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TEMARIO DE T.E.L.

TEMARIO
TÉCNICOS ESPECIALISTAS EN
LABORATORIO

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TEMARIO DE T.E.L.

TEMA 1.- GASES SANGUÍNEOS


BASES FISIOLÓGICAS BÁSICAS
La función básica del pulmón es la de intercambiar gases. La medición de ellos
en sangre arterial, es por lo tanto una buena guía para conocer el estado del
funcionamiento pulmonar.

En cada inspiración, el oxígeno atmosférico llega a los alvéolos pulmonares,


desde allí, por difusión, llega a la sangre. Para transportar el oxígeno, se utiliza la
hemoglobina, presente de forma abundante en los eritrocitos. Su existencia
permite transportar de 30 a 100 veces más oxígeno del que se pudiera
transportar disuelto en sangre.

Como la presión parcial del oxígeno en los alvéolos, es mayor que en el resto del
pulmón, por gradiente de presión, el oxígeno pasa desde los alvéolos a los
capilares sanguíneos. Las arterias, transportan el oxígeno hasta las células
donde la pO2 es menor que en la sangre arterial, produciéndose difusión en
sentido a favor de las células.

Con el dióxido de carbono, ocurre justamente el proceso contrario, los gradientes


de presión, lo van llevando desde las células hasta el alvéolo, donde es
expulsado en cada espiración.

Los procesos metabólicos, por su parte producen grandes cantidades de ácidos


y de dióxido de carbono; los volátiles son eliminados por el pulmón, pero los no
volátiles son transportados por la sangre hasta el lugar de su eliminación, y dada
su naturaleza, son capaces de alterar el equilibrio ácido-base y el pH sanguíneo.
La gasometría arterial permite medir el intercambio de O2 y de CO2 entre el
pulmón y la sangre, y también el estado del equilibrio ácido-base del organismo.
La medición del pH, pO2, y pCO2 en sangre arterial es imprescindible en el
diagnóstico y control de la insuficiencia respiratoria.

TRANSPORTE DE GASES POR LA SANGRE.


TRANSPORTE DE OXÍGENO

El 97% del oxígeno presente en sangre se transporta en combinación con la


hemoglobina, solo el 3% del oxígeno sanguíneo se transporta en el plasma y en
el citoplasma del eritrocito

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La curva de disociación de la oxihemoglobina en sangre presenta forma


sigmoidal. Si la curva es modificada hacia la derecha, la hemoglobina pierde
afinidad por el oxígeno y necesita una mayor pO2 para llegar a saturarse.

Son factores que modifican la curva hacia la derecha:

• El aumento de la temperatura.
• El aumento de la pCO2.
• La disminución del pH.
• La altura.

Si la curva se modifica hacia la izquierda, la afinidad de la hemoglobina por el


oxígeno está aumentada y se llega a la saturación con una menor pO2.

La cantidad de oxígeno unido a la Hb, no solo depende de la pO2, sino de otros


muchos factores entre los que destacan, la pCO2, el pH, los fosfatos, y la altura.

TRANSPORTE DE CO2
La sangre transporta dióxido de carbono en las siguientes formas:

• 70 % en forma de anión bicarbonato.


• 7 % disuelto en plasma.
• 23 % en forma de carbamilo-hemoglobina unido a proteínas plasmáticas.

RECOGIDA DEL ESPÉCIMEN


Existen varios tipos de recipientes recomendados para la recogida de sangre
arterial. Uno de los preferidos es la jeringa de vidrio, que debe ajustar
perfectamente con su émbolo. Se introduce en la jeringa aproximadamente 1 ml
de heparina, con la que se lubrifica el recipiente y posteriormente es expulsada.
De esta forma queda el espacio muerto lleno de heparina. La aguja a utilizar
puede ser del calibre 23 o superior, la jeringa de vidrio presenta los
inconvenientes de su alto coste inicial, la facilidad de rotura y la necesidad de
esterilización.

Otros recipientes de recogida, cada vez más utilizados son las jeringas de
plástico desechables, y los tubos de vacío. Las jeringas de plástico desechable
presentan sobre las de cristal las ventajas, de no ser frágiles, no necesitar
esterilización, son baratas y presentan perfecto ajuste émbolo-cuerpo de la
jeringa.

En cuanto a los tubos de vacío existen distintas opiniones, para muchos autores
(la mayoría) pueden producir alteraciones en la presión parcial de los gases
como consecuencia de la succión que ejercen. Otros autores los definen como
recipientes satisfactorios.

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La sangre venosa, más fácil de obtener, puede dar valores correctos de pH


aunque los dará incorrectos para la pCO2 alveolar y la saturación de oxígeno
arterial.

La sangre capilar arterializada, como la obtenida del dedo se puede emplear


para determinar pH y pCO2, pero no para la pO2.

MANIPULACIÓN
Una vez, extraída la sangre, la jeringa es el recipiente definitivo. Para cerrarla
herméticamente, se suele pinchar en un corcho. No se debe doblar la aguja, ya
que presenta un riesgo innecesario y no se asegura el cierre hermético, (se le
deben eliminar las burbujas de aire, previamente).

Debe ser colocada rápidamente en un recipiente con hielo o en agua helada,


para evitar el consumo de oxígeno y la liberación de dióxido de carbono. No
debe nunca transportarse a temperatura ambiente.

La muestra de sangre arterial no necesita ninguna manipulación, el estudio de


gases se realiza en sangre completa, solo hay que realizar el análisis en los
primeros 15 minutos, pues una mayor conservación podría modificar los gases
disueltos.

La determinación es muy delicada y puede ser influida por:

• El número de leucocitos.
• La temperatura.
• El manejo inadecuado.
• El tiempo.

VALORES CRÍTICOS
OXÍGENO

La cantidad de oxígeno presente en sangre, al igual que la de CO2, suele


expresarse en unidades de presión parcial. La pO2 mide la cantidad de oxígeno
que pasa del pulmón a la sangre y hay varios factores que pueden afectarla
como:

• La correcta circulación sanguínea.


• La capacidad pulmonar.
• El estado del aparato respiratorio.

Los valores de referencia de pO2, están influenciados, por lo tanto por todos
estos factores, pero en general:

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• Para jóvenes adultos 80 mm Hg. es el límite inferior.


• Para individuos de edad avanzada 70 mm de Hg. es el límite inferior.

Anoxia es el término general para la oxigenación insuficiente, hipoxemia es la


oxigenación deficiente de la sangre y anoxemia u anoxihemia es la disminución
del oxígeno en sangre.

Cualquier grado de hipoxemia puede ser compensado temporalmente por el


organismo, pero la privación total de oxígeno lleva a la muerte en pocos minutos
al no poseer el organismo reserva alguna. Se han descrito casos de
supervivencia con pO2 de solo 7.5 mm de Hg.

DIÓXIDO DE CARBONO

El CO2 es transportado desde los tejidos hasta los pulmones, donde es


expulsado a través de la respiración. Con la pCO2 se refleja la eficacia de la
excreción pulmonar y la cantidad de CO2 generado por el metabolismo. Los
valores normales de pCO2 en sangre arterial son de 32 a 45 mm de Hg.

HIPOCAPNIA

Es la disminución de CO2 en sangre por debajo de los valores normales, puede


ser consecuencia de:

• Fallo en el hígado.
• Shock séptico y hemorrágico.
• Lesión craneal.
• Septicemia.

HIPERCAPNIA

Es el aumento de CO2 en sangre por encima de los valores normales, puede ser
consecuencia de:

• Asma.
• Enfisema.
• Bronquitis crónica.

La relación entre los gases presentes en el pulmón por ventilación y los que
existen en sangre se representa por V/Q y recibe el nombre de cociente de
ventilación-perfusión.

La pO2 arterial disminuye, a la vez que la pCO2 aumenta, en los siguientes


casos:

• Hipoventilación.

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• Desigualdad V/Q.
• Defectos de difusión.

ESTUDIO ANALÍTICO
Para medir la pCO2 se emplea el electrodo de Severinghaus. Se trata de un
electrodo de pH rodeado de una solución electrolítica que está separada de la
sangre por una membrana permeable al CO2. El material que compone la
membrana suele ser caucho, teflón o silicona. El pH de la solución depende de la
pCO2 en equilibrio con la sangre.

Para determinar la pO2 se emplea el método del electrodo polarigráfico de Clark


para el oxígeno. Consiste en una solución electrolítica de CLK que sumerge
ánodo y cátodo, separada de la sangre por una membrana.

En este sistema se aplica un voltaje de polarización constante al ánodo de plata-


cloruro de plata, y al cátodo, de alambre de platino. El oxígeno se reduce en el
electrodo y su reducción, modifica el potencial eléctrico, en forma proporcional a
la velocidad de reducción. Esta última, claro está, varía en función de la tensión
de oxígeno presente en la sangre.

Los electrodos del pO2 y del pCO2, deben ser calibrados previamente con un gas
o un líquido de presión parcial de oxígeno conocida.

INTERPRETACIÓN
La gasometría arterial puede indicar ciertas anomalías, pero no su grado de
anormalidad, ni tampoco son suficientes para un diagnóstico etiológico
específico. Por ejemplo, puede presentar los mismos valores de gases en sangre
una persona con obstrucción crónica de las vías respiratorias que un cardiaco
con edema pulmonar, un asmático que un paciente con neumonía.

EQUILIBRIO ÁCIDO-BASE

Los ácidos son productos que pueden ser ingeridos directamente en la dieta, o
producidos endógenamente por el metabolismo (oxidación de lípidos, oxidación
de aminoácidos, etc.). Los ácidos volátiles como el H2CO3, pueden ser
eliminados por el pulmón en forma de CO2, pero los ácidos no volátiles, no
pueden ser eliminados por el pulmón, y deben excretarse a través de la orina.

El organismo, necesita por lo tanto, de mecanismos capaces de mantener


constante el pH de los líquidos intra y extra celulares (de 7.35 a 7.45), sin que se
altere por la presencia de esos ácidos. Esto se consigue con la presencia de
tampones (ácidos débiles en solución con su base conjugada, capaces de
mantener el pH en pequeños márgenes de variación).

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El principal tampón extracelular es el bicarbonato, seguido de la hemoglobina,


las proteínas plasmáticas y el fosfato, todos ellos actúan de forma instantánea en
la reducción del pH pero el equilibrio ácido - base final, lo realizan las células
tubulares renales.

ACIDOSIS

Se produce cuando existe disminución del pH sanguíneo. Puede estar originado


por:

• Acúmulo de CO2 en el organismo “acidosis respiratoria“. Como


consecuencia de una hipoventilación. Los riñones intentan
compensarlo.
• Acúmulo de ácidos fijos, como el CO2 total y tampón, es una “acidosis
metabólica”. En este caso, la frecuencia respiratoria se aumenta para
intentar compensarlo. Aparece en casos de shock, uremia, ingestión
de tóxicos, etc.

ALCALOSIS

Ocurre cuando el pH sanguíneo es superior a 7.45.

