Resumen Biologa Molecular III Nucletidos.

Los nucletidos son molculas intracelulares importantes de bajo peso molecular que participan en una amplia variedad de procesos bioqumicos. La diferencia entre un nucletido (o desoxinucletido) y otro son las bases nitrogenadas. Estas bases nitrogenadas son las Purinas (Adenina y Guanina) y las Pirimidicas (Citocina, Timina y uracilo). El papel mejor conocido de los nucletidos purnicos y pirimidnicos sea el de servir como precursores monomricos del ARN y ADN. Sin embargo, los ribonucletidos de purina sirven tambin en los sistemas biolgicos como la fuente ubicua de alta energa, ATP, como seales reguladoras (AMP cclico [AMPc] y GMP cclico) en una gran variedad de tejidos y organismos. La diferencia que hay entre los nucletidos y los nuclesidos es que este ltimo est compuesto por una base purina o pirimidina, a la cual va unida el azcar a una ribosa en el N5. Los nucletidos pueden contener una, dos o tres unidades de fosfato. Dependiendo del largo que sea la cadena en el 5 pueden ser: NMP, NDP, NTP. Biosntesis de Nucletidos: el que interviene en la mayora de las biosntesis de nucletidos es el Fosforribosilpirofosfato (PRPP). Como por ejemplo en la sntesis de novo de purinas y pirimidinas. Sintesis de Novo de Purinas: Se sintetiza el anillo de purina desde el inicio a travs de precursores. Aspartato: precursor para poder sintetizas los anillos. CO2: como bicarbonato.

Sintesis de novo de pirimidinas: Esta sntesis sirve para sintetizar una molcula compleja a partir de precursores ms simples.

Existe un tipo de sntesis que es el de salvamento que consiste en agregarle un grupo P a los nucleosidos. Para que esto ocurra se cortan los enlaces fosfodiester. La fosforribosil transferasa ayuda a transferir ribosa. En las molculas continuamente se est sintetizando ADN, Principalmente ARN. Cuando se degradan los nucletidos ocurren ciertas reacciones que degradan hasta las bases nitrogenadas. *oligonucletidos: Nucletidos ms cortos (segmentos)

ADN. Caracteristicas elementales del ADN: Esta formado por dos cadenas antiparalelas y complementarias Se encuentra unido entre nucletidos de una misma cadena a travs del enlace fosfodiester. Complementariedad de bases determinada por la formacin de puentes hidrogeno Forma una doble hlice que gira hacia la derecha y que presenta un surco mayor y uno menor. Puede presentar un super enrollamiento.

Las cadenas de ARN consisten en una cadena simple, que puede presentar regiones monohebras y regiones doble hebra. Ademas del enrollamiento que involucra la doble hlice, el ADN puede presentar un superenrrollamiento. Lo que diferencia el ADN con el ARN es que este ltimo presenta un grupo hidroxilo (OH) y el AN solo presenta un H, esta ausencia de O hace que el ADN sea cargado negativamente por fuera. Niveles de empaquetamiento del ADN en clulas Eucariontes. Nosotros como especie presentamos un total de 46 cromosomas o 23 pares de cromosomas, que es lo mismo que decir que tenemos 46 moleculas de ADN. Existen distintos niveles de empaquetamiento del ADN que va desde la simple formacin de la doble hebra de ADN, para convertirse luego en cromatina, est en nucleosomas, la regin extendida de los nucleosomas, luego la condensacin de la seccin del cromosoma en donde por ultimo encontramos un segmento del cromosoma. ADN --- Nucleosoma --- Extension del nucleosoma --- Condensacin de un sector del cromosoma -- Cromosoma. Histona: las histonas son un octomero (H2A, H2B, H3 Y H4), que permiten facilitar la unin del ADN para ejercer su funcin de empaquetarlo, formando parte de la cromatina.

Heterocromatina: Porcin inactiva de la cromatina. Se encuentra en niveles de condensacin desde la fibra de 30nm hacia niveles superiores. Eucromatina: Regin activa de la cromatina, en donde se encuentran los genes que se estn expresando en una determinada clula. Posee un menor grado de condensacin. Heterocromatina constitutiva: Porcin del genoma que se encontrara a la forma de heterocromatina en todos los tipos celulares de un organismo dado. Heterocromatina facultativa: Corresponde a porciones del genoma que se encontraran a la forma de heterocromatina en algunos tipos celulares y de eurocromatina en otros tipos celulares de un organismo dado. Que una porcin del genoma se encuentre a la forma de eucromatina no siempre implicar que sea una regin activa de expresin gnica.

