MEMBRANOPATAS

Diagnstico en el
laboratorio
Rene Leonor Crisp
Hospital Nacional Prof. A. Posadas
Patologa de Membrana
De acuerdo al fenotipo morfolgico y
clnico se pueden categorizar en:
Esferocitosis Hereditaria (HS)
Eliptocitosis Hereditaria (HE) y
piropoiquilocitosis hereditaria (HPP)
Ovalocitosis del Sudeste Asitico (SAO)
Acantocitosis Hereditaria
Estomatocitosis Hereditaria
CARACTERSTICAS CLNICAS
Anemia, ictericia, esplenomegalia
HISTORIA FAMILIAR
Anemias, esplenectomas, litiasis biliar
LABORATORIO GENERAL
Parmetros de anemia
Parmetros de hemlisis
LABORATORIO ESPECIAL
Estudios confirmatorios o de screening
Estudios especficos
No es necesario recurrir a la totalidad
de las determinaciones para arribar al
diagnstico.
Qu estudios debemos realizar?
Cundo debemos estudiar las protenas de la
membrana?
Cul es el rol de los anlisis genticos?
LABORATORIO GENERAL:
LABORATORIO GENERAL:
Par
Par

metros de hem
metros de hem

lisis
lisis
Hem
Hem

lisis
lisis
extravascular
extravascular
Hem
Hem

lisis
lisis
intravascular
intravascular
Globina + hemo
Haptoglobina
Metahema-
albmina
Circulacin
enteroheptica
Bilirrubina
Indirecta
Conjugacin
heptica
Hb
Biliverdina
Bilirrubina
Bilirrubina
Conjugada
Urobilingeno
Flora
intestinal
Hb-Hp
Hb
Hemo-Hpx
Globina + hemo
Reabsorcin
tubular
Filtracin
renal
Hb libre
LDH
Hemopexina
Hemoglobinuria
Hemosiderinuria
Urobilina
LABORATORIO GENERAL
Alteraciones indicativas de hemlisis
Extravascular Intravascular
Bilirrubina Indirecta Hemoglobinemia
Urobilingeno fecal LDH (isoenzima 2)
Urobilina Haptoglobina
Hemoglobinuria
Hemosiderinuria
Prueba de Coombs directa: negativa
Adultos: no descartar la posibilidad de una anemia hereditaria
Reticulocitos: aumentados
Tener en cuenta los valores de referencia adecuados
Edad gestacional: > %Retic a menor edad gestacional
Das de vida: valores elevados al nacimiento hasta el 3 da
LABORATORIO GENERAL
HEMOGRAMA
Hb 9 12 g/dl normal (hemlisis compesada)
VCM generalmente normal
ADE amplitud de distribucin de
volumen eritrocitario: aumentada
Analizadores hematolgicos con deteccin dual de la luz dispersada
CHCM
HDW amplitud de distribucin de Hb eritrocitaria
% de eritrocitos con [Hb] > 410 g/L
( screening)
FROTIS
Desviacin
Standard
(DS)
ADE = DS x 100
VCM
VCM
Esferocitosis
moderado deficit de espectrina
y ankirina
Morfologa normal
o aislados
esferocitos
Pruebas
adicionales
de
laboratorio
para poner
de manifiesto
la anomala
Esferocitosis
deficit banda 3
0,2 a 2,3 % de eritrocitos con forma de hongo.
Especificidad y sensibilidad ~92%
Esferocitosis
severo deficit de espectrina y
ankirina
Esferocitos + eritrocitos con contorno irregular
PPH?
Esferocitosis
deficit de -espectrina
esferoacantocitos
EH leve
heterocigota
Extremos
redondeados
EH doble
heterocigota
Eliptocitos
Poiquilocitos
EH
esferoctica
Ovalocitos
Ausencia de
palidez central
EH severa
heterocigota
Eliptocitos
Poiquilocitos
PPH
Micro
esferocitos y
poiquilocitos
Aislados
eliptocitos.
Gemacin
Ovalocitosis
del Sudeste
Asitico
Puente
transversal o
longitudinal
