VALIDASI METODE PENENTUAN KADAR

APIGENIN DALAM EKSTRAK SELEDRI DENGAN

KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI








RAHMA JUWITA ZAMRI










DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008

ABSTRAK
RAHMA J UWITA ZAMRI. Validasi Metode Penentuan Kadar Apigenin dalam Ekstrak
Seledri dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi. Dibimbing oleh LATIFAH KOSIM
DARUSMAN dan MOHAMAD RAFI.
Apigenin merupakan senyawa aktif yang berasal dari seledri (Apium graveolens)
dan telah digunakan secara luas untuk pengobatan penyakit asam urat. Validasi metode
penentuan kadar apigenin yang dilakukan pada penelitian adalah metode yang
dikemukakan oleh Frankee et al. J Food Compos Anal 17: 1-35 (2005). Analisis kadar
apigenin dilakukan dengan kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT). Untuk meyakinkan
bahwa metode analisis KCKT dapat digunakan sesuai dengan tujuan yang diinginkan
maka metode tersebut divalidasi. Parameter-parameter validasi yang diuji meliputi
linearitas, limit deteksi, limit kuantitasi, ketelitian, dan ketepatan. Semua parameter yang
ditetapkan memenuhi kriteria penerimaan yang telah ditetapkan oleh Association of
Official Analytical Chemist. Linearitas pada konsentrasi 3,8; 5,7; dan 7,6 mg/l memiliki
koefisien korelasi berkisar antara 0,9900 dan 0,9998. Limit deteksi metode ini adalah
sebesar 2,7222 mg/l dan limit kuantifikasi sebesar 8,2500 mg/l. Ketelitian dilakukan pada
hari yang sama sebanyak lima kali ulangan menunjukkan ketelitian yang cukup baik
dengan simpangan baku relatif sebesar 3,85%. Ketepatan ditentukan dengan metode
penambahan standar dengan nilai persen perolehan kembali berkisar antara 95,00 dan
118,77%. Rerata kadar apigenin yang diperoleh adalah sebesar 0,0052% (b/b).



ABSTRACT
RAHMA J UWITA ZAMRI. Validation Method for Determination of Apigenin in Extract
Celery with High Performance Liquid Chromatography. Under the direction of
LATIFAH KOSIM DARUSMAN and MOHAMAD RAFI.
Apigenin is an active substance derived fromcelery (Apium graveolens) and
widely used for the treatment of gout. Determination method of apigenin which have
been validated was introduced by Frankee et al. J Food Compos Anal 17: 1-35 (2005).
Apigenin analysis was done by high performance liquid chromatography (HPLC). To
make sure that HPLC analysis method can be used for the intended purpose then the
method was validated. Parameters determined on method validation were linearity, limit
of detection, limit of quantification, precision, and accuracy. All parameters were in
accordance with the acceptance criteria of Association of Official Analytical Chemist.
The linearity in the concentration of 3,8; 5,7; and 7,6 mg/l had correlation coefficent of
0,99000,9998. limit of detection in this method was 2,7222 mg/l and limit of
quantification was 8,2500 mg/l. Interday precision in five restating showed good
precision with relative standard deviation of 3,85%. Accuracy was determined by
standard addition method with recovery percentage of 95,00118,77%. Average
concentration of apigenin is 0,0052% (w/w).







VALIDASI METODE PENENTUAN KADAR
APIGENIN DALAM EKSTRAK SELEDRI DENGAN
KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI











RAHMA JUWITA ZAMRI




Skripsi
Sebagai salah satu syarat memperoleh gelar
Sarjana Sains pada
Departemen Kimia











DEPARTEMEN KIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2008

J udul Skripsi : Validasi Metode Penentuan Kadar Apigenin dalamEkstrak Seledri
dengan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
Nama : Rahma J uwita Zamri
NIM : G44203012





Disetujui:

Pembimbing I, Pembimbing II,


Prof. Dr. Ir. Latifah K Darusman, MS Mohamad Rafi, S.Si
NIP 13053668 NIP 132321454





Diketahui:
Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam




Dr. drh. Hasim, DEA
NIP 131578806








Tanggal lulus:

PRAKATA
Bismillahirrohamanirrohim.
Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas
limpahan rahmat dan karunia-Nya, sehingga karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Skripsi
ini disusun berdasarkan hasil penelitian yang dilaksanakan sejak bulan April 2007 sampai
Maret 2008. Tema yang diambil adalah validasi metode, dengan judul Validasi Metode
Penentuan Kadar Apigenin dalam Ekstrak Seledri dengan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi.
Terima kasih penulis ucapkan kepada berbagai pihak yang telah membantu selama
kegiatan penelitian dan penyelesaian karya ilmiah ini, antara lain Pusat Studi Biofarmaka
atas bantuan sebagian dana penelitian, almDra.Tuti Setiawati Sudjana, MS yang sempat
menjadi pembimbing I, Prof. Dr. Ir. Latifah K Darusman, MS selaku pembimbing I, M.
Rafi, S.Si selaku pembimbing II, Rudi Heryanto, S.Si, M.Si atas literatur dan saran yang
telah diberikan. Di samping itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada Pak Eman dan
seluruh staf kimia analitik, M. Agung Zaim, S.Si beserta seluruh staf pusat studi
biofarmaka yang telah membantu selama penelitian, Budi Arifin, S.Si, dan teman-teman
kimia angkatan 40 yang senantiasa memberikan semangat dan tempat untuk berdiskusi
khususnya Niken, Wina, Farah, Noerhayati, Erika, Ratna, dan Lita. Terima kasih juga
disampaikan kepada Aby, Umi, Idris, Hasby, Amel, Ruly, Mas Irawan, dan Mbak Muji
atas segala doa, kasih sayang, dan dorongan semangat yang telah diberikan.
Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat.


Bogor, April 2008





Rahma Juwita Zamri


RIWAYAT HIDUP
Penulis dilahirkan di J akarta pada tanggal 05 Maret 1985 dari ayah KH Aby
Muhammad Zamri dan ibu J usmaniar. Penulis merupakan putri pertama dari lima
bersaudara.
Tahun 2003 penulis lulus dari SMUN 1 Cikarang Utara dan pada tahun yang sama
lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB. Penulis memilih
ProgramStudi Kimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.
Selama mengikuti perkuliahan, penulis menjadi asisten praktikum mata kuliah
Kimia TPB pada tahun ajaran 2006/2007, 2007/2008, Kimia Analitik pada tahun ajaran
2006/2007, Kimia Lingkungan pada tahun 2006/2007, Kimia Analitik Dasar D3 pada
tahun ajaran 2006/2007, Kimia Dasar D3 pada tahun ajaran 2007/2008, Spektroskopi I
D3 pada tahun ajaran 2007/2008, Kimia Makanan D3 pada tahun ajaran 2007/2008, dan
Anorganik Dasar D3 pada tahun ajaran 2007/2008. Penulis pernah aktif di kegiatan
organisasi kemahasiswaan, yaitu sebagai salah satu staf Departemen Kimia Pangan,
Ikatan Mahasiswa Kimia, dan sebagai salah satu staf Departemen Kajian dan J urnalistik
Islam DKM Al-Ghifari pada tahun 2006. Penulis mengikuti Program Kreativitas
Mahasiswa Bidang Penelitian (PKMP) dan dibiayai oleh Dikti dengan judul Daya
Antioksidan Ekstrak Tumbuhan Meniran (Phyllanthus niruri Linn), Daun Sendok
(Plantago major Linn) dan SomJ awa (Talinum paniculatum (jack) Gaertn) dengan
Metode Tiosianat dan DPPH pada tahun 2005. Penulis menyelesaikan praktik lapangan di
bagian Non-Soap Detergent PT Unilever Indonesia, Tbk pada tahun 2006 dengan judul
Penentuan Bulk Density Powder Detergen dan Pengaruhnya Terhadap Proses
Pengemasan.


DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR TABEL ..................................................................................................... viii

DAFTAR GAMBAR ................................................................................................ viii

DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................. viii

PENDAHULUAN .................................................................................................... 1

TINJ AUAN PUSTAKA
Seledri (Apium graveolens L.) ......................................................................... 1
Flavonoid ........................................................................................................ 1
Apigenin ......................................................................................................... 2
Validasi ........................................................................................................... 2
Linearitas ........................................................................................................ 2
Limit Deteksi .................................................................................................. 3
Limit Kuantifikasi ........................................................................................... 3
Ketelitian ........................................................................................................ 3
Ketepatan ........................................................................................................ 3
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi .................................................................... 3

BAHAN DAN METODE
Bahan dan Alat................................................................................................. 4
Metode Penelitian ............................................................................................ 4

HASIL DAN PEMBAHASAN
Uji Pendahuluan .............................................................................................. 6
Ekstraksi Apigenin .......................................................................................... 6
Analisis dengan KLT ....................................................................................... 7
Linearitas ........................................................................................................ 7
Limit Deteksi dan Limit Kuantifikasi ............................................................... 8
Ketelitian ........................................................................................................ 9
Ketepatan ........................................................................................................ 9

SIMPULAN DAN SARAN
Simpulan ......................................................................................................... 9
Saran ............................................................................................................... 9

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................................ 9

LAMPIRAN ............................................................................................................. 11


DAFTAR TABEL

Halaman
1 Data rendemen ekstrak seledri ................................................................................ 6
2 Hasil analisis dengan KLT ...................................................................................... 7
3 Persamaan regresi linear dan koefisien korelasi kurva standar ................................ 7
4 Parameter statistika kurva standar rerata (n=3) ........................................................ 8
5 Penentuan kadar apigenin ....................................................................................... 8
6 Rerata persen perolehan kembali ............................................................................ 9



DAFTAR GAMBAR

Halaman
1 Struktur umum senyawa flavonoid ......................................................................... 1
2 Struktur apigenin .................................................................................................... 2
3 Kromatogramhasil KLT standar apigenin dengan ekstrak ...................................... 7
4 Kurva standar rerata ............................................................................................... 7



DAFTAR LAMPIRAN

Halaman
1 Bagan alir penelitian ............................................................................................. 12
2 Hasil analisis kadar air seledri .............................................................................. 13
3 Data rendemen hasil ekstraksi seledri .................................................................... 14
4 Nilai R
f
dan warna bercak hasil KLT ..................................................................... 15
5 Linearitas ulangan 1 .............................................................................................. 16
6 Linearitas ulangan 2 .............................................................................................. 18
7 Linearitas ulangan 3 .............................................................................................. 20
8 Parameter statistika kurva standar rerata ............................................................... 22
9 Penentuan limit deteksi dan limit kuantifikasi ........................................................ 24
10 Penentuan ketelitian ............................................................................................. 25
11 Penentuan persen perolehan kembali .................................................................... 28


PENDAHULUAN

Seledri merupakan salah satu tanaman
obat yang berperan dalammengatasi penyakit
rematik dan asamurat. Komponen metabolit
sekunder yang berhasil diisolasi dari seledri di
antaranya glikosida, apiin, apiol, dan
flavonoid yang bermanfaat sebagai obat
peluruh keringat, penurun demam, rematik
sukar tidur, dan darah tinggi. Selain itu pada
seledri juga ditemukan apigenin, manit,
inositol, asparigina, glutamina, kolina, dan
linamarosa (Soedibyo 1998).
Apigenin merupakan salah satu senyawa
yang terdapat dalam seledri dan dapat
digunakan sebagai obat asam urat (Duke
1999). Metode yang digunakan untuk
penentuan kadar apigenin adalah metode yang
dikemukakan oleh Frankee et al. (2005).
Analisis kadar apigenin pada penelitian ini
menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi
(KCKT) karena metode tersebut memiliki
sensitivitas yang tinggi dan memerlukan
jumlah contoh yang sedikit (beberapa l).
Hasil analisis yang akurat dan absah akan
diperoleh apabila metode yang digunakan
telah divalidasi terlebih dahulu.
Validasi adalah sebuah evaluasi mengenai
ketepatan dan ketelitian dari suatu prosedur
analisis yang layak digunakan untuk
menyelesaikan masalah. Validasi menjamin
bahwa prosedur yang sama mendapatkan hasil
yang dapat dibandingkan. Nisbah analisis ini
dapat digunakan untuk mengevaluasi
ketelitian dan ketepatan. Untuk meyakinkan
bahwa metode analisis dapat digunakan dan
menjamin mutu produk yang dihasilkan sesuai
persyaratan, maka metode tersebut harus
divalidasi. Parameter yang diuji dalam
penelitian ini meliputi linearitas, limit deteksi,
limit kuantifikasi, ketelitian, dan ketepatan.
Penelitian ini bertujuan mengetahui keabsahan
data yang dihasilkan dari metode Frankee et
al. (2005).


TINJAUAN PUSTAKA

Seledri (Apium graveolens)

Apium graveolens adalah daun seledri dari
famili Apiaceae atau Umbelliflorae. Ciri
makroskopis simplisia daun seledri berupa
daun tunggal atau majemuk semu, tangkai
silindris beralur, panjang tangkai 515 cm.
Daun seledri berbentuk segi tiga, dengan
ujung runcing, pangkal berlekuk, tepi
bergerigi dan panjang 1025 cm. Dalam
keadaan kering daun seledri menggulung,
berwarna hijau kecoklatan, berbau aroma
kuat, rasa manis sedikit pahit (Djumidi et al.
1998).
Menurut Soedibyo (1998), kandungan
kimia seledri adalah apiin, apigenin, manit,
inositol, asparagina, glutamina, kolina, dan
linamarosa. Kandungan seledri daun tiap 100
g ialah 89 g air, 2,20 g protein, 0,60 g lemak,
4,60 g karbohidrat, 1,40 g serat, 1,70 g abu,
2685 IU vitamin A, 0,08 mg vitamin B1, 0,12
mg vitamin B2, 0,60 mg niasin, 49 mg
vitamin C, 326 mg Ca, 51 mg P, 15,30 mg Fe,
151 mg Na, 318 mg K (Susiarti 2000).
Tanaman seledri juga dimanfaatkan untuk
pengobatan tradisional, misalnya untuk obat
tekanan darah tinggi, diuretik, emenagog
(memperlancar haid), dengeu (demamdisertai
lini pada sendi-sendi dan otot), dan rematik.
Tanaman ini juga dapat digunakan untuk
melangsingkan tubuh. Di pedesaan Jawa
Barat, daun seledri dimanfaatkan untuk
menyuburkan rambut, selain lidah buaya dan
daun dadap (Susiarti 2000).


Flavonoid

Flavonoid merupakan golongan terbesar
senyawa fenolik di samping fenol sederhana,
fenilpropanoid, dan kuinonfenolik (Harborne
1986). Sebanyak 2% dari seluruh karbon yang
difotosintesis oleh tanaman diubah menjadi
flavonoid atau senyawa yang berhubungan
erat dengannya (Markham 1988). Dalam
tumbuhan, aglikon flavonoid terdapat dalam
berbagai bentuk struktur. Semuanya
mengandung 15 atomC dalaminti dasarnya
yang tersusun dalam konfigurasi C
6
-C
3
-C
6
,
yaitu dua cincin aromatik dihubungkan oleh 3
karbon yang dapat atau tidak dapat
membentuk cincin ketiga. Cincin diberi nama
A, B, dan C, atomkarbon dinomori menurut
sistempenomoran yang menggunakan angka
untuk cincin A dan C serta angka beraksen
untuk cincin B. Struktur umum flavonoid
dapat dilihat pada Gambar 1.

Gambar 1 Struktur umumsenyawa
flavonoid (Markham1988).
A
B
C

Flavonoid umumnya secara alami
terbentuk di bawah pengaruh bioflavonoid
(vitamin D) yang selalu ada dalamtanaman
dan memiliki efek yang bermanfaat terhadap
lebih dari 50 penyakit (Heldt 1997). Flavonoid
akan berubah warnanya jika ditambah basa
atau amonia sehingga mudah dideteksi pada
kromatogram atau pada larutan (Harborne
1986).
Flavonoid, tanin, lignan, dan lignin
merupakan turunan fenilalanina dan pada
beberapa tanaman ada yang berasal dari
tirosina. Fenilalanina dan tirosina terbentuk
dari jalur sikimat. Karena senyawa fenolik
berasal dari dua asamamino yang memiliki
cincin fenil dengan C
3
sebagai rantai samping,
mereka dinamai fenilpropanoid. Flavonoid
yang meliputi flavon, isoflavon, dan
antosianidin, sebagaimana struktur
fenilpropana, mengandung sebuah cincin
kedua yang terbentuk dari tiga molekul asetil
koenzimA (Heldt 1997). Flavon merupakan
prekursor untuk beberapa flavonoid


Apigenin

Apigenin merupakan komponen flavonoid
utama dari seledri yang termasuk ke dalam
golongan flavon (Harborne 1986). Gambar 2
menunjukkan struktur kimia apigenin. Rumus
molekulnya adalah C
15
H
10
O
5
dengan bobot
molekul 270,23 g/mol. Nama Intenational
Union of Pure and Applied Chemistry dari
apigenin adalah 5,7-dihidroksi-2-(4-
hidroksifenil)-4H-1-benzopiran-4-on. Titik
leleh apigenin 345350 C. Apigenin
memiliki banyak kegunaan, salah satunya
dalam bidang farmasi. Senyawa ini dapat
digunakan sebagai obat asam urat (Duke
1999).