Experimentos que ayudaron a establecer que el ADN es el material gentico.

Tecnicas de Biologia Molecular: Obtencin de ADN, Enzimas de Restriccin, Electroforesis. Etapas generales en un protocolo clsico de purificacin del ADN. En humanos, regularmente se utiliza sangre o clulas de la cavidad bucal como muestra. Lisis de las clulas. Mecnica y con solucin con baja concentracin de sal. Digestin del ARN (incubacin con RNasa) Digestin de protenas (incubacin con protenas K) Extraccin orgnica (Fenol, fenol: cloroformo, cloroformo) Precipitacin del ADN con etanol. Centrifugacin y eliminacin del etanol. Re suspensin en agua o solucin tampn.

Electroforesis. La electroforesis consiste en la separacin por tamao de molculas de ADN o protenas en una matriz porosa, al someterlas a un campo elctrico. Para el ADN puede separarse a travs de un gel de agarosa o en gel de poliacrilamida que puede ser denaturante o no denaturantes. Para las protenas en cambio, se utiliza el SDS-PAGE.

Electroforesis en gel de agarosa:

Cuando se hace la electroforesis en gel de agarosa, se coloca un medidor de molculas (marcador molecular) que va en el gel, en donde se van marcando los segmentos de ADN por pares de bases. La visualizacin del ADN se hace con bromuro de Etidio. El voltaje que se aplica en la electroforesis es de 80 volts. En la solucin se usa un Tampn TAE o TBE (es el mas usado). Electroforesis en gel de poliacrilamida. En esta electroforesis se ponen dos compuestos (Bir acrilamida)en un vidrio hasta que queden como gel. EL gel conecta las dos soluciones con el polo negativo y ell positivo. La dsolucin es de un 1%.

Enzimas de Restriccin. Endonucleasas que reconocen secuencias especficas en el ADN. Provenientes de una multiplicidad de bacterias. Las secuencias de reconocimiento son normalmente palndromes de 4-8pb El corte con estas enzimas genera extremos cohesivos (5 o 3 sobresalientes) o bien extremos romos. Aplicaciones: Mapas de restriccin. Deteccion de ciertas mutaciones relacionadas por ejemplo, con enfermedades. Manipulacin de ADN a distintos niveles. Se pueden usar en combinacin con PCR (despus de realizada la PCR)

Replicacin del ADN. Elementos requeridos por las ADN Polimerasa: ADN (ARN) molde o patrn. MG2+ dNTPs Partidor con extremo 3-OH libre.

Caractersticas de la replicacin: Es semiconservativa La sntesis siempre procede en el sentido 5 ------ 3 Es bidireccional Es semidiscontinua Se origina en puntos especficos de un genoma determinado.

Para que ocurra el proceso de replicacin del ADN, este se convierte en una horquilla de replicacin o una burbuja, en donde las hebras de ADN se separan para luego ser copiadas por la hebra nueva. Quien abre estas hebras de ADN es la Helicasa, que va cortando los pares de bases. (eucariontes hay 200 pares de bases). Esto ocurre de la siguiente manera:

La Copia siempre va a ser de 5 a 3, esta se va a llamar la hebra lder que va a ser sintetizada por la ADN polimerasa. La ligasa es la que forma el enlace y va uniendo. Sintesis de la hebra continua: Polimerasa III. La degradacin de los fragmentos de Okazaki la hace la Polimerasa I. La topoisomerasa : Cuando se replica el ADN, se va cortando en los extremos, se torce. La que evita que esta se torsa es la topoisomerasa, que corta y la pega. Proteinas de unin de hebra sencilla: evita que las hebras complementarias se vuelvan a unir. La actividad de las polimerasas es que tienen la capacidad de corregir. Exonucleasa: cortar ADN por los extremos. La replicacin avanza en ambos sentidos. Por eso se dice que el ADN es discontinuo (Fragmentos de Okazaki) Lo hace a saltos y se necesitan muchos cebadores.

Principales diferencias entre replicacin en procariontes y eucariontes. Procariontes: Origen de replicacin nico Proceso sobre ADN desnudo (superEnrrollado) Genoma de ADN circular Polimerasas I,II,III eucariontes: Multiples orgenes de replicacin En presencia de Nucleosomas Genoma Lineal alfa, beta, gama, delta, epsylon.

Un Telomero extendido permite la adicion de un nuevo cebador para la maquinaria replicativa gracias a la telomerasa que polimeriza las bases.