MEMBRANOPATIA
MEMBRANOPATIA
HEREDITARIA
HEREDITARIA
Cuadro clnico
Parmetros de laboratorio general
Historia familiar positiva
No se requieren estudios adicionales
Bolton-Maggs PH, Br. J Haematol. 2004
Guidelines for the diagnosis and management of hereditary spherocytosis
+
Clnica
Parmetros de laboratorio general
Historia Familiar
No se requieren
estudios adicionales
+
Estudios
confirmatorios
No concluyente
No concluyente
Estudios
especficos
Dx
Estudios de membranas
Confirmatorios Especficos
Hemlisis aumentada
Prueba de Autohemlisis
Test de glicerol acidificado
Pink Test
Fragilidad aumentada
osmtica
Curvas de fragilidad
osmtica
Tcnica de Dacie
Fragilmetro
Nefelometra
Criohemlisis hipertnica
mecnica
Deformabilidad celular alterada
Ectacitometra
Reoscopa
Citometra de flujo
Determinacin cuantitativa de
las protenas de membrana
- Electroforesis PAGE-SDS
- Electroforesis bidimensional
- Electroforesis Capilar
Anlisis gentico
- Screening
- Amplificacin y secuenciacin
PRUEBA DE AUTOHEMLISIS
Control Paciente
+ glucosa + glucosa
% hemlisis luego de Incubar sangre anticoagulada a 37C , 48 hs.
Esferocitos suceptibles al stress metablico
DESVENTAJAS
Cantidad de
muestra
Procesamiento
inmediato
Contaminacin
VN:
% H : 0,2 2 %
% H c/ glu: 0 0,9 %
Estudios confirmatorios
HEMOLISIS AUMENTADA
Prueba de autohemlisis
% hemlisis luego de Incubar sangre anticoagulada a 37C , 48 hs.
Prueba de glicerol acidificado
Tiempo que tarda en reducirse a la mitad la absorbancia a 625 nm
presencia de glicerol en medio cido
Rpiday sencilla
Control estricto del pH
Menor volumen de muestra
Baja especifidad
Estudios confirmatorios
Fragilidad osmtica aumentada
Curvas de fragilidad eritrocitaria
Tcnica de Dacie (1954)
Fragilmetro
Nefelometra
Criohemlisis hipertnica (1997)
Fragilidad mecnica
Curvas de fragilidad osmtica
1. Se suspenden los eritrocitos en soluciones de
hipotona creciente de ClNa
2. Los eritrocitos aumentan su volumen por la
penetracin de agua para equilibrar la presin
osmtica con la del medio
3. La clula se vuelve esfrica y al alcanzar un
volumen crtico se rompe
Vcrtico del esferocito <<< Vcrtico GR normal
Hemolizan ms en soluciones no tan diludas
CURVAS BASALES
Curva desplazada
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
% ClNa
%

H
e
m

l
i
s
i
s
Control Basal Paciente Basal
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
% ClNa
%

H
e
m

l
i
s
i
s
Control Basal Paciente Basal
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
% ClNa
%

H
e
m

l
i
s
i
s
Control Basal Paciente Basal
Coincidente con la curva normal Pequea poblacin condicionada
Resultados positivos si:
Existe un gran nmero de esferocitos (se
visualizaran en el frotis)
Porcentaje no elevado de reticulocitos
En toda patologa que posea esferocitos
(HS; AHAI)
CURVA DIFERIDA post incubacin 37C, 24 hs
TIPO II
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
TIPO III
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
TIPO I
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
% ClNa
%

