Anda di halaman 1dari 10

Produksi Protein Sel Tunggal Dari Molasses Kedelai Menggunakan Candida Tropicalis

Abstrak Sebuah bioproses efektif untuk menghasilkan protein sel tunggal (PST) dari molase kedelai menggunakan Candida tropicalis CGMCC 2,587 dikembangkan. Dalam erlenmeyer, media optimal adalah konsentrasi 7 g/100 mL molase kedelai, 0,2 g/L ekstrak ragi dan 0,03 g/L CaCl2, sedangkan kondisi lingkungan yang optimal adalah pH 5,5 dan suhu 30C. Dalam kondisi optimal, berat kering sel maksimum dan total protein mencapai 10,83 dan 6,11 g/L dalam 10-L bioreaktor. PST mengandung 56,42% protein kasar dan 5,28% asam nukleat. PST kaya akan asam amino esensial. Secara keseluruhan, 80.3, 98.2, 56.1, dan 46.9% dari total gula, sukrosa, rafinosa dan stachyose, masing-masing, yang dipergunakan dalam molase kedelai. Hasil ini menunjukkan bahwa C. tropicalis CGMCC 2,587 bisa diterapkan secara efektif untuk menghasilkan PST menggunakan molase kedelai sebagai substrat murah. Kata kunci Protein sel tunggal. Molase kedelai. Candida tropicalis. Substrat murah

PENGANTAR Protein sel tunggal (PST) didefinisikan sebagai jenis sumber protein dari kultur mikroba murni atau campuran termasuk ganggang, ragi, jamur atau bakteri untuk memberi makan hewan dan bahkan manusia (Rajoka et al. 2004). Dengan terus meningkatnya populasi dunia, PST telah digunakan sebagai pengganti protein penting untuk suplemen protein konvensional, terutama dalam industri pakan (Chanda dan Chakrabarti 1996). Produksi PST telah dikembangkan karena mikroba dapat digunakan untuk memfermentasi berbagai limbah agro-industri. Penggunaan kembali bahan limbah ini dapat mengurangi biaya produksi PST secara signifikan (Ravindra 2000).

Dalam beberapa tahun terakhir, beberapa penelitian tentang produksi PST dari limbah agro-industri seperti limbah pengalengan nanas (Nigam 1998), deproteinisasi konsentrat dadih/whey (Schultz et al. 2006), polishing rice/penyosohan beras (Rajoka et al. 2004) dan hidrolisat hemicellulosic ampas tebu (Nigam, 2000) telah dilaporkan. Di antara mikroorganisme yang digunakan untuk produksi PST, ragi, khususnya Saccharomyces spp. dan Candida spp. umumnya dianggap aman (GRAS) dan telah diterapkan secara luas untuk penggunaan kembali berbagai bahan limbah. Selain itu, ragi lebih nyaman digunakan untuk bahan baku murah, dapat dipanen lebih mudah daripada mikroorganisme

lainnya, dan mengandung jumlah asam nukleat per sel yang lebih rendah dari/dibandingkan bakteri (Bekatorou et al. 2006). Molase Kedelai adalah produk sampingan yang dihasilkan dalam proses produksi konsentrat protein kedelai dengan pengendapan protein kedelai menggunakan larutan etanol. Dengan meningkatnya permintaan untuk protein nabati berkualitas tinggi dalam pakan dan industri makanan, produksi protein konsentrat kedelai telah meningkat lebih dari 10% per tahun selama beberapa tahun terakhir (Deak dan Johnson 2006). Akibatnya, sejumlah besar molase kedelai dihasilkan setiap tahunnya. Molase kedelai biasanya mengandung lebih dari 50% padatan terlarut pada dasarnya terdiri dari sekitar 60% karbohidrat, 10% senyawa nitrogen, 20% lipid dan 10% mineral (Kinney 2003). Saat ini, molase kedelai diterapkan terutama untuk industri pakan sebagai bahan pakan dalam pakan campuran. Selain itu, molase kedelai sebagai produk sampingan murah adalah bahan baku yang berpotensi fermentasi karena kandungan gula difermentasi tinggi. Dalam beberapa tahun terakhir, beberapa studi telah melaporkan penggunaan molase kedelai sebagai media fermentasi untuk mengurangi biaya beberapa produk seperti sophorolipids oleh Candida bombicola (Solaiman et al. 2007), bio-ethanol oleh Saccharomyces cerevisiae (Siqueira et al. 2008), hydroxyalkanoates oleh Pseudomonas corrugata (Solaiman et

