LAPORAN GENETIKA MOLEKULER ELEKTROFORESIS DAN KUANTIFIKASI DNA Hari/Tanggal: Jumat, 15 Juni 2012

Disusun Oleh: 1. 2. 3. 4. 5. Ira Nailas Selva Rosyta Dewi Nur Apriana Dias Rizka Darisa Indira Faya N (081014097) (081014099) (081014106) (081014111) (081014114)

Dosen Pembimbing M. Hilman F.A, Ssi.,M.Si PROGRAM STUDI BIOLOGI DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS SAINS DAN TEKNOLOGI UNIVERSITAS AIRLANGGA

I. TUJUAN Mengajarkan dan melatih kepada mahasiswa untuk dapat ampifikasi dan elektroforesis DNA darah dan tumbuhan.

II. DASAR TEORI Elektroforesis berasal dari bahasa Yunani yang mempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik. Elektroforesis adalah suatu cara analisis kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul (Campbell dkk. 2002: 396--398). Elektroforesis adalah suatu teknik pemisahan molekul seluler berdasarkan atas ukurannya, dengan menggunakan medan listrik yang dialirkan pada suatu medium yang mengandung sampel yang akan dipisahkan. Teknik ini dapat digunakan dengan memanfatkan muatan listrik yang ada pada makro molekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan negatif dilewatkan melalui suatu medium misalnya gel agarose, kemudian dialiri arus listrik dari satu kutub ke kutub yang berlawanan muatannya, maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada nisbah (rasio) muatan terhadap massanya, serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Teknik elektroforesis dapat digunakan untuk analisis DNA, RNA, maupun protein (Yuwono, 2005). Elektroforesis gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular. Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis, namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometri massa, PCR, kloning, sekuensing DNA, atau immunoblotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut. Elektroforesis gel merupakan suatu teknik analisis penting dan sangat sering dipakai dalam bidang biokimia dan biologi molekular. Secara prinsip, teknik ini mirip dengan kromatografi: memisahkan campuran bahanbahan berdasarkan perbedaan sifatnya. Dalam elektroforesis gel, pemisahan dilakukan terhadap

campuran bahan dengan muatan listrik yang berbeda-beda (menggunakan prinsip dalam elektroforesis) (Finkelstein, 2007). DNA adalah molekul utama yang mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam organisme. DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa, basa nitrogen, dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida. DNA terdapat di dalam setiap sel makhluk hidup yang sangat berperan penting sebagai pembawa informasi hereditas yang menentukan stuktur protein dan proses metabolisme lain. (Sambrook & Russell 2001: 52--53).

III. ALAT dan BAHAN Bahan : Pewarna ethidium bromide Agarosa Buffer TAE Loading dye Alat : Erlenmeyer Seperangkat alat elektroforesis Glove UV transluminator

IV. PROSEDUR KERJA 1. Pembuatan Gek agarosa a. Timbang 0,5 gr Agarosa b. Larutkan dalam 50 mL x 1 x Buffer TAE ke Erlenmeyer lalu larutkan c. Panaskan Erlenmeyer hingga mendidih dan larutan jernih. d. Dinginkan larutan agarosa (500C)x 2 L Larutan ethidium bromide, campur hingga homogen. e. Siapkan tray, lalu tutup denganisolator pada ujung dan tuangkan larutan agarosa dalam tray yang telah dipasang well-forming combs. f. Tunggu sampai gel mengeras ( 25oC) lepas comb secara perlahan dan gel agarosa siap digunakan. 2. Running Elektroforesis a. Letakkan tray berisi gel agarosa dalam tanki elektroforesis dengan posisi gel terdapat well pada kutub (-) DNA akan menuju kutub (+).

b. Tuang larutan 1x buffer TAE ke dalam tank elektroforesis sampai permukaan gel terendam. c. Ambil sampel 10 L isolasi DNA dan letakkan di atas parafilm. Lalu campur dengan 2L loading dye, lalu resuspen hingga homogeny. d. Ambil 4-8 L larutan, dan masukkan dalam well pada gel agarosa. e. Tutup tank elektroforesis dan hubungkan ke arud listrik (100-120 V) f. Tunggu selama 1 jam (running elektroforesis) sampai terlihat DNA migrasi g. Matikan arus listrik dan ambil tray dengan glove setelah elektroforesis selesai. h. Meletakkan tray pada UV transluminator (tampak pita DNA ) dan siapkan.

V. HASIL PENGAMATAN No 1. Gambar Keterangan Hasil dari DNA yang telah di UV. DNA sebelah kanan merupakan gelombang 1 , dimana sampel dari

tumbuhan tidak ada DNAnya, sedangkan dari sampel darah manusia DNA-nya ada DNA semua. Sedangkan kiri

sebelah

merupakan gelombang 2, dimana tumbuhan sampel ada dari semua

bahkan ada RNA-nya dalam jumlah yang cukup banyak , sedangkan manusia semua sebanyak dari sampel ada tidak DNA

DNA-nya namun dengan

milik gelombang 1.