• Alcalosis respiratoria. Ocurre secundariamente a una hiperventilación,


como consecuencia del aumento de la concentración de la pCO2 en
sangre. Los riñones intentan compensarla, disminuyendo la secreción
de ácidos fijos, o la reabsorción del CO3H-
• Alcalosis metabólica. Aparece cuando existen perdidas de ácidos fijos
o ganancia de bases. Se puede deber a vómitos prolongados,
aspiración nasogástrica, o ingestión excesiva de antiácidos, aunque
también aparece asociado al síndrome de Cushing, o el
hiperaldosteronismo. Se intenta compensar disminuyendo la
frecuencia respiratoria.

pH SANGUÍNEO
Podemos definir el pH como el logaritmo negativo de la concentración de
protones. Sus valores normales se ven afectados por la presencia de sustancias
ácidas o básicas en sangre y es de suma importancia mantenerlo dentro de unos
márgenes concretos para evitar importantes modificaciones de todos los
procesos metabólicos, de ahí la importancia de los tampones.

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MÉTODOS ANALÍTICOS DE MEDIDA DEL pH

Para determinar el pH se utiliza sangre total o plasma, siendo adecuada para ello
tanto la sangre arterial, como la venosa, o la capilar. Normalmente el pH venoso
es 0.0003 unidades menor que el arterial.
Cuando intentamos medir el pH en el laboratorio, es muy importante tener en
cuenta:

• Almacenar las muestras en frío, pues a temperatura ambiente se


agilizan los procesos metabólicos como la glucólisis que producen
ácidos y disminuyen los valores del pH.
• Añadir a las muestras fluoruro sódico para evitar la actividad glucolítica
de los leucocitos.
• Es preferible añadir plasma, pues la actividad anhidrasa carbónica de
los eritrocitos, también modifica el pH.
• No utilizar oxalatos como anticoagulantes, pues aumentan el pH, ni
tampoco citrato o EDTA, pues lo disminuyen, es preferible heparina.

MÉTODOS ELECTROMÉTRICOS

Para medir el pH se usa un sistema de electrodo de vidrio, el cual presenta dos


partes:

• El electrodo de referencia o de calomelanos.


• El electrodo de vidrio.

El electrodo de referencia, mantiene un potencial constante, y el de vidrio


desarrolla un potencial proporcional a la concentración del ión hidrógeno en la
solución problema. La sangre total o el plasma problema, se colocan a un lado
de la membrana de cristal, y al otro se coloca una solución estándar son
concentración de hidrogeniones conocida.

La técnica se basa en medir el potencial creado a través de la membrana que


separa ambas concentraciones con concentración de hidrogeniones desigual.

MÉTODOS DE TITULACIÓN

Son poco utilizados. Para evaluar el equilibrio ácido-base, hay que cuantificar no
solo el pH, sino:

• La pCO2.
• La pCO2 total.
• El exceso de base.

Todo esto nos dará información para evaluar el equilibrio ácido-base e identificar
las causas de las posibles alteraciones.

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TEMA 2. IONOGRAMA. ESTUDIO


ANALÍTICO
CONCEPTO.
Los electrolitos son iones que existen normalmente en los líquidos corporales.

Un ionograma es la determinación y el registro de la concentración de los


diversos aniones y cationes de un líquido corporal.

PRINCIPALES ELECTROLITOS.

A nivel extracelular, los principales cationes son Na+ y K+, y los principales
aniones Cl- y HCO3.

Las concentraciones de estos electrolitos afectan al metabolismo, al estado de


hidratación, al pH intra y extra celular. Además, la diferente concentración de
estos electrolitos en los líquidos intra y extra celulares, regula el funcionamiento
del sistema nervioso y del tejido muscular.

Las concentraciones de electrolitos se pueden expresar de varias formas :

-miliequivalentes por litro = mEq/l.


-milimoles por litro = mmol/l.

*Recordar que 1 mEq equivale a 1mmol, solo en el caso de iones monovalentes.

SODIO, POTASIO Y AGUA.

El agua constituye aproximadamente el 60% del peso corporal de un adulto,


repartida como sigue:

• Líquido
o extracelular 20% (LEC).
o vascular 5%.
o intersticial 15%.
• Líquido intracelular 40% (LIC).
• Líquido transcelular 1-3%.

Lo que distingue a unos líquidos de otros, es simplemente la composición de


electrolitos.

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Líquido extracelular Líquido intracelular


% Na 95-98% 2-5%
Cationes Na (142 mEq /l) >Ca K (161 mEq /l )>Mg>Ca
Aniones HCO3 (27 mEq /l) Aniones orgánicos (proteínas)
Cl (101 mEq /l) * 4 veces más proteínas.
pH 7.4 7.0

El LIC y el LEC, a pesar de su diferente composición electrolítica, se muestran


siempre en equilibrio osmótico, regulado con la bomba Na-K-ATPasa, que extrae
3Na+ del interior celular e introduce 2K+.

Los dos constituyentes el LEC (plasma y líquido intersticial), presentan una


composición muy similar de electrolitos, son la presión hidrostática y la oncótica
las que inducen al intercambio de Na+ y agua entre ambos espacios, que se
lleva a cabo a nivel capilar.

Entre LEC y el transcelular, también se intercambia agua y Na+. A nivel de tubo


digestivo se intercambian de 6-8 l/día de agua cuando la [Na+] es menor que la
del espacio transcelular.

BIOQUÍMICA DEL SODIO Y DEL POTASIO.

Los valores normales de sodio y potasio en sangre son:

-Na+: 135 a 148 mmol/l.


-K+: 3.8 a 5.5 mmol/l.

El sodio se excreta en orina cuando sus valores en sangre superan los 110
mmol/l. Se excreta de 30 a 280 mmol/día.

El potasio excretado en orina es de unos 25 -120 mmol/día.

La función biológica más importante del sodio y el potasio, es la de regular la


presión osmótica, y asegurar la integridad celular (Son cargas positivas que
retienen aniones).

Otra de las funciones del sodio y el potasio es la de mantener el balance de agua


en el organismo.

El sodio, por su parte, interviene en el equilibrio ácido-base, y el potasio, por la


suya, en la propagación del impulso nervioso y por lo tanto, también en la
actividad muscular.

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TÉCNICAS UTILIZADAS PARA LA DETERMINACIÓN DE SODIO Y


POTASIO, ESTUDIO ANALÍTICO.

FOTOMETRÍA DE LLAMA.

Existen diversas técnicas para determinar el sodio y el potasio en sangre. La


más rápida y simple de ellas es la fotometría de llama.

La fotometría de llama se basa en que al pulverizar una solución de una


sustancia sobre una llama, los electrones de los átomos de dicha sustancia se
excitan y pasan a niveles de energía superiores. Este exceso de energía es
cedido al ambiente en forma de color en la llama. Tras colorear la llama, los
átomos pasan a un estado menor de energía.

La coloración aparecida, corresponde a la emisión de rayos de una determinada


longitud de onda, característica de cada elemento. La intensidad del color
depende directamente de la concentración de la sustancia.

En la llama se producen los siguientes colores característicos de determinados


elementos:

Litio........................color rojo.
Sodio......................color amarillo.
Potasio....................color violeta.
Magnesio ...............color azul.

En un fotómetro de llama se distinguen las siguientes partes:

Atomizador: Es la parte encargada de disgregar la solución problema en gotas


pequeñitas. Una vez disgregada, sus átomos pueden, más fácilmente absorber
la energía térmica de la llama, y excitarse.

Llama: Se encarga de excitar los electrones de los átomos de la sustancia


pulverizada.

Monocromador: Es la parte encargada de seleccionar la longitud de onda.

Detector; es el medidor de la energía radiante emitida.

Normalmente se comparan soluciones de concentración conocida del elemento


(Na + o K+) con la muestra problema (suero).

• Se preparan una serie de soluciones patrón de sodio (2.5; 5.0; 7.5 y 10


microgramos /ml).
• Se preparan otra serie de soluciones patrón de potasio (5; 10;15 y 20
microgramos /ml). A esta serie hay que añadir Na+ en concentración
similar a la normal en el suero.

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Con las soluciones patrón se obtienen resultados que hay que trasladar a una
curva de calibración (una para el sodio y otra para el potasio), colocando en
abscisas las concentraciones en microgramos/ml y en ordenadas las
intensidades de emisión leídas por el galvanómetro.

Para la determinación del Na+ se diluye el suero, normalmente 1:500, y para la


del K+ 1:20. Se leen las intensidades de emisión, y se traslada a la curva
respectiva obtenida anteriormente, para de esta forma determinar la
concentración en el suero problema.

Los valores normales suelen ser:

-Na+ en suero ------------------------------135-155 mEq /l.


-K+ en suero-----------------------------------3.6-5.5 mEq /l.

POTENCIOMETRÍA CON ELECTRODO ION -SELECTIVO.

Otra técnica utilizada para detectar Na+ y K + es la de la potenciometría con


electrodo ión selectivo:

-Na+..............electrodo = membrana de i.iónico de vidrio.


-K+................electrodo = membrana transportadora neutra de valinomicina.

Las interferencias que se presentan en la aplicación de esta técnica son; la


hemólisis, el heparinato, y los anticoagulantes sódicos.

IONES CLORURO.

El principal anión extra celular es el cloruro. El exceso de Cl- es excretado con la


orina.

Su concentración normal en suero es de 101 mEq /l, excretándose en orina, en


condiciones normales, de 110 a 250 mmol /día.

Los iones cloruro tienen una importante función en el mantenimiento del


equilibrio ácido - base.

Los iones cloruro son ingeridos normalmente en la dieta y se reabsorben en el


intestino.

ESTUDIO ANALÍTICO.

Se puede medir a través de los siguientes métodos:

• Titulación mercurimétrica.
• Titulación culombimétrica - amperométrica.
• Colorimetría mediante Hg (SCN)2.

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• Uso de electrodos específicos de este ión.

A) Titulación mercurimétrica:

En ella el cloruro y el Hg++ se unen formando HgCl2. El Hg++ en exceso se


combina con la difenilcarbazona dando un complejo coloreado de color azul-
violeta. Un ejemplo de técnica mercurimétrica es la de Shales-Shales.

2CL- + (NO3)2Hg.........................(indicador).............Cl2Hg + 2NO3-

B) Titulación columbimétrica:

Requiere pequeños volúmenes y es un método muy preciso . Se


utiliza en pediatría y también para determinar los niveles de cloruro en el sudor.

C) Método del tiocianato:

Muestra (Cl-) + Hg (SNC)2........................cloruro mercúrico + SNC- Libre.

El tiocianato libre, reacciona con Fe 3+, formando complejos, cuya intensidad de


color determina fotométricamente, es proporcional a las cantidades de cloro
existentes en la muestra.

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TEMA 3.- BIOQUÍMICA CARDIACA


INTRODUCCIÓN.

Aproximadamente en el 20% de los casos de cardiopatía isquémica, la primera


manifestación de la enfermedad es la muerte súbita. La experiencia obtenida en
países como EE.UU., Australia y Finlandia nos muestra que la Cardiopatía
Isquémica es prevenible al menos en parte.

En España, la mortalidad por Cardiopatía Isquémica es baja, pero en el período


1968-1977 prácticamente se duplicó, pasando de la tasa bruta de 43 a la de 80
por cien mil, existiendo una tendencia al aumento de la tasa de mortalidad
estandarizada en relación con otros países europeos.

Estos datos nos hacen ver la importancia de la prevención de la enfermedad así


como del diagnóstico temprano, para evitar desenlaces fatales. Entre las
múltiples técnicas diagnósticas con que contamos, destacaremos en este tema
la valoración bioquímica-enzimática en la fase aguda de la isquemia miocárdica
y en la evolución de la enfermedad en los primeros días.