Etapas del ciclo celular: S: Replicacin. G1: Preparacin del ADN para la replicacin. G2: Preparacin para la mitosis M: Divisin celular. G0: estado de reposo (clula completamente diferenciada). Mitosis: Interfase (cromosomas no visibles como estructuras) profase ( cromatidas comienzan a ser visibles) Metafase(los cromosomas se alinean solos) Anafase (cromosomas de una sola cromatida se mueven a polos opuestos) divisin celular comienza. Telofase (citoquinesis completa. Resultante 2 celulas iguales). TRANSCRIPCION. Requerimientos bsicos para el proceso de transcripcin: ADN molde (Sntesis de ARN dirigida por el ADN) NTPs Mg2+ No se requiere de un partidor.

Etapas del proceso de transcripcin: 1) Iniciacin: A) Polimerasa se une a la secuencia del promotor en el ADN dplex complejo cerrado B) Polimerasa derrite el ADN dplex cerca del sitio de la transcripcin inicial, formando una burbuja de transcripcin complejo abierto. C) Polimerasa cataliza fosfodiester con la vinculacin de dos rNTPs iniciales. 2) Elongacin: D) Polimerasa avanza de 3 a 5 hacia abajo en la hebra molde, el derretimiento de ADN de doble hlice y la adicion creciente de rNTPs ARN. 3) Terminacin: E) En el sitio de detencin de la transcripcin, los comunicados de la polimerasa de ARN se completaron a partir de la disociacin del ADN. Caractersticas de la regin promotora: la caja TATA. Esta caja es la secuencia que podra indicar el inicio de la transcripcin. En procariontes la subunidad sigma de ARN polimerasa reconoce la caja TATA. En eucariontes en cambio, el reconocimiento lo realiza una protena llamada TBP (TATA Binding Protein). La caja TATA es la seal para la maquinaria transcripcional. La resina se adhiere al ADN. Mas de una ARN polimerasa puede estar transcribiendo el mismo gen.

Transcripcin, principales diferencias entre procariontes y eucariontes:

Intrones: Secuencia de ADN que no codifica. Desechos y corta. Extrones: pedacitos que sobran de ADN. Los exones varan. 7 Intrones en la ovoalbmina de pollo. Si el intrn corta un nucletido debe ser especfico y no se puede pasar. Splicesoma: corte y empalme (reconoce la zona y la corta). El empalme es donde se forma el enlace fosfodiester. Formacin del lazo. Los ribosomas catalizan el proceso. Codn: 3 nucletidos. Conjunto de Codoes, aminocidos son codificados por cada conjunto de codones (Codigo gentico) Nunca se va a dar mas de 1 aminoacido por el mismo codn. 1 codon: 1 tipo de aminocidos . Codones de comienzo: AUG Codones de termino: UAA, UAG, AGA.

Traduccin: CODIGO GENETICO.

Caractersticas del cdigo gentico: Es universal No es ambiguo Es degenerado No presenta solapamiento Se lee de manera unidireccional (5 a 3)

Los codones son tripletes no solapados y sin espaciamiento entre ellos. Una vez que se asocia un aminocido con su ARNt correspondiente hablamos de un ARNt cargado o aminoacil-tRNA. La asociacin de un aminocido en partculas con su ARNt correspondiente la realizan enzimas llamadas aminoacil tRNA sintetasas y esta es especfica. El tercer par de un codn es el nico que cambia para una mayor libertad de apareamiento (esto es el balanceo). Por lo tanto, es la nica zona donde est permitido la asociacin de codnanticodn. (lo que permite que el cdigo gentico sea degenerado).

Traduccin y procesamiento post-traduccional. Composicin de los ribosomas: Los ribosomas son complejos macromoleculares constituidos por gran parte de protenas y ARN que se encuentran en el citoplasma, en las mitocondrias, en el retculo endoplasmatico y el cloroplasto. Son un complejo encargado de sintetizar protenas a partir de la informacin gentica que les llega del ADN transcrita en forma de ARN mensajero. En procariontes, la secuencia de Shine-Dalgarno le sirve al ribosoma para dar inicio a la traduccin en el punto correcto. (GAG GG GGAU GGUG GGU G U UAAGGAGGU) En eucariontes, modificacin del ARNm en 5 (cap) y secuencia kozak cumplen la funcin equivalente) Iniciacin de la traduccin en Procariontes:

Caractersticas diferenciales de la traduccin en eucariontes: Estructura de los ribosomas (primera figura de esta presentacin) Iniciacin requiere de muchos ms factores proteicos El alineamiento de la subunidad menor (40s) con el mensajero se da por reconocimiento de la modificacin en el 5 (cap) del mensajero (luego, escaneo hasta llegar al primer AUG) Primera metionina no est formilada. Elongacin y terminacin son similares al caso de procariontes, aunque en eucariontes existe slo un factor de liberacin.

