Catalan Tapia Olivia - 2013

AGRADECIMIENTOS
A DIOS, que me ha dado la vida y me ha permitido conocer su creacin. A mi alma mater, la UNIVERSIDAD AUTNOMA CHAPINGO, ya que gracias a esta noble institucin pude terminar una carrera. A todos los profesores de la Preparatoria Agrcola y principalmente a los del Departamento de ingeniera Agroindustrial, que generosamente han brindado su tiempo y esfuerzo para la educacin en la Universidad Autnoma Chapingo. Tambin porque les debo la formacin y conocimientos que ahora tengo y que me servirn para toda la vida. Al M.C. Armando Santos Moreno, por su acertada direccin en esta Investigacin y por todas sus aportaciones. Al Ing. Jos Alfredo Espejel Zaragoza, I.B.Q. Flix Esparza Torres, Dr. Arturo Hernndez Montes y M.C. Abraham Villegas de Gante por la revisin y aceptacin del presente trabajo de tesis. A Don salva, doa viky, Alvaro, Olivia, Alejandra, Diego, Blanca, Roberto, Salvador por dejarme ser parte de su familia y brindarme su apoyo. A Jos Luis por su apoyo, por su amor, compresin y paciencia. A Margarita Garca Velasco por el gran apoya brindado desde el inicio de nuestra carrera, por su amistad y por su apoyo incondicional. A mis amigos: Ana Laura, Sonia, Sayra, Luca, Alonso (ponchin) y Brenda por su amistad y apoyo incondicional. A Mauricio por su apoyo incondicional en el laboratorio para el desarrollo de este proyecto. A todas esas personas que en algn momento fueron parte de mi vida durante mi estancia en Chapingo.
Gracias a todos
DEDICATORIA
A mis PADRES, Macaria Tapia Ortega y Silvano Cataln Bonilla con el inmenso amor que les profeso y ser un constante ejemplo de amor, lucha , por trasmitirme sus sabios consejos, por ensearme a valorar la vida, por motivarme a seguir superndome en todo momento y darme la herencia ms grande que pueda haber en este mundo el estudio.
A mis hermanos: Elisa, Silvia, Mireya, Ladislao y Aldo, por compartir conmigo una feliz infancia y porque siempre estuvieron en el lugar preciso y el tiempo
suficiente, sin ustedes no hubiera podido, los quiero mucho.
Ing. Jos Luis Gallardo Salazar, por su amor, su cario, nobleza
y por
apoyarme en los momentos que ms necesite.
A mis abuelitos: Norberta Ortega y Salomn Tapia Guerrero (q.e.p.d.), por sus consejos, cario y por darme una madre maravillosa.
A mis mejores amigas (o): Margarita, Sonia, Ana Laura, Sayra, Luca, Alonso, Elena, Brenda, Arturo, Elideth, Yaretzi, Luisa, Abigail e Isabel por su incondicional amistad, confianza y cario.
Sinceramente: Olivia
CONTENIDO
Pg. CONTENIDO ................................................................................................................... i LISTA DE CUADROS .................................................................................................... iii LISTA DE FIGURAS ...................................................................................................... iv RESUMEN ..................................................................................................................... v SUMARY ........................................................................................................................ vi I. INTRODUCCIN ........................................................................................................... 1
II. REVISIN DE LITERATURA ......................................................................................... 2 2.1. Definicin de Leche ................................................................................................. 2 Leche cruda ...................................................................................................... 3 Leche pasteurizada. .......................................................................................... 4
2.1.1. 2.1.2. 2.2.
Productos lcteos. ................................................................................................... 4 Yogur ................................................................................................................ 5 Crema ............................................................................................................... 6 Queso ............................................................................................................... 7
2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. 2.3.
Enzimas de la leche................................................................................................. 9 Fosfatasa cida. .............................................................................................. 10 Fosfatasa alcalina. .......................................................................................... 11 Importancia de las enzimas en la leche .......................................................... 13
2.3.1. 2.3.2. 2.3.3. 2.4.
Prueba de la fosfatasa. .......................................................................................... 14 El paquete lacto-Zyma II ................................................................................. 15
2.4.1. 2.5. 2.6. 2.7.
Espectrofotometra ................................................................................................ 16 Calidad de la leche ................................................................................................ 16 Pasteurizacin de la leche ..................................................................................... 18
pg. i
Pg. 2.7.1. III. IV. Tipos de pasteurizacin .................................................................................. 19
ANTECEDENTES ..................................................................................................... 21 OBJEIVOS..22
V. JUSTIFICACION .......................................................................................................... 23 VI. 6.1. 6.2. 6.3. 6.4. 6.5. VII. 7.1. METODOLOGA ....................................................................................................... 23 Ubicacin del trabajo ............................................................................................. 23 Materiales .............................................................................................................. 23 Lcteos utilizados .................................................................................................. 24 Mtodos aplicados ................................................................................................. 24 Anlisis para la sustitucin de la solucin (B.Q.C.)............................................... 24 RESULTADOS Y DISCUSIN ................................................................................. 25 Interpretacin de los resultados de los productos analizados con el ..................... 28 mtodo de la NOM-243-SSA1-2010 ...................................................................... 28 7.2. 7.3. Fosfatasa residual con el Mtodo de Aschaffenburg y Mullen .............................. 32 Comprobar la utilizacin de los mtodos ............................................................... 33
VIII. CONCLUSIONES ..................................................................................................... 34 IX. LITERATURA CONSULTADA .................................................................................. 35
X. ANEXOS. ....................................................................................................................... 39 1. Manual para la determinacin de fosfatasa residual en leche y productos lcteos segn la NOM-243-SSA1-2010. ................................................... 40 2.Diagrama de proceso del queso..........60 3.Diagrama de proceso de la crema. ............................................................................. 61 4.Diagrama de proceso del yogur. ................................................................................. 62 5.Diagrama de proceso de pasteurizacin de la leche. ................................................. 63
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LISTA DE CUADROS
Pg. Cuadro 1. Tipos de crema y algunos parmetros. ................................................................ 6 Cuadro 2. Clasificacin de los quesos. ................................................................................. 8 Cuadro 3. Caractersticas de la fosfatasa alcalina en le leche............................................ 11 Cuadro 4. Lmite mximo de fosfatasa residual. ................................................................. 18 Cuadro 5. Resultados de obtenidos con los diferentes concentraciones del reactivo Lacto-Zyma II. ................................................................................. 26 Cuadro 6. Resultados con diferentes concentraciones de fenol para elaboracin de la curva patrn. .......................................................................... 27 Cuadro 7. Concentracin de de leche cruda proveniente de la Unidad Tecnolgica Lechera. ......................................................... 28 Cuadro 8.Concentracin en de leche pasteurizada proveniente de la Unidad Tecnolgica Lechera. ................................................ 28 Cuadro 9. Concentracin en de leche ultrapasteurizada de la marca .......... 29
Cuadro 10. Concentracin en de yogur de la Unidad Tecnolgica Lechera. ........................................................................................ 29 Cuadro 11. Concentracin en de yogur de la marca comercial LALA. ......... 30
Cuadro 12. Concentracin en de crema de la Unidad Tecnolgica Lechera. ....................................................................................... 30 Cuadro 13. Concentracin en de queso panela comercial. .......................... 31
Cuadro 14. Lmite mximo segn la NOM-243-SSA1-2010 e interpretacin de resultados. ............................................................................ 31 Cuadro 15. Datos obtenidos de los tubos de la curva patrn. ............................................ 32 Cuadro 16. Datos de la curva patrn del fenol y p-nitrofenol. ............................................. 33
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LISTA DE FIGURAS
Pg. Figura 1: productos derivados de la leche.. .......................................................................... 5 Figura 2. Concentraciones del reactivo Lacto-Zyma II. ..................................................... 26 Figura 3: Grfica de curva patrn. ...................................................................................... 27 Figura 4. Curva patrn de p-nitrofenol. ............................................................................... 32
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MANUAL PARA LA DETERMINACIN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LCTEOS SEGN LA NOM-243-SSA1-2010. Olivia Catalan Tapia1; Armando Santos Moreno2
RESUMEN Tradicionalmente se han empleados pruebas colorimtricas cualitativas para determinar la pasteurizacin de la leche y sus derivados. En la actualidad se requiere de un mtodo capaz de sealar de manera ms exacta si la leche y/o sus derivados fueron sometidos a un proceso de pasteurizacin adecuado. El presente trabajo tuvo como propsito elaborar un manual para el anlisis cuantitativo y cualitativo en la determinacin de la fosfatasa residual en leche y en productos lcteos, con la finalidad de que puedan ser consideradas e implementadas por los pequeos productores lecheros. Se realiz una investigacin sobre dos mtodos especficos de anlisis que se realizan para verificar los procesamientos trmicos en las leches y en productos lcteos. La prueba de la fosfatasa alcalina, es un mtodo efectivo para verificar la pasteurizacin al trmino del
proceso. La primera metodologa est enfocada a la prueba de la fosfatasa, segn la NOM243-SSA1-2010 y la segunda metodologa corresponde al mtodo Aschaffenburg y Mullen. Finalmente por medio de la distribucin de t-student se determin si los resultados de ambos mtodos producan resultados similares.
PALABRAS CLAVES: fosfatasa alcalina, pasteurizacin, leche y productos lcteos.
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Egresada del Departamento de Ingeniera Agroindustrial. Universidad Autnoma Chapingo. Profesor investigador del Departamento de Ingeniera Agroindustrial. Universidad Autnoma Chapingo.
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MANUAL FOR THE DETERMINATION OF PHOSPHATASE ALKALINE IN MILK AND DAIRY PRODUCTS ACCORDING TO LA NOM-243-SSA1-2010
SUMARY
Tests have traditionally been used to determine the qualitative colorimetric pasteurization of milk and derived. Actually a method is required to be able to point out in a more accurate if the milk and/or its derivatives were subjected to proper pasteurization process. The purpose of this study was to develop a handbook for quantitative and qualitative analysis in the determination of residual phosphatase in milk and dairy products, in order that they may be considered and implemented by small dairy producers. An investigation was carried out on two specific methods of analysis to be performed to check the thermal processing on milk and dairy products. The phosphatase alkaline test is an effective method to verify pasteurization at the end of the process. The first methodology is focused on the Phosphatase Test according to NOM-243-SSA1-2010 and the second methodology corresponds to the methods Aschaffenburg and Mullen. Finally through the distrubution of t-student was determined if the results of both methods yielded similar.
KEYWORDS: Phosphatase alkaline, pasteurization,milk and dairy products.
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ELABORACIN DE UN MANUAL PARA LA DETERMINACIN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LCTEOS SEGN LA NOM-243-SSA1-2010
I.
INTRODUCCIN
La leche, en virtud de sus componentes, constituye uno de los alimentos ms completos desde el punto de vista nutritivo. Sin embargo, debido tambin a esa caracterstica es altamente susceptible a la contaminacin y al deterioro por lo que, a efecto de que este producto rena y conserve cualidades fsicas, qumicas y microbiolgicas suficientes para ser considerada segura para su consumo, es necesario que durante su obtencin, conservacin, transporte y distribucin se apliquen procedimientos adecuados destinados a garantizar su calidad e inocuidad (Arroyo, 1997). La leche una vez seleccionada bajo estrictos parmetros de calidad, es sometida al
procesamiento. En este caso nos referimos a la pasteurizacin. El objeto de este proceso trmico es, en primer lugar, destruir los microorganismos que puedan ser causantes de enfermedades para el consumidor y en segundo trmino, disminuir el nmero de aquellos agentes microbianos que puedan afectar la calidad de la leche y sus productos. Adems de las determinaciones fsicas, qumicas y microbiolgicas se deben realizar otras determinaciones para conocer la efectividad de los tratamientos trmicos de pasterizacin, de acuerdo a la inactivacin de determinadas enzimas que de forma natural se encuentran en la leche. La efectividad de los tratamientos trmicos a los que se somete la leche, garantiza la salubridad y calidad del producto tanto de consumo nacional como de exportacin. Por eso, el inters por el monitoreo de la eficiencia de la pasteurizacin de la leche y sus derivados, debera ser en el pas de gran importancia, ya que la deficiencia en la
pasteurizacin puede generar graves consecuencias en la salud de los consumidores. Durante la fabricacin de los productos lcteos, la leche cruda puede diferenciarse de la leche pasteurizada por determinacin de la fosfatasa alcalina. Ya que esta enzima se inactiva a temperatura de pasteurizacin, esta propiedad la convierte en el indicador de eleccin para comprobar que el tratamiento ha sido el adecuado.
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La tesis Elaboracin de un manual para la determinacin de Fosfatasa Residual en Leche y Productos Lcteos segn NOM-243-SSA1-2010 tiene como objeto desarrollar una metodologa entendible para el anlisis de fosfatasa residual alcalina, en leche y productos lcteos (Leche cruda, pasteurizada y ultrapasteurizada, crema y queso); de tal manera, que pueda ser aplicado por medianos y pequeos productores.
II. REVISIN DE LITERATURA 2.1. Definicin de Leche
La leche, es la secrecin de las glndulas mamarias de las vacas sanas, se excluye el producto obtenido quince das antes del parto y cinco das despus de ste o cuando tenga calostro, la cual debe ser sometida a tratamientos trmicos que garanticen la inocuidad del producto (SECOFI, 1997). La NOM-243-SSA1-2010 define como leche a la secrecin natural de las glndulas mamarias de las vacas sanas o de cualquier otra especie animal, excluida el calostro.
A la leche la componen tres grandes estructuras. 1. Estructuras de proteccin. Desarrolla la funcin de proteger a la leche del ataque de los seres vivos distintos a los cros de la especie. 2. Estructuras funcionales. Estn compuestas por casena, protena de la leche que se unen por medio de fosfatos de calcio y magnesio (en menor cantidad), formando lo que se llama micela. 3. Estructuras de reserva. Estn compuestas principalmente por lpidos o grasa butrica (acilgliceroles, fosfolpidos, colesterol, carotenoides, vitaminas A,D,E y K, etc.) (Santos y Villegas, 2005).
La leche est compuesto por un 87 a 88 % de agua, o sea que debe contener de un 13 a 12% de slidos totales. Estos slidos totales estn compuesto normalmente entre un 3 y 3.5 % de grasa, un 3 a un 3.5 % de protena y un 4 a un 6% de carbohidratos como la lactosa y minerales tan importantes como el calcio (Luquet, 1993). pg. 2
La importancia alimenticia de la leche y los productos lcteos radica en su composicin fisicoqumica, en la calidad de sus protenas y carbohidratos, su contenido de calcio vitaminas, su alta digestibilidad, alto aporte nutritivo y energtico, por lo tanto cuando los microorganismos patgenos y los adulterantes alteran o contaminan su composicin fisicoqumica provocan una disminucin de la calidad.
2.1.1. Leche cruda La leche cruda es un producto que no ha sufrido ningn tratamiento de saneamiento que le permita asegurar una mejor conservacin. Su produccin y su comercializacin deben ser severamente controladas para evitar los riesgos que pudiesen ocasionar en la salud de los consumidores. Para ello la leche debe: Provenir de animales exentos de brucelosis y tuberculosis (enfermedades transmisibles del animal al humano) dentro del cuadro de la profilaxis colectiva obligatoria. De explotaciones bien establecidas. Manipularse (ordeo, envasado, almacenamiento) en condiciones higinicas satisfactorias (Luquet, 1993). Los principales agentes causantes del deterioro de la leche son los microorganismos y las enzimas, estas son de origen microbiano, o propias del alimento (v.g. En la leche, la lactasa, las lipasas y proteasas). A su vez la actividad microbiana y enzimtica es afectada por diversas variables fisicoqumicas del alimento o de su entorno, por ejemplo: la temperatura, actividad del agua, el pH, la fuerza inica, la humedad relativa ambiental, etc. La apreciacin, o mejor, la evaluacin de la calidad de la leche cruda es indispensable para fines concretos, por ejemplo: La pertinencia de su empleo para elaborar productos seguros (inocuos) para el consumidor.
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La seleccin de la leche para elaborar productos lcteos concretos, segn las exigencias del producto y el proceso (v.g. Un yogur, una leche UHT, o cajeta).
El pago de la leche, como materia prima, segn su calidad: composicional, sanitaria y tecnolgica (Villegas y Santos, 2003).
2.1.2. Leche pasteurizada. La NOM-155-SCFI-2012 define la leche pasteurizada como la que ha sido sometida al proceso de pasteurizacin, estandarizada o no, para cumplir con las especificaciones descritas en esta norma. Sin embargo, despus de una pasteurizacin adecuada de la leche, los microorganismos pueden llegar a ella directa o indirectamente, a travs de mezclas materiales
contaminados, equipos defectuosos, contacto con las manos o ropa de los operarios, exposicin a estornudos y tos o por cada de gotas de agua contaminada, produciendo de esta manera una recontaminacin, constituyendo un peligro al consumidor, por lo que es necesario practicar pruebas que nos permitan evaluar si hubo recontaminacin y poder as evitar o reducir el riesgo al mnimo (OMS,1960).
2.2.
Productos lcteos.
Los productos lcteos son los productos alimenticios elaborados total o parcialmente con leche, entre ellos estn la leche evaporada, leche deshidratada, leche en polvo, yogur, postres basados en leche, helados. Otra categora la forman los derivados de leche, entre ellos los quesos, mantequilla, crema, requesn, etctera (SECOFI, 1997). Los derivados lcteos son una gama de productos que se obtienen al someter a la leche a determinados procedimientos tecnolgicos. Todos tienen normas oficiales que les definan y especifican sus caractersticas y mtodos de control. Al igual que la leche, deben de cumplir con caractersticas microbiolgicas establecidas en las normas sanitarias; ya que
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estos productos derivados de la leche son consumidos por la sociedad y debemos de asegurar la salud del consumidor (Oria, 1991). La lista de los productos lcteos y de los productos derivados de la leche aumenta cada da; los tres principales derivados: queso, yogur y crema se representan
esquemticamente en la figura 1 (Alais, 2001; Badui 1990).