Las enzimas catalizadoras orgánicas responsables de la mayoría de las


reacciones químicas que suceden en el organismo, se encuentran en todos los
tejidos. Algunas se han identificado en el plasma, al que llegan desde las células
dañadas o quizás incluso desde las células intactas.

En la actualidad se han identificado en el suero más de 50 enzimas. Los niveles


de muchas enzimas han sido estudiados con extensión en una gran variedad de
procesos. Se han aplicado algunas pruebas de enzimas séricas con tanta
amplitud en algunos problemas clínicos, que se consideran procedimientos
habituales en el laboratorio. Otras, aunque muestran claramente ser un reflejo de
diversas enfermedades, se llevan a cabo en relativamente pocos laboratorios
clínicos, porque la prueba en sí es técnicamente diferente o porque la
información facilitada se considera que ayuda muy poco. Otras pruebas tienen
un interés de investigación más que clínico.

El empleo de las enzimas séricas como ayuda diagnóstica ha sido muy empírico,
pero los valores observados en circunstancias clínicas y experimentales
permiten un análisis especulativo de los factores que controlan los niveles de las
enzimas séricas en sujetos normales y enfermos. Los niveles séricos de una
enzima particular crecen en las enfermedades que conducen a un aumento de
su liberación por el tejido, por un aumento de la cantidad disponible para su
liberación o por una disminución de esta cantidad. Un aumento de la cantidad
liberada es sin duda responsable de los elevados niveles séricos de las enzimas
que producen necrosis en las enfermedades hepáticas, pancreáticas y

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miocárdicas. El tipo de anormalidad de los valores de las enzimas séricas


resultantes depende del contenido enzimático normal del tejido afectado y de la
extensión y tipo de la necrosis.

La selección de las pruebas enzimáticas para su uso clínico ha dependido de


circunstancias históricas, de la experiencia ganada en la correlación de los
valores con otras determinaciones patológicas y la facilidad técnica de realizar
cada procedimiento respectivo.

MARCADORES BIOQUÍMICOS: VALOR DIAGNÓSTICO Y EVOLUTIVO EN


EL PROCESO ISQUÉMICO.

En el infarto del miocardio hay unos cambios hemáticos inespecíficos que


traducen la inflamación y necrosis, como son una discreta leucocitosis con
desviación izquierda, que aparece en las primeras horas y dura una semana, y
un aumento de la VSG, que tiene lugar a partir del cuarto o quinto día y dura
varias semanas. Pero el máximo valor diagnóstico lo representan las elevaciones
de ciertas enzimas (contenido fundamental de nuestro tema), liberadas en
grandes cantidades a partir del tejido cardiaco necrosado. Difiere la rapidez con
la cual es liberada cada enzima y su esquema temporal de liberación tiene cierta
importancia diagnóstica.

Transaminasa glutámico oxalacética (GOT): comienza a elevarse


precozmente, a las doce horas, alcanza su máximo al segundo día y se
normaliza al cuarto o quinto día. Puede elevarse hasta 10 veces su valor normal
(8-20 U/L).

La lista de afecciones distintas al infarto del miocardio que pueden elevar la


GOT comprende:

• Insuficiencia ventricular derecha con congestión hepática


• La administración de salicilatos, opiáceos o anticoagulantes
• Enfermedad muscular primaria, incluyendo distrofia muscular y
traumatismo quirúrgico
• Operaciones quirúrgicas
• Pancreatitis aguda
• Daño extenso del sistema nervioso central
• Toxemia del embarazo
• Crisis hemolítica
• Machacamiento o quemaduras
• Infarto del riñón, bazo o intestino
• Hipotiroidismo.

Está presente, además, en otros tejidos: hígado, músculo, riñón, cerebro, por lo
que enfermedades de estos órganos pueden producir aumentos séricos de la
enzima.

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La experiencia confirma que las determinaciones de CPK y sus isoenzimas y de


LDH y sus isoenzimas son indicadores más fiables para el diagnóstico de
laboratorio de necrosis miocárdica.

En pacientes con criterios clínicos de insuficiencia coronaria más que de infarto


de miocardio pueden darse cifras elevadas de GOT en suero. No está claro si
esto representa una necrosis miocárdica que no ha podido reconocerse
mediante otros métodos (bastante improbable) o una liberación de la enzima al
suero, incluso sin una necrosis clara del miocardio.

Lactodehidrogenasa (LDH): esta enzima cataliza la oxidación reversible de


lactato a piruvato. Está ampliamente distribuida en tejidos de mamíferos y es
más abundante en el miocardio, riñón, hígado y músculo. Se han aplicado para
su análisis métodos espectrofotométricos y colorimétricos.

Los niveles séricos elevados de LDH se observan en muchas circunstancias.


Los valores más altos (2 a 40 veces la normalidad) se ven en casos de anemia
megaloblástica, en carcinomatosis extensa, en el shock grave y en la anoxia.
Subidas moderadas (2 a 4 veces la normalidad) ocurren en enfermos de infarto
de miocardio, infarto pulmonar, leucemia granulocítica, anemia hemolítica,
mononucleosis infecciosa y en pacientes con distrofia muscular. Se ven ligeras
elevaciones en casos de hepatitis, ictericias obstructivas o cirrosis.

Son bastantes característicos los patrones de niveles séricos elevados de LDH


en los casos de infarto de miocardio. En general, aumenta más tarde, a las
veinticuatro horas; alcanza el pico a los tres o cuatro días y persiste elevada
cuando el resto de las enzimas se han normalizado; vuelve el nivel basal a los
siete o diez días, y la elevación máxima puede ser dos o tres veces los valores
normales (45-90 U/L).

Es menos específica, pues se encuentra prácticamente en todos los tejidos del


organismo. Por ello tiene más valor determinar sus cinco isoenzimas, que
aunque presentes en toda las economía, lo están a concentraciones diferentes
en los diversos tejidos.

Mediante electroforesis se pueden separar cinco isoenzimas comunes a la LDH.


Cada una de estas isoenzimas se distingue de las otras mediante
procedimientos serológicos, electroforéticos y otros varios de orden químico.
Las isoenzimas de la LDH se designan en la práctica de acuerdo con su
movilidad electroforética. Cada isoenzima es un tetrámero constituido por cuatro
subunidades, cada una con un peso molecular de 34.000. Existen dos tipos de
estas subunidades, designados respectivamente H y M, H para la cadena de
péptidos del corazón y M para la cadena del músculo estriado.

Los diversos tejidos difieren en cuanto a sus esquemas específicos de


isoenzimas, la isoenzima que se desplaza con mayor rapidez y que es más

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abundante en el corazón, ha sido designada LDH1, en cambio, en el hígado y en


el músculo estriado predominan isoenzimas de desplazamiento más lento.
La LDH1 es relativamente específica del corazón, por lo que su elevación y,
sobre todo, la relación LDH1/LDH2 cuando es superior a uno (LDH invertida) es
muy sugerente de infarto de miocardio, aún cuando la LDH total no haya
aumentado. En casos de infarto de miocardio, la LDH1 aumenta antes que la
LDH total, y puede incluso aumentar sin que se note todavía ningún cambio de
LDH total. Por tanto, una elevación de la LDH1 constituye un índice del infarto de
miocardio más sensible que la LDH total. Cabe mencionar una sensibilidad
superior a 95%.

Es difícil la cuantificación de las isoenzimas, y las técnicas son demasiado


incómodas para su empleo en el estudio de numerosos sueros. Sin embargo, la
determinación de LDH1, la isoenzima miocárdica, puede realizarse mediante
técnicas sencillas como el análisis de la actividad total de LDH.

Creatinfosfoquinasa (CPK): es la enzima que más precozmente se eleva en el


infarto de miocardio, ya que hay niveles altos a las cuatro o seis horas, alcanza
el pico máximo a las veinticuatro-treinta horas y se normaliza al tercer o cuarto
día. Puede elevarse hasta cuarenta veces su valor normal (varón 12-70 U/L;
hembra 10-55 U/L).

Es la más específica, pero se encuentra también en el tejido muscular y en el


cerebro y además se eleva por inyecciones intramusculares, cardioversión,
cirugía, etc.

Reviste una importancia especial, en la clínica, el hecho de que una inyección


intramuscular puede ir seguida de una elevación al doble o al triple de la cifra
sanguínea de CK.

Esta particularidad puede significar diagnósticos erróneos de infarto del


miocardio en pacientes que recibieron inyecciones intramusculares de algún
analgésico para combatir un dolor torácico que no era de origen cardiaco. Otras
posibles causas de aumento de la CK pueden ser:

• la miopatía que acompaña al alcoholismo crónico.


• el tratamiento con clofibrato.
• el cateterismo cardiaco.
• el hipotiroidismo.
• las embolias cerebrales.
• el ejercicio físico.

La CPK tiene tres isoenzimas, cada una constituida por dos subunidades: M
(músculo) o B (cerebro); el cerebro contiene BB; el músculo esquelético MM, y el
miocardio MM y MB. Pues bien, la isoenzima MB (CPK-MB) resulta específica
del músculo cardiaco; su curva de elevación es similar a la de la CPK total, pero
algo más precoz.

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La presencia de CPK-MB en los sueros indica una lesión de miocardio y se


observa en todos los pacientes durante el período de 48 horas después de un
infarto agudo de miocardio. Sin embargo, también se detecta en menor grado en
individuos con angina e insuficiencia coronaria graves, pero sin indicaciones de
infarto.

En vista de que la elevación de la cifra sérica de CPK dura poco tiempo, quizá
pase inadvertida si las primeras muestras de sangre se recogen después de
transcurridas 72 horas. La actividad de la CPK-MB nunca supera el 40% de la
actividad sérica total de la CPK y el resto es CPK-MM.

Las determinaciones de la isoenzima de la CPK realizadas después del día 4


sólo revelarán actividad de la CPK-MM, y no podrá establecerse su origen en el
corazón o músculo.

Con las técnicas actuales de reperfusión precoz, utilizando la administración


intravenosa de sustancias fibrinolíticas, para romper la porción fresca del trombo
arterial, los niveles de CPK suben espectacularmente, alcanzando hasta mil
veces su valor normal. Esto último no es indicativo de gran necrosis miocárdica,
sino consecuencia de la destrucción, al menos parcial del trombo intraarterial.

Se sabe desde hace mucho que el tamaño del infarto tiene cierta relación con la
cantidad de enzimas liberadas. Se ha demostrado que puede conocerse la masa
de músculo cardiaco infartado a partir del análisis de la curva de concentración-
tiempo de la enzima en cuestión, siempre y cuando se conociera la cinética de
liberación, desdoblamiento, eliminación, etc. de dicha enzima. Si se analiza una
curva de tiempo de la fracción MB de la CK puede calcularse el tamaño del
infarto en términos de gramos.

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En más del 95% de pacientes con un infarto del miocardio comprobado existen
elevaciones características en la concentración sérica de las enzimas.

Existen otros indicadores bioquímicos de infarto, como el incremento de


mioglobina en suero, disminución del Zinc plasmático, etc., no tienen en la
actualidad utilización en la clínica.

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TEMA 4. PRINCIPALES
MARCADORES TUMORALES E
IMPLICACIÓN PRÁCTICA.

INTRODUCCIÓN

Con la detección y tratamiento precoces del cáncer, responsable actualmente de


una gran mortalidad en la población mundial, se espera se produzca una
marcada disminución en la morbilidad y mortalidad de esta enfermedad.

