LABORATORIO BIOQUMICA N4

REPORTE DE ENZIMAS Laboratorio Bioqumica N4

PROFESORAS: CAROLINA LAGOS VALENTINA MUOZ

INTEGRANTES:

ESTEVES ZIGA KAREN PALMA CIFUENTES MARCO SILVA ALFREDO

FECHA DE ENTREGA : 03/06/2013

PARTE 1
Objetivo: Determinar el pH ptimo de la enzima fosfatasa cida de aorta de bovino. Siguiendo los pasos indicados en la gua de laboratorio y lo que se indica en la tabla 1, Ud. Podr determinar el pH ptimo donde la enzima presenta la mayor actividad enzimtica. Tabla 1. Protocolo para la preparacin de soluciones con distintos valores de pH.

Rotule los tubos de ensayo segn corresponda y proceda a incubar a 37C por el tiempo que le indiquen los profesores de laboratorio. Detenga la reaccin y mida absorbancia como lo indica la gua de laboratorio. Para cada tubo debe agregar la enzima al final, luego de mezclar todos los reactivos. Explique el porqu de este paso . Se debe agregar la enzima al final para crear el producto a partir de todos los componentes, ya que si se agrega al principio, no hay mezcla de componentes y se produce el producto inmediato.

Luego de la preparacin de los distintos tubos con diferentes valores de pH proceda a determinar la absorbancia para cada uno de ellos como se lo indicar su profesor de laboratorio y anote este valor en la tabla 2. Para ello Ud. debe saber que la concentracin de producto formado por una enzima se calcula con la frmula: C= ABS/ L. Donde =17500 M-1 cm-1, L= 1 cm. Recuerde que en esta actividad prctica la enzima fosfatasa cida forma el producto llamado p-nitrofenol. Y la velocidad de reaccin de una enzima se calcula con la frmula: velocidad = [p-nitrifenol] / t. Donde t es el tiempo de incubacin.

30 minutos

Determinacin de pH ptimo

Tabla 2. Valores de absorbancia, concentracin de producto formado y velocidad de reaccin de la enzima fosfatasa cida de bovino.

ABSORBANCIA(A) TUBO

ABSORBANCIA CORREGIDA

(ABS muestra.-ABS blanco) 0 0.013 0.063 0.207 0.252 0.284 ----0.05 0.194 0.239 0.271

CONCENTRACI N en M

CONCENTRACIN en mM

VELOCIDAD DE REACCIN

Blanco Control 1 2 3 4

-------2.8x10-6 1.10x10-5 1.36x10-5 1.5x10-5

----------2.8x10-3 1.108x10-2 1.36x10-2 1.5x10-2

----------9.3x10-5 3.6x10-4 4.5x10-4 5.1x10-4

Frmulas a considerar para la tabla anterior: Absorbancia corregida : Absorbancia- Absorbancia del blanco Concentracin : Velocidad de reaccin: *Coeficiente de extincin molar(): 17500 *Tiempo= 30 minutos

Tabla 3.Velocidad de reaccin enzimtica a diferentes pH pH 3.5 4.4 5.6 6.2 Velocidad de reaccin 0.000093 0.00036 0.00045 0.00051

A continuacin se muestra el grfico que indica la velocidad de reaccin de la enzima dependiendo del pH que se est estudiando.(Grfico 1)

Efecto pH Velocidad de reaccin

0.0006 0.0005 0.0004 0.0003 0.0002 0.0001 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Series1

pH
Grfica 1. Grfico velocidad enzimtica versus pH

II. Responda y Discuta las siguientes preguntas. a) Mencione sustrato(s), enzima, producto(s) que participan en la reaccin estudiada. Sustrato (s) Como sustrato se utilizar p-nitrofenilfosfato, este al hidrolizarse genera paranitrofenol, el cual en estado de p-nitrofenolato (pH alcalino), presenta un color amarillo pudiendo cuantificarse por espectrofotometra. Enzima Aorta de bovino de esta se extrae una fosfomonoesterasa no especfica cuyo pH ptimo est en el rango cido (fosfatasa cida). Productos p-nitrofenol, fosfata cida, de coloracin amarilla.

b) Explique qu tipo de reaccin lleva a cabo esta enzima . En la reaccin, se unir el grupo fosfato a un grupo OH de un residuo de serina del sitio activo de la fosfomonoesterasa, y el intermediario se hidroliza, generando una enzima c) Cmo es la variacin de la velocidad de reaccin en funcin del pH? . A medida que el PH aumenta, la velocidad baja.