H
e
m

l
i
s
i
s
Maduracin de reticulocitos
Stress metablico
Agotamiento de glucosa
Deficit de ATP
Prdida de membrana
Aumento del nmero de clulas en
estado pre-ltico
INTERPRETACION de las Curvas de Fragilidad Osmtica Eritrocitaria
Los parmetros a tener en cuenta para evaluar los resultados son:
Forma y Desplazamiento de la curva:
FCM (fragilidad corpuscular media): Conc. de ClNa a la cual se produjo un 50 % de hemlisis.
VN: FCM basal: 0,4 a 0,445 % de ClNa
FCM diferida: 0,465 a 0,59 % de ClNa
Resistencia mnima: Concentracin de ClNa a la cual comienza la hemlisis. Este
valor est aumentado en las esferocitosis.
Resistencia mxima: Concentracin de ClNa a la cual se produce hemlisis total.
No siempre se encuentran alterados todos estos parmetros simultneamente sino slo
alguno de ellos.
TIPO I
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
% ClNa
%
H
e
m

lis
is
TIPO II
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
TIPO III
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
% Hemlisis
Curva Basal
% ClNa
Normal
Sugestivo
de HS
0,55 0 > 10
0,50 0 - 6 > 20
> 50 0 - 40 0,60
> 30 0 - 10 0,65
> 20 0 - 5 0,75
Sugestivo
de HS
Normal
% Hemlisis
C. Diferida
% ClNa
Curvas de fragilidad osmtica
eritrocitaria
Pueden no se observase anomalas
si la esferocitosis coexiste con:
Ictericia obstructiva
Talasemias
Deficit de hierro
Deficit de B12 y flico
Estudio de fragilidad
en pacientes talasmicos
Curva de Fragilidad
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3
% Cl Na
Control Basal Paciente Basal
Control post-Incubacin Paciente post-Incubacin
Cont Estudios confirmatorios
Fragilidad osmtica aumentada
Curvas de fragilidad osmtica:
% Hemlisis en sl hipotnicas de ClNa
- Depende de la relacin rea/volumen
Tcnica de Dacie
Fragilmetro
Criohemlisis hipertnica
% hemlisis en sl hipertnica de sucrosa (10 37C, 10 0C)
- Depende de la alteracin de la membrana
Distingue esferocitos de HS y AHAI
VN 0,7 11 % HS > 20 %
Fragilidad mecnica (hemlisis con esferas de vidrio)
Deformabilidad: Ectacitometra
Relacin rea/Vol
Viscosidad
citoplasmtica
Rigidez intrnseca
de la membrana
150 uL de muestra
Procesamiento: 5
Conveniente para
estudios en
neonatos
Citometra de flujo
5-EosinaMaleimida (EMA) se une covalentemente con Lis-430
de la banda 3
Sensibilidad 92,7% Especificidad 99,1%
Br J Haematol 2000; 111: 924-933.
1- normal 4-SH (Sp) 7- EH 10- Hb S 16- An Hemol.
2- neonatos 5- SH (banda3) 8- a-Talas 11- Enz 17- AHAI
3-cordn 6- SH (4.2) 9- b-Talas 12- Ferropenia
Poca cantidad de
muestra
Procesamiento:
2 horas
Distingue HS y
An.Hemolticas
No es til para RN
No es til en HS
leves
Citometra de flujo
Histogramas de fluorescencia
permiten diferenciar SH, EH y PPH entre s
Esferocitosis:
Reduccin de fluorescencia
Eliptocitosis:
No presenta diferencias con la
poblacin eritroctica normal
Piropoiquilocitosis:
Doble pico de fluorescencia
Confirmar con prueba de
inestabilidad al calor (45-46C)
Esferocitosis: estudios especficos
Determinacin cuantitativa de las
protenas de membrana
Electroforesis PAGE-SDS
Cuantificacin por densitometra
Electroforesis Capilar
Cuantificacin por absorbancia a 220 nm
Anlisis gentico
Screening
Amplificacin y secuenciacin
Determinacin cuantitativa de las
protenas de membrana