Se distinguen dos tipos de modificaciones post-traduccionales: Cortes proteolticos: La mayor parte de las protenas sufren cortes proteolticos despus de la traduccin. La forma mas fcil es la remocin de la Met (fmet en procariotas) de iniciacin.

Modificaciones covalentes: Modificaciones a nivel de la fosforilacin, Acetilacin, Metilacin, Glicosilacin, Hodroxilacin, ADP-ribosilacin, Otras.

Algunas de las modificaciones post-traduccionales no ocurren inmediatamente despus de sintetizada la protena. Ejemplos: Cascadas de fosforilaciones desencadenadas por glucagn y adrenalina. Modificaciones en las histonas relacionadas a la regulacin de la expresin gnica. Adicin de pptidos a algunas protenas para regular su actividad (ubiquitinacin, sumoilacin).

Direccionamiento de las protenas en los eucariotas. Las protenas destinadas al citoplasma, nucleo, mitocondrias y cloroplastos son sintetizadas en el citoplasma. Las protenas destinadas a la membrana plasmtica, lisosomas, peroxisomas o glioxisomas y el transporte extracelular son sintetizadas en el RER y son distribuidos por el aparato de Golgi. La degradacin de estas protenas ocurre en los lisosomas, en el citosol fundamentalmente por el sistema ubiquitina-proteosoma. Regulacin de la expresin gnica. Primer sistema de regulacin de expresin caracterizado: El opern Lac (procariontes) que es una regulacin a nivel de la transcripcin. 3 proteinas codificantes: para 3 proteinas distintas (ARN). Para que se produzca esto tiene que haber Lactosa. Region Promora: CAP-CAP Para que ocurra esto tiene que haber 2 factores: 1.- Un bajo nivel de azcar: La celula trata de utilizar fuentes de energa alternativa como es la lactosa AMPc ----Cambia su conformacin del CRP. Una parte de la suplantacin de la protena interactua con el ARN polimerasa que se asocia al promotor

Represor Lac: Para que actue entonces se requiere: 1.- Ausencia de Lactosa. 2.- Enzimas que procesan lactosa se encuentren inhibidas. 3.- Continuamente se est expresando el represor, con alta afinidad en el ADN 4.- El ARN Polimerasa se une a la zona operadora y el represor Lac. No se puede asociar la polimerasa. Otro medio es cuando se le agrega lactosa. De esta Lactosa se agrega un inductor (A lolactosa). Regulacin de la transcripcin en Eucariontes. 1.- Polimerasa II: Factores transcripcionales generales. 2.- A: ayuda a que se fije a la ARN polimerasa y no es necesaria la interaccin fsica para que ocurra esto. Es un factor de transcripcin especifico para un gen o un numero reducido de genes. TAFs, TBP y TFIIs son factores de transcripcin generales. Tenemos corepresores (coactivador) Donde se asocia la ARN polimerasa, secuencia cercana al sitio de transcripcin, tiene el nombre de promotor basal. Puede existir secuencias mucho ms lejanas del sitio de inicio de la transcripcin que pueden participar en la regulacin de la transcripcin (expresin) de un gen. Se le conoce como regiones enhancer. (estimuladoras o potenciadoras). Existe toda una maquinaria dedicada a remodelar la estructura local de la cromatina con el objeto de posibilitar (o impedir) la transcripcin. Algunas de estas maquinarias requieren de energa (ATP) para realizar su accin. La expresin gnica tambin se puede regular a nivel de la traduccin, mediante mecanismos como: a) la modelacin de la actividad de factores de iniciacin de la traduccin (IFs), b) interferencia de ARN (RNAi, descubierto mas recientemente)

Organizacin del Genoma. Solo alrededor del 1.5% del genoma humano corresponde a ADN que codifica para protena (exones). Nosotros presentamos alrededor de 3.200 millones de pares de bases. (30.000 genes para protenas). El resto: Regiones reguladoras de expresin (promotores y enhancers) Intrones Genes de ARN (Varios miles, ARNt, ARNr, Micro ARN y otros ARN no codificantes). Regiones relacionadas a estructura de cromosoma y organizacin del genoma. Otros: elementos repetitivos: o En tndem: (~3% del genoma humano) ADN satlite Minisatelite Microsatelite o ADN repetido disperso: (~45% del genoma humano) SINEs (elementos nucleares dispersos cortos). LINEs (elementos nucleares dispersos largos). HERV (secuencias adquiridas desde retrovirus).