Leche entera y descremada, pasteurizada, ultrapasteurizada (UHT) En polvo entera y descremada Condensada azucarada
leche
Yogur Kefir Yakult Otros: Helados Dulces Mantequilla Caseinatos Evaporada
Figura 1: productos derivados de la leche (Fuente: Badui, 1999).
2.2.1. Yogur Es un alimento que contiene fermentos vivos, obtenidos por la coagulacin de la leche pasteurizada de vaca, debido a la fermentacin cida-lctica con Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus, y que debe cumplir los requisitos Mexicana vigente (SECOFI, 2000). La NOM-181-SCFI-2010 define yogur como el producto obtenido de la fermentacin de leche, estandarizada o no, por medio de la accin de microorganismos Streptococcus thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subespecie bulgaricus, y teniendo como resultado la reduccin del pH. pg. 5 de la Norma Oficial
El yogur es el producto de la accin controlada de microorganismos, principalmente sobre el azcar de la leche (lactosa) que es transformado a cido (cido lctico) y tambin sobre las protenas que juegan un papel importante en el accionar de los microorganismos. La incorporacin de estos microorganismos garantiza la produccin de caractersticas agradables y beneficiosas, ya que prolongan la vida til de la leche, entregan un producto sabroso y adems contribuyen a la buena salud de las personas que lo consumen. En la elaboracin del yogur, ya sea industrial o artesanal, se debe tener sumo cuidado con los procedimientos higinicos de elaboracin, ya que si no se respetan reglas bsicas de higiene se puede alternar notablemente el producto final, sobre sus caractersticas organolpticas y lo ms importante sobre la inocuidad del producto, transformado incluso en un alimento peligroso para el consumo (Tamime y Robinson, 1991).
2.2.2. Crema Se entiende por crema, al alimento en el que se ha reunido la mayor parte de grasa de la leche, ya sea por reposo o por centrifugacin, sometida al proceso de pasteurizacin, ultrapasteurizacin, esterilizacin o cualquier otro tratamiento que asegure su calidad sanitaria. Es en efecto, una leche enriquecida en grasa (SECOFI, 2000). La crema es la parte de la leche en la que se ha reunido la mayor cantidad de grasa por medio de centrifugacin y separacin despus del reposo, debe proceder de leches limpias, el proceso de obtencin debe ser higinico, adems de someterse a la pasteurizacin antes de ser puesta en venta y conservarse a temperatura mxima de 6C la crema se clasifica por el contenido de grasa como se presenta en el cuadro 1. Cuadro 1: Tipos de crema y algunos parmetros.
TIPO Crema tradicional Crema cida Media crema Crema ligera GRASA (MNIMO) 30% 30% 20% 14% VALORES SLIDOS NO GRASOS < a 7.5% <a 7.5% <10% <12% CIDEZ EN CIDO LCTICO < 1% 2-5% <1% <1%
Fuente: Claveran, 1989.
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La crema es un producto que se digiere y asimila ms fcil que otras grasas animales y representa una fuente importante de vitamina A (10 veces ms que la leche entera). Al ser muy energtica y una fuente de grasas principalmente saturadas, debe ser consumida con moderacin. La crema contiene por lo menos entre el 12 % y el 30 % de grasa, mientras que la leche contiene como promedio un 3.2%. La materia prima de eleccin para la elaborar crema es aquella que contenga mayor contenido de grasa, es decir, la leche entera. Como en el caso de la fabricacin de yogur, los controles de recepcin de la leche son la clave para la calidad del producto que se obtenga. La pasteurizacin de la crema consiste en elevar la temperatura hasta 85 a 90 C, mantener esa temperatura durante un mximo de 5 minutos y despus enfriar
rpidamente a la temperatura de envasado (SECOFI, 2002).
2.2.3. Queso El queso es el producto resultante de la coagulacin de la leche de ciertos mamferos mediante la renina (presente en el cuajo) o enzimas similares, en presencia de cido lctico producido por microorganismos agregados o propios de la leche, del cual una parte de la humedad es eliminada por corte de la cuajada, calentamiento y/o prensado con subsecuente moldeado, prensado, afinado y conservado en condiciones convenientes. (Davis, 1965, citado por Villegas, 1993). La enorme variedad de condiciones a que puede someterse la cuajada obtenida de la leche hace posible producir un nmero casi infinito de quesos. Esas condiciones son: el contenido de humedad de la cuajada, el contenido relativo de protenas y grasas, las combinaciones de temperatura a que puede someterse la cuajada al madurar y los microorganismos inoculados en ella (Luquet, 1991).
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La fabricacin del queso consiste en la coagulacin de la leche y su conversin en una dispersin coloidal en un gel conocido como cuajada, y la subsiguiente liberacin de agua en forma de suero. El contenido de agua disminuye en un 87% durante el procesamiento de la leche cuando se transforma en queso lo que determina la dureza y las propiedades de conservacin del queso, y esto depende de varios factores: Temperatura, pH y la manera como se corta la cuajada, salado, etc. (Gary, 1988). Los quesos de larga maduracin y prolongado almacenamiento permiten que con el transcurso del tiempo mueran las bacterias patgenas, pero los quesos de vida breve y los quesos blandos pueden contener an patgenos viables, si la leche usada para hacer queso contena patgenos. Los quesos hechos de leche no pasteurizada deben madurar por lo menos 60 das a una temperatura no menor de 35F = 2C. Durante este periodo de almacenamiento mueren algunas bacterias patgenas que pudieran estar presentes en la leche (Helen, 2004). La NOM-243-SSA1-2010 clasifica los quesos como se presenta en el cuadro 2. Cuadro 2. Clasificacin de los quesos. CLASIFICACIN QUESOS
Frescos
Frescales De pasta cocida. Acidificados Quesos de suero Panela, Canasto, Sierra, Ranchero, Fresco, Blanco, Enchilado, Adobado. Oaxaca, Asadero, Mozzarela, Del Morral, Adobera. Cottage, Crema, Doble crema, Petit Suisse, Nuefchatel. Broccio, Broccotle, Cerrase, Geitmysost, Gyetost, Mejetle, Mysost, Recuit, Requesn, Ricotta, Picotn, Schottenezinger, Zinder. Aejo, Parmesano, Cotija, Reggianito. Cheddar, Chester, Chihuahua, Manchego, Brick, Edam, Gouda, Gruyere. Azul, Cabrales, Camembert, Roquefort, Danablu, Limburgo, Brie.
Madurados.
Prensados de pasta dura. Prensados. Con mohos
Procesados
Fundidos Fundidos para untar Fuente: NOM-243-SSA1-2010. pg. 8
2.3.
Enzimas de la leche.
La leche contiene varias enzimas relacionadas con el grupo de las albminas, con las cuales floculan generalmente. Algunas de estas enzimas se encuentran en la membrana de los glbulos de grasa, por tanto son arrastradas por la crema; entre ellas estn las reductasas aldehdicas, las fosfatasas, etc. Otras floculan con las casenas a pH 4.6, por ejemplo, las proteasas, catalasas, ect. (Santos, 2007). La leche contiene muchas enzimas, entre las enzimas que son nativas, es decir producidas por la glndula mamaria, se incluye tambin las que contienen los leucocitos, por ejemplo, la catalasa. Adems, en la leche pueden encontrarse enzimas de origen microbiano, que son secretarias por microorganismos (como las proteinasas y lipasas), o que son liberadas al medio despus de su lisis. Muchas de las enzimas de la leche no parecen tener alguna funcin biolgica, ni porque se encuentran en grandes concentraciones. Algunas enzimas presentan actividad antimicrobiana o ejercen otras funciones beneficiosas (v.g. Absorcin de los componentes de la leche a nivel intestinal cuando termina la lactancia). Otras enzimas se utilizan con fines analticos (v.g. Deteccin de mastitis por medio de la
catalasa) o indicadores de calidad (v.g. Fosfatasa alcalina) (Walstra et al, 2001). Las enzimas nativas en la leche son de gran importancia, ya sea benfico o indeseable. Entre las ms importantes caractersticas son: ndices de salud del animal, especialmente la mastitis (v.g. plasmina, calatasa, NAcetil--D-Glucosaminidasa), ndices de historia trmica de la leche, lactoperoxidasa, -glutamiltranspeptidasa, Deterioro de la calidad del producto, especialmente lipoprotena lipasa (rancidez hidroltica), plamina (protelisis , sabores desagradables), xantina oxidasa (rancidez oxidativa), fosfatasa cida (modificacin de la caseina), Cambios deseables en productos lcteos, v.g. lipoprotena lipasa, plamina, fosfatasa cida y antina oxidasa en quesos madurados. Efectos de proteccin, v.g. lactoperoxidasa , lisozima y tal vez laribonucleasa. (Fox, 2003). pg. 9 especialmente la fosfatasa alcalina ,
La leche contiene dos enzimas que hidrolizan a los steres fosfricos. La fosfatasa cida tiene un mximo de actividad a un pH entre 4.6-4.8, est asociada a la membrana del glbulo de grasa y es termorresistente, ya que no se desnaturaliza a 88C, aun durante 30 minutos. La fosfatasa alcalina es importante desde el punto de vista tecnolgico de la leche porque revela si la leches ha pasteurizado, o no (Santos, 1995).
2.3.1. Fosfatasa cida. La presencia de la fosfatasa cida en la leche fue reportada por primera vez por Huggins y Talalay (1948). Esta observacin se confirm por Mullen (1950). Quien reporta muchas de estas caractersticas. pH ptimo: 4.0 en fenilfosfato como sustrato. Temperatura ptima no se reporta pero aumenta linealmente su actividad entre 14 y 50 C. La enzima no es activada por Mg2+ (como la fosfatasa alcalina), se activa ligeramente con el Mn2+ y es inhibida de manera muy eficaz por F-. El nivel de actividad de la fosfatasa cida en la leche es slo alcalina. p-nitrofenilfosfato fue el mejor sustrato evaluado; - y - glicerofosfato se hidroliza lentamente. Aunque la actividad de la fosfatasa cida es mucho menor que la fosfatasa alcalina, pero su mayor estabilidad al calor, su inferior pH optimo y su capacidad de desfosforilar que la fosfatasa
casenas puede hacer ms importante tecnolgicamente (Fox, 2003). La fosfatasa cida cuya concentracin en la leche representa el 10% de la concentracin de la fosfatasa alcalina. Esta fosfatasa, cuyo pH ptimo es 4.6-4.8, se encuentra, como la fosfatasa alcalina, asociada a la membrana del glbulo graso. Es muy termorresistente ya que soporta el calentamiento a 88C durante 30 minutos. La fosfatasa cida tiene un inters tecnolgico limitado. Sin embrago, su pH de actuacin le permite intervenir en la evolucin de las cuajadas cidas de quesera (Veisseyre, 1998). pg. 10
2.3.2. Fosfatasa alcalina.
La fosfatasa alcalina es una glicoprotena presente en la leche; se activa a un pH alcalino entre 9-10, necesita la presencia de iones magnesio y zinc. La desnaturalizacin de esta enzima puede ser por calentamiento a 60 C por una hora, a 70C por 1 minuto, a 72 C por 30 segundos y a 78C por 20 segundos (Vignola, 2002). La fosfatasa alcalina es una glicoprotena que contiene cido silico, su pH ptimo es de 9.6 y es sensible al calor pues se inactiva a 62C durante 15 minutos o a 72C durante 15 a 20 segundos. Los iones
2 2 2 2
la activan y los iones
, el yodo y la
cistena, la inhiben (Santos, 2007). En el cuadro 3 se muestra ms detallada las caractersticas de esta enzima.
Cuadro 3. Caractersticas de la fosfatasa alcalina en le leche. CARACTERSTICAS CONDICIONES pH ptimo Caseina 6.8
p-nitrofenilfosfato 9.65 p-nitrofenilfosfato 10 Temperatura optima KM Activadores Inhibidores 37 C 0.69 mM en p-nitrofenilfosfato Ca2+,Mn2+,Zn2+,Co2+,Mg2+ Quelantes metlicos (EDTA, EGTA, ect.) Ortofosfatos Peso molecular Contenido de Zn Estabilidad trmica Valor D a 60 C, pH 9 63C, pH 9 Fuente: Fox, 2003 27.2 min 8.3 min 170 kDa 4 mol mol-1
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La fosfatasa alcalina, cataliza la hidrolisis de los monoesteres de fosfato. La determinacin de la actividad enzimtica mediante el test de la fosfatasa alcalina se utiliza habitualmente como el control de la pasteurizacin de la leche. La inactivacin de la enzima garantiza que todos los microorganismos patgenos (al menos los que pueden crecer en la leche) han sido destruidos durante el tratamiento trmico; tambin la mayora, aunque no todas, las bacterias lctica y las bacterias Gram-negativas se destruyen en la pasteurizacin. La mayor parte de la enzima est en la membrana de los glbulos grasos y, por tanto, el test de la fosfatasa es menos sensible cuando se realiza sobre leche descremada (Walstra et al., 2001). La fosfatasa alcalina no es tan slo de inters fisiolgico en la secrecin de la leche, se utiliza tambin como principal indicador de un eficiente tratamiento en la pasteurizacin de la leche. La pasteurizacin de la leche ha sido reconocida ya que es un proceso necesario en la obtencin de productos lcteos libres de microorganismos patgenos desde hace ms de 60 aos y ha sido obligatoria para la proteccin de los consumidores. La eficiencia de la pasteurizacin de los productos lcteos es comnmente evaluada por la prueba de la fosfatasa alcalina (Mistry, 1988). La norma NMX-F-368-1983 menciona que La fosfatasa es una enzima normalmente presente en la leche cruda. Puede conocerse la intensidad de la pasteurizacin mediante la determinacin de la actividad de la fosfatasa alcalina en el caso de la pasteurizacin baja (HTST), y de la lactoperoxidasa para los tratamientos ms severos (Walstra et. al., 2001).
El mecanismo de reactivacin ha sido estudiado por numerosos autores. Solamente puede observarse la restauracin de una fraccin de la fosfatasa alcalina (isoenzima ). Esta
fraccin, durante el calentamiento, es liberada de la membrana del glbulo de graso y se dispersa en la fase acuosa, encontrndose modificada (Veisseyre, 1988).
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La reactivacin consiste en que la enzima que ha sido inactivada por el calor, vuelve a su forma activa despus del enfriamiento. Hay muchas enzimas que no se reactivan y otras lo hacen muy lentamente. Como ejemplo de las enzimas que se reactivan puede mencionarse la fosfatasa alcalina, que experimenta una reactivacin parcial a los pocos das del tratamiento trmico, especialmente en la nata (debido a su elevado contenido de fosfatasa), y tambin la lactoperoxidasa (Walstra et al., 2001).
2.3.3. Importancia de las enzimas en la leche La importancia tecnolgica de la fosfatasa alcalina radica en su uso en el control de la pasteurizacin de leches y cremas, puesto que se inactiva mediante el calentamiento suficiente para la destruccin de Mycobacterium tuberculosis; sin embargo, esta prueba no es muy exacta debido al fenmeno de reactivacin, que se caracteriza por la reaparicin de la actividad de la enzima (Santos, 2007). La importancia de las enzimas radica en cinco propiedades principales: 1. Algunas son factores de degradacin que tienen importancia tecnolgica; por ejemplo, las lipasas son el factor de rancidez, las proteasas provocan la hidrlisis de las casenas, etc. 2. Su sensibilidad al calor permite controlar las temperaturas de pasteurizacin de la leche. 3. La cantidad de algunas enzimas depende del nmero de leucocitos o bacterias que se encuentran en la leche; de esta manera, pueden obtenerse datos acerca de la calidad higinica de la misma. 4. El contenido de enzimas no es el mismo para todas las leches; esta caracterstica podra aprovecharse para distinguirlas pero en la actualidad no se utiliza. 5. Algunas enzimas tienen actividad bactericida y por ello constituyen una proteccin, aunque limitadas, de la leche (Santos, 2007).
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2.4.
Prueba de la fosfatasa.
La prueba de la fosfatasa alcalina es de gran importancia para la salud pblica como medio de vigilar la rigurosidad de la pasteurizacin o la adicin de leche cruda en leche o productos lcteos pasteurizados. Para le prueba de la fosfatasa alcalina se han propuesto diversos sustratos. Pero el ms utilizado es el fenilfosfato disdico, en cuya hidrlisis se libera fenol que es un compuesto muy fcil de medir (Oria, 1991). La prueba de la fosfatasa consiste en valorar colorimtricamente el fenol que se libera del fenilfosfato disdico. Esta tcnica puede aplicarse a la mantequilla y a los quesos, pero en este ltimo caso es preciso tener el hecho de que ciertos microorganismos, normalmente presentes en el curso de la maduracin, secretan fosfatasas (especialmente las levaduras y mohos). La prueba puede entonces ser negativa y volverse luego positiva, sobre todo en los quesos pequeos (Alais, 1991). La determinacin de la actividad enzimtica mediante la prueba de la fosfatasa alcalina, se utiliza habitualmente como control de la pasteurizacin de la leche. La inactivacin de la enzima garantiza que todos los microorganismos patgenos (al menos los que puedan crecer en la leche) han sido destruidos durante el tratamiento trmico; tambin la mayora, aunque no todas. La mayor parte de la enzima est en la membrana de los glbulos grasos y, por lo tanto, la prueba de la fosfatasa es menos sensible cuando se realiza sobre leche desnatada. Mientras que la fosfatasa cida se encuentra en el suero y es bastante termorresistente (Walstra et al., 2001). Durante la fabricacin de productos lcteos, los de leche cruda puede diferenciarse de los de leche pasteurizada por determinacin de la fosfatasa alcalina. La presencia de esta enzima termosensible de la leche indica un proceso insuficiente de tratamiento trmico (v.g. pasteurizacin) (Eck y Gillis, 2000).
