Laporan Praktikum Biokimia

Hari/Tanggal : Selasa, 12 November 2013 Waktu PJP Asisten : 09:00-10:40 WIB : Syaefudin,M.si : Lusianawati,S.si Resti Siti Muthmainah,S.si

ISOLASI DNA KROMOSOM

Kelompok 2 Mhd Ali Aman.Siregar Indryani Rahayu Kuswardhani Emilia Anisa J3L112002 J3L112080 J3L112153

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA PROGRAM DIPLOMA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2013

Pendahuluan Isolasi DNA adalah tahap awal dalam mempelajari DNA sequence yang spesifik dengan populasi DNA yang lengkap, dan dalam analisa struktur gen dan ekspresi gen (Miller 2000). DNA pada makhluk hidup dapat diisolasi secara sederhana. Pengisolasian DNA secara sederhana dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel, membran plasma dan membran inti baik secara mekanik maupun secara kimiawi. Isolasi DNA merupakan suatu teknik yang digunakan untuk memperoleh DNA murni, yaitu tanpa protein dan RNA dari suatu sel dalam jaringan. DNA dapat mengalami denaturasi dan renaturasi. Selain itu DNA juga bisa diisolasi (Robinson 1975). Isolasi DNA kromosom secara umum dibagi atas 3 tahap yaitu pemecahan sel atau jaringan/sel dilisis untuk membebaskan isinya, ekstrak sel diberi perlakuan untuk menghilangkan semua komponen kecuali DNA,dan pemekatan larutan DNA yang telah diperoleh (Miller 2000). Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA. Pemecahan dinding sel secara mekanik dapat dilakukan dengan pemblenderan atau penggerus menggunakan mortar dan pistil. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan dengan pemberian detergen. Penambahan sabun cair dan garam dapur adalah untuk melisiskan membran inti untuk mengeluarkan isi inti sel yang berisi DNA (Brush 1994). Sentrifugasi adalah metode sedimentasi untuk memisahkan partikel-partikel dari suatu fluida berdasarkan berat jenisnya dengan memberikan gaya sentripetal (Robinson 1975). Sentrifugasi bertujuan untuk memisahkan sel menjadi organel-organel utama sehingga fungsinya dapat diketahui (Miller 2000). Substansi yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan terletak di atas (Miller 2000). Substansi hasil sentrifugasi terbagi menjadi dua, yaitu supernatan dan pelet. Supernatan adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih rendah. Posisis dari substansi ini berada pada lapisan atas dan warnanya lebih jernih. Sementara pelet adalah substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis yang lebih tinggi. Posisisnya berada pada bagian bawah (berupa endapan) dan warnanya lebih keruh. Sentrifugasi bertujuan untuk memisahkan sel menjadi organel-organel utama sehingga fungsinya dapat diketahui (Miller 2000). Sentrifugasi ini biasa digunakan untuk memisahkan molekul-molekul yang perbedaan densitasnya hingga 0,02 g/mL/ molekul-molekul tersebut seperti molekul protein,

DNA, dan RNA yang densitasnya pada larutan sesium klorida ialah 1.3 g/mL , 1.6-1.7 g/mL, dan 1.75-1.8 g/Ml (Collen et al 1996). Tujuan Percobaan bertujuan menunjukan sifat dan struktur DNA memlalui proses isolasi, dan melatih dalam proses isolasi DNA dengan umbi bawang.

Alat dan Bahan Alat alat yang digunakan yaitu Pipet mikro,corong pisah, mortar,tabung reaksi,gelas piala 100 mL, pisau, Sentrifus kecepatan tinggi, tabung sentrifius, Penangas air. Bahan-bahan yang digunakan yaitu Umbi bawang merah, NaCl, Larutan lisis, SDS 10%, Buffer elusi/buffer TE, dH2O steril, larutan EtOH.

