Qumica Analtica

Introduo teoria da separao por cromatografia

Sumrio

Classificao das tcnicas cromatogrficas. Teoria dos pratos tericos. Teoria cintica. Reteno, selectividade, alargamento de bandas e resoluo. O problema geral de eluio.
Lus M. S. Loura

Cromatografia
um conjunto de mtodos separativos que permitem separar,
identificar, quantificar e isolar componentes semelhantes de uma mistura complexa, o que em muitos casos seria impossvel por outros meios.

Estes mtodos, apesar de muito diversos entre si, usam todos uma fase estacionria e uma fase mvel.

Os componentes da mistura passam atravs da fase estacionria (com a qual devero interagir, adsorvendo-se a ela, dissolvendo-se nela ou reagindo quimicamente com ela) por aco da fase mvel (onde so solveis), sendo as separaes baseadas nas diferentes distribuies entre as duas fases e consequentemente das diferentes velocidades de migrao (que ocorre apenas na fase mvel) dos vrios componentes da mistura.

 Cromatografia em coluna A fase estacionria est contida num

tubo de vidro ou metal e a fase mvel, que pode ser um lquido ou um gs, forada atravs desta sob presso ou desce livremente por gravidade.

Cromatografia em leito aberto A fase estacionria suportada por um vidro plano ou por uma placa de metal ou plstico, deslocando-se a fase mvel por capilaridade ou por aco da gravidade.

Em qualquer caso, a fase estacionria pode ser um slido finamente dividido ou um lquido imobilizado imiscvel com a fase mvel. Nesta ltima possibilidade, a fixao frequentemente i) por adsoro a um slido finamente dividido (que serve apenas de suporte); ii) cobrindo, num estreito filme, as paredes de um tubo capilar (por onde passa a fase mvel gasosa); iii) por adeso s fibras dum suporte de papel.

Nome Gs-lquido Gs-slido Partio Adsoro Papel Camada fina Gel Permuta inica

Fase mvel Gs Gs Lquido Lquido Lquido Lquido Lquido Lquido

Fase estacionria Lquido Slido Lquido Slido Lquido Lquido ou slido Lquido Slido

Mtodo de fixar a fase estacionria Adsorvida num slido poroso num tubo, ou na superfcie interior de um tubo capilar Mantida numa coluna tubular Adsorvida num slido poroso, sendo este mantido numa coluna tubular Mantida numa coluna tubular Mantida nos poros do papel Slido finamente dividido, eventualmente cobrindo placa de vidro Mantida nos interstcios dum polmero Resina finamente dividida contida numa coluna

Troca aninica

Troca catinica

A diferena de afinidade dos componentes entre as fases pode ser descrita pelo coeficiente de partio, K:
CS = concentrao analtica de soluto na fase estacionria CM = concentrao analtica de soluto na fase mvel

K = CS/CM

Em cromatografia de eluio, a amostra

dissolvida e introduzida no topo da coluna. A adio contnua de mais fase mvel (eluente) fora a amostra a descer pela coluna. Os componentes distribuem-se pelas duas fases, de acordo com os K respectivos. O que apresenta K maior (B na figura) mais retido pela fase estacionria, passa menos tempo na fase mvel (a nica onde ocorre movimento) e a sua sada na base da coluna retardada. O detector produz um grfico de picos (cromatograma), cada um correspondente sada dum componente da mistura.

Skoog et al., op. cit.

t2 > t1

Posio dos picos no

cromatograma pode ser importante em anlise qualitativa (identificao) rea dos picos importante em anlise quantitativa (proporcional concentrao)

Skoog et al., op. cit.

Durante a migrao atravs da coluna, os picos respeitantes aos vrios compostos vo alargando (v. figura). Como este alargamento mais lento do que a separao entre os picos, em geral possvel separar os diferentes componentes da mistura, desde que a coluna seja suficientemente longa.

Uma boa teoria cromatogrfica dever: Interpretar a velocidade a que migram os solutos; Explicar o alargamento dos picos durante a migrao.