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La prueba de la fosfatasa debe, pues, interpretarse con mucha precaucin; un resultado positivo puede deberse a varios factores: a) Una pasteurizacin inadecuada. b) Contaminacin con leche cruda, sin pasteurizar. c) Contaminacin microbiana posterior a la pasteurizacin. d) Reactivacin de la fosfatasa. Sin embargo, la literatura menciona procedimientos fciles para identificar el origen de la fosfatasa positiva; para esto se aprovecha el hecho de que la enzima, para ser activa, requiere de iones magnesio (Badui, 1990).
2.4.1. El paquete lacto-Zyma II
El kit de Lacto-Zyma II, se emplea en una prueba cualitativa para la deteccin de la fosfatasa en leche, crema y mantequilla, especialmente para la supervisin ambulante de plantas pasteurizadas de leche.
El principio qumico es: La leche no pasteurizada contiene la enzima fosfatasa, la cual al incubarse con un sustrato de fenil fosfato, lo descompone, liberando fenol. La cantidad de fenol libre producida, se valora semi-cuantitativamente con el reactivo desarrollador de color Lacto-Zyma II, con produccin de un color azul. Esta es la forma ms estable del reactivo cualitativo para fosfatasa de scharer. Al aadir estos dos reactivos a la muestra de leche dan una reaccin de color la cual puede ser comparada con las simples inspeccin visual, lo cual es de gran valor en la supervisin ambulante de plantas pasteurizadas de leche (Medina, 2008).
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2.5.
Espectrofotometra
La espectrofotometra UV-visible es una tcnica analtica que permite determinar la concentracin de un compuesto en solucin. Se basa en que las molculas absorben las radiaciones electromagnticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma lineal de la concentracin. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotmetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solucin y medir la cantidad de luz absorbida por la misma (Kirk y Othmer, 1962). La espectrofotometra consiste en la medida de la absorcin que experimentan las sustancias qumicas, de una radiacin electromagntica de longitudes de onda situadas en una banda definida y estrecha, en la regin visible (380 nm - 780 nm). La cantidad absorbida por la solucin de la muestra se relaciona con la concentracin de sustancias que se desea analizar. Mientras ms concentrada sea la solucin de la sustancia analizada, mayor cantidad de luz es absorbida y se observa un color de tono ms intenso, con esta finalidad se adiciona un reactivo a la muestra o a la sustancia puesta a prueba, para producir un color el cual al ser comparado con la preparacin estndar que ha realizado simultneamente y que contiene aproximadamente una cantidad igual del estndar de referencia (Fox, 1992). La medicin de la luz en con la la regin ayuda visible de un (colorimetra) colormetro puede realizarse un
espectrofotomtricamente
fotoelctrico,
espectrofotmetro o con menor precisin por comparacin visual con estndares de color.
2.6.
Calidad de la leche
Atendiendo a un enfoque productor/usuario, la calidad de la leche puede definirse como: la suma de las caractersticas que la definen (nutritivas, composicionales, microbiolgicas, sensoriales, tecnolgicas, etctera) y que concurren a proporcionar una mayor o menor satisfaccin al utilizarlo, ya sea ste consumidor intermedio (industrial) o final. El estado ha creado una serie de normas, leyes y reglamentos que ayuden a mejorar la calidad de la leche y sus productos (Villegas y Santos, 2003). pg. 16
Mxico cuenta con dos normas de calidad las NOMs (normas oficiales de calidad) y NMX (norma Mexicana) la primera es obligatoria y la segunda no, aunque esta ltima al igual que la primera est basada en las normas ISO 9000 y cuyo propsito es buscar la implementacin de la calidad total en los bienes y servicios que se vayan a comercializar. La Norma Mexicana para la leche cruda establece los requisitos de calidad composicional y sanitaria que debe cumplir la leche en el lugar en donde se acuerde la transferencia al comprador o de la industria (Cano, 2006). Una de las principales preocupaciones que la Normatividad tiene es la salud pblica; para contribuir a ello, la ley exige que la leche y los productos lcteos deben elaborarse con leche tratada trmicamente (Santos y Villegas, 2005). Considerando la NOM-243-SSA1-2010, la cual establece las especificaciones sanitarias y nutrimentales que debe cumplir la leche, frmula lctea, producto lcteo combinado y los derivados lcteos. Dentro de las especificaciones fsicas y qumicas de esta norma se encuentra la prueba de la fosfatasa, que es utilizada para verificar la correcta pasteurizacin. Por lo que es necesario que esta sea de fcil entendimiento, para que pequeos productores puedan emplearla correctamente. Segn la NOM-243-SSA1-2010 en la cuadro 4, muestra los lmites mximos de fosfatasa residual en alimentos lcteos.
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Cuadro 4: Lmite mximo de fosfatasa residual. PRODUCTO LMITE MXIMO DE FOSFATASA RESIDUAL (UF/G) Leche, frmula lctea o producto lcteo 4
combinado pasteurizado Quesos frescos, madurados y procesados Quesos de suero Helados de crema, de leche o grasa vegetal, sorbetes y bases o mezclas para helados Mantequilla y crema pasteurizada Fuente: NOM-243-SSA1-2010. 4 12 4 4
2.7.
Pasteurizacin de la leche
La pasteurizacin puede definirse como un proceso higienizante destinado a eliminar completamente la microflora patgena de la leche, disminuir considerablemente la microflora banal, y destruir una alto porcentaje de enzimas deterioradoras (v.g. lipasas). El proceso est basado en la destruccin de Mycobacterium tuberculosis, el cual es el patgeno ms termorresistente que se halla en la leche. (Santos y Villegas, 2005). El objetivo principal de la pasteurizacin de la leche es reducir los riesgos que supone para la salud del consumidor la eventual presencia de microorganismos patgenos en los productos crudos. En el tratamiento de pasteurizacin, es posible que no se eliminen todos los patgenos, pero se reducen a unos niveles que no suponen ningn riesgo para el consumidor (Early, 2000). La finalidad de la pasteurizacin de la leche, es destruir el bacilo de la tuberculosis, as como la Coxiella burnetti causante de la fiebre Q. este calentamiento tambin es suficiente para inactivar la fosfatasa alcalina (Badui, 1999).
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Se han estudiado distintas combinaciones de temperatura y tiempo para pasteurizar pero finalmente se han reducido a dos: pasteurizacin lenta o discontinua y pasteurizacin rpida o continua (Nieto, 1998). Los efectos ms importantes de la pasteurizacin son: 1. La destruccin de microorganismos patgenos perjudiciales para la salud del consumidor. Este es el fin primordial por el que se desarroll la pasteurizacin. 2. La reduccin del nmero total de bacterias presentes, con lo que se puede prolongar su periodo de consumo y utilizacin (vida de anaquel). 3. La inactivacin de ciertas enzimas y bacterias perjudiciales en la elaboracin de quesos. Por otro lado, tambin hay que destacar la destruccin de bacterias y enzimas benficas, por lo que hay que reemplazarlas por cepas microbianas seleccionadas que permitan obtener la calidad deseada del queso (Madrid, 1990).
2.7.1. Tipos de pasteurizacin
1. La pasteurizacin lenta LTLT (Low Temperature Long Time): Consiste en calentar la leche a temperaturas entre 62 y 64C y mantenerla a esta temperatura durante 30 minutos. Luego de estos 30 minutos, la leche es enfriada a temperaturas entre 4 y 10C segn la conveniencia. El uso de esta tcnica es adecuada para procesar cantidades pequeas de leche hasta aproximadamente 2000 litros diarios, de lo contrario no se aconseja.
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2. Pasteurizacin rpida HTST (High Temperature Short Time): Este proceso tiene el propsito de eliminar, mediante el calor, a casi toda la flora microbiana y la totalidad de la flora patgena, alterando lo menos posible las estructuras de la leche (Santos y Villegas, 2005).
Llamada tambin pasteurizacin continua o bien HTST (High Temperature short time), se realiza en un intercambiador de calor de placas, este tratamiento consiste en aplicar a la leche una temperatura de 7273C en un tiempo de 15 a 20 segundos (Snchez, 1992).
3. Ultra Pasteurizacin UHT
(Ultra High Temperature): La ultra pasteurizacin,
designada tambin como ultra esterilizacin o procedimiento de temperatura ultra alta (UHT). Posee un efecto germicida muy elevado gracias a la accin de la alta temperatura durante un tiempo de retencin extremadamente breve. Sin embargo, las modificaciones fsico-qumicas son equivalentes a la pasteurizacin rpida o alta (AOAC, 1984). Es un tratamiento de esterilizacin comercial de la leche, por el cual se logra destruir todos los microorganismos que se encuentran normalmente. Sin embargo este proceso de alta temperatura, ocasiona la destruccin o debilitamiento de las estructuras, provocando que el cuajo no acte eficientemente, dificultndose la elaboracin de quesos (Santos y Villegas, 2005).
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III.
ANTECEDENTES
Numerosos trabajos se han orientado a la fosfatasa alcalina en la leche a continuacin se menciona unos. Kay y Graham (1935) desarrollaron otra prueba de fosfatasa, la cual est basada en el hecho de que la enzima natural fosfatasa est siempre presente en la leche cruda, pero es destruida a la temperatura necesaria para una pasteurizacin eficiente. La ausencia de fosfatasa es un ndice de que la leche ha sido pasteurizada, mientras que su presencia denota calentamiento insuficiente o contaminacin con leche cruda. Haab y Smith (1956) reporta variaciones en la actividad de la fosfatasa de la leche cruda y su posible importancia en las normas de pasteurizacin. Toda la leche cruda contiene fosfatasas que pueden hidrolizar los steres de fosfato por debajo de las condiciones alcalinas. Tericamente, la concentracin inicial de la enzima puede producir variaciones correspondientes de la actividad de la fosfatasa residual presente despus del tratamiento de pasteurizacin. Scharer (1938) desarroll un mtodo para la deteccin de fosfatasa alcalina en leche. Us 2,6 Dibromoquinonacloroimida (BQC) en lugar del reactivo de Folin-Ciocalteu para cuantificar el fenol liberado. Fara, et al. (2000), estudi la eficiencia de la pasteurizacin de la leche de cabra, en una miniplanta procesadora de queso y obtuvo resultados positivos de la prueba de la fosfatasa en la leche cruda; mientras que, en las leches pasteurizadas la prueba de la fosfatasa fue negativa.
Bindith et al (1996) inform que la actividad de la fosfatasa alcalina no se ve afectada en la leche descremada a 55 C por microfiltracin, pero la leche descremada cuando se
calienta a 70 C durante 15 s muestra una reduccin de 3 log y cuando se calienta un 65 C durante 70 s se reduce solo uno. El uso de p-nitrofenilfosfato como sustrato para estimar la actividad de la fosfatasa alcalina fue introducido por Aschaffenburg y Mullen (1949). pg. 21
Battistotti et. al. (1997) determin la actividad de la fosfatasa alcalina fluoromtricamente en la leche cruda o caliente (62, 64,66 o 68 C durante 20 s), en el queso Taleggio y Gorgonzola se elabor con leche pasteurizada a 74C por 20 s, y el queso Provolone se hizo con leche cruda. La actividad de la enzima en la leche disminuye progresivamente con el aumento de la intensidad del tratamiento trmico. Girrotti et al (1994) desarroll un anlisis quimioluminiscente altamente sensible y rpido para medir la actividad de la fosfatasa alcalina en la leche. Reynold y Telford en 1966. Mencion que la ausencia de la fosfatasa alcalina ha sido universalmente aceptada como la evidencia de una eficiente pasteurizacin de leche.
IV.
OBJETIVOS
Objetivo general Elaborar un manual para la determinacin de Fosfatasa Residual en Leche y Productos Lcteos segn NOM-243-SSA1-2010. Objetivos particulares Analizar la metodologa de la prueba de Fosfatasa Residual en Leche y Productos Lcteos segn NOM-243-SSA1-2010. Determinar la prueba cuantitativa de la fosfatasa residual en leche y en productos lcteos. Desarrollar la metodologa segn NOM-243-SSA1-2010 para la comprensin de su contenido.
pg. 22
V.
JUSTIFICACION
La fosfatasa alcalina es utilizada como indicador de una adecuada pasteurizacin. En la NOM-243-SSA1-2010 se desarrolla una metodologa para calcular los lmites mximo
expresados en UFenol/g. Sin embrago, los trminos tcnicos utilizados en la norma hacen complicada su aplicacin para personas que no estn relacionadas con dichos trminos. Por tal motivo surge la idea de elaborar un manual que sirva de gua a pequeos y medianos productores para verificar la adecuada pasteurizacin de la leche y productos lcteos de forma cualitativa y cuantitativa.
VI.
METODOLOGA 6.1. Ubicacin del trabajo
El presente estudio se llev a cabo en el Laboratorio de lcteos perteneciente al Departamento de Ingeniera Agroindustrial (DIA) de la Universidad Autnoma Chapingo; en el kilmetro 38.5 de la carretera Mxico-Texcoco.
La leche cruda, el yogur y la crema que se utiliz se compraron en la Unidad Tecnolgica Lechera y en la tienda Campestre de la Universidad Autnoma Chapingo.
6.2.
Materiales
Los materiales que se utilizaron se puntualizan en el manual.
El material, los reactivos y el equipo de Bao de agua con control de temperatura a 3740C.empleados para la desarrollo de la prueba de fosfatasa, fue adquirido por el distribuidor de productos y equipos de laboratorio QUMICA LAITZ.
pg. 23
6.3.
Lcteos utilizados
Se pasteuriz la leche a 65C durante 30 minutos (pasteurizacin lenta). El yogur, queso y leche ultrapasteurizada, fueron de la marca comercial LALA.
6.4. Mtodos aplicados
Se realiz una investigacin sobre los mtodos para el anlisis cuantitativo y cualitativo en la determinacin de la fosfatasa alcalina residual en leche y en productos lcteos. Se revis y analiz la NOM-243-SSA1-2010. Se aplic la metodologa de NOM-243-SSA1-2010 y el mtodo conocido como Aschaffenburg y Mullen. Ver el manual anexo. Los datos se obtuvieron al leer las muestras en un Spectronic Genesys 5 a 610 nm para la metodologa de NOM-243-SSA1-2010 y 403 nm en el caso del mtodo alterno. La cantidad de fosfatasa que hay en la leche o productos lcteos analizados se expresa en UFenol/g que es lo mismo que gFenol/mL y gP-nitrofenol/mL para el mtodo de Aschaffenburg y Mullen.
6.5. Anlisis para la sustitucin de la solucin (B.Q.C.) Debido a que no se pudo adquirir el reactivo 2,6-dibromoquinonacloroimida (B.Q.C.), se opt por sustituirlo con el reactivo Lacto-Zyma II (desarrollador de color), por lo que fue necesario realizar los anlisis para encontrar la concentracin ptima a la que reaccione toda la fosfatasa alcalina presente en el producto y no se desperdicie reactivo; al mismo tiempo fundamentar la sustitucin. Para ello se utiliz el siguiente procedimiento.
1. Medir con pipeta 1 mL de leche fluida y colocar dentro del tubo de ensayo. 2. Agregar a cada tubo 10 mL de la solucin reguladora de trabajo con fenil fosfato disdico, posteriormente tapar los tubos y mezclar. 3. Incubar en bao de agua a 37-38C por una hora. pg. 24
4. Dejar enfriar los tubos a la temperatura ambiente por inmersin en un recipiente de agua fra. 5. Aadir 1.0 mL de la solucin precipitante para protenas zinc-cobre. 6. Filtrar empleando embudos de 5 cm de dimetro y papel filtro No. 42 de 9 cm de dimetro o bien el No. 2 o su equivalente; recoger 5 mL del filtrado en tubos graduado en 5 y 10 mL. 7. Pesar concentraciones exactas del reactivo desarrollador de color del kit de Lacto-Zyma II. 8. Agregar a cada tubo 5 mL de solucin reguladora para desarrollo de color y del reactivo 0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.6,0.7,0.8,0.9 y 1 g de Lacto-Zyma II, mezclar y dejar a temperatura ambiente durante 30 min para desarrollo de color. 9. Leer la intensidad del color azul midiendo en el espectrofotmetro la absorbancia de la muestra con referencia a la prueba en blanco a 610 nm.
VII.
RESULTADOS Y DISCUSIN
Para la sustitucin de la solucin (B.Q.C.), con los resultados obtenidos de las diferentes concentraciones del desarrollador de LactoZyma II que se muestran en el cuadro 5 se elabor una grfica (ver figura 2) en que se puede observar que la concentracin ptima es 0.5 g , por lo que se tom esta concentracin para el desarrollo de la prueba ya que es donde la curva se vuelve asntota lo cual implica que es la cantidad necesaria en donde reacciona toda la enzima y no se desperdicia el reactivo desarrollador de color de kit de Lacto-Zyma II.
pg. 25
Cuadro 5. Resultados de obtenidos con los diferentes concentraciones del reactivo Lacto-Zyma II. CONCENTRACIN DEL REACTIVO LACTO-ZYMA II A610 R1 A610 R2 A610 R3
0 0.05 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 Fuente: Elaboracin propia.
0 0.128 0.184 0.220 0.246 0.277 0.29 0.291 0.292 0.293 0.292 0.293
0 0.177 0.243 0.262 0.281 0.285 0.304 0.306 0.303 0.304 0.305 0.306
0 0.122 0.176 0.219 0.239 0.278 0.301 0.303 0.302 0.301 0.303 0.299
Diferentes concentraciones del reactivo Lacto-Zyma II