Prosedur percobaan Pembuatan larutan. Larutan lisis terdiri dari 50 mM Tris HCl, pH 8.0 yang mengandung 50 mM EDTA. Sedangkan larutan elusi atau buffer TE dibuat dari 10 mM Tris-HCl pH 8,0 yang mengandung 0.1 mM EDTA pH 8.0. Setelah itu, larutan disimpan di pendingin. Prosedur isolasi DNA kromosom. Sebanyak 25 gram umbi bawang digerus dengan menggunakan mortar, ditambahkan 40 mL larutan lisis dan 0.5 gram garam dapur digerus sampai halus. Setelah itu, dituang ke dalam gelas piala 250 mL dan ditambahkan 5 mL larutan SDS 10%. Larutan dicampur secara homogen dan diinkubasi pada suhu 60C dalam water bath selama 20 menit. Hasil inkubasi lalu disaring ke dalam gelas beaker yang ditempatkan diatas es sehingga larutan tersebut segera menjadi dingin. Setelah larutan menjadi dingin kemudian ditambahkan 0,5 gram protease, aduk secara sempurna dan biarkan selama 15 menit. Kemudian larutan dibiarkan 5 menit lalu diambil larutan atas dengan menggunakan pipet tetes dan dipindahkan ke dalam 4 tabung baru. EtOH dingin sebanyak 10 mL ditambahkan melalui sisi tabung. Kemudian, tabung ditempatkan secara perlahan di atas es dan dibiarkan selama 2-5 menit. DNA kromosom akan mengendap pada bagian atas dari EtOH dan tampak sebagai benang-benang putih. DNA kromosom diambil dengan pipet tetes secara hati-hati dengan sesedikit mungkin larutan EtOH yang terambil dan ditempatkan pada 2 tabung eppendorf 1.5 mL. Keempat tabung disentrifugasi

selama 1 menit dengan kecepatan 10.000 atau 13.000 rpm. EtOH dibuang pada lapisan atas secara hati-hati tanpa merusak pellet dan ditambahkan 1 mL EtOH ke pellet DNA kromosom. Resuspen pelet DNA kromosom dengan cara vortex dalam 1 mL EtOH dan disentrifugasi kembali selama 1 menit. EtOH dituang dan DNA kromosom dikeringkan dalam bech selama 10 menit. Setelah kering, buffer TE atau dH2O steril 1 mL untuk melarutkan DNA kromosom. Ukur absorbansi DNA pada panjang gelombang 260 dan 280 nm dengan spektrofotometri.

Data dan Hasil Percobaan Tabel 1 Data hasil pengukuran konsentrasi DNA dari umbi bawang Larutan A 260 A 280 A koreksi 260 Sampel 1 Sampel 2 Sampel 3 Sampel 4 Blanko(TE) 0.7775 0.7905 0.7808 0.7590 0 0.7972 0.7978 0.7972 0.7981 0 0.7775 0.7905 0.7808 0.7590 A koreksi 280 0.7972 0.7978 0.7972 0.7981 38.875 39.750 39.040 37.950 39.875 39.890 39.875 39.905 0.974 0.996 0.979 0.951 [DNA] [RNA] [DNA/RNA]

Contoh perhitungan: A koreksi = A sampel A blanko =0.7775 -0 =0.7775

[DNA] = A 260 x 50 mg/mL = 0.7775 x 50 mg/mL = 38.875 mg/mL

[RNA] = A 280 x 50 mg/mL

= 0.7972x 50 mg/mL = 39.875 mg/mL

Pembahasan Prinsip isolasi DNA kromosom itu sendiri didasarkan pada pemisahan DNA kromosom dari pengotor lain berupa protein atau RNA menggunakan teknik sentrifugasi. Secara umum isolasi DNA kromosom terbagi atas tiga tahapan proses yaitu pemecahan sel atau pelisisan sel, menghilangkan komponen lain selain DNA kromosom, dan pemekatan larutan DNA yang diperoleh (David et al. 1983). Isolasi DNA kromosom merupakan tahap yang paling penting yang harus dilakukan. Hal ini dikarenakan DNA kromosom merupakan sumber DNA yang umumnya kita kehendaki untuk diklon yang harus bersih dari pengotor-pengotor seperti protein dan RNA. Sumber DNA dapat berasal dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel manusia (Brush 1994). Isolasi DNA kromosom dilakukan pada umbi bawang merah pada praktikum kali ini. Penggunaan umbi bawang merah sebagai sumber pengisolasian DNA kromosom disebabkan umbi bawang memiliki sedikit pati sehingga DNA akan terlihat akan lebih jelas dan mudah diisolasi (David et al. 1983). Percobaan ini terlebih dahulu bawang merah diris dengan pisau,hal ini dilakukan agar memperkecil umbi bawang dan merperluas permukaannya sehingga mempercepat penggerusan. Setelah itu umbi bawang digerus dengan mortal dan ditambahkan dengan larutan lilis 40 Ml dan 1,5 gram garam dapur. Penambahan larutan lisis yang berfungsi melisis dinding sel,dan