 PSEUDOGENES:

Transposones de ADN.

De los genes codificantes para protenas tenemos dos tipos generales: Genes nicos (1 copia de gen por genoma haploide) Genes de copia mltiple. (familia gnica, Genes repetidos en tndem (como los de histonas).

Reestructuracin del material gentico. Meiosis. Lines: retrotransposones. Una lesin puede cambiar la conformacin del genoma. Una transposicin y amplificacin tambin generan cambios en el genoma. A estos cambios se les conoce como Mutaciones que alterna a nivel genmico. Estas mutaciones son debido a : Errores de replicacin no corregidos y a daos de causa ambiental (ya sea por modificacin o por modificacin fotoqumica) Cuando el dao no se repara se puede tener como consecuencia la muerte de la celula o de la transmisicion de una mutacin a las clulas hijas. Ciertos tipos de reparacin involucran un cambio en el contenido gentico. En un organismo multicelular, cuando ocurren en las clulas germinales, estas mutaciones pueden ser transmitidas a la decendencia. Las mutaciones podran afectar la secuencia codificante para una determinada protena (o molecula de ARN) o bien afectar regiones regulatorias de la exprresion de un gen. Si una mutacin ocurre en una regin el genoma que no tenga relacin con la secuencia o regulacin de la expresin de algn gen, se habla de mutaciones silentes. A veces una mutacin en la regin codificante de un gen puede ser una mutacin silente (si ocurre en la tercera base de ciertos codones). Las mutaciones pueden introducir diversidad gentica en una especie determinada. Los organismos multicelulares tienen adems como fuente de diversidad gentica la reproduccin sexual. En el caso de la reproduccin sexual, la generacin de diversidad descansa en la segregacin al azar de los cromosomas y en el fenmeno de recombinacin que forman parte de la meiosis. La recombinacin del ADN se puede dar en procesos que no tengan relacin con meiosis. Ejemplos: Generacin de anticuerpos por parte de los linfocitos; ciertos tipos de reparacin de ADN; transposones.

La amplificacin gnica puede ocurrir en clulas somticas generalmente por sometimiento a algn tipo de estrs. Tambin puede ocurrir en clulas germinales. Crossing over: cruzamiento de crosomas homologos resultando 4 haploides. TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR: PCR Y OTRAS TCNICAS. La PCR es una tcnica que tiene como objeto amplificar de manera especfica una regin particular de ADN, que est contenida dentro de una molcula de ADN de mayor tamao. Sirve para test de paternidad, identificacin de individuos, estudios poblacionales, entre otros. Se requiere de polimerasa termoestable, partidores, templado y buffer. Los partidores son pequeas secuencias complementarias con cadenas a amplificar. CICLO 1 o Incubar a 95C para separar las hebras del ADN o 50-60C para permitir alineamiento de partidores. o 72C para permitir accin de polimerasa termoestable o Repetir etapas 1 y 2 CICLO 2 o Repetir etapa 3 CICLO 3 o Repetir etapas 1 a 3 o Despus de 25 ciclos, el segmento blanco de ADN se ha amplificado alrededor de un milln de veces. Cuando la PCR se invent, no existan polimerasas termoestables, por lo cual tena que hacerlo a 37C, y tenan que colocar ms polimerasa con cada ciclo.

SOUTHERN APLICACIONES o Deteccin de una secuencia particular de ADN en una mezcla compleja o RFLP (restriction fragment len gth polimorfisms): Identificacin de personas y tests de paternidad. Cromosomas homlogos humanos difieren en su secuencia cada 1250pb, en promedio. Hay caracterizadas regiones en los cromosomas que son ms variables de individuo a individuo, y que son blanco del anlisis RFLP Ya no se usa mucho, porque, yknow, radiacin.

SISTEMA CODIS (1997) Se analizan 13 microsatlites, para comparar los patrones del nmero de patrones. Estadsticamente, es casi totalmente imposible que tenga el mismo patrn de repeticiones de los 13 microsatlites.

MTODO DE SANGER Mtodo de los dieoxinucletidos o de terminacin de cadena. Mayor relevancia en las ltimas tres dcadas. Involucra reaccin de polimerizacin y su detencin por la adicin de dideoxinucletidos que son anlogos de los deoxinucletidos, pero que no permiten que contine la elongacin del ADN. En el proceso automatizado que usan los dideoxinucletidos marcados con fluorforos, que le otorgan un color de fluorescencia a cada uno.