INTRODUCCIN

Los monosacridos y disacridos estn presentes en cantidades considerables en frutas, leche y sus derivados. En la miel, los monosacridos y disacridos constituyen aproximadamente el 80% de la masa total (Gil, 2010). Los mtodos clsicos para la determinacin de azcares en alimentos se basan en el ndice de refraccin, lo cual proporciona informacin sobre los slidos presentes y da una rpida aproximacin sobre el contenido de azcares totales. Alternativamente, diferentes procedimientos volumtricos proporcionan informacin acerca del contenido de azcares reductores y podra tambin ser empleado para la estimacin del contenido total de azcares (Rambla y Garrigues, 1997). Mtodos instrumentales modernos, como CG, HPLC, anlisis enzimticos, electroqumicos y espectromtricos pueden proporcionar informacin sobre la cantidad de azcares totales y la concentracin especfica de cada carbohidrato (Rambla y Garrigues, 1997). La espectroscopa de infrarrojo es uno de los mtodos ms comunes empleados para la determinacin de azcares debido a las bandas de absorcin de los carbohidratos a estas longitudes de onda, el infrarrojo cercano es empleado con frecuencia debido a las ventajas que presenta en contraste con el infrarrojo cercano. El empleo de espectroscopa de infrarrojo de primera y segunda derivada permite identificar azcares debido a que las bandas distintivas de cada azcar se encuentran muy cercanas, adems de que permite que el efecto interferente de la matriz de la muestra sea menor (Rambla y Garrigues, 1997).

METODOLOGA Muestra Miel de abeja El Puritano, adquirida en la tienda Dunosusa ubicada en Tixkokob el da 6 de noviembre de 2013.

Materiales 1 Esptula analtica 1 Matraz volumtrico de 100 ml 12 Matraces volumtricos de 25 ml 2 Vasos de precipitados de 50 ml 3 Vidrios de Reloj

Reactivos Fructosa grado analtico Glucosa grado analtico Sacarosa grado analtico Agua destilada Equipos Espectrofotmetro FT-IR Thermo Scientific Nicolet iS10 Balanza analtica OHAUS Modelo: DV114C Nitrgeno Gaseoso para purga

Procedimiento 1. Se prepararon estndares de cada uno de los azcares empleando glucosa, fructosa y sacarosa grado analtico, aforando con agua a un volumen de 25 ml. Para la preparacin de los estndares se emplearon las siguientes masas de azcares:
Cuadro 1.-Estandares de glucosa, fructosa y sacarosa

Estndar Glucosa (g) Fructosa (g) 0.0501 0.1000 1 0.0752 0.1505 2 0.1000 0.2008 3 0.1257 0.2570 4 2. Se prepar al muestra pesando 1.0029 g de miel y aforando a 100 ml.

Sacarosa (g) 0.1000 0.1505 0.2005 0.2570

3. Los estndares se leyeron empleando un espectrofotmetro FT-IR a 45 pulsos por transmitancia, a una temperatura de 25C. Se registraron los espectros en el intervalo de longitudes desde 700 hasta 4000 cm-1. La muestra se ley de la misma manera. 4. Los espectros de muestras y estndares se registraron como tablas en Excel, teniendo como ordenada la absorbancia y como abscisa las longitudes de onda del intervalo antes especificado. De esta manera se pudo calcular el espectro de primera y de segunda derivada. 5. Se seleccionaron los datos de ordenada para el espectro de segunda derivada para realizar la curva de calibracin. Los nmeros de onda seleccionados para cada distinto azcar fueron los siguientes: Glucosa Fructosa Sacarosa 1793.00 cm-1 1855.00 cm-1 1673.91 cm-1

6. Las curvas de calibracin fueron construidas en Excel para cada estndar individual. Por interpolacin, fue posible encontrar la concentracin de azcar en la muestra. Esto permite obtener la cantidad de azcares individuales.