Teoria dos pratos tericos (Martin & Synge, 1941)

A coluna cromatogrfica modelada como sendo composta por uma srie
de camadas horizontais justapostas e estreitas, os pratos tericos. Em cada prato considera-se que se estabelece o equilbrio de distribuio do soluto entre a fase mvel e a estacionria. O movimento do soluto e do solvente encarado como uma srie de transferncias de um prato para o seguinte. A eficincia de uma coluna medida pelo seu nmero de pratos tericos, N, ou (inversamente) pela altura de cada prato, H. Tem-se N = L/H onde L = comprimento da coluna. N e H so parmetros do modelo, mas no correspondem a entidades fsicas. Devem apenas ser encarados como medidas da eficincia da coluna. Esta teoria no explica os fenmenos responsveis pelo alargamento das bandas. Para isso preciso considerar a teoria cintica, na qual N e H voltam a surgir como parmetros.

Teoria cintica
D uma interpretao estatstica ao cromatograma. Durante a descida da
coluna, cada molcula individual de soluto vai sofrer um nmero muito grande de transferncias entre as duas fases, sendo o tempo de residncia em cada fase varivel. Como consequncia destes processos individuais aleatrios, obtm-se uma gama de velocidades de eluio simtrica em relao a um valor mdio (pico). Quanto maior o tempo de permanncia das molculas na coluna (i.e. quanto maior for o comprimento desta ou menor a velocidade da fase mvel), mais possibilidade existe de ocorrer diferenas acentuadas na eluio das molculas, e aumenta a largura do pico. Os picos tm forma aproximadamente Gaussiana, e o desvio padro relaciona-se com a largura do pico. 95,4% da rea de um pico Gaussiano est compreendida em 2 do mximo. Se se traarem tangentes aos dois pontos de inflexo duma curva Gaussiana, de modo a formarem um tringulo com o eixo das abcissas (v. fig. seguinte), a sua rea corresponde a ~96% da rea do pico. A sua base, que mede ~4, a chamada largura do pico (w).

 O desvio padro de um pico cromatogrfico exprime-se usualmente em unidades de tempo (que designaremos por na sequncia) ou de distncia ao longo da coluna (que designaremos por na sequncia). Designa-se por tempo de reteno (tR) de um soluto ao tempo que medeia entra a injeco da amostra e o mximo do pico desse soluto.

Clculo de N e H a partir do cromatograma

Na teoria cintica, define-se a
eficincia intrnseca duma coluna, H (a altura equivalente a um prato terico) por

Substituindo W (em termos de

tempo) = 4, resulta:

Sendo N = L/H, vem que N =

L2/2. Contudo, a maior parte dos cromatogramas obtida com o tempo nas abcissas. A converso do desvio-padro de unidades de comprimento ao longo da coluna para tempo faz-se dividindo o primeiro pela velocidade mdia a que o soluto percorreu a coluna:

Substituindo finalmente H = 2/L e

N = L2/2, resulta

Causas do alargamento das bandas

1) Irregularidades de percurso: Diferentes molculas do mesmo soluto produziro sinais no detector a tempos maiores ou menores em funo do comprimento da sua trajectria na coluna, que condicionado pelas irregularidades do percurso.

Causas do alargamento das bandas

2) Difuso longitudinal: Resulta da migrao do soluto de zonas onde a sua concentrao maior para outras onde esta menor produz alargamento, em especial se a velocidade de eluio baixa, e se a fase mvel gasosa.

Causas do alargamento das bandas

3) Estados de no equilbrio nos processos de transferncia de massa Importante sobretudo quando a fase mvel to rpida que no se chegam a constituir verdadeiros equilbrios entre as duas fases. Consequentemente, resulta um alargamento da distribuio espacial do soluto na coluna medida que este desce.

Equao de Van Deemter

Exprime globalmente a variao da
altura dum prato com a velocidade da fase mvel, u:
Curva de ajuste Zona ptima em termos de eficincia da coluna

A = termo resultante de irregularidades de percurso B/u = termo resultante da difuso longitudinal Cu = termo resultante da equilibrao lenta entre S e M

Hoje considerada aplicvel

apenas para colunas de enchimento e caudais elevados (como em cromatografia gasosa), mas, em qualquer caso, ainda conceptualmente til.

Separaes em colunas tempo de reteno

t = 0: instante em que a amostra foi colocada e a eluio comeou t = tM: pico correspondente a uma espcie que no interactua com a fase estacionria (usado para calcular velocidade da fase mvel, u = L / tM) t = tR: tempo de reteno para um dado soluto, que migra com velocidade mdia v = L / tR = u(tM /tR) = u(fraco de tempo que o soluto passa na fase mvel)

Skoog et al., op. cit.

