vediamo ora come interagiscono i substrati con gli enzimi. Sia i substrati sia i relativi stati di transizione sono legati con molteplici interazioni non covalenti con la superficie dellenzima. Dal momento che la forza di queste interazioni fortemente dipendente dalla distanza e dallangolo di interazione, si possono generare legami altamente selettivi. Per mezzo dei tre punti di attacco si possono discriminare strutture enantiomeriche. Le costrizioni steriche possono aiutare la discriminazione tra strutture molto simili . Il sito attivo di un enzima si trova spesso in una fenditura o su una superficie piana irregolare. Il riconoscimento del substrato un processo dinamico, che non riguarda soltanto lassociazione e la dissociazione del substrato, ma pu coinvolgere anche movimenti della catena proteica per adeguarsi al processo di legame con il substrato (inducedfit). Il primo esempio quello fornito da Carbossipeptidasi A che idrolizza le proteine sequenzialmente partendo dallacido libero e preferisce gli amminoacidi idrofobici. Nel 1967 sono state determinate le strutture dellenzima al lavoro. Da questo esempio si possono evincere due cose: 1. 2. Il legame con il substrato cambia la struttura dellenzima Il legame col substrato induce sottile ma importanti cambi della distribuzione elettronica dellenzima

stessa che permettono la reazione. Nella figura A si vede lenzima nella sua struttura originaria

Nella figura B rappresentata la struttura dellcomplesso con la gliciltirosina.

Il cambio di struttura molto evidente se se guarda tiroxina 248 che si sposta verso linterno orientandosi con il gruppo fenolico verso il carbossile terminale. Anche arginina 145 e glutammato 270 si sostano verso linterno. Il secondo punto importante la perturbazione della distribuzione elettronica nel substrato provocata da Zn C).
2+

. Il gruppo carbossilico si coordina allo ione spostando lacqua come legante (figura

5 Cofattori e coenzimi Il potenziale chimico delle catene laterali degli amminoacidi che formano le proteine limitato, per esempio non vi v sono efficienti accettori di elettroni. La catalisi enzimatica si avvale quindi quando necessario di specifici ioni metallici come Zn 2+, Fe 2+ , Co 2+ , Cu 2+ , ed altri. Alcuni esempi sono forniti nella figura successiva.

Accanto agli ioni metallici, cofattori e coenzimi servono ad attivare gruppi e partecipano al processo catalitico.Abbiamo gi visto quando abbiamo parlato di vitamine vari cofattori e le reazioni che catalizzano. I coenzimi e i cofattori agiscono per attacco nucleofilico od elettrofilico sul substrato per iniziare la reazione. I cofattori sono strettamente legati (legame covalente) alla proteina e possono dare reazioni cicliche durante il processo catalitico ritornando allo stato iniziale alla fine del processo stesso. Se lossigeno laccettore di elettroni finale in FAD, FMN, o NADP+, questi cofattori per essere rigenerati richiedono una seconda reazione dove il cosubstrato sia ossigeno. I coenzimi sono legati in equilibrio associazione /dissociazione agli enzimi e devono essere presenti in concentrazione sufficiente per ottenere la massima attivit enzimatica. Alcuni sono rigenerati in ciclo catalitico mentre sono legati allenzima, come piridossal fosfato o tiamina pirofosfato, cosicch sono sufficienti quantit catalitiche per sostenere la reazione. Altri richiedono una o pi reazioni separate con

6 cosubstrati diversi da ossigeno per rigenerare il prodotto di partenza. Questo vero per NAD(P)+, NAD(P)H, SAM, CoA, ATP ed altri. In questi casi il coenzima necessario in quantit stechiometriche. Adesso vediamo le strutture chimiche di cofattori e coenzimi. NAD e NADP (nicotinamide dinucletide) e le sue forme ridotte sono coinvolti in molte reazione di deidrogenazione allinterno delle cellule. Sono solubili in acqua e possono essere allontanati dallenzima sia nella forma ridotta che ossidata per partecipare con altri enzimi a reazione di ossido-riduzione

FAD (flavin nucleotide) e FMN (flavin mononucleotide) son i coenzima di una classe di deidrogenasi chiamate flavoproteine. Il gruppo flavina deriva dalla riboflavina (vitamina B2), la riduzione del FAD (FMN) coinvolge i due atomi di azoto non sostituiti della struttura chiamata isoalloxazina.