Gambar 2 Struktur apigenin
(Markham1988).

Penelitian sebelumnya yang dilakukan
oleh Hertog et al. (1992) mengemukakan
bahwa kadar apigenin pada seledri yang
direfluks dengan metanol 50% adalah 1787
mg/kg bobot kering seledri. Kemudian,
Crozier et al. (1997) mengemukakan bahwa
kadar apigenin dalam seledri bervariasi
bergantung dari jenis seledri yang dianalisis,
kadar apigenin dalamseledri bervariasi antara
17 dan 191 g/g bobot segar seledri. Baru-
baru ini, Laura (2007) mengemukakan bahwa
kadar apigenin dalamseledri berkisar antara 2
dan 17 ppm bergantung pada masa tanam
seledri.


Validasi

Validasi menurut Harmita (2004)
merupakan suatu tindakan penilaian terhadap
parameter tertentu berdasarkan percobaan
laboratorium untuk membuktikan bahwa
parameter tersebut memenuhi persyaratan
untuk penggunaannya. Validasi menurut SK
Menkes RI No. 43/Menkes/SK/II/1988
tentang cara pembuatan obat yang baik
(CPOB) merupakan suatu tindakan
pembuktian dengan cara yang sesuai bahwa
tiap bahan, prosedur, kegiatan, sistem,
perlengkapan, atau mekanisme yang
digunakan dalam produksi dan pengawasan
akan senantiasa mencapai hasil yang
diinginkan (Depkes RI 2001). Association of
South East Asian Nation Good Manufacturing
Practice (ASEAN GMP) menyatakan bahwa
validasi adalah kegiatan membuktikan dengan
pasti bahwa material, proses, prosedur,
aktivitas, sistem, peralatan, atau mekanisme
yang digunakan di pabrik akan mencapai hasil
yang diharapkan pada standar yang konsisten
(ASEAN 1996).
Validasi metode menurut Association of
Official Analytical Chemist (AOAC)
(2002) adalah suatu proses yang menetapkan
bahwa karakteristik suatu metode yang
ditemukan dapat memenuhi kebutuhan untuk
aplikasi analisis yang diharapkan dengan cara
studi laboratorium. Validasi menurut Levin
(2002) dibagi menjadi empat kelas, yaitu kelas
A, B, C, dan D. Kelas A digunakan untuk
identifikasi suatu senyawa. Kelas B digunakan
untuk mendeteksi dan menentukan adanya
pengotor. Kelas C dapat menentukan senyawa
secara kuantitatif dan kelas D untuk mencari
ciri suatu senyawa.

Linearitas

Linearitas menunjukkan kemampuan suatu
metode analisis untuk memperoleh hasil
pengujian yang sesuai dengan konsentrasi
analit dalamcontoh pada kisaran konsentrasi
tertentu (AOAC 2002). Linearitas suatu
metode analisis adalah ukuran yang
menunjukkan tingkat kesesuaian atau korelasi

antara kadar analit dan respons detektor,
dinyatakan sebagai koefisien korelasi (r)
(Depkes 2001). Respons detektor yang
digunakan adalah luas area puncak untuk
instrumen KCKT. Koefisien korelasi didapat
dengan menghitung regresi dari persamaan
linearnya, sedangkan perpotongan dengan
sumbu y menyatakan ukuran biasnya. Selang
linearitas adalah selang antara konsentrasi
tertinggi dan terendah dari analit yang dapat
ditetapkan menggunakan suatu metode
dengan tingkat, ketelitian, kecermatan, dan
koefisien korelasi yang telah dilakukan. Nilai
r yang dihasilkan lebih besar atau sama
dengan 0.9900 (AOAC 2002). Secara
matematis, nilai r dapat dihitung dengan
menggunakan rumus
r =
| || | { }
( ) ( )
2 / 1
2
2
)
`

y y x x
y y x x
i i
i i

dengan
r =koefisien korelasi
x
i
=konsentrasi analit setiap ulangan
x =konsentrasi analit rerata
y
i
=luas area puncak setiap ulangan
y
=luas area puncak rerata


Limit Deteksi

Limit deteksi (LD) menurut AOAC (2002)
adalah konsentrasi analit terendah di dalam
suatu contoh yang dapat dideteksi tetapi tidak
harus terkuantitasi pada kondisi percobaan
yang ditetapkan. Umumnya nisbah respons
antara analit:derau adalah 3:1. LD dihitung
dari rerata kemiringan garis dan simpangan
baku intersep kurva standar yang diperoleh.

Limit Kuantifikasi

Limit kuantifikasi adalah konsentrasi
analit terendah yang terdapat dalam contoh
yang dapat diukur secara tepat dan teliti
(AOAC 2002). LK dapat dihitung sebagai
konsentrasi analit yang memiliki respons
analit:derau sebesar 10:1 (Green 1996; ICH
1995). LK dihitung dari rerata kemiringan
garis dan simpangan baku intersep kurva
standar yang diperoleh.


Ketelitian
Ketelitian dapat dinyatakan dengan tiga
cara, yaitu kedapatulangan, ketelitian
intermediet, dan ketertiruan. Ketelitian
menurut AOAC (2002) adalah kesamaan hasil
dari tiap individu ketika metode tersebut
diterapkan berulang kali pada berbagai
pencuplikan suatu contoh homogen. Ketelitian
diukur dengan menghitung simpangan baku
relatif (SBR) dari lima kali pengukuran ulang.
Menurut AOAC syarat penerimaan parameter
validasi ini, sebagai berikut: sangat teliti
(%SBR <1), teliti (%SBR 1-2), sedang
(%SBR 2-5), dan tidak teliti (%SBR >5)


Ketepatan

Ketepatan suatu prosedur analisis
didefinisikan sebagai kedekatan hasil yang
diterima (baik sebagai nilai teoretis maupun
dengan nilai rujukan yang diterima) dengan
nilai yang diperoleh dari hasil pengukuran
(ICH 1995 diacu dalam Chan 2004).
Ketepatan menurut AOAC (2002) adalah
kedekatan nilai hasil percobaan yang
diperoleh dari suatu metode terhadap nilai
sebenarnya. Ketepatan diukur dengan
menghitung perolehan kembali (PK)
menggunakan metode penambahan standar.
Nilai PK bergantung pada matriks contoh,
prosedur proses contoh, dan konsentrasi
analit. Batas penerimaan PK menurut AOAC
adalah 80120%.


Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
(KCKT)

KCKT adalah suatu teknik analisis
kromatografi dengan menggunakan tekanan
tinggi yang berguna untuk pemisahan ion atau
molekul terlarut dalamsuatu larutan. Teknik
ini berkembang untuk mengatasi kelemahan-
kelemahan pemisahan pada kromatografi gas,
seperti senyawa yang relatif tidak tahan panas
dan senyawa yang tidak volatil.
KCKT berdasarkan kepolaran kolomnya
dibagi menjadi dua, yaitu fase normal dan
terbalik. Kromatografi fase normal
menggunakan fase diamlebih polar daripada
fase gerak, sedangkan pada kromatografi fase
terbalik, fase gerak lebih polar daripada fase
diam. Proses pemisahan campuran komponen
terjadi di dalam kolom, yaitu berdasarkan
perbedaan distribusi masing-masing
komponen pada fase diamdan fase gerak. Zat-
zat yang berinteraksi kuat dengan fase diam
akan tertahan lebih lama dalam kolom,
sedangkan yang berinteraksi lemah akan

