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Bioensaios celulares:

Princpios e Aplicaes
Letcia Veras Costa Lotufo
Laboratrio de Oncologia Experimental
Departamento de Fisiologia e Farmacologia,
UFC
lvcosta@secrel.com.br
PROGRAMA:
11/02
aula 1 - Princpios bsicos Ensaios de
citotoxicidade
aula 2 Aplicaes no estudo de novas drogas
anticncer
12/02
aula 3 Aplicaes no estudo de novas drogas
anticncer
aula 4 - Morte celular: apoptose versus necrose
Cl1CLSCuLLL1C
MlcroLubulos (1ubullna)
AcLlna
roLelnas moLoras
Aurora,
lo qulnases
Culneslnas
MlC8C18uLCS
Segregao cromossmlca
Aurora
papel cenLral na orlenLao dos
cromossomos
Mayer eL al., 1999, Sclence 286, 971.
BIOENSAIOS:
ollmerlzao de Lubullna !" $!%&'
Lnsalos de llgao ((!")!"*") - slLlos: Laxol,
alcalldes da vlnca e colchlclna
Mlcroscopla confocal
ollmerlzao/despollmerlzao 1ubullna
Ensaio clssico baseia-se na leitura de absorbncia a 340 nm
Atualmente pode ser realizado a partir da incorporao de um
marcador uorescentes na tubulina
Lnsalos de Llgao
Lnsalos de Llgao
Lnsalos de Llgao
Lnsalos de saLurao
Lnsalos de compeLlo
Log [Ligante] M
L
i
g
a

o

lmunofluorescncla para clLoesqueleLo
Mlcroscopla confocal
24h
Adlo
das drogas
24h
8S
llxadas e
ermeablllzadas
!-Lubullna 24h
Ac-Cy3 3h
laloldlna-llC1
8nAse
l
Zelss LSM 310
VIAS DE MORTE
CELULAR
Apoptose vs. Necrose
APOPTOSE#
Denio
Descrita em 1972 e denominada
seguindo o termo grego cair fora.
Termo morte programada da clula
( PCD )
Apoptose
Apoptose-like PCD
Necrose-like PCD

APOPTOSE#
Denio
uma forma de morte celular destinada a
eliminar clulas indesejveis, do hospedeiro,
atravs da ativao de uma srie coordenada e
programada de eventos executados por um
conjunto exclusivo de produtos gnicos.
( Robbins, 2000).
AC1CSL
1. Durante o desenvolvimento
2. Mecanismo homeosttico para manter as
populaes celulares nos tecidos
3. Mecanismo de defesa, como nas reaes
imunes
4. Quando as clulas so lesadas por uma
doena ( corpsculos de Councilman) ou
agentes nocivos ( calor, radiao, hipxica,
drogas anti-cncer citotxicas)
5. Envelhecimento
MECANISMOS MOLECULARES
Via Intrnseca:
MECANISMOS MOLECULARES
Via extrnsica
Ativao de pro-caspases pelo TNF-! e Fas ligante.
Receptores da superfcie celular associa-se com uma protena
adaptadora com dommio de morte.
Apoptose mediada por Fas-Fas ligante ( eliminao de linfcitos
ativados de uma reao imune)

MECANISMOS MOLECULARES#
Via extrnsica
ApopLose lnduzlda por 1nl
1nl - 81 18Auu lAuu
ALlvao do faLor de Lranscrlo nuclear - "8 ao
esLlmular a degradao do seu lnlbldor ( l "8)
MECANISMOS MOLECULARES#
!"#"$#%& &%$()*+,-, "#. +(/012($#% 3 2($#$14(2#%
L1C - esLlmula a secreo de perfurlna
Serlna-proLease granzlma 8 - cllva proLelnas com reslduos de asparLaLo e
aLlva caspases.
!"#"$#%& ,"1% ".(5,67# -& 0,$#. -& 2.&%2()&/$#
8cl-2 movem-se para o clLosol
AumenLo da permeabllldade da membrana
!"#"$#%& )&-(,-, "#. +&%7# -& 89!
unA lesado - acumulo de p33 - lnLerrompe o clclo celular na fase C1.
lalha do reparo apopLose.
Vias no-apoptticas de morte
celular
necrose
MorLe celular auLofglca
MorLe celular lndependenLe de caspase
ALlvao de caspases Cllvagem da bomba de clclo
lragmenLao de unA por caspases
Anlise morfolgica Colorao Diferencial
por Brometo de Etdio/Laranja de Acridina
Montar placa
24h
Incubar com
droga
BE
LA
Ncleo
Contagem
Clula vivel Clula apopttica Clula necrtica
MCGAHON et al., 1995


Amostra
Lixo
Fluxo
de
Tampo
Laser
Filtros
pticos
Foward
Angle
Light
Scatter
Side
Angle
Light
Scatter
Green
Flourescen
ce
(FL1
)
Orang
e
- Red
Flourescen
ce
(FL2
)
Red
Flourescen
ce
(FL3
)
Detectores
Sistema ptico e
Eletrnico
Sistema
de Luzes
Sistema
Fludico
Sistemas de Controle
e Arquivo de Dados
Amostra
Lixo
Fluxo
de
Amostra
Tampo
Laser
Tampo Tampo
Laser Laser
Filtros
pticos
Side
Angle
Light
Scatter
Green
Flourescen
ce
(FL1
)
Orang
e
- Red
Flourescen
ce
(FL2
)
Red
Flourescen
ce
(FL3
)
Detectores
Sistema ptico e
Eletrnico
Sistema
de Luzes
Sistema
Fludico
Sistemas de Controle
e Arquivo de Dados
Fluorescncia
Forward Angle
Light Scatter
Forward Angle
Light Scatter
Side Angle
Light Scatter
Green
fluorescence
FL1
Red-Orange
fluorescence
FL2
Red
fluorescence
FL3
Citometria de fluxo
Viso dos Dados
HISTOGRAMA:
Intensidade de fluorescncia x nmero de clulas
FITC FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
FITC
Intensidade de Fluorescncia
N
u
m
b
e
r

o
f

E
v
e
n
t
s

10
0

10
1
10
2
10
3
10
4

C
o
u
n
t
s

FL-2
Positive cells
INTEGRIDADE DA MEMBRANA CELULAR
CITOMETRIA DE FLUXO
Montar placa
Incubar
com droga
24h
PI
centrifuga
PBS
Fragmentao do DNA
Citometria de fluxo
Montar placa
Incubar
com droga
24h
PI + tampo de lise
centrifuga
30 mim
unA Ladder
Potencial transmembrnico da
mitocndria - Citometria de fluxo
Montar placa
Incubar
com droga
24h
Rodamina
centrifugar
15 mim
centrifugar
PBS
Identificao de fosfotidilserina
externalizada - Anexina V
+
ALlvao de CASASLS
ClLomeLrla de fluxo
WesLern 8loL
(LleLroforese)
klLs colorlmeLrlcos
klLs fluorlmLrlcos

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