penambahan garam dapur untuk melarutkan DNA pada umbi bawang, kemudian masukkan ekstrak kedalam gelas piala 250 mL dan di tambahkan larutan SDS 10% sebanyak 5 mL. Hal ini dilakukan untuk
O

memecahkan dinding sel dengan mengemulsi lipid dan protein merusak

interaksi polar pada membran sel, kemudian larutan di inkubasi dalam water batch pada suhu 60 C selama 10 menit. Tahapan ini dilakukan untuk mengoptimalkan kerja buffer ekstrak yang

ditambahkan ke dalam sampel, setelah selesai larutan disaring dan ditempatatkan di atas es agr lebih cepat dingin. Setelah selesai dingin ditambahkan 0,5 gram NaCl, NaCl ini dapat menyebabkan DNA menjadi larut karena ion Na+ mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif fosfat DNA yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak menolak satu sama lain

sehingga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA. Hal ini akan menyebabkan DNA akan terkumpul (Doyle & Doyle 1990). Biarkan larutan selama 15 menit,dan larutan paling atas dipindahkan pada tabung lain dan ditambahkan dengan 10 mL larutan EtOH melaluai sisi tabung. Penambahan alkohol dingin pada ekstrak ekstrak sel melalui dinding tabung akan membentuk gumpalan putih. Etanol dingin berfungsi dalam pengikatan strand DNA yang telah terkumpul kerena pemekatan oleh garam. Hal ini karena kerapatan alkohol lebih kecil dibandingkan kerapatan air maka alkohol akan berada di bagian atas larutan pada tabung reaksi. Strand-strand DNA yang terikat oleh alkohol akan nampak sebagi benang-benang putih yang terapung di atas filtrat. Benang-benang DNA berwarna putih pada lapisan atas larutan diambil dan dimasukkan dalam tabung eppendorf 1.5 ml untuk selanjutnya disentrifugasi dengan kecepatan 13.000 rpm. Sentrifugasi berfungsi untuk memisahkan DNA kromosom dari komponen lain seperti protein ataupun RNA. Pemisahan dengan sentrifus didasarkan perbedaan bobot molekul. DNA kromosom yang memiliki bobot molekul lebih besar akan berada dibagian dasar setelah disentrifugasi. Pada tahap akhir pelet dikering-anginkan untuk menghilangkan EtOH dan DNA kromosom yang didapatkan ditambahkan dengan dH2O steril. Larutan diukur dengan sperofotmotri dengan A 260 dan 280 nm,hal ini karena DNA dan RNA menyerap pada panjang gelobang maksimal 260 nm, sementara kebanyakan protein menyerap kuat pada 180 nm. Namun asam nukleat juga menyerap secara signifikan pada 280 nm (50%-50% dari absorbansi pada 260 nm) dan sebagian protein dapat menyerap kuat pada 260 nm. Dengan demikian , untuk mengukur secara akurat konsentrasi DNA, RNA,dan protein dalam campuran yang komples bias menjadi sulit. Namun mengukur pada absorbansi 260 dan 280 nm dapat memberikan validasi kemurnian sampelasam nukleat rasio A260/A280 di atas 1,8 untuk DNA dan 2,0 untuk RNA mengindikasikan sampel yang murni, nilai rasio yang rendah menunjukan adanya protein dan kontaminan lainnya. (teare 1997).

Simpulan Proses isolasi DNA kromosom pada umbi bawang merah memiliki empat tahap, yaitu: pemecahan sel, pengendapan DNA, penghilangan komponen lain selain DNA, dan pemekatan DNA. DNA kromosom memiliki bobot molekul yang besar dibandingkan molekul dalam sel lainnya.

Daftar pustaka Brush A. 1994. Biologi Molekular Sel Edisi ke-2. Jakarta: Gramedia. David AM, Freyer GA, Crotty DA. 1983. DNA Science: A First Course. New York: Laboratory Press. Doyle J.J and Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus. Moscow. 12(1):13-15. Miller J.N. 2000. Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, 4th ed. Harlow: Prentice. Hall. Robinson J.R. 1975. Fundamental Of Acid-Base Regulation, 5th edition. Oxford: Blackwell Scientific Publication. Teare, J.M. et al. 1997. Measuremen of Nucleic Acid Concentration Using the DyNa QuanTM and the GenequantTM . BioTechniques.