La detección precoz mediante técnicas citológicas han dado resultados muy


positivos en la detección de ciertos tumores (Ej.: cáncer cervical) aunque no
detectan por sí mismas gran cantidad de tumores. Es por ello que la
investigación se ha centrado en la investigación de productos tumorales en
sangre, orina y otros líquidos corporales.

Así, reciben el nombre de MARCADORES TUMORALES a aquellas sustancias


presentes en sangre, orina u otros líquidos corporales (fundamentalmente se
investiga en sangre) procedentes de la célula neoplásica, ya que por sus
especiales características ésta sintetiza compuestos que se distinguen de los
aportados por una célula normal, bien en su estructura, bien en su concentración
en los líquidos biológicos.

TUMOR, CÁNCER Y CÉLULAS TUMORALES

Llamamos tumor a la neoformación o nuevo crecimiento de tejidos en que la


multiplicación de las células no está totalmente controlada por los sistemas
reguladores del organismo.

Denominamos cáncer a un tumor maligno en general. Las características


básicas de la malignidad es una anormalidad de las células trasmitidas a las
células hijas, que se manifiesta por la reducción del control del crecimiento y la
función celular, conduciendo a una serie de fenómenos adversos en el huésped
a través de un crecimiento masivo, invasión de tejidos vecinos y metástasis.

La característica principal de la célula tumoral con respecto a las células


normales es fundamentalmente la pérdida de control en los procesos de
crecimiento y división. Al llevarse estos de forma desorganizada, conduce a la
formación de una masa tumoral que invade los tejidos circundantes rompiendo
las membranas límites de las distintas estructuras. La diseminación y
colonización de algunas de estas células tumorales puede dar lugar a la

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aparición de metástasis o más focos morbosos secundarios en regiones no


contiguas del punto de evolución del foco primitivo.

ALTERACIONES DE LAS CÉLULAS TUMORALES

En las células tumorales o neoplásicas se conocen anomalías tanto estructurales


como genéticas.

DE LA MEMBRANA

En las membranas celulares se detectan modificaciones en las glicoproteínas


transmembrana y en los enlaces entre los distintos componentes moleculares
que ocasionan un crecimiento desordenado del tejido, con la formación de la
masa tumoral.

Igualmente aparecen modificaciones en los receptores de membrana que


conducen en algunos casos a facilitar el anclaje de células tumorales en otros
tejidos.

Aparecen además proteínas anómalas que dotan a las células neoplásicas de


una gran respuesta a factores que determinan su crecimiento y multiplicación.
Cabe resaltar la detección de la llamada “proteína P” que dota a las células de
gran resistencia a las drogas neoplásicas utilizadas en quimioterapia.

DEL NÚCLEO

Respecto a las anomalías que afectan al núcleo, las más fácilmente detectables
afectan al tamaño nuclear, lo que determina un índice mitótico mayor que el
correspondiente a una célula normal.

GENÉTICAS

Las alteraciones más importantes afectan al material genético. Existen una serie
de genes normales llamados prooncogenes que por acción de determinados
agentes se transforman en oncogenes, lo que se traduce en la mayoría de los
casos en la alteración en la composición de las proteínas que codifican o
alteraciones en la cantidad induciendo a la mitosis acelerada de las células.

Por este mismo mecanismo puede además desaparecer genes protectores,


malignizándose igualmente la célula afectada.

DEL CICLO CELULAR

En un ciclo celular normal la mayor parte del tiempo lo dedican las células, una
vez diferenciadas, a sintetizar productos específicos de cada tipo celular. Una
vez dividida la célula puede madurar y diferenciarse para continuar de nuevo el

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ciclo celular. Dicho ciclo celular está regulado por una serie de proteínas
sintetizadas por la propia célula.

Cuando este ciclo se altera, las células no maduran, no se diferencian, por lo que
no tienen capacidad de síntesis y se dividen a gran velocidad constituyendo
rápidamente la masa tumoral.

TIPOS DE MARCADORES TUMORALES

ESPECÍFICOS E INESPECÍFICOS

Las sustancias marcadores se pueden clasificar como específicos de un tumor o


asociados a este.

Los antígenos específicos del tumor se piensan que son resultado directo de la
oncogénesis; pueden considerarse como neoantígenos específicos de las
células tumorales.

Los antígenos inespecíficos están asociados al tumor, y comprenden diversas


enzimas y proteínas que aparecen en sangre y son mediadas por el propio tumor
o su influencia en tejidos no afectados.

EN FUNCIÓN DE SU UTILIDAD CLÍNICA

Podemos clasificar los marcadores tumorales en función de su utilidad clínica en:


marcadores diagnósticos, terapéuticos, de evolución y genómicos.

La determinación de marcadores tumorales en sangre nos proporciona una gran


información, aunque el conocimiento de la tasa de marcadores tumorales en la
propia masa tumoral nos va a proporcionar también una valiosa información.

Si estos son negativos, nos indica que nos encontramos frente a un tumor de
células no diferenciadas incapaz de sintetizar estos marcadores, y por lo tanto de
gran agresividad. Por el contrario, si los marcadores son positivos, nos indica
que las células tienen la diferenciación suficiente para sintetizar, y por lo tanto de
menor agresividad que en el caso anterior.

Así, este tipo de determinación nos ayuda a diagnosticar y cuantificar la mayor o


menor agresividad de las células tumorales, se denominan por tanto
marcadores diagnósticos.

La determinación basal y la cuantificación periódica de los marcadores tumorales


es indicativa de la sensibilidad de la célula a una determinada terapia
(marcadores terapéuticos) e indicativa igualmente de la evolución de la
enfermedad y de la utilidad de la terapia elegida (marcadores de evolución).

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Existen además marcadores genómicos que permiten conocer la incidencia de


las alteraciones de los prooncogenes al inicio de la enfermedad. Habitualmente
se trata de proteínas codificadas por los genes alterados.

CARACTERÍSTICAS DE LOS MARCADORES TUMORALES

Para que un marcador tumoral sea considerado como tal debe reunir una serie
de características como son:

1. Deben ser producidas por las células tumorales o bien modificar los valores
normales de un individuo sano. En el primer caso, entre o l s marcadores
producidos por una célula neoplásica tenemos por ejemplo los antígenos
oncofetales, o la gonadotropina coriónica en varones o mujeres no
embarazadas. En el segundo caso, hay que fijar previamente los llamados
valores de corte o valores a partir de los cuales supondremos probable la
existencia de una patología.
2. Deben detectarse y cuantificarse fácilmente.
3. Deben ser de alta sensibilidad y su tasa ser reflejo del tamaño tumoral.
4. Deben ser específicos.
5. Sus niveles en individuos sanos deben ser muy inferiores a los que se
encuentran en individuos enfermos.

CUALIDADES DE LOS MARCADORES TUMORALES.

Como comentamos anteriormente, un marcador debe ser sensible y específico.


Podemos definir los conceptos de sensibilidad y especificidad de la siguiente
forma:

• Sensibilidad: Es la probabilidad de encontrar un valor positivo en


una población de enfermos.
• Especificidad: Es la probabilidad de hallar un valor negativo en
una población de sanos.

Si suponemos dos muestras de población, una de individuos sanos y otra de


individuos enfermos, consideraremos un valor verdaderamente positivo (VP) a
aquel superior al límite de normalidad en un individuo enfermo; un valor
verdaderamente negativo (VN) al valor inferior al límite normal en un individuo
sano; un valor falsamente positivo (FP) a un valor superior al límite de
normalidad en un individuo sano y un valor falsamente negativo (FN) a un valor
inferior al límite de normalidad en un individuo enfermo.

En base a esto:

Sensibilidad = (VP/(FP+FN)) x 100


Especificidad = (VN/(FP+VN)) x 100

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Es por ello que se deben asociar marcadores de gran sensibilidad con otros de
gran especificidad.

Así, si tenemos interés en conocer que no se padece una determinada


enfermedad, buscaremos una especificidad alta, donde los falsos positivos
tiendan a cero; mientras que si queremos tratar una patología de gran
agresividad debemos buscar técnicas de gran sensibilidad, donde los falsos
negativos tiendan a cero,

Podemos definir también respecto a los marcadores tumorales el Valor


Predictivo, que es la probabilidad de que un sujeto investigado padezca o no la
enfermedad. Así, el valor predictivo positivo es la probabilidad de que el sujeto
padezca la enfermedad.

VPP = (VP/(VP+FP)) x 100

El valor predictivo negativo, por tanto, será la probabilidad de que el individuo no


padezca la enfermedad.

VPN = (VN/)VN+FN)) x 100

Un marcador se puede emplear como prueba de screening en una población


para detectar un determinado cáncer cuando el VVP sea alto.

DETERMINACIÓN DE MARCADORES

NIVELES DE MARCADORES

Los factores que determinan los niveles de marcadores en sangre son:

1. Índice tumoral de síntesis: Es la relación entre el número de células


productoras del marcador utilizado en el seguimiento y el número total de
células constitutivas de la masa tumoral.

2. Localización de la masa tumoral y mecanismo de liberación que permite el


paso del marcador a la circulación general.

3. Vida media del marcador en la propia masa tumoral y en sangre periférica.

4. Factores analíticos relacionados con la técnica elegida para su determinación.

TOMA DE MUESTRAS

La obtención de la muestra es de gran importancia ya que los niveles de


marcadores se pueden ver afectados por:

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1. La exploración del paciente previa a la obtención de la muestra puede


provocar un aumento en la tasa de marcadores, especialmente en el caso de
enfermedades prostáticas.

2. Los agentes quimioterapéuticos pueden interferir en la determinación del


marcador, por lo que debe esperarse un periodo determinado que va a
depender de la vida media de la droga utilizada.

3. La necrosis celular que sigue a un tratamiento radiológico o a la quimioterapia


ocasiona la liberación de todos los componentes celulares, con la
consecuente elevación de los niveles en sangre.

DETERMINACIÓN DE MARCADORES

Es importante antes de iniciar cualquier tratamiento o manipulación determinar


los valores basales, para poder seguir la evolución y eficacia del tratamiento
elegido.

Por otro lado, los marcadores inespecíficos no tienen unas tasas o valores
establecidos en general, por lo que el propio paciente es su propio control, y el
conocimiento de los valores basales ayudará en la interpretación de las
oscilaciones que tengan dichos valores.

La historia y patología de cada paciente, así como la medicación que se


prescriba marcará el número y frecuencia de las determinaciones posteriores
para el seguimiento del tratamiento y evolución de la enfermedad. La
interpretación de las cifras de los marcadores ha de hacerse con cautela, pues
están sujetos a muchas variables.

La presencia de un valor elevado inesperado y no explicable por una posible


manipulación, medicación, infección, etc., deberá ser cuidadosamente
comprobado repitiendo la determinación e incluso la extracción. Esto es
importante ya que este valor elevado nos puede indicar recidivas mucho antes
que estas puedan ser detectadas por otros medios.

MÉTODOS DE DETERMINACIÓN

Los marcadores tumorales pueden ser detectados tanto en tejidos tumorales


como en líquidos biológicos.

La detección en tejidos tumorales se realiza mediante técnicas


inmunicitoquímicas.

La determinación de marcadores tumorales en líquidos biológicos se lleva a cabo


mediante técnicas inmunoquímicas, que incluyen entre otras el
radioinmunoanálisis (RIA) y técnicas de enzimoinmunoanálisis (ELISA).

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Son técnicas basadas en reacciones antígeno-anticuerpo, por lo que son de gran


sensibilidad, aunque van a influir en la técnica la afinidad y especificidad del
anticuerpo utilizado.