0.35 0.3 0.25 Absorbancia 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 concentracin de Lacto-Zyma II (g) R1 R2 R3
Figura 2. Concentraciones del reactivo Lacto-Zyma II. En la figura 3 presenta la grfica de la curva patrn que se elabor con los resultados obtenidos que se muestran en el cuadro 6. pg. 26
Cuadro 6. Resultados con diferentes concentraciones de fenol para elaboracin de la curva patrn. Concentracin de A610 A610 A610 fenol (UFenol/mL R1 R2 R3 gFenol/mL) 0 0 0 0 0.5 0.007 0.017 0.009 1 0.014 0.023 0.017 3 0.061 0.081 0.077 5 0.081 0.085 0.097 10 0.220 0.291 0.208 20 0.359 0.346 0.357 30 0.523 0.557 0.531 40 0.764 0.802 0.827 Fuente: Elaboracin propia.
Figura 3: Grfica de curva patrn fenol.
pg. 27
7.1.
Interpretacin de los resultados de los productos analizados con el mtodo de la NOM-243-SSA1-2010 Leche cruda
Cuadro 7. Concentracin de Tecnolgica Lechera. Tubos 1 2 3 Testigo

610 610
de leche cruda proveniente de la Unidad Con respecto a la curva patrn 9.1368 8.5578 10.6631 Concentracin de en el producto 21.92 20.53 25.59
0.346 0.335 0.375 0.168
Final 0.178 0.167 0.207
Fuente: Elaboracin propia En la leche cruda se obtuvieron 21.92, 20.53 y 25.59 ; estos valores no se
pueden comparar con los lmites mximos que especifica la norma, dado que solo hay lmites para los productos pasteurizados, pero es evidente la actividad de la fosfatasa residual. Los resultados de la leche pasteurizada y ultrapasteurizada (cuadro 8 y 9) si se puede comparar con la norma, la cual, establece un lmite mximo de fosfatasa residual de 4 UFenol/mL establecido Cuadro 8. Concentracin en Unidad Tecnolgica Lechera. Tubos 1 2 3 Testigo
610 610
por lo tanto ambos productos se mantienen dentro de lo
de leche pasteurizada proveniente de la Con respecto a la curva patrn 0.7157 0.8736 0.7157 Concentracin de en el producto 1.71 2.09 1.71
0.207 0.21 0.206 0.189
Final 0.018 0.021 0.017
Fuente: Elaboracin propia
pg. 28
Cuadro 9. Concentracin en
Tubos 1 2 3 Testigo
610
0.222 0.215 0.212 0.198
de leche ultrapasteurizada de la marca comercial LALA. Con respecto a Concentracin de 610 la curva patrn en el Final producto 0.013 0.4526 1.08 0.017 0.014 0.6631 0.5052 1.59 1.21
Fuente: Elaboracin propia.
Yogur
El yogur comercial y el de la Unidad Tecnolgica Lechera (UTL) se encuentran dentro de la norma, porque los resultados (cuadro 10 y 11) estn dentro del lmite mximo de fosfatasa residual de 4 UFenol/g
Cuadro 10. Concentracin en Lechera. Tubos 1 2 3 Testigo