keluar dengan cepat dari kolom (Christian
1986).
KCKT terdiri atas beberapa bagian, yaitu
sistemeluen, sistemtekanan, injeksi contoh,
kolom, dan sistemdeteksi. Sistemeluen pada
KCKT dapat menggunakan berbagai macam
pelarut, biasanya air dan pelarut organik.
Eluen yang digunakan dapat berupa pelarut
tunggal atau campuran dari dua atau lebih
pelarut. Keadaan ini menyebabkan ada dua
jenis sistemelusi, yaitu isokratik dan gradien.
Pada sistemisokratik eluen tidak mengalami
perubahan konsentrasi, jika sebaliknya disebut
sistem elusi gradien. Sistem tekanan pada
KCKT menggunakan pompa bertekanan
tinggi. Pompa harus tahan terhadap semua
jenis pelarut, dapat mencapai tekanan sampai
6000 psi, dapat mengantarkan aliran terukur
0.011.0 atau 0.120 ml/menit.
Injeksi contoh pada KCKT menggunakan
syringe dengan volume 550 l. Kolompada
KCKT ada dua jenis, yaitu kolompelindung
dan kolom pemisahan. Kolom pelindung
digunakan untuk menahan zat-zat pengotor
yang dapat menyumbat kolom pemisahan
sehingga memperpanjang masa pakainya.
Kolom pelindung atau prakolom sering
dipasang antara katup pemasukan dan kolom
utama. Kolom pelindung ini sering
mengandung kemasan yang serupa dengan
kemasan yang dipakai dalam kolom utama,
tetapi butirannya yang lebih keras dan lebih
besar (2040 m), (Gritter et al. 1991).
Kolom ini memiliki panjang 1030 cm
dengan diameter 310 mm dan diisi dengan
fase diam. Sistem deteksi pada KCKT
menggunakan beberapa macam detektor.
Detektor ultraviolet (UV) dapat berfungsi jika
pelarut mengandung kromofor UV (benzena
atau toluena) atau jika zat terlarut mempunyai
gugus fungsi C=C, C=O, N=O, dan
N=N. Sel detektor yang bersih sangat
menentukan pada pendeteksian yang teliti
(Meloan 1999).


BAHAN DAN METODE

Bahan dan Alat
Bahan-bahan yang digunakan adalah
seledri, standar apigenin untuk KLT dengan
kemurnian 95%, Mg, HCl 37%, etanol 95%,
amil alkohol, metanol : air (5:4), HCl 1,2 M,
hidroksitoluena terbutilasi (BHT), asamasetat
10%, asetonitril, akuabides, dan akuades.
Alat-alat yang digunakan adalah
seperangkat alat refluks, radas penguap putar,
alat-alat kaca, neraca analitik Sartorius,
eksikator, oven, bejana pengembang Camag,
pipa kapiler, sonikator Branson 1510,
perangkat KCKT Hitachi dengan detektor
UV-Vis L-2420, dan saringan 0,45 m.


Metode Penelitian

Penyiapan Bahan Baku
Seledri diperoleh dari Kecamatan Milir,
Kabupaten Bandungan, provinsi Jawa Tengah
dalam bentuk kering. Seledri yang sudah
kering kemudian dihaluskan. Bagan alir
penelitian dapat dilihat pada Lampiran 1

Penetapan Kadar Air (Depkes 1995)
Cawan porselen dikeringkan pada suhu
105 C selama 30 menit, lalu ditempatkan di
dalameksikator dan ditimbang. Seledri yang
telah dihaluskan ditimbang sekitar 5 g dan
dimasukkan ke dalamcawan tersebut. Contoh
beserta cawannya dikeringkan pada suhu 105
C selama 3 jam, dimasukkan ke dalam
eksikator, dan ditimbang kembali.
Pengeringan dan penimbangan dilakukan
berulang kali sampai diperoleh bobot tetap
dengan selisih kurang lebih 0,0001 g.
Pekerjaan dilakukan sebanyak tiga kali
ulangan.
Kadar air =
a
b a

dengan
a =bobot contoh sebelumdikeringkan (g)
b =bobot contohl setelah dikeringkan (g)


Ekstraksi Apigenin (Frankee et al. 2005)
Ekstraksi sekaligus hidrolisis flavon
dilakukan dengan menambahkan 225 ml
metanol:air (5:4) ke dalam5 g seledri dengan
0,05 g BHT sebagai antioksidan dan 25 ml
HCl 1,2 M. Campuran disonikasi selama satu
menit, sebelum direfluks selama 2 jam.
Ekstrak lalu disaring dan dipekatkan dengan
radas penguap putar.

Uji Flavonoid (Harborne 1986)
Sebanyak 1 gramekstrak dimasukkan ke
dalamgelas piala kemudian ditambahkan 100
ml air panas dan dididihkan selama 5 menit.
Setelah itu larutan disaring dan filtratnya
digunakan untuk pengujian. Sebanyak 10 ml
filtrat ditambahkan 0,50 g serbuk Mg, 2 ml
alkohol klorhidrat (campuran HCl 37% dan
etanol 95%), dan 2 ml amil alkohol.
Terbentuknya warna merah, kuning, dan

jingga pada lapisan amil alkohol menunjukkan
keberadaan flavonoid.

Analisis dengan Kromatografi Lapis Tipis
(KLT)
Ekstrak dan standar apigenin ditotolkan
pada lempeng silika gel GF
254
sebagai fase
diam. Fase gerak yang digunakan adalah
kloroform:metanol (9,5:0,5). Lempeng silika
gel dimasukkan ke dalambejana pengembang
yang berisi fase gerak yang telah dijenuhkan.
Setelah selesai, lempeng tersebut
dikeringudarakan dan dilakukan pengamatan
bercak dengan menggunakan lampu UV pada
panjang gelombang 365 nm

Analisis dengan Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi (Frankee et al. 2005)
Kadar apigenin dianalisis menggunakan
KCKT. Kolom yang digunakan adalah kolom
fase terbalik C
18
yang berisi silika dengan
detektor ultraviolet (UV). Elusi dengan laju
alir sebesar 0,60 ml/menit. Digunakan
campuran eluen asam asetat 10% (A) dan
metanol/asetonitril/air (0,8:1:1; v/v/v) (B).
Elusi diikuti dengan gradien linear dengan
konsentrasi B dalamA (v/v) dari 0% sampai
50% selama 20 menit, dari 50% kembali ke
40% dalam0,1 menit, lalu dipertahankan pada
40% selama 10 menit. Kemudian dilanjutkan
dari 40% ke 95% selama 15 menit, dari 95%
ke 10% dalam3 menit dengan kesetimbangan
selama 10 menit sebelum injeksi yang
berikutnya. Kadar apigenin diukur pada 333
nm.


Validasi Metode Penentuan Apigenin

Pembuatan Larutan Standar dan Contoh
Sebanyak 10 mg serbuk apigenin
dimasukkan ke dalam gelas piala dan
ditambahkan 30 ml metanol pa, kemudian
dipanaskan pada suhu 50
o
C sambil diaduk
dengan pengaduk magnetik sampai serbuk
benar-benar larut. Larutan ini dimasukkan ke
dalam labu takar 100 ml dan ditepatkan
dengan metanol. Larutan stok standar dengan
konsentrasi 100 mg/l (konsentrasi sebenarnya
95 mg/l) kemudian diencerkan menjadi 4, 6,
dan 8 mg/l (konsentrasi sebenarnya 3,8; 5,7;
dan 7,6 mg/l). Larutan ini digunakan pada uji
linearitas. Semua larutan disaring terlebih
dahulu dengan saringan 0,45 m sebelum
diinjeksikan ke dalamKCKT.
Ekstrak pekat yang dihasilkan dari proses
ekstraksi dilarutkan dengan metanol dan
disaring dengan kertas saring Whatman no 1,
lalu volumenya ditepatkan sampai 25 ml.
Sebanyak 5 ml contoh dipipet ke dalamlabu
takar 10 ml dan volumenya ditepatkan dengan
metanol. Sebanyak 2 ml contoh yang telah
diencerkan diekstraksi fase padat (SPE).
Kemudian contoh disaring dengan saringan
0,45 m sebelum diinjeksikan ke dalam
KCKT. Larutan ini digunakan pada uji
ketelitian.

Linearitas
Sebanyak tiga seri deret larutan standar
disiapkan dengan konsentrasi 3,8; 5,7; dan 7,6
ppm. Masing-masing konsentrasi dibuat
sebanyak tiga kali ulangan. kemudian setiap
larutan diukur dengan KCKT pada kondisi
yang telah ditentukan dan dibuat persamaan
linearnya dengan metode regresi kuadrat
terkecil (y =a +bx). Peubah a menyatakan
intersep dan b adalah kemiringan garis dari
ketiga deret standar yang diukur. Linearitas
kurva kalibrasi dilihat dari nilai koefisien
korelasi (r).

