Anda di halaman 1dari 2

BIOLOGI SEL DAN MOLEKULER

ANALISIS PROTEIN

Prinsip dasar biokimia metode Bradford untuk mengukur protein total


Finsa F.Gusmara, Gianni Yosephine, Hafidz S.Shah, Maryanna I. Pratiwi, Rubyantara Jalu P., Nurul Jamal G. Metode pengukuran konsentrasi protein yang telah ada sebelumnya masih memiliki banyak kekurangan. Metode Bradford dengan coomassie brilliant blue G-250 dapat mengatasi kekurangan dalam metode terdahulu, dengan langkah sederhana dan cepat. Review ini menjabarkan prinsip dasar kuantifikasi protein dalam sampel menggunakan metode Bradford.

Proses kuantifikasi protein dalam kerja laboratorium seringkali memerlukan metode kuantifikasi protein yang sensitif dan cepat. Sayangnya, metode yang telah lebih dahulu ditemukan kurang memenuhi kedua syarat tadi. Prosedur-prosedur yang telah dimodifikasi dapat mengatasi kekurangsensitivan dalam metode biuret dan Lowry, namun menjadi lebih rumit dan memakan waktu lama. Metode Bradford, dengan prinsip coomasie dye binding dapat mengatasi semua kekurangan metode sebelumnya. Coomassie brilliant blue G-250 (trifenilmetan) merupakan pewarna yang dapat berwujud dalam dua warna, yaitu merah dan biru kehijauan. Ketika berikatan dengan protein, pewarna ini akan membentuk kompleks pewarna-protein lalu berubah menjadi biru. Kompleks ini terbentuk secara cepat dan memiliki koefisien kespesifikan tinggi sehingga metode lebih sensitif sekaligus cepat.1 Prinsip dasar metode Bradford adalah pemakaian

ciri spektral CBB G-250 untuk mengestimasi jumlah protein pada larutan. Sampel protein ditambahkan ke dalam larutan CBB yang mengandung asam fosforat dan etanol. CBB akan bereaksi paling banyak dengan residu arginin dan histidin, lisin, tirosin, triptofan, dan fenilalanin dalam jumlah yang lebih kecil.1 Gugus trifenilmetan akan berikatan dengan strktur nonpolar pada protein, sementara gugus sulfonat anion akan berinteraksi dengan sisi kation pada protein (seperti arginin dan lisin) pada pH asam.2 Konsentrasi protein akan ditentukan dengan membuat kurva standar dengan konsentrasi protein diketahui dan mengekstrapolasi nilai absorbansi sampel. Protein standar yang kerap digunakan adalah bovine serum albumine atau BSA dan immunoglobulin atau IgG. Protein ini menghasilkan standar yang konsisten untuk estimasi protein. Perubahan warna coomassie blue bergantung pada keasaman larutan dan sisi pengikatan pada asam

amino dan peptida. Pada pH asam atau disebut keadaan dominasi kation, CBB memiliki warna merah dengan absorpsi panjang gelombang maksimal pada 470 nm sementara pada pH netral warna yang dihasilkan adalah kehijauan dengan panjang gelombang maksimal 620 nm. Adapun saat keadaan larutan anionik atau basa, akan dihasilkan warna biru dengan panjang gelombang maksimal 595 nm. Dengan kata lain perubahan warna yang dihasilkan merupakan hasil dari perbedaan keadaan muatan CBB, yang berhubungan dengan jumlah muatan positif pada tiga atom nitrogen pada molekul CBB, sementara gugus asam sulfonat tetap bermuatan negatif. Saat pH sekitar 0, ketiga atom nitrogen bermuatan postif, akibatnya CBB akan menjadi kation dengan total muatan +1 dan membentuk warna merah. Pada saat berwarna kehijauan, CBB tidak memiliki muatan total, sementara pada pH 2 atau hingga pH netral, hanya satu nitrogen yang membawa muatan positif sehingga molekul CBB akan

berwarna biru dengan muatan total -1. Pada kondisi basa, proton terakhir hilang dan CBB berubah warna menjadi merah muda, tetapi tidak ada relevansi berarti dalam pengujian saat kondisi tersebut.3