1. Obtencin de las membranas
Lavado y lisis de los eritrocitos
Separacin de las membranas
Lavado exhaustivo
2. Electroforesis
Determinacin de protenas totales
Preparacin de geles de poliacrilamida
Siembra y corrida electrofortica
Tincin, lavado y secado del gel
3. Densitometra
4. Anlisis de los resultados
* Centrfuga refrigerada
* Inhibidores de proteasas
* Procesar simultneamente
controles normales
* Establecer valores de
referencia
Electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE - SDS)
Fairbanks Laemmli
Gradiente:
3,5% 17%
exponencial
9 bandas
Mejor
resolucin de
bandas lentas
Gradiente:
4 % 17%
lineal
8 bandas
Mejor
resolucin de
bandas
rpidas
J Korean Med Sci 2000; 15: 284-8
Electroforesis en gel de
poliacrilamida (PAGE - SDS)
PAGE SDS: Densitometra y cuantificacin
> 50 % HS leves 50 % tpica
50 % severa
Cociente B3
B3
4.2
Sp
Ank
4.2
Sp
4.2
Sp 4.2
Sp/ Banda 3 N
Ank/Banda 3
N N N
4.2/ Banda 3 N N
PAGE SDS: Anlisis de los resultados
Cocientes para establecer la protena deficiente
Cociente HS leve HS tpica HS severa
Sp / 4.2 N
Banda 3 / 4.2 N
La Banda 3 generalmente va acompaada de prot 4.2
Ank: si hay reticulocitosis puede no detectarse; observndose disminucin de Sp y Prot 4.2.
Puede observarse disminucin de Sp o de Prot 4.2 aisladas
Cocientes relacionados con la severidad
Esferocitosis Hereditaria
Fairbanks
Laemmli
Deficit
combinado
de
Ankirina
y
Espectrina
Deficit
parcial
de
protena
4.2
Pte Control Pte Control
Ank/Banda3 = 0,11 0,28 0,88 1,35 Prot 4.2/Prot 4.1
Sp/Banda3 = 1,00 1,14
J Korean Med Sci 2000; 15: 284-8
Mapeo de
peptidos
de
espectrina
obtenidos
por
digestin
con
tripsina
Eliptociostosis y Piropoiquilocitosis
IEF/PAGE-SDS
ELECTROFORESIS CAPILAR
Resolucin similar a la
obtenida por PAGE-SDS
convencional
Ms rpido (17 min)
Menos laborioso
Deteccin (220 nm) y
cuantificacin por
relacin de reas.
Altamente reproducible
Changying Lin et al. Journal of Chromatography B, 742 (2000)
ELECTROFORESIS CAPILAR
Deficit de espectrina
Banda 3 normal
Ank normal
Deficit de banda 3
Anlisis gentico
Estudio de protenas no concluyente.
Mayor severidad clnica que el grupo
familiar.
Estudio de mutaciones de novo.
Diferenciar el defecto primario de las
protenas disminuidas en forma
secundaria.
GEN Protena
Esferocitosis
hereditaria
SH
ANK1
SPTB
SLC4A1 AE1
EPB42
SPTA1
Ankirina
Beta Sp
Banda 3
Prot 4.2
Alfa Sp
Eliptocitosis
hereditaria
EH y PPH
SPTA1
SPTB
EPB4.1
Alfa Sp
Beta Sp
Prot 4.1
ESTUDIO GENETICO
Varios genes involucrados en cada
patologa
Estudio gentico
Banda 3: localizacin de mutaciones
Mutaciones diversas
SSCP: Polimorfismo
conformacional de
simple cadena
VNTR: Nmero
variable de
repeticiones en
Tandem
Anlisis de polimorfismos
Bsqueda de
genes blancos
Secuenciacin
Identificacin de la
mutacin
Eur J Haematol 2005; 74: 396 - 401
Conclusiones
El 75 % de las HS pueden ser diagnosticadas
con:
Cuadro clnico
Parmetros de laboratorio general
Historia familiar positiva
De las restantes, el 66 % pueden diagnosticarse
mediante estudios confirmatorios simples:
Prueba de autohemlisis
Curvas de Fragilidad eritrocitaria
Criohemlisis hipertnica
Muy pocas veces se requieren estudios
especficos para arribar al diagnstico:
Electroforesis de membrana (PAGE-SDS)
Muchas gracias por su atencin