al. 2006) dan butanol oleh Clostridium beijerinckii BA101 (Qureshi et al. 2001). Sampai saat ini, belum ada laporan tentang penggunaan molase kedelai sebagai substrat fermentasi untuk produksi PST. Dalam tulisan ini, kami menjelaskan produksi PST oleh ragi menggunakan molase kedelai sebagai potensi substrat murah. BAHAN DAN METODE Organisme dan Kondisi Kultur Geotrichum candidum CGMCC 2,498, Candida tropicalis CGMCC 2,587 dan Candida utilis CGMCC 2.120 diperoleh dari Pusat koleksi Kultur Mikrobiologi Umum China. Geotrichum candidum CGMCC 2,1035 dan C. utilis CGMCC 2,1180 disediakan oleh Institute of Microbiology di Provinsi Heilongjiang, China. Candida utilis A1, Saccharomyces ellipsoideus G1 dan S. cerevisiae A1 diperoleh dari Food College of Heilongjiang Bayi Universitas Pertanian, Cina. Semua strain ini disimpan dalam media agar yeast pepton dekstrosa (YPD) yang mengandung 1,0% ekstrak ragi, 2,0% glukosa, 2,0% polipepton dan 1,5% agar dan disimpan pada suhu 4C. Sebelum digunakan, kultur ditumbuhkan dalam kaldu YPD pada 30C dengan dishaking konstan (100 rpm) selama 18 jam. Molase Kedelai Molase kedelai disediakan oleh Heilongjiang Shuanghe Songnen Soybean Bioengineering Co, (Daqing, Cina). Konsentrasi masing-masing padatan terlarut dan total gula molase

kedelai adalah 60,5% dan 34,5%. Gula utama dalam molase kedelai adalah sukrosa (21,7%), stachyose (10,3%) dan rafinosa (2,1%). Pemilihan ragi untuk produksi PST dari molase kedelai Untuk mengadaptasi mikroorganisme untuk produksi PST dari molase kedelai, ragi ditumbuhkan pada media agar molase kedelai dan kaldu molase kedelai. Awalnya, delapan strain ragi disaring untuk ditumbuhan pada medium agar molase kedelai. Kultur berturutan diencerkan sepuluh kali lipat dengan air steril dan cairan sampel (0,1 mL, 10-5 pengenceran, sekitar 103 CFU/mL) yang tersebar pada permukaan pelat agar molase kedelai (30 g berat basah molase kedelai per 100 mL medium). Setelah inkubasi pada 30oC selama 3-4 hari, jumlah sel yang layak (CFU/mL) diukur dan status pertumbuhan diamati. Strain yang dapat tumbuh lebih cepat dan membentuk koloni tebal pada pelat agar molase kedelai dipilih. Strain diperoleh dengan screening awal pada pelat agar molase kedelai yang dikultur dalam kaldu YPD pada 30oC dengan dishaker konstan (100 rpm) selama 18 jam. Kultur ini diinokulasi ke dalam kaldu molase kedelai (berat basah molase kedelai 10 g per 100 mL media) dan dibudidayakan dengan dishaker pada 160 rpm dan 30 C selama 24 jam. Selsel dipanen dengan sentrifugasi (4.000