Limit Deteksi dan Limit kuantifikasi
Persamaan linear yang diperoleh pada uji
linearitas selanjutnya digunakan untuk
menghitung limit deteksi dan kuantifikasi. LD
dan LK dihitung dari rerata kemiringan garis
dan simpangan baku intersep kurva standar
yang diperoleh dengan rumus
LD =3,3
b
Sa
LK =10
b
Sa

dengan
LD =limit deteksi (mg/l)
LK =limit kuantifikasi (mg/l)
Sa =simpangan baku intersep kurva standar
(n =3)
b =rerata kemiringan garis kurva standar

Ketelitian
Larutan contoh yang telah disiapkan sesuai
dengan prosedur preparasi larutan contoh di
atas kemudian diukur dengan KCKT
sebanyak 5 kali ulangan pada hari yang sama.
Ketelitian diukur dengan menghitung
persentase simpangan baku relatif (%SBR)
dengan menggunakan rumus
SB =
( )
1
2
1

=
n
x x
i
n
i


SBR (%) =
x
SB 100

dengan
SB =simpangan baku

SBR =simpangan baku relatif
x
i
=kadar apigenin tiap ulangan
x =rerata kadar apigenin
n =banyaknya ulangan (n =5)

Ketepatan
Ketepatan metode ini diuji dengan
menggunakan metode penambahan standar.
Larutan standar apigenin disiapkan dengan
konsentrasi 10 mg/l dan larutan stok contoh
dibuat dengan konsentrasi 10 mg/l. Sebanyak
2,50 ml contoh dipindahkan ke dalam labu
takar 10 ml dan ditambahkan larutan standar
apigenin masing-masing sebanyak 1,00; 6,50;
dan 7,00 ml kemudian volumenya ditepatkan
dengan metanol. Masing-masing larutan
dibuat tiga kali ulangan. Sebanyak 2 ml
larutan dimasukkan ke dalamSPE, kemudian
larutan disaring dengan saringan 0,45 m
sebelumdiinjeksikan ke dalamKCKT. Persen
perolehan kembali dihitung dengan rumus
(%PK) =
c
b a
100%
dengan
a =konsentrasi contoh +konsentrasi standar
yang terukur
b =konsentrasi contoh
c =konsentrasi standar teoretis yang
ditambahkan


HASIL DAN PEMBAHASAN

Uji Pendahuluan

Penentuan kadar air berguna untuk
mengetahui ketahanan suatu bahan yang akan
disimpan agak lama, karena kandungan air di
dalamsuatu bahan merupakan media tumbuh
bakteri dan mikroorganisme. Hal ini berkaitan
dengan kelembapan bahan tersebut. Hasil
analisis kadar air dapat dilihat pada Lampiran
2. Kadar air seledri kering diperoleh sebesar
6.05%, dengan kadar air yang cukup rendah
seledri kering ini dapat disimpan dalam
jangka waktu yang lama. Hal ini sesuai
dengan yang tertera pada monografi ekstrak
BPOM (2004) bahwa untuk seledri nilai kadar
air yang baik adalah tidak lebih besar dari
9.3%. Selain itu menurut Winarno (1997) bila
kadar air yang terkandung dalam bahan
berkisar antara 3 dan 7% maka kestabilan
optimum bahan akan tercapai dan
pertumbuhan mikrob dapat dikurangi.
Kadar air juga dapat dipakai untuk
menentukan kadar zat aktif berdasarkan bobot
keringnya karena jumlah air yang terkandung
bergantung pada perlakuan yang telah dialami
bahan dan kelembaban udara tempat
penyimpanan. Bahan yang sama jika
dianalisis pada waktu yang sama dapat
menghasilkan kadar zat aktif yang berbeda
jika kelembaban bahan tersebut berubah.
Uji fitokimia yang dilakukan hanya uji
flavonoid. Uji ini dilakukan untuk mengetahui
bahwa apigenin yang merupakan golongan
flavonoid terdapat dalamcontoh. Terbentuk
warna kuning dalam pengujian yang
menandakan bahwa bahan tersebut positif
mengandung flavonoid.


Ekstraksi Apigenin

Apigenin diekstraksi dengan metode
refluks menggunakan pelarut metanol:air
(5:4). Metode ini digunakan karena sifat
apigenin yang tahan terhadap panas dengan
titik leleh 345350 C. Kondisi ekstraksi ini
memungkinkan apigenin yang terekstrak dari
seledri tersebut tidak rusak dan dapat
dianalisis. HCl 1,2 M juga ditambahkan untuk
menghidrolisis ikatan glikosida yang terdapat
pada flavonoid sehingga diharapkan flavonoid
bebas yang terekstrak. Antioksidan BHT juga
ditambahkan untuk mencegah apigenin
teroksidasi. Hal ini disebabkan flavonoid tidak
stabil terhadap cahaya, oksidasi, dan
perubahan kimia. Faktor-faktor ini dapat
mengubah struktur flavonoid sehingga
keaktifannya menurun bahkan hilang
(Funamaya et al. 1993)
Pemilihan pelarut metanol:air (5:4) dan
HCl 1,2 M didasarkan pada penelitian yang
telah dilakukan oleh Frankee et al. (2005) dan
Crozier et al. (1997). Pelarut tersebut bersifat
polar, sehingga diharapkan dapat menarik
apigenin dari seledri. Apigenin bersifat polar
karena mengandung gugus OH, maka
memiliki kelarutan yang tinggi pada alkohol
hangat. Pada Tabel 1 dan Lampiran 3
disajikan data rendemen ekstrak dari lima kali
ulangan ekstraksi.

Tabel 1 Data rendemen ekstrak seledri

Ulangan
Bobot
Seledri (g)
Bobot
Ekstrak (g)
Rendemen
(%)
1 5,0000 1,7945 35,89
2 5,0000 1,5304 30,61
3 5,0000 1,5286 30,58
4 5,0000 1,7286 34,57
5 5,0000 1,6304 32,61
Rerata 32,85

Analisis dengan KLT

Analisis kandungan apigenin dalam
ekstrak dilakukan dengan KLT. Eluen
pengembang yang digunakan adalah
kloroform:metanol dengan nisbah komposisi
9,50:0,50. Lempeng KLT yang digunakan
adalah silika gel GF
254
karena lempeng ini
mengandung indikator fluoresens yang akan
membuat lempeng tersebut bersinar jika
dikenai sinar yang tepat pada daerah UV
(Gritter et al. 1991)
Gambar 3 merupakan kromatogram
ekstrak seledri setelah disinari UV 365 nm.
Lempeng KLT tampak berwarna ungu dan
semua bercak menjadi bercak berwarna gelap
setelah disinari UV 365 nm. Nilai R
f
dan
warna bercak standar apigenin dan ekstrak
hasil ekstraksi dapat dilihat pada Tabel 2
berikut dan pada Lampiran 4.

Tabel 2 Hasil analisis dengan KLT
Sampel Bercak
J arak
tempuh
(mm)
Rf
Warna
Bercak
Standar
apigenin
tunggal 30,00 0,3529 Gelap
ekstrak enam 30,00 0,3529 Gelap

Standar apigenin muncul dengan bercak
tunggal berwarna gelap dan tidak berekor. Hal
ini menunjukkan bahwa standar yang
digunakan memiliki kemurnian yang baik.
Nilai R
f
standar apigenin 0,3529. Contoh
mengandung apigenin karena memiliki R
f

yang sama dengan standar apigenin.
Banyaknya bercak menunjukkan adanya
senyawa selain apigenin yang ikut terekstrak
yang diduga akan mengganggu analisis pada
KCKT.


Gambar 3 Kromatogramhasil KLT
standar apigenin dengan ekstrak.