FUNDAMENTO: La mayora de las enzimas logran su actividad enzimtica en base a pH ptimos, por lo tanto a valores superiores o inferiores del pH ptimo, la actividad enzimtica puede disminuir, dado que algunas cadenas laterales de aminocidos pueden actuar como cidos o bases dbiles que desarrollan funciones crticas en el sitio activo de la enzima y que dependen del mantenimiento de un cierto estado de ionizacin, mientras que en las otras zonas de las protenas algunas cadenas laterales ionizadas pueden jugar un papel esencial en las interacciones que mantienen la estructura de la protena (enzima) . (Grajales Muiz, y Ofelia.2005) d) A qu se debe que el factor pH altere la actividad cataltica de esta enzima? Explique . El factor pH no afecta directamente la actividad enzimtica, sino que modifica la concentracin de protones, y estos alteran la estructura de la enzima y el sustrato. Cada enzima trabaja a un pH determinado, por ende, al alejarla del pH ptimo, sta va perdiendo su funcionalidad hasta desnaturarse. FUNDAMENTO: La enzima fosfatasa atacan uniones esteres, (quitan una molecula de monofosfato). La actividad cataltica est relacionada con el estado ionico del lugar activo. Las variaciones de la concentracin de ion de hidrogeno pueden afectar a la ionizacin de los grupos de lugar activo.

Un cambio brusco de pH pueden alterar el carcter ionico de los grupos amino y carboxilo en la superficie proteica, afectando asi las propiedades catalticas de la enzima. A pH alto o bajo se produce una desnaturalizacin de la enzima. (Grajales Muiz, y Ofelia.2005) Sin embargo, bajo condiciones de pH que no se desnaturalizan a la enzima, cuando se traza una grfica de la velocidad inicial de la reaccin (o en algunos casos la Vmx), con el pH con frecuencia se obtiene una curva en forma de campana y /o una curva con informacin que puede ayudar a delinear el mecanismo. El pH en el punto de actividad mxima, se denomina el pH ptimo de la enzima. La intensidad mxima de la actividad de la enzima, ocurre en el pH ptimo, con rpida disminucin de la actividad a cada lado de este valor de pH.

PARTE 2 I. Efecto de la concentracin de sustrato sobre la velocidad de reaccin. Objetivo: Determinar las constantes cinticas Vmax y Km. Tabla 4. Protocolo para la preparacin de soluciones con distinta concentracin de sustrato.

Rotule los tubos de ensayo segn corresponda y proceda a incubar por el tiempo que le indiquen los profesores de laboratorio. Haga el clculo de la concentracin de sustrato para los tubos 1, 2, 3 y 4. Detenga la reaccin y mida absorbancia como lo indica la gua de laboratorio. Proceda a determinar la absorbancia de los cuatro tubos anotando estos datos en la tabla 5. Realice los clculos requeridos para completar la tabla 5 y verifique estos datos con los profesores.