RESULTADOS La cuantificacin se realizo a partir del espectro de segunda derivada de la muestra, tal como se observa en las Figura 1, se indican tambin las regiones sensibilizadas por derivacin para realizar la cuantificacin.
1.02E+02 1.00E+02 9.80E+01 9.60E+01 9.40E+01 9.20E+01 9.00E+01 8.80E+01 8.60E+01 8.40E+01 8.20E+01 3.95E+03 3.95E+03 3.95E+03 3.70E+03 3.70E+03 3.70E+03 3.45E+03 3.45E+03 3.45E+03 3.20E+03 3.20E+03 3.20E+03 2.95E+03 2.95E+03 2.95E+03 2.70E+03 2.70E+03 2.70E+03 2.45E+03 2.45E+03 2.45E+03 2.20E+03
cm-1

1.95E+03 1.95E+03

1.70E+03

1.45E+03

1.20E+03

9.50E+02

7.00E+02 2.50E-01 2.00E-01 1.50E-01 1.00E-01 5.00E-02 0.00E+00

Figura 1.-Espectro de IR de la muestra analizada, espectro de primera derivada y espectro de segunda derivada en orden descendente respectivamente. Derivadas generadas en Excel. Se enmarca en cuadro rojo la zona que fue sensibilizada al realizar el espectro de segunda derivada para observar las seales correspondientes a los azucares de inters, en el cuadro 2 se presentan las longitudes exactas para cada seal en el intervalo resaltado el cuadro rojo amplificado.

2.20E+03 2.20E+03

1.70E+03 1.70E+03

1.45E+03

1.20E+03

9.50E+02

7.00E+02

-5.00E-02 -1.00E-01 -1.50E-01 -2.00E-01 6.00E-02 1.00E-02

1.95E+03

1.45E+03

1.20E+03

9.50E+02

7.00E+02

-4.00E-02 -9.00E-02

Realizando las lecturas de intensidad en el intervalo indicado en el espectro IR de segunda derivada a las longitudes sealadas en el cuadro 2 para cada estndar, se construyen las curvas de calibracin obtenidas para cada uno de los azcares se muestran a continuacin.
0.04300 0.04250 0.04200 0.04150 0.04100 0.04050 0.04000 0.03950 0.03900 0.03850 0.03800 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 Concentracin g/100 ml
Figura 2.-Curva de calibracin de glucosa

y = 0.0513x + 0.0359 R = 0.9935

0.00900 0.00800 0.00700 0.00600 0.00500 0.00400 0.00300 0.00200 0.00100 0.00000 0.0000 0.0500 0.1000 0.1500 0.2000 0.2500 0.3000 y = 0.0364x - 0.0011 R = 0.999

Concentracin g/100 ml
Figura 3.-Curva de calibracin de Fructosa

0.05700 0.05600 0.05500 0.05400 0.05300 0.05200 0.05100 0.05000 0.04900 0.04800 0.04700 0

y = 0.0474x + 0.0438 R = 0.9892

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

Concentracin g/100 ml
Figura 4.-Curva de calibracin de sacarosa

Para la muestra, los datos experimentales obtenidos fueron los siguientes:

Cuadro 2.- Longitudes de onda y seales obtenidas para cada uno de los azucares en la muestra.

Azcar No. de onda (cm-1) Seal

Glucosa 1793.00 0.0506

Fructosa 1855.00 0.0141

Sacarosa 1673.91 0.0449

Por medio de interpolacin en cada una de las ecuaciones es posible calcular las concentraciones de cada azcar de manera individual. Paso 1. Despejar x de la ecuacin de la recta para cada una de las ecuaciones de curva de calibracin. Glucosa Fructosa Sacarosa Paso 2. Sustituir los datos de seal encontrados experimentalmente para poder encontrar la concentracin de azcar por cada 100 ml de dilucin de muestra, en g/100 ml. Glucosa Fructosa Sacarosa

Paso 3. Como las concentraciones anteriores se encuentran en gramos por 100 mililitros, corresponden entonces a los gramos en la cantidad de muestra pesada (1 g de muestra fue aforado a 100 ml). Se expresar la cantidad de azcares en la miel como porcentaje para 1.0029 g de muestra pesada. Glucosa Fructosa Sacarosa