Validasi Metode Penentuan Kadar
Apigenin dengan KCKT

Linearitas
Uji linearitas merupakan suatu metode
analisis yang menggambarkan kemampuan
suatu alat untuk memperoleh hasil pengujian
yang sebanding dengan kadar analit dalamzat
uji pada rentang kadar tertentu. Linearitas
metode penentuan kadar apigenin dengan
KCKT ditentukan dengan cara membuat
kurva hubungan antara konsentrasi standar
pada sumbu x dan luas area pada sumbu y.
Konsentrasi yang digunakan adalah 3,8; 5,7;
dan 7,6 mg/l.
Pengujian parameter ini dilakukan
sebanyak tiga kali ulangan. Tabel 3
menyajikan persamaan regresi linear dari
masing-masing kurva standar. Linearitas
dinyatakan dalam koefisien korelasi (r).
Berdasarkan hasil pengujian, diperoleh
koefisien korelasi dari tiga kali ulangan
berkisar antara 0,9900 dan 0,9998. Kurva
standar rerata nilai r sebesar 0,9970. Menurut
AOAC (2002) nilai ini memenuhi syarat yang
ditetapkan, yaitu 0,9900. Nilai koefisien
korelasi yang tinggi menunjukkan hubungan
yang linear antara sinyal detektor yang terukur
dan jumlah apigenin dalam contoh.
Kromatogramlinearitas apigenin dapat dilihat
pada Lampiran 47.
y =1440340.834 +576365.8771x
r =0.9970
0
2000000
4000000
6000000
8000000
0.0000 2.0000 4.0000 6.0000 8.0000
Konsentrasi Apigenin (ppm)
L
u
a
s

A
r
e
a

P
u
n
c
a
k

Gambar 4 Kurva standar rerata

Tabel 3 Persamaan regresi linear dan
koefisien korelasi kurva standar
Ulangan
Persamaan Regresi
Linear
Koefisien
Korelasi
1
y =2439535,667 +
414297,8947x
0,9998
2
y =738960,667 +
777575,7895x
0,9900
3
y =1142526,167 +
537223,947x
0,9993
Rerata
y = 1440340,834 +
576365,8771x
0,9970


Apigenin
standar
Apigenin
contoh

Persamaan regresi linear untuk kurva
standar rerata adalah y = 1440340,834 +
576365,8771x (Gambar 4). Nilai intersep (a)
dan batas galatnya (tSa) pada selang
kepercayaan 95% adalah sebesar
1440340,834 1320019,476 (Tabel 4). Nilai
intersep menyatakan adanya pengaruh matriks
pada larutan yang dianalisis. Nilai intersep
yang semakin jauh dari nol dipengaruhi oleh
matriks dalam larutan yang semakin besar.
Hal ini dapat mengganggu penentuan analit
dalamcontoh yang akan dianalisis. Persamaan
regresi kurva standar rerata mempunyai
intersep yang sangat jauh dari nol, yaitu
1440340,834 1320019,476 sehingga matriks
contoh sangat mempengaruhi penentuan kadar
apigenin. Salah satu cara menangulanginya
adalah dengan menggunakan larutan yang
masih segar dan belumdisimpan terlalu lama.
Nilai kemiringan garis menyatakan
sensitivitas suatu metode. Nilai kemiringan
garis yang besar menunjukkan bahwa
perubahan konsentrasi yang kecil sangat
berpengaruh terhadap sinyal detektor yang
dihasilkan, sehingga metode dapat dikatakan
mempunyai sensitivitas yang sangat baik.
Nilai kemiringan garis (b) dan batas galatnya
(tSb) adalah 576365,8771 129011,2963
(Tabel 4). Nilai ini sangat besar sehingga
perubahan konsentrasi yang sangat kecil akan
berpengaruh terhadap perubahan sinyal
detektor. Contoh perhitungan parameter
statistika kurva standar dapat dilihat pada
Lampiran 8.

Tabel 4 Parameter statistika kurva standar
rerata (n =3)
Parameter Statistika
Persamaan regresi
linear
y =1440340,834 +
576365,8771x
Intersep (a) 1440340,834
Sa 475511,3386
tSa 1320019,476
Kemiringan garis (b) 537223,947
Sb 46473,8099
tSb 129011,2963
Koefisien korelasi (r) 0,9970


Limit Deteksi dan Limit Kuantifikasi

Limit deteksi (LD) dan kuantifikasi (LK)
ditentukan dari persamaan regresi linear kurva
standar rerata hasil penentuan uji linearitas.
Limit deteksi ditentukan untuk mengetahui
konsentrasi analit terendah yang dapat diukur
dan antara sinyal derau dengan analit dapat
dibedakan. Kedua parameter ini mempunyai
nilai yang berbeda bergantung pada metode
yang digunakan, walaupun peralatan yang kita
gunakan sama. Limit deteksi metode ini
adalah sebesar 2.7222 mg/l. Nilai ini
menunjukkan bahwa sinyal antara apigenin
dengan derau dapat dibedakan pada
konsentrasi terendah 2.7222 mg/l. Instrumen
ini tidak dapat membedakan sinyal antara
derau dengan apigenin pada konsentrasi di
bawah ini.
Limit kuantifikasi ditentukan untuk
mengetahui konsentrasi terendah yang dapat
ditentukan oleh suatu metode pada tingkat
ketelitian dan ketepatan yang baik. Nilai limit
kuantifikasi berdasarkan hasil uji adalah
sebesar 8.2500 ppm. Konsentrasi analit yang
terukur di bawah nilai ini memberikan
ketelitian dan ketepatan yang kurang baik.
Perhitungan limit deteksi dan limit
kuantifikasi disajikan pada Lampiran 9.


Ketelitian

Ketelitian metode ini ditentukan sebanyak
lima kali ulangan dan hanya dilakukan pada
hari yang sama. Ketelitian yang dilakukan
adalah kedapatulangan karena dilakukan oleh
operator, instrumen, peralatan, dan
laboratorium yang sama. Kedapatulangan
dapat digunakan untuk mengetahui adanya
galat acak yang berasal dari preparsi contoh,
seperti penimbangan, ekstraksi contoh,
pembuatan larutan, penyaringan, proses SPE,
dan kondisi instrumen KCKT yang
digunakan. Hasil penelitian menunjukkan
bahwa %SBR sebesar 3,85% (Tabel 5).
Menurut AOAC nilai %SBR yang berada
pada kisaran 25% sehingga dapat dikatakan
memiliki metode dengan ketelitian sedang.
Nilai %SBR di atas 2% menunjukkan bahwa
galat acak yang berasal dari penyiapan larutan
sangat mempengaruhi hasil analisis secara
nyata, galat acak terbesar diduga dari proses
penyaringan dan proses SPE. Perhitungan
ketelitian dapat dilihat pada Lampiran 10.

Tabel 5 Penentuan kadar apigenin
Ulangan Kadar Apigenin (%b/b)
1 0.0055
2 0.0050
3 0.0050
4 0.0053
5 0.0050
Rerata 0.0052
SBR (%) 3.85



Ketepatan

Ketepatan metode ini ditentukan dengan
metode penambahan standar dan dinyatakan
sebagai persen perolehan kembali. Perolehan
kembali merupakan jumlah standar yang dapat
diperoleh kembali setelah ditambahkan ke
dalamcontoh. Ketepatan dapat menunjukkan
adanya galat sistematik yang dapat
mempengaruhi metode analisis. Galat
sistematik dapat menyebabkan hasil analisis
menjadi lebih besar atau lebih kecil dari nilai
yang seharusnya. Berikut ini merupakan
beberapa contoh penyebab galat sistematik,
yaitu galat pada saat pengambilan contoh,
kurva kalibrasi yang tidak linear, dan galat
yang disebabkan oleh kondisi instrumen serta
alat-alat kaca yang digunakan.
Penentuan ketepatan dilakukan dengan
menambahkan apigenin sebanyak 0,0100;
0,0650; dan 0,0700 mg ke dalam contoh
ekstrak yang berisi 0,0279 mg apigenin.
Perolehan kembali berkisar antara 95,00 dan
118,77% (Tabel 6). Menurut AOAC (2002)
nilai perolehan kembali ini masih berada pada
kisaran yang ditetapkan, yaitu 80120%,
sehingga dapat dikatakan bahwa metode ini
mempunyai ketepatan yang baik. Perhitungan
perolehan kembali tertera pada Lampiran 11.

Tabel 6 Rerata persen perolehan kembali
Standar Apigenin (mg)
Ditambahkan Ditemukan
Perolehan
Kembali (%)
0.0100 0.0105 105.00
0.0650 0.0736 113.23
0.0700 0.0763 108.95


SIMPULAN DAN SARAN

Simpulan

Metode penentuan kadar apigenin dengan
KCKT mempunyai linearitas yang baik
dengan persamaan kurva standar rerata
y = 1440340,834 + 576365,8771x dan
r = 0,9970. Limit deteksi dan kuantifikasi
berturut-turut adalah 2,7222 dan 8,250 mg/l.
Metode ini mempunyai ketelitian yang sedang
dengan nilai %SBR sebesar 3,85%. Metode
ini juga mempunyai ketepatan yang baik
dengan persen perolehan kembali rerata
berkisar 105113,23%. Validasi metode ini
tergolong ke dalam kelas C, yaitu dapat
digunakan untuk menentukan kadar apigenin
secara kuantitatif.


Saran

Perlu dilakukan uji terhadap parameter
validasi yang lain, seperti selektivitas,
sensitivitas, ketangguhan, dan ketidakrataan.
Selain itu perlu dilakukan pengembangan
metode, yaitu optimasi untuk fase gerak
(eluen) yang digunakan pada KCKT supaya
diperoleh waktu retensi yang lebih singkat.
Selain itu perlu dilakukan efektivitas ekstraksi
untuk meningkatkan rendemen apigenin yang
diperoleh.