610 610
de yogur de la Unidad Tecnolgica Con respecto a la curva patrn 0.5052 0.3473 0.4526 Concentracin de en el producto 1.11 0.76 0.99
0.145 0.142 0.144 0.131
Final 0.014 0.011 0.013
Fuente: Elaboracin propia
pg. 29

Tubos 1 2 3 Testigo 610 0.233 0.228 0.231 0.220 610 Final 0.013 0.008 0.011
de yogur de la marca comercial LALA.

Con respecto a la curva patrn 0.4526 0.1894 0.3473 Concentracin de en el producto 0.99 0.41 0.76
Crema
El contenido de fosfatasa residual alcalina en la crema de la UTL si cumplen con la norma ya que no rebasan el lmite mximo de 4
que establece la norma.

Tubos 1 2 3 Testigo 603 0.183 0.178 0.181 0.156 610 Final 0.027 0.022 0.025
de crema de la Unidad Tecnolgica Lechera.

Con respecto a la curva patrn 1.1894 0.9263 1.0842 Concentracin de en el producto 2.85 2.22 2.60
pg. 30
Queso A continuacin se presenta los datos obtenidos de la muestra de queso, por lo que se puede notar los valores 1.76, 4.30 y 1.99 estn por bajo con respecto a 12 , que es el lmite mximo que establece la norma para este producto. Cuadro 13. Concentracin en Tubos 1 2 3 Testigo
603 610
0.289 0.3 0.290 0.277
Final 0.012 0.023 0.013
de queso panela comercial. Con respecto a Concentracin de la curva patrn en el producto 0.4 1.76 0.9789 0.4526 4.30 1.99
Fuente: Elaboracin propia. En el cuadro 14 se presenta la interpretacin para cada uno de los productos analizados con respecto al lmite mximo que establece la norma.
Cuadro 14. Lmite mximo segn la NOM-243-SSA1-2010 e interpretacin de resultados. Productos Lmite mximo UF/mL o segn la NOM-243-SSA1-2010 4 4 4 4 4 4 4 12 Interpretacin de resultados si no estn dentro de la norma No Si Si Si Si Si Si Si
leche cruda leche pasteurizada leche ultrapasteurizada yogur UTL yogur natural comercial crema UTL crema comercial Queso panela comercial Fuente: Elaboracin propia.
pg. 31
7.2.
Fosfatasa residual con el Mtodo de Aschaffenburg y Mullen
Con los resultados obtenidos que se muestran en el cuadro 15 se realiz una grfica que se muestra en la figura 20.
Cuadro 15. Datos obtenidos de los tubos de la curva patrn. Concentracin de p-nitrofenol A403 A403 A403 (mgP-nitrofenol/mL) R1 R2 R3 0 0 0 0 0.5 1 2 3 4 4.5 Fuente: Elaboracin propia. 0.152 0.298 0.596 0.981 1.199 1.356 0.147 0.221 0.544 0.919 1.022 1.13 0.173 0.283 0.601 0.978 1.007 1.123
Figura 4. Curva patrn de p-nitrofenol.
pg. 32
7.3.
Comprobar la utilizacin de los mtodos
Debido a que no fue posible conseguir el reactivo 2,6 Dibromoquinonacloroimida para desarrollar nicamente el mtodo propuesto por la norma, fue necesario utilizar los datos de la curva patrn del mtodo propuesto por la NOM-243-SSA1-2010 y el mtodo de Aschaffenburg y Mullen (p-nitrofenol) (ver cuadro 16), y se realiz una distribucin t de student para comprobar que los resultados obtenidos de ambos mtodos eran similares. Con un nivel de significancia =0.01. Con 14 grados de libertad encontramos en la tabla de t-student, t0.005(14)= 2.9768, por lo que la regla de decisin es rechazar H o si to> 2.9768 o to< -2.9768. Puesto que to= -2.1152, la conclusin por lo que no se rechaza la H o con un =0.01, lo cual indica que las medias de ambos mtodos son iguales y por lo tanto se podr utilizar cualquiera de los dos mtodos investigados. Cuadro 16: Datos de la curva patrn del fenol y p-nitrofenol. UFenol/mL 0 0.5 1 3 5 10 20 30 40 A610 0 0.007 0.014 0.061 0.081 0.2 0.359 0.523 0.764 Up-nitrofenol/mL 0 0.5 1 2 3 4 4.5 A403 0 0.152 0.298 0.596 0.981 1.199 1.356
pg. 33
VIII.
CONCLUSIONES
Con base en los resultados obtenidos, podemos concluir lo siguiente: 1. El mtodo utilizando p-nitrofenol es rpido y eficiente para la determinacin de la pasteurizacin de la leche empleada en la elaboracin de los productos derivados de ella y mediante la distribucin de t- student la t0.005 con una se encontr
que ambos mtodos pueden ser utilizados obteniendo resultados similares. 2. El mtodo de Aschaffenburg y Mullen en donde se utiliza p-nitrofenol es ms rpido comparado con el mtodo propuesto por la norma. 3. El problema con el mtodo propuesto por la NOM-243-SSA1-2010 es que no es posible conseguir en el mercado el reactivo 2,6 Dibromoquinonacloroimida por lo que fue necesario sustituirlo por el reactivo desarrollador de color del kit de LactoZyma II. 4. Por otra parte el mtodo de Aschaffenburg y Mullen slo puede ser utilizado para la determinacin de fosfatasa residual en leche y no en productos lcteos como es el caso del mtodo propuesto por la norma. 5. La prueba de la fosfatasa, es un mtodo efectivo para verificar la pasteurizacin al trmino del proceso, Sin embargo, estas metodologas no son aplicables a leche en anaquel debido a que la fosfatasa alcalina tiende a reactivarse de acuerdo al tiempo y a la temperatura a la que se exponga.
pg. 34
IX.
LITERATURA CONSULTADA
Alais, C. (1991). Ciencia y tecnologa de la leche. Editorial compaa editorial continental, S.A. Mxico. Alais, C. (2001). Ciencia de la Leche y Tecnologa de Los Productos Lcteos. Editorial compaa editorial continental, S.A. Mxico. Amiot, J. (1991) ciencia y tecnologa de la leche. Editorial ACRIBIA, S.A. Zaragoza, Espaa. Pp. 39. AOAC. (1984). Official Methods of Analysis of the Association of the Official Analytical Chemists. AOAC.14th edition. USA. Arroyo, G.G. (1997). Guia para la produccin higinica de leche en establos con ordeo mecnico. Secretara de Salud. Mxico; D.F. Aschaffenburg, R. y Mullen, J.E.C. (1949).A rapid and simple phosphatase test for milk. Journal of Dairy Res., Vol.16 Badui, DS. (1999) Qumica de los Alimentos. Cuarta edicin. Editorial Addison wesley Longman de Mxico, S.A. de C.V. Naucalpan de Jurez, Edo. de Mxico., pp 294300. Battistotti, B., Brambille, E., Cappa, F. y Ferreandi, G. (1997) Alkaline phosphatase in milk and ripenet cheeses. Sci. Tecn. Latt.-Casearia. Vol.48. Cano, M. A. (2006). La leche y sus derivados en el marco normativo mexicano. Tesis de licenciatura. Ingeniero Agroindustrial. AUCh. Chapingo; Mxico. Claveran, M.A.S., (1989).Estudio de factibilidad tcnica econmica para la produccin de crema natural y vegetal en Aguascalientes, Ags.FES. Cuautitln. Early, R. (2000). Tecnologa de los prodcremauctos lcteos. . Editorial ACRIBIA, S.A. Zaragoza, Espaa
pg. 35
Eck, A. y Gillis, J.C. (2000). Cheese making, from science to quality assurance. Second edition. LavoisierPublishing, Paris France, pp 89. Fara, R. J., Garca U.A., Garca A. y Tovar V. A. (2000). Efficiency of Pasteurization the Goat Milk in Cheesemaking Miniplant.Revista Cientfica FCV-LUZ. 2(10).
Maracaibo, Venezuela. p 119-123. Fox, C. (1992). Ciencia de los alimentos. Editorial LIMUSA S.A de C.V. Mxico. Fox, P.F.y McSweene, P.L.H.(2003). Advanced dairy chemistry KLUWER ACADEMIC/PLENUM PUBLISHERS. New york. Gary, D. C. (1988). Qumica Analtica. 2 Edicin. Editorial LIMUSA S.A de C.V. Mxico. Haab, W. y Smith, L.M(1956). Variations in alkaline phosphatase activity of milk. Journal of science. Vol. 39. No.12. Helen, C. (2004). Tecnologa de alimentos. Procesos qumicos y fsicos en la preparacin de alimentos. Editorial Limusa. Mexico Kay, H.D. y W.R. Graham, Jr. (1935). The phosphatase test for pasteurized milk. J. Dairy Res. 6:191. Kirk, R. y Othmer, D. (1962). Enciclopedia de Tecnologa Qumica. Editorial 1 Proteins. Editorial
Hispanoamericana. Tomo 5. Mxico. Luquet, A. (1993). Leche y Productos Lcteos. Editorial ACRIBIA S.A. Zaragoza, Espaa. pp. 407-427. Madrid, V. A. (1990). Manual de Tecnologa Quesera. De. AMV Ediciones MundiFrema. Madrid, Espaa. Mistry, V.V. (1988). Thermal inactivation characteristics of alkaline phosphatase in ultrafiltered milk. Journal of Dairy Science. Vol. 72 Nieto, G.I. (1998). Rendimiento del queso Oaxaca. Efecto de la acidez y la materia grasa de la leche. Tesis profesional. Ingeniera Agroindustrial, UACh. Chapingo. Mxico. pg. 36
NMX-F-368-1983. Alimentos. Leche Fluida. Fosfatasa Residual. Mtodo de Prueba. Foods. Fluid Milk. Residual Phosphatase.Method of Test. Normas Mexicanas. Direccin General de Normas. En lnea:
http://www.colpos.mx/bancodenormas/nmexicanas/NMX-F-368-1983.PDF (15/08/012). NOM-243-SSA1-2010 Productos y servicios. Leche, frmula lctea, producto lcteo combinado y derivados lcteos. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Mtodos de prueba. En lnea:
http://200.77.231.100/work/normas/noms/2010/243ssa12010.pdf (15/08/2012). NOM-181-SCFI-2010, Yogurt-Denominacin, especificaciones fisicoqumicas
y microbiolgicas, informacin comercial y mtodos de prueba. En lnea: http://200.77.231.100/work/normas/noms/2010/181scfi2010.pdf. NOM-155-SCFI-2012, fisicoqumicas, informacin Leche-Denominaciones, comercial y mtodo de especificaciones prueba En
lnea:http://dof.gob.mx/nota_detalle.php?codigo=5254842&fecha=03/05/2012. Oria, A.R. (1991). Ciencia y tecnologa de la leche. Principios y aplicaciones. ACRIBIA, S.A. Zaragoza, Espaa. Organizacin Mundial de la Salud (OMS), (1960) Normas para el examen de los Productos Lcteos. 11 ed. Washington. 145-179 pp. Reynold, R.G. y Telford, J.P.(1966). Application of And Automated Procedure to the Milk Phosphatase test. Journal of Milk and Food Technology. 30(1). 35-39. Snchez, C. (1992). Recopilacin de esquemas tecnolgicos bsicos de elaboracin de quesos. Folleto del curso "Tecnologa de procesamiento de leche, carne y cueros en ovinos, caprinos y bovinos". ISBN980-318-0363. Santos, M.A. (2007). Leche y sus derivados. Segunda edicin. Editorial Trillas. Mxico.
pg. 37
Santos, M.A. (1995). Productos lcteos, anlisis y elaboracin. Editorial UACh. Departamento de Ingeniera Agroindustrial. Universidad Autnoma Chapingo. Santos, M. A. y Villegas de G. A. (2005), Manual bsico para elaborar productos lcteos. Editorial Universidad Autnoma Chapingo. Mxico. Pp.9-19. SECOFI. (2000). Guas empresariales. Yogurt y crema. Editorial LIMUSA, S.A. de C.V. Mxico, D.F. Scharer, H. (1938). A rapid phosphomonoesterase test for control of dairy pasteurization, Journal of food science. SECOFI. (1997). NMX-F-026-1997-SCFI. Leche Denominacin, especificaciones comerciales y mtodos de prueba. Mxico; D.F. Tamime, A. Y. Y Robinson R. K. (1991). Yogur, ciencia y tecnologa. Ed. ACRIBIA, S. A. Zaragoza, Espaa. Veisseyre, R. (1988) Lactologa tcnica. Composicin, recogida, tratamiento y transformacin de la leche. Segunda edicin. Vignola, C. L. (2002) Science et technoligie du lait, transformation du lait. Editorial
Fundation de Technologie Laitire du Quebec Inc. Montreal Canada Villegas de G. A. (1993). Los quesos Mexicnnos. CIESTAAM-UACH. Mxico. Villegas de G. A. y Santos M. A. (2003). Calidad de leche cruda. Manual de prcticas. Editorial Universidad Autnoma Chapingo. Mxico. Walstra, P. Geurts T. J., Noomen A, Jellena A, y Van Boekel M.A.J.S. (2001). Ciencia de la leche y tecnologa de los productos lcteos. Ed. ACRIBIA, S. A. Zaragoza, Espaa.
pg. 38
pg. 39
1.MANUAL PARA LA DETERMINACIN DE FOSFATASA RESIDUAL EN LECHE Y PRODUCTOS LCTEOS SEGN LA NOM-243-SSA1-2010.
1. INTRODUCCIN. indicador de la correcta
La prueba de la fosfatasa alcalina se aplica como un pasteurizacin
en la leche, queso y otros productos lcteos. Por consiguiente si se
descubre en una muestra de leche pasteurizada que la actividad de la fosfatasa alcalina est presente, esto comprueba que su procesamiento ha sido inadecuado o que la enzima ha sido reactivada. Esta prueba segn la NOM-243-SSA1-2010, se fundamenta en la accin de la enzima fosfatasa alcalina sobre el sustrato fenilfosfato disdico en solucin reguladora de hidrxido de bario-borato. Si la fosfatasa activa est presente, el fenilfosfato se hidroliza y se forma fenol. La cantidad de fenol liberada a partir del sustrato es proporcional a la actividad de la enzima. C6H5OPO3H2 + H2O
Fosfatasa Alcalina
C6H5OH + H3PO4
Por lo que si la leche utilizada en la elaboracin del producto ha sido pasteurizada eficientemente, la fosfatasa se inactiva y no hay hidrlisisEl fenol formado se determina colorimtricamente despus de su reaccin con 2,6-dibromoquinonacloroimida (B.Q.C.), obtenindose un color azul, cuya intensidad se mide espectrofotomtricamente a 610 nm. El Mtodo de Aschaffenburg y Mullen, tambin es muy utilizado para efectuar la prueba de la fosfatasa. Este mtodo, se basa en la actividad de la fosfatasa alcalina presente en la leche cruda, sobre el sustrato p-nitrofenilfosfato disdico, en condiciones alcalinas liberando p-nitrofenol como producto, evidencindose por su color amarillo. Cuya intensidad se mide espectrofotomtricamente a 403 nm (Muoz, 1975). En el presente manual se encuentra la metodologa de cada una de los mtodos mencionados. pg. 40