rpm, 10 menit), dicuci tiga kali dengan menggunakan larutan garam steril, dan kemudian dikeringkan agar berat konstan pada 105C. Akhirnya, strain optimal ditentukan setelah menganalisis berat kering sel, kandungan protein dalam sel kering dan protein total. Tes fermentasi dalam termos segitiga Fermentasi Batch dilakukan dalam 10-L bioreaktor (GBJS-10, Zhenjiang Timur Biotech Peralatan dan Teknologi, Zhenjiang, China) yang berisi 4 L medium fermentasi pada kondisi optimal (berat basah 7 g molase kedelai per 100 mL media, 0,2 g/L yeast ekstrak, 0,02 g/L CaCl2). Konsentrasi biomassa pada awal fermentasi telah disesuaikan menjadi sekitar 1 108 CFU/mL. Kecepatan pengadukan dan laju aliran udara diatur masing-masing sebesar 200 rpm dan 3 L/menit,. Suhu dan pH dipertahankan pada 30 C dan 5,5. Berat kering sel, total protein dan gula total dianalisis dengan interval 3 jam setelah 30 jam fermentasi. Metode analisis Berat kering kultur sel dianalisis dengan sentrifugasi pada 4.000 rpm selama 15 menit, mencuci pelet tiga dengan air suling dan pengeringan pada 105 C untuk massa konstan. Kandungan protein dalam sel kering diukur dengan metode Kjeldahl nitrogen (Strickland dan Parsons 1972). Protein total (g/L) dinyatakan sebagai jumlah protein yang dihasilkan oleh C. tropicalis CGMCC 2,587 dalam 1 L media.

Sukrosa, rafinosa dan stachyose dianalisis menggunakan sistem HPLC PC-2025 (SSI, LabAlliance, http://www.laballiance.com) yang terdiri dari pompa Seri III (LabAlliance), kolom Thermo NH3 (2504,6 mm, 5 m) dan detektor RID-2001 (LabAlliance). Fase gerak adalah 75% larutan asetonitril dan laju alir adalah 1,0 mL/menit. Standar adalah 2,5 mg/mL sukrosa (Sigma, St Louis, MO), rafinosa (Sigma) dan stachyose (Sigma). Konsentrasi gula individu dihitung dengan kurva standar yang berkaitan konsentrasi ke daerah puncak. Gula total diukur dengan metode reagen anthrone (Zill 1956). Komposisi asam amino dari PST dianalisis menggunakan otomatis asam amino analyzer (Hitachi L-8800, TECHCOMP, Tokyo, Jepang) sesuai dengan metode yang dijelaskan oleh Tong et al. (2009). Kandungan asam nukleat dari PST diukur dengan tes kolorimetri seperti yang dijelaskan oleh Kochert (1978). Analisis statistik Setiap percobaan diulang tiga kali. Semua data dianalisis dengan menggunakan Microsoft Excel (versi 2003). Perbedaan signifikansi dianalisis dengan menggunakan SAS 8.1 (SAS Institute, Cary, NC).

HASIL Pemilihan ragi untuk produksi PST Awalnya, delapan strain disaring untuk pertumbuhan pada pelat molase kedelai agar. Di antara strain ini, G. candidum CGMCC 2,498, C. tropicalis CGMCC 2,587, C. utilis CGMCC 2.120, G. candidum CGMCC 2,1035 dan C. utilis CGMCC 2,1180 tumbuh relatif lebih cepat dan membentuk koloni yang lebih besar dan lebih tebal pada molase kedelai agar pelat setelah 24 jam budidaya. Candida utilis A1, S. ellipsoideus G1 dan S. cerevisiae A1 tumbuh relatif lebih lambat dan membentuk koloni yang lebih kecil dan lebih jarang (data tidak ditampilkan). Oleh karena itu, lima jenis terdahulu dibudidayakan dalam molase kaldu kedelai untuk membandingkan potensinya untuk mendukung biomassa sel dan total protein yang dihasilkan. Di antara lima jenis strain ini, berat kering sel dan hasil total protein C. tropicalis CGMCC 2,587 adalah yang tertinggi, masing-masing pada 8,41 g/L dan 4,47 g/L (Tabel 1). Kandungan protein dalam sel kering dalam strain ini adalah 53,13%. Hasil ini menunjukkan bahwa C. tropicalis CGMCC 2.587 mampu tumbuh lebih cepat dalam kaldu molase kedelai dan mengubah zat yang ada dalam molase kedelai menjadi protein. Oleh karena