Separaes em colunas factor de reteno

Ora, do ponto de vista estatstico, calcular a fraco de tempo que o soluto passa na fase mvel equivale a fraco mdia de molculas de soluto na fase mvel, o que pode ser expresso usando as concentraes de soluto em cada fase (CM e CS) e os volumes de cada fase (VM e VS):

Substituindo o coeficiente de partio, K = CS/CM: Definindo o factor de reteno (ou capacidade) k, para o soluto A:

Utilizando as definies de u e v , rearranjando, obtm-se: Ou seja, k obtm-se do cromatograma. k << 1 indica que o soluto no interactua com a fase estacionria e sai demasiado depressa da coluna; k > 20-30 implica tempos de eluio demasiado longos. Idealmente, 1 < k < 5 (como se mostra mais abaixo).

Separaes em colunas resoluo

O factor de selectividade () de uma coluna para 2 solutos, A e B, em que B sempre a espcie mais retida (o que implica > 1) define-se como:

A resoluo (Rs, medida de quo separados esto os picos relativamente s suas prprias larguras) definida atravs de:
Skoog et al., op. cit.

Rs = 0,75: separao claramente insuficiente, grande sobreposio. Rs = 1,0: sobreposio de ~4%. Rs = 1,5: sobreposio apenas de ~0,3%, separao quase completa.

Efeitos da reteno e selectividade sobre a resoluo

Tomando WA WB W, possvel deduzir as seguintes equaes:

Estas expresses so extremamente teis, pois indicam as condies para se obter uma resoluo adequada num tempo mnimo. Cada uma elas contm trs termos. O primeiro descreve a eficincia da coluna em termos de N ou H. O segundo, o termo da selectividade, depende das propriedades dos dois solutos. O terceiro, o termo da reteno, depende de caractersticas da coluna e dos solutos.

Pela primeira equao, aumentando o nmero de pratos melhora-se a resoluo, mas isto implica um aumento no tempo de anlise, a menos que seja conseguido atravs de uma reduo em H (e no de um aumento em L). Reduzir H pode ser conseguido reduzindo o tamanho das partculas do enchimento, o dimetro da coluna e a espessura do filme lquido, bem como optimizando o fluxo de fase mvel.

 Para avaliar o efeito do factor de reteno, podem-se escrever as primeira e terceira equaes nas formas simplificadas

claro da figura A que kB > 10 devem ser evitados, pois no melhoram apreciavelmente a resoluo, mas aumentam muito o tempo de eluio. Idealmente 1<kB<5. Frequentemente, optimizar k o modo mais fcil de melhorar Rs, o que se consegue variando a temperatura (fase mvel gasosa) ou a composio do solvente (fase mvel lquida, v. figura B).
Skoog et al., op. cit.

em que Q e Q representam os outros termos das respectivas equaes.

Skoog et al., op. cit.

 Como seria de esperar, Rs aumenta com . Uma boa separao possvel em tempo mnimo quando >2. Por outro lado, quando 1, no se consegue uma boa resoluo a menos que se use uma coluna muito grande. Por outro lado, quando 1, o tempo necessrio para a separao aumenta enormemente. Por exemplo, quando passa de 1,1 para 1,01, necessrio um aumento de 84 vezes em tR para se realizar a mesma separao.

Mtodos que podem fazer aumentar , mantendo k entre 1 e 10, so (em ordem decrescente de convenincia/aplicabilidade provvel): i) mudar a composio da fase mvel; ii) mudar a temperatura da coluna (fase mvel gasosa, ou em cromatografia de permuta inica); iii) mudar a composio da fase estacionria e iv) utilizando efeitos qumicos especiais (p. ex. complexao selectiva de solutos).

Problema geral de eluio

Frequentemente, quando h grupos de picos situados em regies muito distintas do cromatograma, a resoluo conveniente dos picos de tR mais elevado (5, 6 na figura) em tempo til leva a uma sobreposio dos picos dos componentes menos retidos (v. (b) e (c) na figura).

A soluo mais comum passa por alterar as condies durante a separao (p. ex. a composio do solvente em cromatografia lquida e a temperatura em cromatografia gasosa), usualmente de uma forma programada.
Skoog et al., op. cit.