1.1.
Determinacin de fosfatasa segn la NOM-243-SSA1-2010.
1.1.1. Materiales Tubos de ensaye con tapas. Pipetas graduadas. Embudos de filtracin. Matraces volumtricos de diferentes capacidades. Papel filtro Whatman No. 42 o No. 2. Perilla de succin. Tubos de ensaye con graduacin de 0 a 10 mL. Vasos de precipitacin. Celdas de cuarzo. Agitadores de vidrio. 1.1.2. Equipo Parrilla de calentamiento, de control termosttico. Espectrofotmetro Balanza analtica. Bao de agua con control de temperatura a 37-40C. 1.1.3. Reactivos Hidrxido de bario octahidratado (Ba (OH) 2 8 H2 O). cido brico (H3 BO3). Metaborato de sodio (NaBO2). Cloruro de sodio (NaCl). Borato de sodio decahidratado (Na2 B4O7 10 H2 O). Fenilfosfato disdico (Cristales libres de fenol) (Na2 C6H5PO4) 2H2 O. Alcohol butlico (C4 H10 O). Sulfato de zinc heptahidratado (Zn SO4. 7 H2 O). Sulfato de cobre pentahidratado (CuSO4 5 H2 O). Fenol (C6H6 O). Reactivo desarrollador de color del kit de Lacto-Zyma II.
pg. 41
Todos los reactivos deben ser grado analtico y libre de fenol; por agua debe entenderse agua destilada. 1.1.4. Metodologa. De acuerdo a la NOM-243-SSA1-2010 la prueba de fosfatasa es una prueba cualitativa y cuantitativa y se expresa en unidades fenol o microgramos de fenol y
existen lmites mximos para leche y diferentes productos lcteos los cuales se presenta en la norma.
1.1.5. Procedimiento.
a) Preparacin de reactivos.
1. Solucin reguladora de hidrxido de bario-borato (pH 10.6 0.15 a 25C). Disolver 25 g de hidrxido de bario octahidratado en agua caliente y diluir a 500 mL. Disolver 11 g de cido brico y diluir a 500 mL. Calentar cada una de las soluciones a 50C y mezclar. Agitar y enfriar aproximadamente a 25C. Ajustar el pH a 10.6 0.15, con la solucin de hidrxido de bario-borato y filtrar. Conservar la solucin en un recipiente bien cerrado. Para leche y quesos: Antes de su uso, diluir la solucin con la misma cantidad de agua. Por ejemplo: diluir 500 mL de esta solucin reguladora con 500 mL de agua. Para yogur: diluir esta solucin reguladora con un cuarto de su volumen de agua (ejemplo 80 mL de este regulador con 20 mL de agua).
pg. 42
Figura 1. Preparacin de la solucin reguladora de hidrxido de bario-borato.
Figura 2. Dilucin de la solucin reguladora de hidrxido de bario-borato.
2. Soluciones reguladoras de trabajo con fenil fosfato disdico Para leche: Disolver 0.1 g de fenil fosfato disdico en 100 mL de la solucin reguladora de hidrxido de bario-borato. pg. 43
En caso de que el fenil fosfato disdico no est libre de fenol debe ser purificado de la siguiente manera: Disolver 0.5 g de fenilfosfato disdico en 4.5 mL de agua; agregar 0.5 mL de la solucin reguladora de hidrxido de bario-borato y dos gotas de reactivo B.Q.C.(0.5 g de Lacto-Zyma II); dejar en reposo 30 min. Extraer el color formado con 2.5 mL de alcohol butlico. Si fuese necesario, repetir la extraccin del color. Luego de separar, descartar el alcohol butrico. Diluir 1 mL de esta solucin en un matraz aforado de 100 mL y aadir el regulador de hidrxido de bario- borato hasta aforar. Calentar la solucin a 85C por 2 min, tapar inmediatamente y guardar en refrigeracin. Esta solucin madre debe mantenerse en el refrigerador durante algunos das. Al emplearse, desarrollar el color y eliminarlo por extraccin como se ha indicado anteriormente. La solucin es estable por un ao si se encuentra bien guardada y con mnima exposicin al aire. Antes de usar, desarrollar el color y reextraer si es necesario. Para yogur: Disolver 0.1 g de fenil fosfato disdico en 100 mL de hidrxido de bario- borato y mezclar bien. Conservar en frasco color mbar y en refrigeracin. Para quesos y crema: Disolver 0.1 g de fenil fosfato disdico en 100 mL de solucin de hidrxido de bario-borato. Mezclar y Conservar en frasco color mbar y en refrigeracin. 3. Solucin reguladora para desarrollo de color (pH 9.8 0.15 a 25C). Para leche, yogur y queso: Disolver 6 g de metaborato de sodio y 20 g de cloruro de sodio en agua y diluir a un litro. Conservar en refrigeracin. 4. Reactivo precipitante para protenas zinc-cobre. Para leche y crema: Disolver 3 g de sulfato de zinc heptahidratado y 0.6 g de sulfato de cobre pentahidratado en agua y diluir a 100 mL. Para yogur: Disolver 4.5 g de sulfato de zinc heptahidratado y 0.1 g de sulfato de cobre pentahidratado en agua y llevar un volumen de 100 mL. pg. 44
Para quesos: Disolver 6 g de sulfato de zinc heptahidratado en agua y diluir a 100 mL.
Figura 3. Solucin precipitante para protenas zinc-cobre.
5. Solucin de sulfato de cobre para patrones al 0,05%. Disolver 0,05 g de sulfato de cobre pentahidratado en 100 mL de agua.
Figura 4. Solucin de sulfato de cobre para patrones al 0,05%.
pg. 45
6. Solucin de 2,6-dibromoquinonacloroimida (B.Q.C.) Agregar 0.5 g de Lacto-Zyma II.
Figura 5. Reactivo desarrollador de color.
7. Solucin madre de fenol de 1
Pesar exactamente 1.0 g de fenol, transferir a un matraz volumtrico de un litro y llevar al volumen con agua. Mezclar perfectamente. Esta solucin es estable durante varios meses mantenida en refrigeracin.
Figura 6. Reactivo de fenol. pg. 46
b) Preparacin de la curva patrn de comparacin.
1. Diluir 10 mL de la solucin madre
de fenol
a un litro con agua y mezclar
perfectamente. De manera semejante preparar las soluciones patrn que contengan 20, 30 y 40 unidades por mL. Guardar en refrigeracin y permitir que est a la temperatura ambiente en el momento de su uso. 2. Preparacin de Soluciones patrn para estndares: En cuatro matraces
volumtrico de 100 mL aadir 5, 10, 30 y 50 mL de la solucin patrn de fenol de 10 g/mL, posteriormente adicionar agua destilada, agitar y aforar. Estas soluciones contienen respectivamente 0,5; 1,0; 3,0 y 5,0 g o unida des de fenol por mL. Pipetear 1 mL de cada solucin patrn en tubos de ensayo para obtener una serie de muestras conteniendo 0.0 (blanco), 0.5; 1; 3; 5; 10; 20; 30 y 40 g o unidades de fenol por mL. El blanco se obtienen pipeteando 1 mL de agua destilada. ( se recomienda preparar dos o ms tubos de cada uno de las concentraciones de fenol para determinaciones por duplicado.) 3. Pipetear sucesivamente en cada tubo de ensayo 1 mL de la solucin de sulfato de cobre al 0.05 %, con objeto de aumentar la intensidad del color azul y la estabilidad de los patrones 4. Agregar en cada tubo de ensayo 5 mL de la solucin para el desarrollo de color, 3 mL de agua y 0.5 g de reactivo de LactoZyma II. Mezclar. 5. Dejar en reposo 30 min, a temperatura ambiente para desarrollo de color. 6. Realizar la lectura de la intensidad del color con un espectrofotmetro a 610 nanmetros, restar el valor que alcanza la lectura del testigo a la de cada una de las soluciones patrones de fenol. 7. Establecer una curva de calibracin la cual debe ajustarse mediante el mtodo de mnimos cuadrados (regresin lineal).
pg. 47
c) Preparacin de la muestra. Para leche: Medir con pipeta 1 mL de leche fluida y colocar dentro del tubo de ensayo. Para yogur: Pesar 1 g de muestra (por duplicado) sobre un pedazo de papel encerado de 2.5 X 2.5 cm e introducir la muestra dentro del tubo de ensayo. Para queso: Pesar 0. 5 g de queso de muestra (por duplicado) sobre un pedazo de papel encerado de 2.5 X 2.5 cm e introducir la muestra dentro del tubo de ensayo. Para crema: pesar 1 g de crema de muestra (por duplicado) sobre un pedazo de papel encerado de 2.5 X 2.5 cm e introducir la muestra dentro del tubo de ensayo.
Nota: se necesita un tubo como testigo y se recomienda preparar dos o ms tubos para determinaciones por duplicado.
Figura 7. Tubos con muestras de crema, yogur, leche cruda y pasteurizada.
pg. 48
1.1.6. Procedimiento 1. Agregar a cada tubo 10 mL de la solucin reguladora de trabajo con fenil fosfato disdico, posteriormente tapar los tubos y mezclar.
Figura 8. Aadiendo los 10 mL de la solucin de trabajo con fenil fosfato disdico.
2. Calentar el tubo testigo en un bao de agua a ebullicin cubierto durante 1 min (la temperatura interna del tubo debe estar entre 85-90C). Dejar enfriar a temperatura ambiente y mezclar de nuevo con el agitador.
Figura 9. Bao de agua en donde se colocaron los tubos testigos.
pg. 49
3. Colocar los dems tubos en bao de agua a 37-38C. Incubar ah por una hora. Agitando el contenido de vez en cuando.
Figura 10. Incubacin de tubos a 38.0 C.
4. Trasladar los tubos a un recipiente con agua a ebullicin durante 1 min. Dejar enfriar los tubos a la temperatura ambiente por inmersin en un recipiente de agua fra.
Figura 11. Calentando los tubos durante un minuto.
pg. 50
5. Aadir 1 mL de la solucin precipitante para protenas zinc-cobre, mezclar. El pH de la mezcla debe ser de 9 -9.1.
Figura 12. Aadiendo un mililitro de solucin precipitante para protena. 6. Filtrar empleando embudos de 5 cm de dimetro y papel filtro No. 42 de 9 cm de dimetro o bien el No. 2 o su equivalente; recoger 5 mL del filtrado en tubos graduado en 5 y 10 mL. Descartar los primeros filtrados hasta obtener un lquido ntido.
7. Agregar a cada tubo 5 mL de solucin reguladora para desarrollo de color y 0.5 g del reactivo de Lacto-Zyma II, mezclar y dejar a temperatura ambiente durante 30 min para desarrollo de color.
pg. 51
Figura 13. Color de los tubos despus de 30 minutos.
8. Leer la intensidad del color azul midiendo en el espectrofotmetro la absorbancia de la muestra por referencia a la prueba en blanco a 610 nm y a los estndares preparados.
Figura 14. Lecturas de absorbancia con el espectrofotmetro.
pg. 52
1.1.7. Clculos.
1. Para calcular la actividad de la fosfatasa expresada en microgramos de fenol por mL, empleando la formula siguiente:
U. de Fenol/mL = C X Factor de dilucin. Donde: C = concentracin de la muestra obtenida de la grfica de la curva patrn en unidades fenol/mL.
Cuadro 1: Factor de dilucin de algunos productos lcteos de acuerdo con la NOM-243-SSA1-2010 Producto lcteo. Leche Yogur queso crema Factor de dilucin. 2.4 2.2 4.4 2.4
Pasos para obtener el resultado de la actividad de la fosfatasa residual alcalina. 1.- Obtener los datos despus de leer a 610 nm. 2.- Restar a cada una de las lecturas de muestras la lectura del testigo. 3.- Empleando la ecuacin grfica de la curva patrn se despeja x para obtener la
concentracin de la muestra con respecto a la curva patrn en unidades fenol/mL. o .
y = mx+b
pg. 53
4.- El resultado de la concentracin se multiplica con el factor de dilucin. El producto
que resulta de esta operacin se expresa en
1.1.8. Recomendaciones para determinar fosfatasa en leche y en productos lcteos. Durante el desarrollo de la prueba de la fosfatasa residual se sugiere considerar siguientes recomendaciones. las
1. Limpiar perfectamente todo el material de vidrio y tapones.
2. Enjuagar y hervir con agua o tratarlos por vapor todo el material de vidrio y tapones.
3. Evitar el empleo de material plstico y tapones que pudieran contener fenol cualquier otro contaminante.
4. Evitar cuidadosamente todo indicio de saliva, puesto que sta contiene fosfatasa.
pg. 54
1.2.
Determinacin de fosfatasa con el Mtodo de Aschaffenburg y Mullen.
1.2.1. Materiales Tubos de ensaye con tapas. Pipetas graduadas Embudos de filtracin. Matraces volumtricos de diferentes capacidades. Papel filtro Whatman No. 42 o No. 2. Perilla de succin. Vasos de precipitacin. Celdas de cuarzo. Agitadores de vidrio. Embudos de separacin.
1.2.2. Equipo
Parrilla de calentamiento, de control termosttico. Espectrofotmetro de UV-Visible. Balanza analtica. Bomba de vacio.
1.2.3. Reactivos
Fosfatasa alcalina de leche cruda. Solucin de p-nitrofenilfosfato. Solucin reguladora de glicina 0.2 M a pH 9.75.
Solucin de NaOH 0.02 M.
pg. 55
1.2.4 Curva patrn.
Esta curva se hace con el fin de que los datos obtenidos con las muestra de leche cruda, convertirlos a concentracin de producto (p-nitrofenol). Para ello se prepara la siguiente serie de tubos como se indica en cuadro 2. Mezclar perfectamente y determinar su
absorbancia a 403 nm utilizando el tubo uno como blanco.
Cuadro 2. Preparacin de tubos para la curva patrn.