itu, C. tropicalis CGMCC 2,587 dipilih sebagai strain optimal untuk produksi PST dari molase kedelai. Pengaruh konsentrasi molase kedelai pada produksi PST Jumlah protein meningkat dari 2,61 menjadi 4,70 g/L, dan berat kering sel meningkat dari 5,43 menjadi 8,82 g/L ketika konsentrasi molase kedelai ditingkatkan dari 1 sampai 7 g/100 mL (Tabel 2). Tapi ketika konsentrasi molase kedelai dinaikkan lebih lanjut dari 7 sampai 11 g/100 ml, protein total dan berat kering sel yang menurun masing-masing menjadi 3,95 dan 7,44 g/L (Tabel 2). Hasil penelitian menunjukkan bahwa molase kedelai 7 g/100 mL adalah konsentrasi yang paling cocok untuk produksi PST oleh C. tropicalis CGMCC 2,587. Jumlah gula dalam medium menurun menjadi 4,92 g/L pada konsentrasi ini (data tidak ditampilkan).

CGMCC 2.587 dari pH awal di kisaran 4,0-6,5 dapat dilihat pada Tabel 3. Bila nilai pH awal medium diatur menjadi 5,5, total protein dan berat sel kering mencapai hasil maksimum 5.05 dan 8,96 g/L setelah 24 jam fermentasi (Tabel 3).

Pengaruh sumber suplemen nitrogen pada produksi PST Hasil pada Tabel 4 menunjukkan bahwa total protein meningkat dari 4,63 menjadi 5,24 g/L dan berat kering sel meningkat dari 8,73 menjadi 9,36 g/L ketika 0,5 g/L ekstrak ragi ditambahkan dalam medium molase kedelai, dan nitrogen anorganik (0,5 g/L natrium nitrat, amonium sulfat dan urea) tidak memiliki pengaruh memfasilitasi pada produksi PST (Tabel 4).

Pengaruh pH awal pada produksi PST Nilai pH dari proses fermentasi untuk memproduksi PST biasanya dalam kisaran pH 4,5-5,5 karena ragi dan jamur berfilamen menjadi acidophiles (Vicente et al. 1998). Efek pada produksi PST oleh C. tropicalis

Seperti ditunjukkan dalam Gambar. 1, total protein meningkat

dari 4,61 menjadi 5,34 g/L dan berat kering sel meningkat dari 8,68 menjadi 9,51 g/L, ketika medium molase kedelai dilengkapi dengan ekstrak 0,2 g/L yeast. Tapi ketika jumlah yang ditambahkan ekstrak ragi meningkat dari 0,2 menjadi 1,0 g/L, total protein dan berat kering sel tidak terlalu meningkat (P> 0,05) (Gambar 1). Karena biaya ekstrak ragi komersial relatif tinggi, jumlah yang paling cocok dari ekstrak ragi dianggap menjadi 0,2 g/L.

bahwa penambahan Ca2+ jelas mempengaruhi siklus sel ragi dan mungkin mengatur tingkat adenosin monofosfat siklik.

Efek Penambahan Garam Anorganik pada Produksi PST Seperti terlihat pada Tabel 5, total protein meningkat dari 4,58 menjadi 5,60 g/L dan berat kering sel meningkat dari 8,62 menjadi 9,95 g/L ketika CaCl2 (0,05 g/L) ditambahkan ke dalam medium molase kedelai, sedangkan penambahan NaCl, MgSO4.7H2O, K2HPO4 dan ZnSO4.7H2O (0,05 g/L) tidak memiliki efek penting (P> 0,05). Hasil ini menunjukkan bahwa CaCl2 dalam medium penting untuk produksi PST oleh C. tropicalis CGMCC 2.587. Hasil Iida et al. (1990) juga menunjukkan

Hasil yang disajikan pada Gambar. 2 menunjukkan bahwa total protein dan berat kering sel mencapai maksimal masing-masing 5,67 dan 10,06 g/L, ketika jumlah tambahan dari CaCl2 0,03 g/L, dan meningkat lebih dari 15% dibandingkan dengan medium yang tidak yang ditambahkan dengan CaCl2. Ketika jumlah CaCl2 ditambahkan ke medium lebih dari 0,03 g/L, total protein dan berat kering sel mulai berkurang. Oleh karena itu, suplemen garam anorganik yang cocok dalam medium fermentasi adalah 0,03 g/L CaCl2.