Tabla 5. Determinacin de las concentraciones de producto y velocidad de reaccin. Debe usar las mismas frmulas empleadas en la Tabla 2
Concentracin del sustrato (S) Absorbancia (A) Concentracin mM Velocidad Reaccin ( mM/min) Velocidad reaccin (M/min) -1 5.71x10 1/(S) -1 (mMxmin ) 1/(V) (mM/min )

2,5 5 7,5 10

0,300 0.357 0.408 0.508

1.71x10-2 2.0x10-2 2.3x10-2 2.9x10-2

5.7x10-4 6.6x10-4 7.7x10-4 9.6x10-4

0,4 0,2 0,13 0,1

0,083333333 0,166666667 0,25 0,333333333

6.8x10-1 7.6x10-1 9.6x10-1

Clculo de concentraciones de sustrato en cada tubo

Para el clculo de las concentraciones de sustrato se consider la siguiente frmula:

C1*V1=C2*V2

Tubo 1 30mM*0,5mL= XmM* 6mL X = 2,5mM Tubo 2 30mM*1mL= XmM* 6mL X = 5mM Tubo 3 30mM*1,5mL= XmM* 6mL X = 7,5mM Tubo 4 30mM*2mL= XmM* 6mL X = 10Mm Tabla 6.Datos para la construccin de la grfica de Michaelis-Menten

Concentracin del sustrato(S) 2,5 5 7,5 10

Velocidad de reaccin(mM/min) *V=(S)/30minutos 0,083333333 0,166666667 0,25 0,333333333

*Concentracin stock 30Mm

A continuacin se muestra el grfico que indica la relacin entre la concentracin del sustrato con la velocidad de reaccin de la enzima.

Michaelis-Menten
0.35 0.3 0.25 0.2 0.15 0.1 0.05 0 0 5 10 15 CONCENTRACIN DE SUSTRATO(mM) VELOCIDAD DE REACCIN(mM/min)

Grfico 2. Grfico de Michaelis-Menten para la dependencia de la velocidad respecto de la concentracin de sustrato en la muestra Con los datos de la tabla 5 se procede a realizar la segunda grafica que relaciona los dobles recprocos 1/velocidad v/s 1/concentracin de sustrato (mg/mL) (Grfica de Lineaweaber-Burk) Determinacin de Constantes cinticas Para una mejor extrapolacin de datos y calcular la pendiente, se tom en cuenta los inversos de la concentracin de sustrato y de velocidad de reaccin para cada tubo, para posteriormente linealizar el comportamiento Michaelis-Menten . Tabla 7.Datos para la construccin del grfico de Lineweaver-Burk 1/(S) (1/mM) 0,4 0,2 0,13 0,1 1/(V) (mM/Min) 12 5,99999999 4 3

A continuacin se muestra el grfico que indica la relacin entre la concentracin de sustrato y la velocidad de reaccin de la enzima para lograr hacer una buena extrapolacin de los datos.

Linewear-Burk
14 12 1/V(mM/Min) 10 8 6 4 2 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 1/S(1/mM-1)

y = 29.858x + 0.0544 R = 0.9999

Series1 Linear (Series1)

Grfico 3.Grfico de Lineweaver-Burk Frmulas a considerar:

Pendiente:

Intercepto:

Clculos para determinacin de las constantes:

0,0544=

29,858=

Vmax= 1.838 mM/min

Km = 5.48x102 mM

DISCUSIN: Responda y Discuta las siguientes preguntas. a) Cmo es la variacin de la velocidad de reaccin al modificar la concentracin de sustrato? Recuerde que la concentracin de enzima se mantiene constante . La velocidad de una reaccin catalizada por una enzima se incrementa al aumentar la cantidad de sustrato hasta un punto en el cual ya no hay incremento. An con la adicin de sustrato, en esta fase el sustrato ha saturado los sitios activos de enzima y se ha logrado la velocidad mxima de la reaccin, la cual depende de la afinidad de la enzima y el sustrato correspondiente.(Donald Voet,Judith G. Voe.2006)