7 Gli enzimi nella catena di trasporto di elettroni trasformano idrogeno in H+ ed e-. Gli elettroni sono poi trasportati da enzimi chiamati citocromo a, b, c, e d. Questi enzimi sono capaci di accettare un elettrone e di passarlo ad un altro citocromo. Latomo di ferro legato con un gruppo eme a, b, c, d ad un coenzima porfirina identico a quello dellemoglobina, con la differenza che nel citocromo il ferro subisce ossidazione e riduzione.

8 Il coenzima A (CoA-SH) una molecola complessa che contiene un gruppo SH libero. Questo gruppo pu reagire con un gruppo carbossilico per formare un tioestere. Nellacetil coenzima A il legame tioestereo attiva sia il gruppo metilico che il gruppo acetile.

ATP, ADP, e AMP (adenin nucleotide trifosfato, difosfato e monofosfato) sono coenzimi che influenzano la direzione del flusso nei percorsi metabolici. Inoltre ATP funziona come un donatore di fosfato ad altre molecole in reazioni catalizzate da chinasi.

Piridossal fosfato, un derivato della vitamina B6, agisce come coenzima nella transaminazione e nella decarbossilazione. Nella transamminazione il gruppo aldeidico del piridossal fosfato forma una base di Schiff con il gruppo amminico dellamminoacido, che poi convertito in cheto acido. Il piridossal fosfato a sua volta convertito in piridossammina fosfato che trasferisce il gruppo amminico ad un altro cheto acido per formare il corrispondente amminoacido.

Tiamina pirofosfato (TTP). Tutte le reazioni a cui partecipa la tiamina iniziano con la rottura del legame C-C dei composti 2-osso carbonilici e procedono con la formazione di unaldeide attivata. TPP catalizza la decarbossilazione di cheto acidi, insieme ad acido lipoico ossidazioni decarbossilative e reazioni di transchetolazione.

Gli enzimi che contengono biotina catalizzano le reazioni di trasferimento di CO2, che sono carbossilazioni, transcarbossilazioni e decarbossilazioni. Il gruppo carbossilico della biotina legato ad un NH2 della lisina nella catena proteica dellenzima..

5-Adenosil-1-metionina come composto solfonio pu trasferire il suo gruppo metilico come CH3+ ad un centro nucleofilo del substrato.

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I coenzimi folato trasferisco frammenti C1come metile, metilene, formile o formimmino a seconda dei sostituenti presenti in N5 ed N10 dellacido folico.

Cobalammine Ladenosil-cobalammina catalizza lo spostamento di idrogeno come una speciale reazione di isomerizzazione. Lo spostamento avviene intramolecolarmente. La metil-cobalammina e lacido tetridrofolico sono i coenzimi della metilazione dellomocisteina a metionina.

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Cinetica enzimatica
Velocit di reazione e concentrazione del substrato. Abbiamo visto che una reazione enzimatica pu essere descritta dal seguente meccanismo:

K1

K2

E + S
K1-1

ES

EP

E + P

Michaelis-Menten hanno descritto matematicamente la velocit di questo processo enzimatico basandosi su questo schema e sullassunzione che il legame tra substrato ed enzima sia reversibile e veloce se confrontato con il rilascio dei prodotti (K1 >K2).

v = v max

S KM + S

Questa equazione rappresentata da uniperbole descritta da due parametri vmax e KM.

KM , chiamata costante di Michaelis, definita come la concentrazione di substrato per cui la velocit di reazione osservata met della velocit massima.. Il valore di KM caratterizza laffinit del substrato con lenzima e in prima approssimazione pu essere vista come la costante di dissociazione del complesso enzima substrato ES. KM indipendente dalla concentrazione dellenzima e normalmente ha un valore che va da 10-6 a 10-2 M. Vmax la massima velocit possibile se ogni molecola di enzima presente saturata dal substrato ed una propriet del particolare enzima. Questa grandezza pu essere messa in relazione con il peso molecolare

13 dellenzima ed chiamata numero di turnover, rappresentando il numero di molecole di substrato convertite per sito attivo per unit di tempo: il valore pi comune 103-104 sec-1. Unaltra quantit usata frequentemente per la caratterizzazione di un enzima lattivit catalitica. Lattivit catalitica espressa in IU (unit interenazionali): 1 IU catalizza la conversione di 1 M di substrato in 1 secondo a 30C in specifiche condizioni. Lattivit catalitica pu essere misurata anche in miscele grezze e gli enzimi sono quantificati e vengono venduti sulla base di questo parametro.