ASOCIACIÓN DE MARCADORES

Los marcadores tumorales se suelen asociar en el estudio de una determinada


enfermedad, ya que utilizados asociados aumenta la sensibilidad.

Se recomienda asociar al menos dos marcadores, un marcador de celularidad,


habitualmente de poca especificidad (CEA), de alteración de la respuesta
inmunitaria (Neopterina) o de proliferación celular (TPS) con otro de mayor
especificidad dentro de la patología estudiada, habitualmente de menor
sensibilidad que los anteriores.

En distintas neoplasias se emplean asociaciones de varios marcadores para el


diagnóstico, seguimiento y detección precoz de recidivas. Ponemos varios
ejemplos:

1. Cáncer de mama: es la primera causa de mortalidad por cáncer en las


mújeres. Se emplea como marcadores tumorales para el diagnóstico y
seguimiento el CEA y el Antígeno Ca 153, como marcadores de pronóstico y
terapéuticos se utilizan los receptores de estrógeno y progesterona.

2. Cáncer de próstata: Es la segunda causa de mortalidad por cáncer en el


varón de edad comprendida entre los 50 y 60 años. En el diagnóstico y
seguimiento se utilizan el PSA y la fosfatasa ácida prostática (PAP).

3. Cáncer de hígado: Como marcador se emplea la alfafetoproteína, de utilidad


en el diagnóstico y en el control, e incluso con valor pronóstico para enfermos
con hepatocarcinoma. En el estudio de las metástasis se emplea el antígeno
carcinoembrionario, sobre todo en el seguimiento del enfermo tratado.

ESTRUCTURA DE LOS MARCADORES

Los marcadores pertenecen a grupos con estructuras químicas muy variadas.

Los antígenos oncofecales se detectan en sangre fetal y prácticamente después


del parto se reducen a niveles no detectables. A medida que un individuo sano
crece es posible que aparezcan en suero en concentraciones bajas. Dos de los
antígenos oncofecales más conocidos son la alfafetoproteína (AFP) y el antígeno
carcinoembrionario (CEA).

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Entre las proteínas que tienen utilidad de diagnóstico para la evaluación de


pacientes con cáncer se encuentran aquellas asociadas al embarazo, tales como
la gonadotropina coriónica humana.

Las enzimas son marcadores útiles de procesos malignos.

Muchas hormonas son producidas por los tumores: cuando el tejido no


endocrino es responsable de la producción de hormonas se habla de producción
hormonal ectópica.

Los marcadores celulares, tales como los antígenos de las células T o B son
útiles, así como los receptores de estrógenos y progesterona.

En la tabla 1 aparecen los marcadores tumorales asociados a las patologías en


que aparecen.

MARCADORES TUMORALES MÁS UTILIZADOS

ANTÍGENO CARCINOEMBRIONARIO (CEA)

Se trata de una glicoproteína sintetizada en el tejido fetal, formada por varios


componentes que han de tenerse en cuenta, ya que dependiendo del anticuerpo
empleado en la técnica de determinación, se reconocerá uno o varios
componentes, lo que se reflejará en la tasa obtenida.

En pacientes adultos con diversos tipos de cáncer pueden detectar niveles


elevados en las células y en plasma, aunque no es específico de ningún proceso
maligno ni de tipo tumoral.

El CEA puede aparecer aumentado es especial en procesos malignos del


aparato digestivo, páncreas, pulmón y mama.

Su mayor aplicación es el diagnóstico y seguimiento postoperatorio del cáncer


colo-rectal y el estudio de las metástasis del cáncer de hígado.

ALFAFETOPROTEINA (AFP)

Es una glicoproteína presente en el suero de individuos sanos a bajas


concentraciones. Valores aumentados se observan en hepatomas y en tumores
germinales. Pequeños incrementos de AFP pueden detectarse en relación con
tumores del aparato digestivo o del pulmón.

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Tabla 1: Marcadores tumorales y tumores asociados

TIPO MARCADOR TUMOR ASOCIADO


Antígenos CEA Mama, colon
oncofetales AFP Hígado, tumores germinales
Glicoproteínas Ca 153 Mama
Ca 549 Mama
Ca 125 Ovario
Proteínas Caseína Mama, pulmón,
Ferritina gastrointestinal
Osteocalcina Leucemia
Metástasis ósea
Enzimas Creatincinasa (BB) Próstata
Fosfatasa ácida prostática(PAP) Próstata
Fosfatasa alcalina Pulmón
Antíg. Especif. Prostático(PSA) Próstata
Receptores De estrógeno Mama
hormonales De progesterona Mama
Marcadores Marcadores de las células T, B Linfoma
celulares
Poliaminas Espermina, espermidina, Leucemia, linfoma, cáncer
putresceina colorrectal
Hormonas Calcitonina (CT) Metástasis óseas
Gonadotropina coriónica(HCG) Tumores germinales
Adrenocorticotropica (ACTH) Pulmón
Paratiroidea (PTH) Riñón, pulmón, páncreas,
Antidiurética (ADH) ovario
Del crecimiento (GH) Pulmón
Eritropoyetina Pulmón, estómago
Lactógeno placentario humano Cerebro, hígado
Estimulante del tiroides (TSH) Pulmón
Pulmón, mama

ANTÍGENO Ca 153

Pertenece al grupo de las proteínas transmembranas, cuya estructura aún no


está establecida.

Existe una gran dispersión entre los valores encontrados en una población
normal, en una población afectada de una patología mamaria benigna y una
población que presenta una enfermedad maligna. Es por ello, que lo interesante
es disponer de los valores de evolución de un mismo paciente con el fin de
detectar precozmente recidivas.

Sus valores están aumentados en los cánceres que afecten a tejido epitelial,
fundamentalmente mamarios.

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ANTÍGENO Ca 125

Pertenece al grupo de las glicoproteínas no identificadas.

Es especialmente útil su empleo en carcinomas ginecológicos


(fundamentalmente de ovario) aunque también se ve aumentada sus tasas en
carcinomas gastrointestinales, de mama y de pulmón. Aumenta también en el
embarazo y en patologías como la diabetes y cirrosis.

GONADOTROPINA CORIONICA HUMANA (HCG)

Es una hormona glucoproteica generalmente detectada en suero y orina durante


la gestación. La hormona está compuesta de una unidad alfa y de una unidad
beta. Se ha puesto de manifiesto que una subunidad aislada puede ser
producida por un determinado tumor

Se detecta en tumores de células embrionarias y es muy útil en el seguimiento


de la evolución de las molas tras su evacuación.

ANTÍGENO PROSTÁTICO ESPECÍFICO

Es una glicoproteína secretada exclusivamente por la próstata. Es por tanto un


marcador específico de próstata, por lo que tiene interés en el diagnóstico,
pronóstico, determinación del estadio y seguimiento del cáncer de próstata.

Puede encontrarse elevado en afecciones como prostatitis aguda o adenomas.

ANTÍGENO POLIPEPTÍDICO TISULAR (TPA)

Es una proteína aislada de muestras tumorales y metástasis.

Es considerado como un marcador de proliferación tumoral, por lo que no es


específico de la patología tumoral. Tiene interés en el seguimiento terapéutico
del cáncer de vejiga y en la identificación de sujetos de riesgo, siendo de gran
importancia disponer de los valores basales del enfermo en particular.

RECEPTORES HORMONALES

Son estructuras proteicas encargadas del reconocimiento de las hormonas por


sus células diana.

Se emplean como marcadores tumorales dos tipos de receptores: los receptores


de estrógeno y los receptores de progesterona.

Se utilizan para valorar la sensibilidad de los tumores malignos de mama a la


respuesta hormonal. Su determinación también permite la correcta aplicación y
selección de la terapia en función de la hormonodependencia o no del tumor.

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HORMONAS COMO MARCADORES TUMORALES

La determinación de la producción hormonal ectópica puede emplearse como un


marcador bioquímico para la monitorización de pacientes con tumores
confirmados o con sospecha.

En aproximadamente dos tercios de los pacientes, la producción ectópica de la


hormona adrenocorticotrópica (ACTH) se asocia con carcinoma pulmonar
mientras que otros tumores, como los carcinoides bronquiales y los tumores
pancreáticos y tímicos, son responsables del resto de los casos.

El carcinoma de células renales y el carcinoma epidermoide de pulmón son


responsables de aproximadamente dos tercios de los tumores productores de
hormona paratiroidea (PTH) ectópica, mientras que el resto de los tumores se
originan en distintas localizaciones.

Los tumores responsables de la producción de hormona antidiurética (ADH) son


los pulmonares y pancreáticos.

La producción de hormona del crecimiento (GH) ha sido descrita solamente en


asociación con unos pocos tumores, los más frecuentes de los cuales son el
carcinoma broncogénico y el gástrico. En pacientes con carcinoma broncogénico
se ha observado el lactógeno placentario humano (LPH) como marcador
tumoral.

La eritropoyetina se ha detectado en relación a la patología neoplásica renal,


pero, dado que el riñón es normalmente responsable de su producción, estos
tumores no pueden detectarse como síndromes ectópicos. Sin embargo, dicha
sustancia ha sido secretada por hepatomas y tumores cerebelosos; los tumores
pulmonares son característicos por no secretar esta hormona.

La tirocalcitonina sérica (TCT) aparece aumentada en ciertos pacientes con


carcinoma pulmonar, colónico, mamario, pancreático y gástrico.

MARCADORES TUMORALES ANATOMOPATOLÓGICOS

La cuantificación de marcadores tumorales en sangre es sencilla y práctica. Sin


embargo, el conocimiento de la propia masa tumoral también nos proporciona
valiosa información.

Para precisar el tipo de neoplasia y su posible histogénesis: epitelial (carcinoma),


mesenquimatoso (sarcoma), linfoide (linfoma) etc. e intentar determinar la
localización primaria ante una neoplasia metastásica, el anatomopatólogo cuenta
con una serie de marcadores que resumimos a continuación:

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A) Marcadores tumorales histoquímicos: En general los marcadores


histoquímicos pueden ser muy útiles en el diagnóstico
anatomopatológico de procesos metastáticos en los que no se conoce
la localización del tumor primitivo.
a) Glucógeno: Tiene valor en el diagnóstico general de las
neoplasias.
b) Sustancia mucoides
c) Lípidos
d) Pigmentos melánicos: Es un marcador diagnóstico de melanoma
maligno.
B) Marcadores tumorales inmunohistoquímicos de carácter general: Las
técnicas inmunohistoquímicas aplicadas a la patología tumoral pueden
contribuir a realizar el diagnóstico diferencial de los tumores, identificar
probables agentes etiológicos y subclasificarlos diversos tipos de
tumores.
a) Filamentos intermedios: son un componente importante del
citoesqueleto celular cuya función primordial es mantener la
forma calular y la organización espacial de los orgánulos
citoplasmáticos.
a.1) Citoqueratinas
a.2) Vimentina
a.3) Desmina
a.4) Proteina ácida glial fibrilar
a.5) Neurofilamentos
b) Proteína S-100: Se emplea en el diagnóstico de tumores
indiferenciados. En ausencia de citoqueratinas y antígeno
epitelial de membrana (EMA), la positividad de esta proteína es
diagnóstica de melanoma maligno.
c) Antígeno epitelial de membrana (EMA): Se emplea
simultáneamente con las citoqueratinas para precisar el origen
epitelial de un tumor indiferenciado.
d) Antígeno leucocitario común (ALC): Este antígeno es positivo en
linfomas.
C) Otros marcadores inmunohistoquímicos
a) Antígenos vasculares: Antígenos útiles en el diagnóstico de
tumores vasculares.
a.1) Antígeno asociado al factor VIII
a.2) Ulex europeus
b) Antígenos de diferenciación neuroendocrina: Antígenos
demostrados en tumores neuroendocrinos y neuroectodérmicos.
b.1) Enolasa específica neuronal
b.2) Sinaptofisina
b.3) Cromograninas
c) Antígenos de naturaleza enzimática: Son antígenos poco útiles
debido a su baja sensibilidad que han quedado limitados a
determinados tumores.
c.1) Lisozima

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c.2) Alfa-1-antitripsina
c.3) Alfa-1-antiquimotripsina
d) Antígenos oncofetales
d.1) AFP
d.2) CEA
e) Antígenos específicos
e.1) Prostáticos (PSA y FAP): Ambos se expresan en procesos
benignos y malignos de la glándula prostática.
e.2) HMB 45: detectado en melanomas y en los nevus pigmento-
celulares.
e.3) Alfa-lactoalbúmina: Tiene importancia en el diagnóstico de
carcinoma metastásico axilar en ausencia de clínica tumoral en
mama.
e.4) B 72.3: Marcador de glándulas apocrinas que se demuestra en
la mayor parte de los carcinomas de mama.
e.5) Ca 125: Glucoproteina de superficie observada en los tumores
mucinosos de ovario, aunque también se ha evidenciado en otros
adenocarcinomas: endometrio, gastrointestinal y mama.