b) Defina la ecuacin de la grfica hiperblica (Grfica 2) y ecuacin de los dobles recprocos (Grfica 3). La ecuacin de Michaelis-Menten describe como vara la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas de acuerdo a la concentracin de sustrato. Michaelis Menten , dedujeron esta ecuacin a partir de su hiptesis bsica de que el paso limitante de velocidad en las reacciones enzimticas es la descomposicin del complejo enzima sustrato para formar el producto y enzima libre, la ecuacin es: V0= V mx [S] Km + [S] La ecuacin de la velocidad de una reaccin catalizada enzimticamente con un [S]. Es una definicin de la relacin cuantitativa entre la V0, Vmx y [S], todos ellos relacionados a travs de la constante de Michaelis. (Fornaguera yGomez .2008). El grfico de Lineweaver-Burke, tambin se denomina de dobles recprocos, el inverso de la velocidad (1/v0) ,contra el inverso de la concentracin de substrato (1/[S]), se obtiene una lnea recta, se utiliza para calcular la Km y la Vmax as como para determinar el mecanismo de accin de los diversos tipos de inhibidores(Castillo Rodriguez.2005) La ecuacin que describe a la grfca de Lineweaver-Burke es:

Describe una recta en donde el intercepto con el eje de las abscisas es igual a 1/Km y el intercepto con el eje de las ordenadas es igual a 1/ Vmax.

c) Defina los parmetros cinticos V max y Km. Interprete V mx: Para cuantificar los parmetros caractersticos de cada enzima con comportamiento de Michaelis Menten se realiza el estudio del efecto de la concentracin de sustrato frente a la velocidad de la reaccin, donde se obtiene una curva, en la cual en un principio se observa que al aumentar la [S], aumenta la velocidad de reaccin, hasta que llega a un punto en que aunque se aumente la concentracin de sustrato [S], la velocidad ya no aumenta , si no que se mantiene constante, est es la Vmx y se alcanza cuando la enzima se satura con sustrato Km Es la concentracin inicial de sustrato a la mitad de la velocidad mxima o media saturacin de enzima con sustrato. Los valores de Km tambin pueden usarse para evaluar la especificidad de accin de determinada enzima hacia los sustratos similares. Km es un parmetro de actividad enzimtica, Km es inversamente proporcional con la actividad de la enzima, si el valor de Km es grande la actividad de la enzima es baja y si el valor Km es bajo la actividad enzimtica ser alta. En conclusin se puede decir que la velocidad de reaccin enzimtica puede describirse si se conoce la Km y la V max de la enzima que acelera dicha reaccin. Si la Km es baja ,significa que la enzima requiere poco sustrato para empezar su funcin y por lo tanto ,la velocidad de la reaccin es rpida ;por otra parte ,si la Km es alta ,indica que la enzima requiere mucho sustrato para iniciar la funcin y entonces la velocidad de la reaccin es ms tardada. En relacin con la Vmax ,si es alta en una enzima ,ovbio es que la velocidad de reaccin es rpida y viceversa d) Discuta el valor de Km y Vmax obtenidos por Ud. y compare con los valores tericos de la enzima La mayor concentracin de producto se obtuvo del tubo 4 (10mM de sustrato) de la tabla 5 de los resultados, con una absorbancia de0.508, por lo cual se determina que a mayor concentracin de sustrato, mayor velocidad de reaccin, que fue de 9.6x10-42M/min. Como se muestra en los grficos anteriores (constantes cinticas), para el grfico Michaleis Menten se observ una lnea de tendencia ,ello quiere decir que su cintica enzimtica no es buena, pero para lograr una curva ms representativa y poder observar una cintica mejor ,es posible visualizarlo mediante el grfico de Lineaweaver-Burk la cual nos indica que con pocos puntos se logra una mejor recta.

BIBLIOGRAFIAS

Grajales Muiz, Ofelia. Apuntes de bioquimica vegetal. Bases para su aplicacion fisiolgica. Universidad Nacional Autnoma de Mxico.2005. Donald Voet,Judith G. Voe Bioquimica. Editorial Mdica Panamericana S.A .Buenos Aires.Argentina.2006 Fornaguera Jaime y Gmez Georgina. Bioqumica: la Ciencia de la Vida ,Espaa. 2008

Castillo Rodriguez Francisco ; Biotecnologa Ambiental .Editorial Tbar.Madrid.2005