Pengaruh suhu pada produksi PST Suhu merupakan salah satu faktor utama yang dapat secara signifikan mempengaruhi pertumbuhan sel dan produksi metabolit dalam bioproses apapun. Kisaran suhu untuk produksi PST umumnya berada pada 25-35C (Ugalde dan Castrillo 2002). Efek pada produksi PST dari molase kedelai oleh C. tropicalis CGMCC 2.587 terhadap suhu fermentasi pada kisaran 21-36 C ditunjukkan pada Gambar. 3; hasil maksimal dari total protein dan berat kering sel diperoleh ketika suhu fermentasi diadakan pada 30 C. Oleh karena itu suhu fermentasi optimal untuk produksi PST dari media molase kedelai oleh C. tropicalis CGMCC 2,587 adalah 30 C.

sel dan protein total mencapai 10,83 dan 6.11 g/L setelah 30 jam fermentasi dalam 10-L bioreaktor (Gambar . 4). Kandungan protein dalam sel kering yang diproduksi oleh C. tropicalis CGMCC 2,587 adalah 56,42%.

Komposisi asam amino dan kandungan asam nukleat dalam PST Analisis komposisi asam amino menunjukkan bahwa protein yang dihasilkan oleh C. tropicalis CGMCC 2,587 dari molase kedelai mengandung kadar asam amino esensial tinggi untuk pakan ternak (Tabel 6). Di antara asam amino esensial dalam protein yang dihasilkan oleh C. tropicalis CGMCC 2,587, dengan pengecualian sistin dan isoleusin, konsentrasi lisin, treonin, valin, metionin, leusin dan fenilalanin yang lebih tinggi dibandingkan standar FAO (Tabel 6). Dengan pengecualian dari leusin, isoleusin dan valin, isi asam amino esensial dalam protein yang dihasilkan oleh C. tropicalis CGMCC 2,587 lebih tinggi daripada kedelai (Tabel 6).

Produksi PST dalam 10-L bioreaktor Dalam labu segitiga (Erlenmeyer), media yang optimal untuk produksi PST adalah 7 g/100 mL molase kedelai, 0,2 g ekstrak ragi dan 0,03 g CaCl2 ditambahkan per liter media (pH 5,5) pada 30 C. Dengan kondisi tersebut, dan kecepatan pengadukan (agitasi) 200 rpm dan tingkat aliran udara 3 L/menit, hasil maksimum berat kering

Secara umum, kandungan asam nukleat dari PST harus antara 1% dan 11 % (Rajoka et al. 2004). Dalam penelitian ini, kandungan asam nukleat dari produksi PST oleh C. tropicalis CGMCC 2.587 ditemukan sebesar 5,28%, yang secara signifikan lebih rendah dari nilai yang dilaporkan oleh Nigam (1998, 2000) dan Gao et al (2007). Konsumsi gula Gula utama yang dikonsumsi oleh C. tropicalis CGMCC 2,587 dianalisis dengan HPLC setelah 30 jam fermentasi dalam bioreaktor 10-L (Gambar 5). Akhirnya, 98,2% sukrosa, 56,1% dari rafinosa dan 46,9% dari stachyose hadir dalam media molase kedelai yang digunakan oleh C. tropicalis CGMCC 2,587. Setelah 30 jam fermentasi, 80,3% dari total gula molase kedelai yang dikonsumsi oleh C. tropicalis CGMCC 2,587, dan hanya 19,7% dari gula residu tetap dalam medium molase kedelai. DISKUSI Spesies Candida dapat tumbuh di berbagai produk sampingan dari industri makanan dan pertanian (Bekatorou et al. 2006). Beberapa penelitian telah melaporkan penggunaan ragi Candida untuk menghasilkan PST menggunakan berbagai produk samping dan limbah, seperti limbah manufaktur minyak salad (Zheng et al. 2005a), Selada air garam (Suntornsuk 2000), molase dan gula beet pulp ( Nigam dan Vogel 1991) dan hidrolisat jerami padi (Zheng et al. 2005b). Dari hasil yang ditunjukkan pada Tabel 1, kami juga menemukan bahwa ketiga strain