D) Marcadores ultraestructurales: la mayor parte del diagnóstico


anatomopatológico de los tumores se realiza con microscopio óptico y
técnicas de inmunohistoquímica, pero en ocasiones, la microscopía
electrónica de transmisión contribuye notablemente a identificar algunos
aspectos celulares de importancia.

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TEMA 5. LÍQUIDOS BIOLÓGICOS:


CITOLOGÍA Y BIOQUÍMICA.
Bajo el término de líquidos biológicos podemos definir a todos aquellos líquidos o
fluidos corporales procedentes del organismo, tales como:

• Líquido cefalorraquídeo.
• Líquido pleural.
• Líquido sinovial.
• Líquido pericárdico.
• Líquido amniótico.

A lo largo de este tema nos vamos a centrar en los que se consideran de mayor
importancia, líquido cefalorraquídeo (LCR), y líquido sinovial.

LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO
El LCR, es el líquido seroso contenido en los ventrículos cerebrales, espacio
subaracnoideo y conducto medular. Se forma principalmente en los plexos
coroideos y espacio subaracnoideo. Su volumen en adulto es de unos 150 ml y
en recién nacido de 10 a 60 ml. Se renueva cada 2-4 horas y la velocidad a la
que se forma es de unos 21 ml /h.

Su aspecto es incoloro, claro y de baja viscosidad. No contiene apenas


fibrinógeno, contiene pocas proteínas, principalmente albúmina y globulina, y su
pH oscila entre 7.28 y 7.34.

Se suelen obtener 2 tubos:

Tubo 1: Para Microbiología.

• Centrifugar con rapidez.


• Teñir el sedimento con Gram.
• A la vez sembrar en medio especial.
• Separar 3 ml en tubo estéril con tapón de rosca y heparina.
• No conservar en frigorífico, pues algunos gérmenes se dañan.

Tubo 2: Para Citología, Bioquímica y Serología.

• Hacer estudio sin fijar y antes de que transcurran 2 horas desde la


extracción.
• Centrifugar y usar el sobrenadante.
• Se investiga glucosa y proteínas.

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• No conservar durante más de dos horas, pues los leucocitos consumen la


glucosa.

EXAMEN FÍSICO
VOLUMEN

Se mide añadiendo agua a otro tubo de ensayo de las mismas características,


hasta enrasar para no contaminarlo durante la manipulación.

ASPECTO

Normalmente limpio, claro y sin sedimento. Si se presenta turbio, puede deberse


a la presencia de leucocitos.

COLOR

Normalmente incoloro. Si el color oscila entre rosa pálido, anaranjado o


amarillento se denomina xantocromía y puede deberse a:

• Oxihemoglobina.
• Metahemoglobina.
• Bilirrubina.
• Elevada concentración de proteínas (niveles superiores a 150 mg/dl).

Tras una hemorragia subaracnoidea (2-4 horas después) es normal la


xantocromía, que desaparece tras 4 a 8 días.

COÁGULOS Y SEDIMENTOS

No deben aparecer coágulos al dejarlo en reposo, pero si lo hacen pueden


indicar:

• Coágulos sedimentados, en caso de meningitis purulenta.


• Coágulos floculantes, en caso de sífilis.
• Coágulos a modo de tela de araña con películas suspendidas de la
superficie del líquido en meningitis tuberculosa.

EXAMEN BIOQUÍMICO
PROTEÍNAS

El LCR contiene muy pocas proteínas en relación al plasma (14 -45 mg/100 ml),
siendo las principales:

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Proteínas Plasma (mg/l) LCR (mg /l)


Prealbúmina 238 17.3
Albúmina 36600 236
Transferrina 2040 142
Ig G 9870 802
Ig A 1750 1346
Fibrinógeno 2960 4940
Beta-lipoproteína 3726 6213

Albúminas -> prealbúminas -> globulinas.

Un aumento en la concentración de proteínas del LCR puede estar causada por:

• Aumento en la permeabilidad de la barrera hematoencefálica por


inflamación.
• Meningitis purulenta.
• Meningitis graves.
• Caso de esclerosis múltiple u otras enfermedades degenerativas del SNC.
• Alteraciones endocrinas, metabólicas, etc.
• Aumento de la síntesis de proteínas en el SNC.

A) Proteínas totales:

Los métodos utilizados para medir las proteínas totales en LCR se clasifican en:

a) Procedimientos turbidimétricos.

• Ácido sulfosalicílico más sulfato sódico (SAS).


• Ácido tricloroacético (TCA).

b) Espectrofotometría ultravioleta a 210 nm después de:

• Cromatografía en columna.
• Ultra centrifugación.

c) Método de Lowry utilizando el reactivo de Folin-ciocalteau.

• Con blanco.
• Sin blanco.

d) Procedimientos modificados del Biuret con medición a 330 nm.

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e) Fijación de colorante.

• Ponceau.
• Otros colorantes.

f) Métodos inmunológicos.

a) Procedimientos turbidimétricos:

Son muy utilizados, en ellos hay que controlar concienzudamente la temperatura,


pues existe relación lineal entre temperatura y turbidez, y la alteración de la
primera daría resultados poco fiables. Son sencillos, pero se necesitan 500
microlitros de LCR, frente a los 25 - 200 microlitros necesarios para otros
métodos. Presentan interferencias en la xantocromía.

b) La espectrofotometría ultravioleta a 210 nm se basa en que las proteínas


presentan absorbancia intensa entre 210 y 220 nm. Su precisión es mayor que la
de los métodos turbidimétricos.

c) El método de Lowry con el reactivo de Folin, se utiliza mucho y tiene dos


fases:

1. Reacción entre las proteínas y el cobre.


2. Reducción de los ácidos fonsfotúnsgico y fosfomolíbdico, con el complejo
proteínas-cobre.

Es un método más largo de realizar que los métodos turbidimétricos y presenta


interferencias derivadas de los fenoles.

d) Procedimientos modificados del Biuret.

Son más largos y difíciles que los turbidimétricos y presentan interferencias


derivadas de polipéptidos de cadena corta.

f) Métodos inmunológicos.

Son métodos simples y rápidos. Un aumento sensible en la concentración de


proteínas totales indica hiperreactividad capilar (inflamación, neoplasia,
diabetes..., etc.). Un aumento en la concentración de las globulinas puede indicar
plasmocitoma del SNC o esclerosis múltiple.

B) Glucosa

Los valores normales de glucosa en LCR son de 40 - 80 mg/dl (50% - 80% de la


concentración en sangre, con pacientes en ayunas).

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Una disminución de los niveles de glucosa puede indicar meningitis purulenta,


abscesos cerebrales, tumores, etc.

La determinación de la glucosa en LCR se puede hacer por los métodos


espectrofotométricos de:

• Folin Wu.
• Glucosa-oxidasa.
• Ortotoluidina.

C) Enzimas

En LCR están presentes muchas enzimas (GOT, GPT, etc.), pero solo la LDH
(lactato deshidrogenasa) parece clínicamente útil. La LDH aumenta en los
siguientes casos:

• Leucemia.
• Hemorragia subaracnoidea.
• Meningitis bacteriana.
• Tumores del SNC.

CITOLOGÍA
EXAMEN MICROSCÓPICO

El LCR apenas presenta células, suele ser normal:

• En adulto, de 0 a 0.5 células mononucleadas (linfo y monocitos) por mm3.


• En niño de 0 a 30.
• La presencia de hematíes suele ser anormal.

RECUENTO CELULAR

Debe efectuarse antes de 1 hora tras la extracción. Se deben rechazar las


muestras con sangre a simple vista.

Para el recuento se utiliza una cámara cuentaglóbulos como la de Neubauer. Un


aumento anormal de células se llama pleocitosis y es causada por tumores
cerebrales, meningitis tuberculosa, etc.

CITODIAGNÓSTICO

Recuento diferencial:

El primer paso de un recuento diferencial de LCR es concentrar los leucocitos a


través de distintas técnicas como:

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• Centrifugación, con tinción de Wright del sedimento resuspendido


(también con May-Grumwald-Giemsa).
• Filtración con Millipore o Nucleopore, etc.

El paso siguiente consiste en observar al microscopio (100X), contar las células


y clasificarlas en; linfocitos neutrófilos, segmentados, células endoteliales, etc.,
expresando su concentración en porcentaje.

Los valores normales suelen ser:

Tipo celular Adulto Recién nacido


Linfocitos 62% 20%
Células mesoteliales 36% 72%
y monocitos
Neutrófilos 2% 3%
Histocitos raros raros
Eosinófilos raros raros

En las meningitis purulentas aumenta el número de neutrófilos segmentados. En


las pielonefritis agudas, primero aumento el número de neutrófilos y después el
de linfocitos pequeños.

LIQUIDO SINOVIAL
FUNCIÓN, RECOGIDA DE MUESTRAS Y MANIPULACIÓN

Es un ultrafiltrado del plasma al que se une el ácido hialurónico, elaborado por


las células de la membrana sinovial. Proporciona lubricación y nutrientes a las
células cartilaginosas de la articulación.

Normalmente la cantidad es de 3-4 ml a no ser que exista derrame, enfermedad,


etc.

La técnica de extracción se denomina artrocentesis y consiste en aspirar


percutáneamente todo el líquido de la cavidad sinovial, mediante jeringa de
plástico estéril.

El paciente preferentemente estará en ayunas 6-2 horas antes (importante para


los niveles de glucosa). Puede dar información sobre:

• Sospecha de infección (artritis supurativa).


• Artritis por ácido úrico (gota).
• Artritis por pirofosfato cálcico (pseudogota, etc).

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Tubo 1, para serología:

• De 5-10 ml sin anticoagulante.


• Centrifugar y usar sobrenadante.

Tubo 2, para bacteriología:

• Sin anticoagulante.
• Si se sospecha infección por gonococos, sembrar directamente en
Tayer-Martin.