Coomassie blue dapat membentuk kompleks non kovalen yang kuat dengan protein. Hal ini diperkirakan akibat kombinasi gaya van der Waals dan interaksi elektrostatis antar dua molekul gugus sulfonat dengan gugus kation pada protein. Keasaman pH hacil pencampuran kemudian cukup rendah untuk mengubah protein menjadi kation, namun tidak cukup kuat untuk menetralisasi gugus sulfonat. Protein yang tidak menyisakan gugus anion tidak akan bereaksi pada CBB meskipun pada pH sangat asam.4Meskipun sensitif, hasil pengukuran protein dengan metode Bradford dapat menghasilkan respon berbeda pada protein yang berbeda. Hal ini berhubungan dengan urutan asam amino pada protein, titik isoelektrik, dan keberadaan sisi tertentu atau gugus prostetik yang dapat mengubah hasil secara dramatis.5 6 Langkah estimasi protein total menggunakan metode

Bradford cukup sederhana. Langkah pertama adalah persiapan protein standar, yaitu dengan mencari konsentrasi protein standar yang akan dipakai. Langkah kedua dengan mengencerkan CBB G-250 pada 50 ml 95% etanol dan 100 ml 85% asam fosforat dan mengencerkan kembali hingga 1 liter. Kemudian, menguji protein sampel dengan reagen protein yang telah dibuat dan mengukur absorbansinya pada 595 nm. Maka konsentrasi protein dapat diketahui dengan rumus persamaan garis hasil regresi protein standar BSA.1
Intisari kunci
-kuantifikasi konsentrasi protein memanfaatkan prinsip reaksi CBB dengan protein akan menghasilkan warna biru yang dapat divisualisasikan pada absorbansi 595 nm - konsentrasi protein dapat dihitung melalui kurva protein standar yang konsentrasinya telah diketahui - saat CBB menjadi kation, warna larutan merah, namun saat CBB menjadi anion, warna larutan berubah menjadi biru - protein dapat bereaksi dengan CBB melalui gaya van der Waals dan interaksi elektrostatis -tahap pengukuran konsentrasi protein menggunakan metode Bradford antara lain persiapan protein standar, pembuatan reagen protein, pengujian protein, serta pengukuran absorbansi

dapat diatasi seperti pengendapan protein oleh asam trikloroasetat (TCA) untuk mengatasi interferensi oleh senyawa nonprotein.7 Meskipun terdapat beberapa kelemahan metode Bradford merupakan metode yang sangat baik untuk mengukur konsentrasi protein.
Kelompok 1 Proyek Biologi Sel Molekuler, Program Studi Biologi, Sekolah Ilmu dan Teknologi Hayati, Institut Teknologi Bnadung, Jl. Ganesha no.10, Indonesia.
1. Bradford, M. M. (1976). Rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72: 248254 2. Lovrien, R.E., Conroy, M.J., and Richardson, T.I. 1995. Molecular hasis forprotein separations. In Protein-SolvenlInleractions (R.B. Gregory, ed.) pp. 521-553. Marcel Dekkcr, New York. 3. Chial, H. J.; Thompson, H. B.; Splittgerber, A. G. (1993). "A spectral study of the charge forms of Coomassie Blue G". Analytical Biochemistry 209 (2): 258266. 4. Craig, L.C. (1967). Techniques for the study ul peptides and proteins hy dialysis and diffusion. Methods EnzymoI. 11370-884. 5.Tal, M., Silberstein, A. and Nusser, E. (1980). Why does Coomassie brilliant blue R interact differently with different proteins? J Biol Chem 260:9976-80. 6. Compton, S.J. and Jones, C.J. (1985). Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Anal Biochem 151:36974. 7. Clayton JR Jr, Dortch Q, Thoresen SS, Ahmed SI (1988) Evaluation of methods for the separation and analysis of proteins and free amino acids in phytoplankton samples. J. Plankton Res. 10: 341 358.

Respon pengukuran berbeda pada protein yang berbeda, gangguan pengukuran oleh temperatur, serta interferensi senyawa lain merupakan kelmahankelemahan dalam pengukuran konsentrasi dengan Bradford. Kelemahan itu pun masih