DAFTAR PUSTAKA
[AOAC] Association of Official Analytical
Chemists. 2002. AOAC International
methods committee guidelines for
validation of qualitative and quantitative
food microbiological official methods of
analysis. [terhubung berkala]. J AOAC Int.
85: 15. [2 Feb 2007].
[ASEAN] Association of South East Asian
Nations. 1996. Good Manufacturing
Practice Guidelines. Ed ke-3. Jakarta:
ASEAN.
[BPOM RI] Badan Pengawas Obat dan
Makanan Republik Indonesia. 2004.
Monografi Ekstrak Tumbuhan Obat
Indonesia Volume 1. Jakarta: BPOM RI.
Chan CC. 2004. Potency method validation.
Di dalam: Chan CC, Lee YC, Lam H,
Zhang XM, editor. Analytical Method
Validation and Instrument Performance
Verification. New Jersey: J Wiley.

Christian GD. 1986. Analytical Chemistry.
Kanada: J Wiley.
Crozier A, Jensen E, Lean MEJ, Mc Donald
MS. 1997. Quantitative analysis of the
flavonoids content of commercial
tomatoes, onions, lettuce, and celery.
[terhubung berkala]. J Agric Food Chem
45: 590593. [2 Feb 2007].
[Depkes RI] Departemen Kesehatan Republik
Indonesia. 2001. Petunjuk Operasional
Penerapan CPOB. Ed ke-2. Jakarta:
Depkes.

[Depkes RI] Departemen Kesehatan Republik
Indonesia. 1995. Farmakope Indonesia.
Ed ke-5. Jakarta: Depkes.
Djumidi et al. 1998. Simplisia Nabati. Jilid 1.
Jakarta: Depkes RI.
Duke JA. 1999. US. Department of
Agriculture Phytochemistry and
Ethnobotanical Database. [terhubung
berkala]. http://www.ars-grin.gov/duke/ [2
Feb 2007].
Frankee A, Custer LJ, Arakaki C, Murphy SP.
2005. Vitamin C and flavonoid levels of
fruits and vegetables consumed in Hawai.
[terhubung berkala]. J Food Composition
Anal 17: 1-35. [2 Feb 2007].
Funamaya et al. 1993. A new microorganism
producing a glucocyl transfer enzym to
polyphenols. Biosci Biotech Biochem 58:
817820.
Green JM. 1996. A Practical Guide to
Analytical Method Validation. Anal Chem
68: 305A-309A.
Gritter RJ , Bobbit JM, Schwarting AE. 1991.
Pengantar Kromatografi. Ed ke 2.
Padmawinata K, Soediro I, Penerjemah;
Bandung: Penerbit ITB. Terjemahan dari:
Introduction to Chromatography.
Harborne JB. 1986. Metode Fitokimia. Ed
ke-2. Padmawinata K, Soediro I,
Penerjemah; Bandung: Penerbit ITB.
Terjemahan dari: Phytochemical Methods.
Harmita. 2004. Petunjuk Pelaksanaan validasi
metode dan cara perhitungannya.
[terhubung berkala]. Maj Ilmu
Kefarmasian I: 117-135. [4 Feb 2007].
Harvey D. 2000. Modern Analytical
Chemistry. New York: Mc Graw Hill.
Heldt HW. 1997. Plant Biochemistry &
Molecular Biology. New York: Oxford
University Pr.
Hertog MGL, Hollman PCH, Venema DP.
1992. Optimization of a quantitative
HPLC determination of potentially
anticarcinogenic flavonoids in vegetables
and fruits. [terhubung berkala]. J Agric
Food Chem 40: 15911598. [6 Feb 2007].
[ICH] International Conference on
Harmonization. 1995. Validation of
Analytical Procedurs: Definitions and
Terminology. [terhubung berkala].
http://www.ich.org. [10 Februari 2007].
Laura JP. 2007. Perbedaan lingkungan dan
masa tanamseledri (Apium graveolens L.)
terhadap senyawa bioaktif apigenin.
[skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan
Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian
Bogor.
Levin S. 2002. Quantitatif Work in HPLC.
http://www.forumsci.co.il/HPLC. [10 Feb
2007].
MarkhamKR. 1988. Techniques of Flavonoid
Identification. London: Academic Pr.
Meloan CE. 1999. Chemical Separations.
New York: J Wiley.
Soedibyo M. 1998. Alam Sumber Kesehatan.
Manfaat dan Kegunaan. Jakarta: Balai
Pustaka.
Susiarti S. 2000. Seledri (Apium graveolens
L.). Dari Mengolah Lahan Tidur Menuju
Agribisnis Sayuran. Seri Pengembangan
Proses 8.1. Jakarta: Prosea Indonesia.
Winarno FG. 1997. Kimia Pangan dan Gizi.
Jakarta: PT Gramedia Pustaka Utama.


































LAMPIRAN
























Lampiran 1 Bagan alir penelitian



Standar Apigenin dan ekstrak apigenin
Preparasi standar dan contoh
Validasi Metode KCKT
(penentuan linearitas, limit
deteksi, limit kuantitasi,
ketelitian, dan ketepatan
Seledri kering
Ekstrak apigenin
Uji Flavonoid
Analisis dengan KLT
Kadar air
ekstraksi

Lampiran 2 Hasil analisis kadar air seledri
Ulangan
Bobot
Seledri
(g)
Bobot Cawan
Kosong (g)
Bobot Cawan +
Contoh Setelah
dikeringkan (g)
Bobot Seledri
Setelah
dikeringkan (g)
Kadar Air
(%)
1 5,0103 24,2491 28,9546 4,7055 6,08
2 5,0026 23,9342 28,6349 4,7007 6,03
3 5,0034 24,8906 29,5914 4,7008 6,04
Rerata 6,05

Contoh perhitungan: Ulangan 1
Kadar air =
a
b a

dengan
a =bobot contoh sebelumdikeringkan (g)
b =bobot contoh setelah dikeringkan (g)
Kadar air =
0103 , 5
7055 , 4 0103 , 5
100%
Kadar air =6,08%
























Lampiran 3 Data rendemen hasil ekstraksi seledri









Contoh Perhitungan: Ulangan 1
Rendemen (%) =
b
a
100%
=
0000 , 5
7945 , 1
100%
=35,89%
dengan a =bobot ekstrak (g)
b =bobot contoh (g)

Simpangan baku (SB) =
( )
1
2
1

=
n
x x
i
n
i

=2,37
x
i
=bobot ekstrak ulangan ke-i
x =rerata bobot ekstrak
n =banyaknya ulangan (n =5)

Batas galat = t SB
n
=2,776 2,37

5

=2,94













Ulangan
Bobot Seledri
(g)
Bobot Ekstrak
(g)
Bobot BHT
(g)
Rendemen (%)
1 5,0000 1,7945 0,0500 35,89
2 5,0000 1,5304 0,0500 30,61
3 5,0000 1,5286 0,0500 30,58
4 5,0000 1,7286 0,0500 34,57
5 5,0000 1,6304 0,0500 32,61
Rerata 32,85
Simpangan baku (SB) 2,37
Batas galat (t tabel untuk =0.05 dan derajat bebas =4 yaitu
2.776)
2,94
Rerata rendemen batas galat 32,85 2,94


Lampiran 4 Nilai R
f
dan warna bercak hasil KLT
Sampel Bercak Jarak tempuh (mm) R
f
Warna Bercak
Standar apigenin tunggal 30 0,3529 gelap
Ekstrak enam 30 0,3529 gelap

Jarak tempuh eluen =85,00 mm
Contoh perhitungan:
R
f
standar apigenin = Jarak tempuh bercak
Jarak tempuh eluen
=
00 , 85
00 , 30

=0,3529

Hasil analisis KLT.












Apigenin
standar
Apigenin
contoh


Lampiran 5 Linearitas ulangan 1

Kromatogramstandar apigenin 3,8 mg/l ulangan 1.


Kromatogramstandar apigenin 5,7 mg/l ulangan 1.


Kromatogramstandar apigenin 7,6 mg/l ulangan 1.