2.

Ini adalah sampel DNA dari gelombang 2, dimana

sampel DNA dari tumbuhan ada semua bahkan ada RNA dalam jumlah yang cukup banyak , sedangkan DNA dari sampel darah manusia DNA ada semua tetapi

sedikit sekali diketahui dari pita DNA-nya yang sangat tipis.

3.

Ini adalah sampel DNA dari gelombang 1, dimana

sampel DNA dari tumbuhan ada yang tidak DNA ada, dari

sedangkan

sampel darah manusia DNA ada semua diketahui dari pita DNA yang tebal.

VI. PEMBAHASAN DNA (Deoxyribonucleic Acid) merupakan senyawa biomolekuler pembawa sifat genetik yang tersusun dari asam nukleat dan pengatur seluruh perkembangan biologis makhluk hidup. DNA hadir dalam bentuk double helix (pilinan ganda) berupa dua pita yang saling berpasangan. Satu pita DNA tersusun dari banyak nukleotida. Nukleotida merupakan monomer dari DNA. Nukleotida terdiri dari gugus gula, basa nitrogen dan fosfat (Irawan,2008). Komponen fosfat yang melekat pada atom C5' dari gula memiliki dua atom O yang belum berpasangan. Keadaan demikian membuat nukleotida bermuatan negatif sebagaimana gambar di bawah ini:

Nukleotida-nukleotida tersebut akan saling berikatan dengan ikatan fosfodiester membentuk suatu pita DNA. Sekalipun pita DNA yang panjang tidak mengalami kendala dalam ikatannya namun pita DNA tersebut akan selalu bermuatan negatif. Pada tahun 1947, sebelum ditemukannya struktur molekul DNA, seorang ahli biokimia bernama Erwin Chargaff menganalisis komposisi basa DNA sejumlah organisme yang berbeda. Hasil analisisnya adalah tiap spesies organisme memiliki komposisi DNA yang berbeda-beda. Banyaknya keempat basa nitrogen pada tiap spesies tidak sama, tetapi memiliki perbandingan yang khas. Artinya, tiap spesies memiliki jumlah basa yang khas. Dalam DNA setiap spesies yang ditelitinya, Chargaff mengemukakan bahwa jumlah adenin hampir sama dengan jumlah timin dan jumlah sitosin hampir sama dengan jumlah guanin. Selain itu, urutan basa dan panjang DNA pada tiap spesies berbeda. Dengan 4 macam basa dan DNA yang panjang, akan terbentuk berbagai kemungkinan urutan basa. Karena gen tersusun dari urutan basa tertentu, maka jumlah gen pada DNA juga sangat banyak kemungkinannya. Jadi, hanya dengan 4 macam basa akan terbentuk banyak gen yang menentukan sifat individu. Isolasi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA murni dari pengotor-pengotor yang terdapat pada sel, misalnya organel-organel sel lainnya. Sedangkan proses elektroforesis merupakan suatu migrasi partikel melalui suatu media di bawah pengaruh medan listrik. Pada

praktikum kali ini menggunakan gel agarose sebagai medianya. pembuatan gel agarose dilarutkan dalam buffer TAE hingga larut. Penambahan larutan buffer pada pembuatan gel agarose berfungsi untuk mendukung proses elektroforesis Kebanyakan gel agarosa dibuat antara 0,7% dan 2%. Sebuah gel 0,7% akan menunjukkan pemisahan yang baik (resolusi) fragmen DNA besar (kb 5-10) dan gel 2% akan menunjukkan resolusi yang baik untuk fragmen kecil (0,2-1 kb). Gel dalam persentase rendah bersifat sangat lemah dan bisa pecah ketika diangkat. Gel dalam persentase yang tinggi sering rapuh dan tidak larut secara merata. Pada praktikum kali ini menggunakan prosentase 1%. Tujuan dari penggunaan gel ini untuk melihat DNA. DNA divisualisasikan pada gel dengan penambahan etidium bromida pada saat gel agarose yang telah didihkan mengalami penurunan suhu atau diberikan pada suhu berkisar 50oC bertujuan untuk meminimalkan penguapan etidium bromida. Etidium bromida sangat berbahaya atau bersifat mutagenik. Kelebihannya, Etidium bromida dapat mengikat kuat DNA dengan terinterkalasi antara dasar dan neon yang berarti bahwa ia menyerap sinar UV tidak terlihat dan memancarkan energi sebagai cahaya oranye terlihat. Sebelum gel agarose dituangkan dalam tray dipasang comb (yang telah ditentukan jumlah well sesuai kebutuhan) terlebih dahulu untuk membuat well. Dimana well tersebut digunakan untuk meletakkan hasil isolasi DNA. Well merupakan kutub negatif yang merupakan tempat DNA. Telah kita bahas di atas bahwa DNA bermuatan negatif. Gel agarose yang telah dingin dalam tray dimasukkan dalam tank elektroforesis. Namun sebelumnya comb harus dilepas secara perlahan agar gel tidak rusak. Selanjutnya dilakukan penuangan buffer TAE ke dalam tank elktroforesis. Penggunaan buffer TAE pada proses elektroforesis tersebut digunakan sebagai media perantara katode yang dialirkan dari sumber listrik ke dalam gel. Penggunaan larutan penyangga yang sama pada pembuatan gel, sample dan media perantara katode dinamakan continuous buffer system. Dalam sistem kontinu, muatan molekul dan ukuran pori gel adalah satu-satunya faktor yang memiliki efek penting pada pemisahan dan penyusunan atau konsentrasi sampel ke dalam sebuah band. Sebuah band terkonsentrasi bentuk sampel dimana molekul melambat antara permukaan buffer dan gel. Sampel hasil isolasi DNA 10 l dicampur dengan loading dye 2 l, kemudian di-resuspen hingga homogen. Penambahn loading dye pada sample memiliki dua tujuan. Pertama, pewarna tersebut memberikan muatan untuk membantu berat DNA, sehingga dapat tenggelam ke dasar sumur dan tidak mengapung dalam larutan buffer. kedua, loading dye bergerak lebih cepat dari