Inibitori ed attivatori I composti chimici che influenzano negativamente la velocit di reazione di un processo enzima catalizzato si chiamano inibitori. Gli inibitori irreversibili potrebbero essere degli analoghi al substrato che formano legami covalenti con lenzima e con questo bloccano il sito attivo. Ioni di metalli pesanti presenti in tracce in alcuni substrati grezzi possono per esempio reagire con gruppi sulfidrilici essenziali ed inattivare lenzima. Molto pi importanti sono gli inbitori reversibili, che formano specifici complessi enzima-inibitore e che influenzano la velocit di reazione. importante notare che anche i substrati e specialmente i prodotti possono inibire la reazione.

Effetto del pH Gli enzimi hanno amminoacidi polari in superficie che possono essere protonati o deprotonati in dipendenza del pH del mezzo. Lattivit enzimatica varia grandemente al variare del pH. Leffetto del pH varia debolmente al variare del substrato in quanto diverse sono le forze di legame. Nel digramma successivo si vedono le velocit di reazione di unamminazione riduttiva di vari cheto esteri mediate da leucina deidrogenasi da Bacillus cereus.

14 Effetto della temperatura Un altro importante parametro la temperatura. Di solito la velocit di reazione aumenta con la temperatura. Daltra parte aumentando la temperatura, la mobilit della proteina aumenta mentre diminuiscono le forze delle interazioni idrofobiche. Allinizio, questo porta ad una diminuzione dellattivit catalitica, ma se la temperatura continua ad aumentare questo si risolve in una completa disattivazione non reversibile.

La denaturazione avviene di solito in un intervallo tra i 30 e i 70C. La temperatura ottimale deve sempre essere tenuta pi bassa quando si lavora con gli enzimi per lungo tempo.

Classificazione degli enzimi L IUB (International Union of Biochemistry) classifica gli enzimi in 6 classi principali in accordo con il tipo di reazioni che catalizzano.

1 Ossidoreduttasi Appartengono a questa classe le idrogenasi (trasferimento di uno ione idruro), le ossidasi (trasferimento di elettroni allossigeno molecolare), le ossigenasi (trasferimento di ossigeno dallossigeno molecolare) le per ossidasi (trasferimento di elettroni al perossido)

15 2 Transferasi Trasferiscono gruppi di atomi da un donatore ad un accettare 3 Idrolasi Idrolizzano legami. Molti enzimi commerciali appartengono a questa classe: proteasi, amilasi, amilasi, lipasi, esterasi ecc. 4 Liasi Catalizzano rotture non idrolitiche di legami C-C, C-O, C-N attraverso reazioni di eliminazione con formazione di doppi legami e le reazioni inverse di addizione ai doppi legami. Alcuni esempi sono fumarasi, aspartasi, decarbossilasi, deidratasi, aldolasi. 5 Isomerasi Catalizzano lisomerizzazione e le reazione di trasferimento allinterno di una molecola. Il pi importante enzima di questo gruppo la glucosio-isomerasi. 6 Ligasi Catalizzano la formazione di legami covalenti tra due molecole.

Le classi principali sono divise successivamente in sottoclassi e sottogruppi. Il nome sistematico di un enzima basato sullequazione della reazione chimica che avviene e il tipo di reazione, seguito dal suffisso asi. Per accordi internazionali la reazione catalitiche espressa ed identificata da 4 gruppi di numeri secondo il sistema E.C.(enzyme classification). Facciamo un esempio: un enzima che converte un alcol in aldeide usando NAD come coenzima classificato come: ossidoreduttasi agisce su i gruppi CH-OH usa NAD come accettare alcol: NAD-ossidoreduttasi classe principale 1 sottoclasse 1.1 sottogruppo 1.1.1 E.C. 1.1.1.1

Lultimo numero il numero seriale di un enzima identificato dai primi tre numeri.