[Konsentrasi standar] (mg/l) Luas area Waktu retensi (menit)
3,8000 4004510 42,8500
5,7000 4819749 42,8530
7,6000 5578842 42,8370

Rerata waktu retensi 42,8467
Simpangan baku 0,0085
Batas galat 0,0211
Rerata waktu retensi batas galat 42,8467 0,0211


y =2439535,667 +414297,8947x
r =0,9998
0
2000000
4000000
6000000
0.0000 2.0000 4.0000 6.0000 8.0000
Konsentrasi apigenin (mg/l)
L
u
a
s

A
r
e
a

P
u
n
c
a
k

Standar apigenin ulangan 1.

Persamaan regresi linear ulangan 1
y =2439535,667 +414297,8947x
r =0,9998



























Lampiran 6 Linearitas ulangan 2

Kromatogramstandar apigenin 3,8 mg/l ulangan 2.


Kromatogramstandar apigenin 5,7 mg/l ulangan 2.


Kromatogramstandar apigenin 7,6 ulangan 2.

[Konsentrasi standar] (mg/l) Luas area Waktu retensi (menit)
3,8000 3832835 42,8630
5,7000 4892970 42,8670
7,6000 6787623 42,8670

Rerata waktu retensi 42,8657
Simpangan baku 0,0023
Batas galat 0,0057
Rerata waktu retensi batas galat 42,8657 0,0057



y =738960,667 +777575,7895x
r =0,9900
0
2000000
4000000
6000000
8000000
0.0000 2.0000 4.0000 6.0000 8.0000
Konsentrasi Apigenin (mg/l)
L
u
a
s

A
r
e
a

P
u
n
c
a
k

Standar apigenin ulangan 2.

Persamaan regeresi linear ulangan 2
y =738960,667 +777575,7895x
r =0,9900




























Lampiran 7 Linearitas ulangan 3

Kromatogramstandar apigenin 3,8 mg/l ulangan 3.


Kromatogramstandar apigenin 5,7 mg/l ulangan 3.


Kromatogramstandar apigenin 7,6 mg/l ulangan 3.

[Konsentrasi standar] (mg/l) Luas area Waktu retensi (menit)
3,8000 3207189 43,3500
5,7000 4158279 43,3700
7,6000 5248640 43,3370

Rerata waktu retensi 43,3523
Simpangan baku 0,0166
Batas galat 0,0412
Rerata waktu retensi batas galat 43,3523 0,0412





y =1142526,167 +537223,947x
r =0,9993
0
2000000
4000000
6000000
0.0000 2.0000 4.0000 6.0000 8.0000
Konsentrasi Apigenin (mg/l)
L
u
a
s

A
r
e
a

P
u
n
c
a
k

Standar apigenin ulangan 3.

Persamaan regeresi linear ulangan 3
y =1142526,167 +537223,947x
r =0.9993
























Lampiran 8 Parameter statistika kurva standar rerata
Konsentrasi standar (mg/l) Luas area rerata
3,8000 3681511,3333
5,7000 4623666,0000
7,6000 5871701,6667

y =1440340,834 +576365,8771x
r =0,9970
0
2000000
4000000
6000000
8000000
0.0000 2.0000 4.0000 6.0000 8.0000
Konsentrasi Apigenin (mg/l)
L
u
a
s

A
r
e
a

P
u
n
c
a
k

Standar apigenin rerata

x
i
2
x x
i
x
i
2
y
i
y (y
i
- y)
2

3,80 3,61 14,44 3681511,3333 3630531,1670 2598977361
5,70 0,00 32,49 4623666,0000 4725626,3335 10395909601
7,60 3,61 57,76 5871701,6667 5820721,5000 2598977397
dengan
x
i =
konsentrasi standar apigenin
y
i
=luas area terukur
y=luas area teoritis

Persamaan regresi linear rerata
y =1440340,834 +576365,8771x
r =0,9970

Contoh perhitungan:
Luas area teoritis pada konsentrasi 3,8 mg/l
y=1440340,834 +576365,8771(3,8)
y= 3630531,1670

x
i
2
=104,69

( Xi -
x ) =7,22
(yi - y)
2
=15593864360



Simpangan baku regresi (S
r
) =
( )
2

1
2

n
y y
n
n
i
=124875,3953

Simpangan baku intersep (S
a
) =S
r

=
n
i
n
i
x xi
xi
2
2
1
) (
=475511,3386

Simpangan baku kemiringan (S
b
) =
( )
2

i
i
r
x x
S
= 46473,8099


Selang kepercayaan intersep untuk o =0,05 dan derajat bebas =4 (t tabel =2,776), yaitu
a tS
a
=1440340,834 (2,776)(475511,3386)
=1440340,834 1320019,476

Selang kepercayaan kemiringan untuk 0,05 dan derajat bebas =4 (t tabel =2,776) yaitu
b tS
b
=576365,8771 (2,776)(46473,8099)
=576365,8771 129011,2963










Lampiran 9 Penentuan limit deteksi dan limit kuantifikasi
LD =3,3
b
Sa

LD =3,3
8771 . 576365
3386 . 475511

LD =2,7222 mg/l


LK =10
b
Sa

LK =10
8771 . 576365
3386 . 475511

LK =8,2500 mg/l

dengan
LD =limit deteksi (mg/l)
LK =limit kuantifikasi (mg/l)
Sa =simpangan baku intersep kurva standar (n =3)
b =rerata kemiringan garis kurva standar























Lampiran 10 Penentuan ketelitian


Kromatogramcontoh ulangan 1.


Kromatogramcontoh ulangan 2.


Kromatogramcontoh ulangan 3.


Kromatogramcontoh ulangan 4.

Apigenin
Apigenin
Apigenin
Apigenin




Kromatogramcontoh ulangan 5.

Penentuan ketelitian
Ulangan Luas Area
Konsentrasi
apigenin
(mg/l)
Konsentrasi
Apigenin
sebenarnya
(mg/l)
Bobot
Apigenin
(mg)
Kadar
Apigenin
(%b/b)
1 4664136 5,5933 11,1866 0,2797 0,0055
2 4199753 4,7876 9,5752 0,2394 0,0050
3 4153898 4,7080 9,4161 0,2354 0,0050
4 4509912 5,3257 10,6515 0,2663 0,0053
5 4302088 4,9652 9,9303 0,2483 0,0050
Rerata 10,1519 0,2538 0,0052

Contoh perhitungan pada ulangan 1
Persamaan regresi linear rerata
y =1440340,834 +576365,8771x
r =0,9970

Konsentrasi apigenin (X)
X =
8771 . 5576365
834 . 1440340 4664136

X =5,5933 mg/l

Konsentrasi apigenin sebenarnya =konsentrasi apigenin faktor pengenceran
=5,5933 mg/l
5
10

=11,1866 mg/l



Apigenin

Bobot apigenin =konsentrasi apigenin sebenarnya volume larutan
=11,1866 mg/l 0,025 l
=0,2797 mg
Kadar apigenin (%b/b) =
b
a
100%
=
5000
2797 . 0
100%
=0,0055%
dengan a =bobot apigenin (mg)
b =bobot contoh (mg)

Simpangan baku (SB) =
( )
1
2
1

=
n
x x
i
n
i
=0,0002

Simpangan baku relatif (%) =
x
SB 100
=3,85
dengan
x
i
=kadar apigenin tiap ulangan
x =rerata kadar apigenin
n =banyaknya ulangan (n =5)




















Lampiran 11 Penentuan persen perolehan kembali
Standar Apigenin (mg)
Ditambahkan Terukur
Perolehan
Kembali (%)
Rerata (%) Batas Galat SBR (%)
0,0100 0,0109 109,00
0,0100 0,0095 95,00
0,0100 0,0111 111,00
105,00 21,6579 8,30
0,0650 0,0740 113,85
0,0650 0,0696 107,08
0,0650 0,0772 118,77
113,23 14,5814 5,18
0,0700 0,0761 108,71
0,0700 0,0756 108,00
0,0700 0,0771 110,14
108,95 2,7079 1,00

Contoh perhitungan untuk jumlah standar yang ditambahkan 0,0100 mg ulangan 1
(%PK) =
c
b a
100%
=
0100 . 0
0109 . 0
100%
=109,00%
dengan
a =konsentrasi contoh +konsentrasi standar yang terukur (mg)
b =konsentrasi contoh (mg)
c =konsentrasi standar teoritis yang ditambahkan (mg)
Simpangan baku (SB) =
( )
1
2
1

=
n
x x
i
n
i
=8,7178

Simpangan baku relatif (%) =
x
SB 100
=8,30
dengan
x
i
=persen perolehan kembali ulangan ke-i
x =rerata persen perolehan kembali
n =banyaknya ulangan (n =3)

Batas galat = t SB
n
=4,3030 8,7178
3
=21,6579