bagian DNA yang sebenarnya sehingga dapat dijadikan sebagai indikator untuk mengetahui kapan listrik pada ruang elektroforesis harus dimatikan. Cairan tersebut juga membuat DNA terlihat dengan mata telanjang, memberikan warna keunguan, dan membuat proses elektroforesis lebih cepat berlangsung.Proses elektroforesis berlangsung selama kurang lebih satu jam. Kemudian tray hasil dari proses elektroforesis diletakkan dalam UV transluminator untuk melihat band-band DNA.

VII. KESIMPULAN Proses elektorforesis ialah suatu proses migrasi molekul-molekul DNA dari muatan negatif ke muatan positif melalui suatu larutan penyangga. Proses ini bertujuan untuk melihat pita-pita DNA pada suatu sampel. Penggunaan larutan penyangga atau buffer yang sama pada pembuatan gel, sample dan media perantara katoda dinamakan continuous buffer system. Penambah loading dye ialah untuk memberikan pewarnaan dan muatan pada DNA agar tidak mengapung dalam larutan buffer.

VIII. DAFTAR PUSTAKA Campbell, N.A., J. B. Reece & L. G. Mitchell. 2002. Biologi. Ed ke-5. Terj. dari Biology oleh Lestari, R, dkk. Penerbit Erlangga, Jakarta: xxi + 438 hlm.

Academic Press, Inc., San Diego: xviii + 235 hlm. David G. Watson. 2009. Analisis Farmasi. Jakarta : EGC. Khopkar, S. M., 1990, Konsep Dasar Kimia Analitik, UI-Press, Jakarta. Sambrook, J. & D. W. Russell. 2001. Molecular cloning: A laboratory manual vol 2. 3rd ed. Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York: xvii + 3.4--14.53 + 1.44 Skoog, A. D; F. J. Holler; and T. A. Nieman. 1998. Principle of Instrumental Analysis Fifth Edition. Saunders College Publishing. Yuwono, Triwibowo. 2005. Biologi Molekuler. Penerbit Erlangga: Jakarta. Finkelstein, 2007, Nature Milestones; DNA Technologies, Nature Publishing Group.

XI. No 1.

LAMPIRAN Gambar Keterangan Ethidium Bromine

2. Buffer TAE

3. Tray yang masih kosong dan yang menutup isolator pada ujung

4. Proses pembuatan Gel Agarose

5. Penuangan agarose pada tray,yang telah di beri sisir.

6. Gel Agarose yang sudah mengeras

7. Agarose yang telah memadat dan diambil sisirnya,agar membentuk kolom-kolom

8. Saat penuangan larutan 1x buffer TAE ke tank elektroforesis sampai permukaan gel terendam

9. Sampel DNA tumbuhan maupun darah yang akan digunakan untuk elektroforesis

10. Pengambilan sampel DNA tumbuhan maupun darah

11. Saat pengambilan sampel 10 l isolasi DNA tumbuhan maupun darah dan meletakkan diatas parafilm kemudian mencampurkannya atau meresuspen.

12. Saat akan memberikan larutan dan dimasukkan dalam well pada gel agarose

13. sampel dalam well pada agarose, yang siap untuk di elektroforesis

14. Saat menutup tank elektroforesis

15. Menghubungkan arus ke listrik (100 volt ) selama 2 jam (running elektroforesis sampai terlihat molekul DNA migrasi

16. Saat meletakkan Try pada UV transluminator (akan tampak pita DNA)

17. Pita DNA tumbuhan

18. Pita DNA hewan