Cuadro 3.-Resultados de concentracin de azucares en la muestra analizada

Glucosa Fructosa Sacarosa

28.58 % 41.64 % 2.32 %

DISCUSIONES En cuanto al desarrollo del mtodo descrito, el principio de absorcin en el infrarrojo se basa en el desplazamiento de la seal del estiramiento C-C que pasa de 1855 cm-1 para la fructosa a 1793 cm-1 para la glucosa debido al cambio del esqueleto cclico carbonado de 6C a 5C, para el caso de la sacarosa se tiene adems la intensidad agregada del estiramiento 6C-5C que desplaza an ms la seal a 1673 cm-1 (Figura 5), sin embargo dichas seales se ven opacadas por los estiramiento CCOH que aparecen entre 1900 cm-1 y 1600 cm-1 por lo que solo se parecan como inflexiones (Figura 1, superior) motivo por el cual es necesario sensibilizar el espectro hasta la segunda derivada. Estudios anteriores al 2013 han demostrado de los picos empleados para cuantificar se encuentran libres de interferencias (R. Vonach, 2012)

Figura 5.-Reaccin de Inversin de la sacarosa

La principal ventaja de esta metodologa es que la muestra puede ser analizada tan solo con diluirla a un nivel de concentracin que se encuentre dentro de los lmites de linealidad e la tcnica ya que se determina de forma directa la seal correspondiente a cada analito (siempre que no contenga precipitado). La desventaja es que requiere de un proceso de calibrado del equipo con los estndares hasta encontrar las condiciones ptimas de lectura para la mejor resolucin del espectro (nmero de pulsos, intensidad de pulsos y lnea base con purga) que debe ser realizado cada vez que se haga una lectura a menos que sea en un equipo de uso cotidiano para el ensayo en cuestin. Considerando la preparacin de estndares y ajuste del equipo, el tiempo total del anlisis realizado fue de 120 minutos, junto con el bajo nivel de residuos generado y cantidad de material utilizado, en general se trata de una prueba rpida y sencilla. Respecto a los resultados del anlisis, se encuentra claramente reportado el alto grado de linealidad que existe para el intervalo de cuantificacin ensayado (Rambla & Garrigues, 1997), mismo que se demostr al observar los coeficientes de correlacin obtenidos (Figuras 2, 3 y 4). El punto de incertidumbre a considerar y que sera recomendable evaluar en ensayos futuros, es si la presencia de otros azucares en menores cantidades como la maltosa causan una interferencia apreciable para el caso de la sacarosa, aun que tericamente debido al fundamento del mtodo esto no debera representar un problema, no hay referencias al respecto que lo confirmen. Asumiendo la validez de los resultados, de acuerdo a la Norma Mexicana NMX-F-036-1997-NORMEX, que contiene las especificaciones y mtodos de prueba para la evaluacin de la calidad de la miel que establece que las cantidades de azcares recomendadas para la miel son 5% de sacarosa y 38% de glucosa, como mximo, la muestra se encuentra dentro de los lmites de control deseados.

CONCLUSIONES Se ensay una metodologa nueva sugerida para azucares en alimentos libres de precipitado (con o sin tratamiento previo), en general el mtodo resulta sencillo y rpido siempre que se cuente con la infraestructura necesaria para ello (cuando menos un equipo de IR con purga de nitrogeno y estndares grado analtico). Por cuestiones tcnicas no fue posible realizar una validacin de los resultados (determinacin de parmetros de validez) pero los antecedentes y fundamentos de la tcnica as como la conformidad de los resultados indican un correcto anlisis.

REFERENCIAS

Gil, . (2010). Tratado de nutricin (Segunda ed., Vol. II). Espaa: Panamericana. R. Vonach, J. B. (2012). Application of Mid-Infrared Transmission Spectrometry to the Direct Determination of Glucose in Whole Blood (Vol. Vol. 52). UK: Applied Spectroscopy. Rambla, F., & Garrigues, S. (1997). PLS-NIR determination of total sugar, glucose, fructose and sucrose in aqueous solutions of fruit juices. Analytica Chimica Acta , 344, 41-53. Norma mexicana: NMX-F-036-1997-NORMEX