Candida yang digunakan memiliki kandungan protein yang lebih tinggi dalam sel kering daripada dua strain Geotrichum diuji ketika dibudidayakan di media molase kedelai. Telah lama diketahui bahwa pH awal media memiliki efek penting pada produksi PST (Ravindra 2000). PH proses fermentasi untuk memproduksi PST biasanya di kisaran 4,5-5,5 karena ragi dan jamur berfilamen umumnya acidophiles (Vicente et al 1998.); Hasil yang ditunjukkan pada Tabel 3 sesuai dengan peraturan ini. Ragi adalah organisme heterotrofik dan pertumbuhan mereka membutuhkan pasokan karbon organik dan sumber nitrogen. Hasil yang disajikan di sini juga menunjukkan bahwa penambahan ekstrak ragi untuk media molase kedelai bermanfaat bagi pertumbuhan strain ragi dan konversi protein dalam sel, meskipun molase kedelai sudah mengandung cukup protein. Solaiman et al. (2007) juga melaporkan bahwa suplementasi ekstrak ragi dan urea dapat meningkatkan produksi sophorolipids dari molase kedelai oleh C. bombicola ATCC 22214, dan bahwa penghilangan dua sumber nitrogen ini menurunkan hasil produk sekitar 30%. Iida et al. (1990) melaporkan bahwa penambahan Ca2+ jelas mempengaruhi siklus sel ragi, mungkin melalui pengaturan tingkat adenosin monofosfat siklik. Hasil dalam penelitian ini juga menunjukkan bahwa CaCl2 dalam medium penting bagi pertumbuhan C. tropicalis CGMCC 2,587 dan produksi PST.

Dalam kondisi optimal , hasil maksimum berat kering sel dan protein total mencapai 10,83 dan 6,11 g/L setelah 30 jam fermentasi dalam bioreaktor 10-L (Gambar 4). Kandungan protein dalam sel kering yang diproduksi oleh C. tropicalis CGMCC 2,587 adalah 56,41 % . Massa sel yang diperoleh dalam penelitian ini lebih tinggi dari yang dilaporkan oleh Nigam ( 1998) , Rajoka (2005) , dan Gao et al (2007) . Dalam penelitian ini , kandungan asam nukleat dari PST ( 5,28 % ) secara signifikan lebih rendah daripada yang dilaporkan oleh Nigam ( 1998) , Nigam ( 2000) dan Gao et al . ( 2007) . Protein yang dihasilkan oleh C. tropicalis CGMCC 2,587 mengandung semua asam amino esensial untuk hewan . Analisis komposisi asam amino dan kandungan asam nukleat menunjukkan bahwa C. tropicalis CGMCC 2,587 cocok untuk produksi PST berkualitas tinggi menggunakan molase kedelai sebagai substrat murah (ekonomis). Stachyose , rafinosa dan sukrosa merupakan gula utama yang terdapat dalam molase kedelai , dan semua memiliki ikatan -1,2 yang dapat dihidrolisis oleh -D-fructofuranoside fructohydrolase (EC 3.2.1.26). Hal ini diketahui bahwa ragi umumnya menghasilkan -D-fructofuranoside fructohydrolase , yang dapat membelah sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa (Za dan Grisch 1995). Tidak seperti sukrosa, stachyose dan raffinose mengandung ikatan -1,6 yang dapat dihidrolisis oleh -galaktosidase (EC 3.2.1.22) - yang mungkin tidak

diproduksi oleh Saccharomyces cerevisiae - menghasilkan konsentrasi tinggi gula sisa (48 % dari gula molase kedelai) setelah fermentasi etanol (Siqueira et al . 2008) . Hasil ini menunjukkan bahwa C. tropicalis CGMCC 2,587 mungkin menghasilkan tidak hanya -D fructofuranoside fructohydrolase tetapi juga galaktosidase, dan karena itu menunjukkan potensi yang baik untuk menggunakan molase kedelai dan menghasilkan PST dengan biaya rendah. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa molase kedelai memiliki potensi sebagai substrat fermentasi murah untuk produksi PST. Strain Candida tropicalis CGMCC 2,587 memiliki kemampuan kuat untuk memanfaatkan karbohidrat yang ada dalam molase kedelai. Produksi PST oleh C. tropicalis CGMCC 2,587 menggunakan molase kedelai sebagai substrat memiliki kualitas protein dan kandungan protein tinggi, kandungan asam nukleat rendah dan kaya akan asam amino esensial untuk hewan.