Tubo 3, para citología/ bioquímica:

• Usar heparina como anticoagulante (25 U/ml).


• No deben formarse coágulos, si los hay indica tardanza o mala ejecución
del mezclado.

Puede conservarse a -4º C, para analizar inmediatamente y a -70º C para


serología.

El examen habitual del líquido sinovial incluye:

• Determinación de su aspecto.
• Resultados de la prueba del coágulo de mucina.
• Estudio microscópico con luz polarizada compensada.
• Tinción de Gram.
• Cultivo.
• Nivel de glucosa.

Ninguna de estas pruebas, excepto la tinción de Gram y la identificación de


cristales, puede considerarse altamente específica para determinar el tipo de
artritis.

EXAMEN MACROSCÓPICO

El aspecto normal del líquido sinovial es transparente y de color amarillo pálido.


La turbidez sugiere inflamación, aunque no necesariamente.

PRUEBA DEL COÁGULO DE MUCINA

Sirve para calcular la viscosidad, consiste en colocar una gota del líquido sobre
el dedo pulgar y tocar con otro dedo de la mano. Al separar los dedos, el líquido
debe formar un hilo de 4-6 cm. de longitud. Si el hilo se rompe antes de 3 cm..,
debe considerarse viscosidad menor de la normal.

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CITOLOGÍA

RECUENTO CELULAR DE LEUCOCITOS

Puede hacerse con hemocitómetro, o en cámara de Fuchs-Rosenthal.

• Para microscopio óptico normal utilizar diluyente con 0.1% de azul de


metileno (facilita el reconocimiento de leucocitos).
• Para microscopio de contraste de fase no es necesario colorante.
• Si el líquido aparece muy manchado de sangre, es necesario lisar los
eritrocitos previamente.

Son valores normales:

• 100.000 leucocitos /microlitro.


• Valores normales indican infección bacteriana normalmente.

RECUENTO DIFERENCIAL

Para calcular el porcentaje de neutrófilos puede utilizarse:

• Tinción de Wright (sin concentrar).


• Tinción de Wright del sedimento centrifugado.
• Tinción de Wright del líquido concentrado por citocentrifugación (previa
tinción de Papanicolau)

La técnica microscópica elegida casi siempre es la de contraste de fase. Cuando


se dan los resultados de un recuento diferencial, habitualmente solo se hace
mención al porcentaje de neutrófilos.

El valor normal de estos suele ser del 25%. Un porcentaje muy alto (90% o más)
es indicativo de artritis bacteriana.

Morfología celular:

• Células AR; son neutrófilos en cuyo citoplasma aparecen, tanto en


microscopia óptica, como de fase, pequeños gránulos (de 10 a 20)
citoplasmáticos oscuros con diámetro entre 0.5 y 2 micras. Los gránulos
pueden identificarse claramente con contraste de fase o inmersión en
aceite, y puede ser demostrada su presencia con técnicas de
inmunofluorescencia. Aparecen en artritis reumatoide, gota y artritis
séptica.

• Células LE; en el Lupus Eritematoso, aparecen en líquido sinovial unas


células de características particulares denominadas células LE.

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• Grandes células histiocíticas con inclusiones citoplasmáticas, aparecen al


teñir con Giemsa y con Papanicolau en el síndrome de Reiter.

• Células cartilaginosas multinucleares; se presentan en la osteoartritis,


para identificarlas se tiñe con Papanicolau.

Cristales; se han descrito 4 tipos asociados a las siguientes enfermedades:

Artritis cristales de apatita


Gota cristales de urato monosódico dentro de los neutrófilos y
macrófagos durante el ataque de gota, y fuera de ellos en
época de no ataque
Pseudogota cristales de dehidrato de pirofosfato cálcico
Artritis cristales de dehidrato de talco (introducidos en una
crónica intervención quirúrgica)

EXAMEN BIOQUÍMICO. INTERVALOS DE REFERENCIA DEL LÍQUIDO


SINOVIAL.

Líquido Sinovial Plasma


Proteínas 1-3gr/dl 6-8 gr/dl
Albúmina 55-70% 50-65%
Alfa-globulina 5-7% 3-5%
Beta-globulina 8-10% 8-14%
Gamma-globulina 10-14% 12-22%
Glucosa 70-110 mg/dl 70-110 mg/dl
PH 7.3-7.4 7.38-7.44 arterial
7.36-7.42 venoso

Las proteínas presentes en líquido sinovial dependen de las presentes en


plasma. Si aumenta el nivel de proteínas en plasma, también lo hace en el
líquido sinovial.

La concentración de una proteína específica se expresa normalmente como


cociente líquido sinovial/plasma.

La glucosa en plasma y en líquido sinovial presenta valores muy similares. Es


importante obtener la muestra en ayuno de 6 a 12 horas.

También se presentan enzimas como la fosfatasa ácida, LDH y transaminasas,


pero su determinación parece tener escaso valor clínico.

La determinación de pH y de lactato proporciona un índice útil de la inflamación,


pero es inespecífico de la etiología.

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TEMA 6. ANÁLISIS CUALITATIVO DEL


SEDIMENTO URINARIO
INTRODUCCIÓN
El examen del sedimento urinario comprende la investigación e interpretación de
una serie de estructuras de distinto origen y composición que pasaremos a ver
detenidamente en este tema.

Realizado en las debidas condiciones el examen microscópico del sedimento


urinario proporciona una ayuda indiscutible en el estudio del diagnóstico y
evolución de las enfermedades renales.

PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
El examen del sedimento urinario es más seguro cuando la orina está
concentrada. Si la muestra está demasiado diluida y los elementos celulares
lisados, la cantidad del sedimento obtenida incluso después de centrifugación
puede no ser representativa.

El examen microscópico se hace generalmente con el sedimento obtenido por


centrifugación de la orina.

Un sedimento puede prepararse de la siguiente forma (la técnica, en la


actualidad, no se encuentra totalmente estandarizada):

1. Mezclar bien la muestra de orina y transferir un volumen


aproximadamente de 10 ml a un tubo de centrífuga cónico.
2. Centrifugar a 1500 rpm durante 5 minutos.
3. Decantar la muestra. Volver a suspender el sedimento en unas gotas de
orina.
4. Colocar la gota de sedimento sobre un porta y taparla con un cubre. La
gota no ha de ser demasiado grande, debiendo evitarse la formación de
burbujas.
5. Examinar la preparación antes de que se produzca evaporación.
6. Examinar en primer lugar un área grande con poco aumento. Luego
reducir la intensidad de luz al mínimo y examinar varios campos en busca
de cilindros. Finalmente, enfocar con mayor aumento (40x). Examinar
varios campos para evaluar células y otros.

El sedimento obtenido mediante centrifugación de la orina contiene todos


aquellos materiales insolubles (denominados también elementos formes) que se
han acumulado en la orina durante el proceso de formación (células,

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microorganismos, cilindros, etc.) contiene también cristales de distintas formas y


tamaños dependiendo del pH de la orina, y generalmente (salvo excepciones) de
poca importancia clínica.

Muchos laboratorios utilizan la microscopía de contraste de fases para la


interpretación del sedimento urinario, en especial la observación de cilindros.

IDENTIFICACIÓN DE ELEMENTOS ESPECÍFICOS


EN EL SEDIMENTO
Clasificación:

Sedimento organizado
Hematíes
Leucocitos
Células epiteliales
o Células escamosas
o Células de transición
o Células renales
Microorganismos
o Bacterias
o Levaduras
o Protozoos
o Parásitos
Espermatozoides
Cilindros
o Hialinos
o Epiteliales
o Granulosos
o Eritrocitarios
o Leucocitarios
o Céreos
o Cilindroides

Sedimento no organizado
Cristales
o pH ácido
§ Uratos
§ Ácido úrico
o pH alcalino
§ Fosfatos triples
§ Fosfatos amorfos
§ Carbonato cálcico
o pH variable
§ Oxalato cálcico
§ Cistina

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§ Colesterol
§ Tirosina
§ Leucina

GLÓBULOS ROJOS

Aparecen en el sedimento como formas circulares, carecen de núcleo y refractan


un poco la luz. Presenta aspecto de disco transparente. Son de menor tamaño
que los leucocitos y las células epiteliales.

No debe considerarse patológica la aparición de 2/3 hematíes por campo, en el


estudio del sedimento. Cuando la orina contiene un número elevado de
hematíes y aparezcan además cilindros hemáticos hay que considerar que la
hematuria es de origen renal. El aumento de glóbulos rojos en orina se conoce
como hematuria.

GLÓBULOS BLANCOS

Son más grandes que los rojos. Contienen uno o más núcleos. Su presencia en
orina indica generalmente
inflamación. Son valores
normales en el hombre
menos de 3/campo y en la
mujer menos de 5/campo.
En la mayoría de los
trastornos renales o del
tracto urinario se produce
un incremento de la cifra
de leucocitos en orina,
que afecta principalmente
a los neutrófilos. También
puede observarse un
aumento temporal en caso

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TEMARIO DE T.E.L.

de fiebre y después de un ejercicio intenso. Si su presencia va acompañada de


cilindros leucocitarios o que contengan leucocitos y células epiteliales, la
elevación de la cifra de leucocitos presentes en la orina se considera de origen
renal. Su aumento en orina se conoce como Leucocituria o piuria.

CÉLULAS EPITELIALES

Son varias veces más grandes que los glóbulos rojos o blancos. Según su origen
tienen diferentes formas, pero la identificación del origen de estas células puede
ser en ocasiones dificultoso. Cuando la distinción es posible, podemos encontrar:

Células epiteliales escamosas. Proceden de la porción distal del tracto urinario


inferior y del tracto genital femenino. Son las de mayor tamaño. Se trata de
células planas con un gran citoplasma y núcleo simple. Son poco significativas,
a menos que su presencia sea muy abundante.

Células de transición (pelvis renal). Su forma es redondeada u oval. En


ocasiones parecen tener una proyección en forma de cola (células en raqueta)
La orina normal puede contener cierto numero de estas células como resultado
del proceso normal de descamación. Cuando aparecen en gran número indica la
existencia de un proceso patológico causante de exfoliación anormal.

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• Células renales (pelvis y túbulos renales). Son células pequeñas y


redondeadas. La presencia de más de dos células epiteliales del túbulo
renal por campo de gran aumento indica un daño activo o una lesión
tubular renal.

MICROORGANISMOS
Bacterias. La orina normal fresca no contiene microorganismos. Debemos tener
en cuenta que si la orina no ha sido recogida en condiciones adecuadas puede
tener contaminación. Además si la orina permanece a temperatura ambiente
durante algún tiempo, las bacterias pueden proliferar rápidamente y se ven en
gran número. Una orina muy alcalina con muchas bacterias y muy pocos
glóbulos blancos es característica de muestras contaminadas.

La bacteriuria puede informarse como escasa, moderada o intensa.


Generalmente en caso de que aparezca debe realizarse un estudio
microbiológico de la orina.

Levaduras. La más común en el sedimento es la Cándida Albicans.


Frecuentemente su presencia en mujeres es consecuencia de una
contaminación de la orina. Las levaduras se diferencian de los hematíes en que
no se pueden teñir con eosina.

Parásitos. La presencia de
parásitos en la orina suele
indicar contaminación genital
o fecal. El flagelado
Trichomonas Vaginalis es el
parásito más común hallado
en la orina. La incidencia de
este tipo de parasitismo es
muy elevada en las mujeres
y puede ser causa de
vaginitis intensa.