N de tubo 1 2 3 4 5 6 7 p- nitrofenol (5X10-5 m) 0.0 0.5 1.0 2.0 3.0 4.0 4.5 Agua (mL) 4.5 4.0 3.5 2.5 1.5 0.5 0.0 NaOH 0.02 M (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Figura 15.Tubos para la curva patrn.
pg. 56
1.2.5. Preparacin de reactivo.
1. Sucin de p-nitrofenilfosfato disdico (sustrato) Preparar 100 m de solucin al 2.5 X 10-3 M, considerando un peso molecular de 264.
Figura 16. Frasco del reactivo p-nitrofenilfosfato disdico utilizado.
2. Solucin de NaOH 5 M. Disolver 20 g de NaOH en 100 mL de agua. 3. Solucin de NaOH 0.02 M. Disolver 0.08 g de NaOH en 100 mL de agua. 4. Solucin reguladora de glicina 0.2 M a pH 9.75 Disolver 3 g de glicina en aproximadamente 150 mL de agua destilada y adicionar NaoH 5 M hasta que el pH sea de 9.75. Aforar con agua destilada a 200mL.
pg. 57
Figura 17. Solucin de glicina.
5. Solucin de p-nitrofenol. Preparar una solucin 5X 105 M a partir de una solucin stock de concentracin 0.01 M (0.1391/100), la solucin diluida se deber preparar al momento de usar, el stock se puede guardar bastante tiempo.
1.2.6.
Preparacin de la muestra.
A un litro de leche sin pasteurizar agregar 500 mL de isobutanol, calentar a 38C y agitar durante 5 minutos con el fin de lograr la coagulacin de las casenas, si no ocurre esto agregar 4.5 de cido actico glacial y agitar hasta que dicha coagulacin se lleve a cabo.
Separar la capa superior de isobutanol y proceder conteniendo una capa de 0.5 mm de filtro agudo (celita), sobre un papel whatman N 2 en un embudo cnico el filtrado as obtenido ser utilizado como extracto crudo de la enzima.
pg. 58
Figura 18. Bomba de succin y matraz para filtrar.
1.2.7.
Procedimiento.
Preparar el tubo con la muestra cmo se nuestra en la cuadro y realizar la lectura en el fotoespectrometro a 403 nm. Cuadro 3. Preparacin de tubos para la muestra testigo. N de tubo mL de p-nitrofenilfosfato 4 4 4 Leche (mL)
1 2 3
1 1 1
pg. 59
2. Diagrama de proceso del queso Leche Acondicionamiento Estandarizacin Ajustes de acidez Pasteurizacin Ajuste de temperatura
Adicin de CaCl2 Cuajado Cortado Agitado Desuerado Moldeado
Prensado
Madurado Queso
pg. 60
3. Diagrama de proceso de la crema Leche Nata
Estandarizacin
Desacidificacin
Pasteurizacin
Maduracin
Refrigeracin
Crema
pg. 61
4. Diagrama de proceso del yogur Leche
Ajuste de slidos
Estandarizacin
Ajuste de acidez
Sobrepasteurizacin
Enfriamiento
Inoculacin
Incubacin
Enfriamiento
Maduracin
Adicin de fruta
Envasado
Conservacin
Yogur
pg. 62
5. Diagrama de proceso de pasteurizacin de la leche
Recepcin de la leche cruda
Filtracin
Enfriamiento
Estandarizacin
Pasteurizacin
Envasado
Leche pasteurizada
pg. 63

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AGRADECIMIENTOS

suficiente, sin ustedes no hubiera podido, los quiero mucho.

Ing. Jos Luis Gallardo Salazar, por su amor, su cario, nobleza

apoyarme en los momentos que ms necesite.

2.1.1. 2.1.2. 2.2.

2.2.1. 2.2.2. 2.2.3. 2.3.

2.3.1. 2.3.2. 2.3.3. 2.4.

Prueba de la fosfatasa. .......................................................................................... 14 El paquete lacto-Zyma II ................................................................................. 15

2.4.1. 2.5. 2.6. 2.7.

Pg. 2.7.1. III. IV. Tipos de pasteurizacin .................................................................................. 19

ANTECEDENTES ..................................................................................................... 21 OBJEIVOS..22

VIII. CONCLUSIONES ..................................................................................................... 34 IX. LITERATURA CONSULTADA .................................................................................. 35

PALABRAS CLAVES: fosfatasa alcalina, pasteurizacin, leche y productos lcteos.

KEYWORDS: Phosphatase alkaline, pasteurization,milk and dairy products.

II. REVISIN DE LITERATURA 2.1. Definicin de Leche

esquemticamente en la figura 1 (Alais, 2001; Badui 1990).

Figura 1: productos derivados de la leche (Fuente: Badui, 1999).

Fuente: Claveran, 1989.

rpidamente a la temperatura de envasado (SECOFI, 2002).

2.3.2. Fosfatasa alcalina.

la activan y los iones

2.4.1. El paquete lacto-Zyma II

2.7.1. Tipos de pasteurizacin

3. Ultra Pasteurizacin UHT

(Ultra High Temperature): La ultra pasteurizacin,

METODOLOGA 6.1. Ubicacin del trabajo

Los materiales que se utilizaron se puntualizan en el manual.

6.4. Mtodos aplicados

Diferentes concentraciones del reactivo Lacto-Zyma II

Figura 3: Grfica de curva patrn fenol.

Cuadro 7. Concentracin de Tecnolgica Lechera. Tubos 1 2 3 Testigo

0.346 0.335 0.375 0.168

Final 0.178 0.167 0.207

por lo tanto ambos productos se mantienen dentro de lo

0.207 0.21 0.206 0.189

Final 0.018 0.021 0.017

Fuente: Elaboracin propia

0.222 0.215 0.212 0.198

Fuente: Elaboracin propia.

Cuadro 10. Concentracin en Lechera. Tubos 1 2 3 Testigo

0.145 0.142 0.144 0.131

Final 0.014 0.011 0.013

Fuente: Elaboracin propia

Cuadro 11. Concentracin en

de yogur de la marca comercial LALA.

Fuente: Elaboracin propia.

que establece la norma.

Cuadro 12. Concentracin en

de crema de la Unidad Tecnolgica Lechera.

Fuente: Elaboracin propia.

0.289 0.3 0.290 0.277

Final 0.012 0.023 0.013

Fosfatasa residual con el Mtodo de Aschaffenburg y Mullen

Figura 4. Curva patrn de p-nitrofenol.

Comprobar la utilizacin de los mtodos

Fuente: Elaboracin propia.

http://200.77.231.100/work/normas/noms/2010/243ssa12010.pdf (15/08/2012). NOM-181-SCFI-2010, Yogurt-Denominacin, especificaciones fisicoqumicas

La prueba de la fosfatasa alcalina se aplica como un pasteurizacin

en la leche, queso y otros productos lcteos. Por consiguiente si se

Determinacin de fosfatasa segn la NOM-243-SSA1-2010.

Figura 1. Preparacin de la solucin reguladora de hidrxido de bario-borato.

Figura 2. Dilucin de la solucin reguladora de hidrxido de bario-borato.

Figura 3. Solucin precipitante para protenas zinc-cobre.