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ESPERMATOZOIDES

La presencia de espermatozoides en la orina es un hecho bastante frecuente y


carece de significación patológica. Están formados por una cabeza ovoide y por
una larga cola.

CILINDROS

Son conglomerados alargados de material proteico formados en los túbulos


renales o en los conductos colectores. La formación de cilindros es mayor
cuando el pH es bajo y existe obstrucción de la nefrona provocada por restos
celulares o células.

Normalmente el sedimento urinario no contiene cilindros, aunque su detección


no indica forzosamente la existencia de una patología renal. Sin embargo,
generalizando, podríamos decir que la presencia numerosa de cilindros en un
sedimento urinario es indicativa de enfermedad renal.

El tamaño y la forma de los cilindros dependen del lugar en que se forman. Los
más grandes proceden de los túbulos dilatados, los más finos de los túbulos
comprimidos o se deben a una desintegración. A veces son contorneados y
ocasionalmente muestran ramificaciones.

Hialinos. Se trata de cilindros compuestos fundamentalmente de proteínas sin


inclusiones. Son pálidos y transparentes. Difíciles de visualizar. Su aparición en
grandes cantidades puede indicar una alteración importante del parénquima
renal.

Epiteliales. Son más cortos que los hialinos y más fáciles de ver. Indican
inflamación aguda del riñón. Contiene dentro células epiteliales. En las unidades
de trasplante, estos cilindros son uno de los criterios más fiables para el
diagnóstico de rechazo agudo a partir del tercer día después de la intervención.

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Granulosos. Pueden ser debidos a una evolución de los cilindros de células


epiteliales en los que ha existido una degeneración celular. Presentan un
aspecto granular con granulaciones más o menos finas (cilindros granulosos
finos o gruesos). Su presencia implica un trastorno crónico del riñón.

Eritrocitarios. Contienen glóbulos rojos en su interior. Tienen un aspecto muy


variable. Suelen ser indicativo de glomerulonefritis por causa diversa.

Leucocitarios. Se caracterizan por la aparición de leucocitos identificables en el


interior de la matriz proteica. Acompaña a las infecciones del tracto urinario. Su
presencia exige una investigación bacteriológica de la orina.

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Céreos. Se caracterizan por un alto índice de refracción y una coloración


amarillenta. Su composición no es bien conocida. Se ven asociados a procesos
crónicos.

Cilindroides, fibrina, células epiteliales, leucocitos, eritrocitos o bacterias


pueden agruparse dando formas semejantes a los cilindros. Generalmente se
distinguen de los cilindros verdaderos por sus contornos variables e irregulares.
No se conoce con exactitud su lugar de procedencia ni la causa de su formación.

CRISTALES

Cristales de muy diferentes formas y tamaños se ven habitualmente en la orina,


aunque solo ocasionalmente su presencia tiene algún significado. La cristaluria
puede ser asintomática o ir asociada a la formación de cálculos, dando lugar a
las manifestaciones clínicas que acompañan a una obstrucción completa o
parcial del flujo urinario.

El pH de la orina tiene importancia en la aparición de los distintos tipos de


cristales.

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pH ácido:

Uratos
Ácido úrico

pH alcalino:

Fosfatos triples
Fosfatos amorfos
Carbonato cálcico

pH variable:

Oxalato cálcico
Cistina
Colesterol
Tiroxina
Leucina

Uratos. Los uratos amorfos aparecen como granulaciones oscuras, dando al


sedimento una coloración rosada, amarillenta o anaranjada. Pueden proceder de
la alimentación aunque tambien aumentan en estados febriles.

Cristales de Urato

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Ácido úrico. Toma formas diferentes como pesa, prisma, roseta, placas
irregulares. No poseen significación clínica a menos que se presenten en gran
cantidad en orinas recién emitidas. Los cálculos de ácido úrico o de uratos se
encuentran aproximadamente en el 16% de los pacientes con gota.

Fosfatos. Los cristales de fosfato triple (amónico, magnésico y cálcico) son


incoloros y presentan forma típica de ataúd. Se encuentran en orinas alcalinas.
Los cristales de fosfato cálcico son amorfos o tienen forma de prisma, roseta,
aguja etc.

Cristales de Fosfato Cristales de Fosfato amónico-magnésico

Los fosfatos amorfos aparecen como granulaciones que confieren al sedimento


una coloración blanquecina. Pueden aparecer tras la ingestión de determinados
alimentos como la fruta.

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Carbonato cálcico. Su forma característica es la de pesa, ocho, esfera. No


tienen interés clínico.

Oxalato cálcico. Suelen aparecer en forma de octaedro y presentan un


característico cuadrado cruzado diagonalmente (se dice que tienen forma de
sobre). Pueden producirse en caso de dietas ricas en oxalato (tomates, repollo
espárragos, naranjas...)

El oxalato cálcico, muchas veces mezclado con sales de fosfato, está presente
en una gran parte de los cálculos urinarios.

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Cistina. Son placas hexagonales. Su presencia es poco habitual y son


indicativos de cistinuria (error metabólico congénito poco frecuente).

Colesterol. Aparecen como placas transparentes de forma irregular. Su


presencia es rara. Pueden aparecer en nefritis e infecciones graves del tracto
urinario.

Leucina y tirosina. Los cristales de estos dos aminoácidos suelen aparecer


juntos en la orina como consecuencia generalmente de una grave enfermedad
hepática. Suelen ser de color amarillento debido a la presencia de bilirrubina
(ictericia).

Un conjunto de material no significativo puede formar parte del sedimento


urinario. Son los desechos o artefactos. A veces se debe a material de vejiga o
uretra, pero otras se debe a contaminación. Es frecuente encontrar hilos
mucosos, pelos, fibras diversas, etc. Su presencia puede sugerir una recogida
defectuosa.

SEDIMENTO NORMAL
El sedimento normal no está libre de células o cilindros, pero contiene un número
limitado de elementos formes. Una definición precisa de la normalidad es difícil
de obtener, pero la presencia de uno o más glóbulos rojos por campo de alto
poder, uno o dos leucocitos y algunas células epiteliales no se considerarán
necesariamente anormales. La orina de mujeres maduras puede tambien
contener un gran número de células epiteliales escamosas procedentes de las
paredes vaginales.

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TEMA 7. ESTUDIO DE HECES:


DIGESTIÓN, SANGRE OCULTA Y
CUERPOS REDUCTORES.
INTRODUCCIÓN
Las materias fecales están constituidas en unas tres cuartas partes por agua.
Las sustancias sólidas del cuarto restante comprenden:

• 30% de bacterias muertas.


• 10 - 20% de grasa.
• 2 - 3% de proteínas.
• 10 - 20% de sustancias inorgánicas.
• 30% de restos no digeribles, componentes sólidos del jugo digestivo como
pigmentos biliares y detritus celulares.

El estudio de laboratorio de muestras fecales de origen humano, permite obtener


datos que nos sirve para determinar:

1.- La situación del funcionalismo digestivo.


2.- Infecciones intestinales causadas por virus, bacterias y hongos.
3.- Infecciones causadas por parásitos intestinales.

Este estudio tiene su máxima indicación en las diarreas crónicas, y comprende la


observación macroscópica y microscópica de las heces, así como su análisis
químico, bacteriológico y parasitológico.

ESTUDIO DEL FUNCIONALISMO DIGESTIVO


Con este estudio procuramos saber la digestión de los principios inmediatos. La
digestión es el conjunto de fenómenos mecánicos y bioquímicos que
transforman los constituyentes orgánicos más o menos complejos de los
alimentos en sustancias simples directamente asimilables.

Los alimentos son triturados en la boca sufriendo una división física. Luego
comienza una disgregación química mediante fermentos digestivos y elementos
bacterianos, siendo absorbidas, las sustancias transformadas, por la mucosa
intestinal y por último los residuos no aprovechables de la digestión son
expulsados fuera del organismo.

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ALIMENTACIÓN PREVIA AL ANÁLISIS


Se debe seguir con el régimen habitual de comidas, pero hay que añadir
aquellos elementos que nos pueden suministrar una base para el diagnóstico,
como son:

• Carne: Se investiga el tejido conjuntivo y fibras musculares. Debe


comerse lo más cruda posible.
• Patatas: Se investiga la digestión de almidón.
• Grasa: Se tomará en forma de leche, mantequilla o carne.

Este plan se sigue durante 3 días y luego se recoge la muestra de heces.

TOMA DE MUESTRA
Se recogerán las heces en un frasco limpio con cierre hermético, no es
necesaria la esterilidad. El análisis se hará en las 12 horas siguientes a la
deposición, guardando la muestra en el frigorífico a 4-10º C.

Si el análisis se pospone más de 24 horas se añadirá un volumen igual al de las


heces de una solución acuosa al 5% de formol comercial.

CARACTERES ORGANOLÉPTICOS

A) OLOR:

a) Según la ingesta:

o Inodoro: Meconio.
o Aumentado: Comidas ricas en carne y pescado.
o Débil: Dieta vegetariana y láctea.
o Ligeramente agrio: Niños de pecho.

b) Fecaloide normal.
c) Pútrido (olor a amoniaco)
Debido a la flora proteolítica aumentada. Provoca diarreas de
putrefacción (heces alcalinas y gases).
d) Agrio penetrante o rancio
Debido a la flora sacarolítica aumentada. Provoca diarreas de
fermentación (heces ácidas y gases).
e) Nauseabundo
Debido a la descomposición de tejidos, ocasionada por carcinoma,
úlceras...

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TEMARIO DE T.E.L.

B) COLOR:

a) Marrón: Es el color habitual.


b) Verde:
Puede ser debido a la ingesta (verduras, medicamentos...) o a la
presencia de biliverdina (rapidez del tránsito intestinal, diarreas
infantiles).
c) Rojo:
Debido a la ingesta (remolacha) o a la existencia de hemorragias
próximas al ano.
d) Negro:
Debido a la ingesta (sangre, morcilla, espinacas), a los medicamentos
(carbón, hierro, bismuto) o a hemorragias internas (heces pastosas,
melenas).
e) Blanco:
Debido a la ingesta (leche, bario, caolín...) o a la ausencia de bilis
fundamentalmente.
f) Amarillo:
Debido a la ingesta (régimen lácteo) o a diarreas de fermentación
hidrocarbonada.

C) CONSISTENCIA:

Puede ser dura, normal, pastosa, líquida...

D) FORMA: Varía con la consistencia

a) Cilíndrica: Es la normal.
b) Laminada o en cinta: Debido a papilomas.
c) Bolitas secas y duras: Estreñimiento.
d) Bolitas en masas: Se presenta en la Salmonelosis.
e) Bola maleable del tamaño de un puño: Se presenta en la atonía del
recto (personas ancianas).

E) VISCOSIDAD:

Se determina tocando las diferentes partes de las heces con un agitador


de vidrio.

a) Viscosas (pastosas): Se adhieren al agitador.


b) Poco viscosas: No se adhieren al agitador.
c) Grasas: Tienen gran maleabilidad moldeándose en ellas el agitador,
como tierra amasada.

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EXAMEN MACROSCÓPICO

Para este examen se tritura ligeramente en un mortero con agua una cantidad de
heces del tamaño de una nuez. Luego se pasa a una placa de Petri y colocamos
esta sobre una cartulina blanca y negra. Los fragmentos de carne aparecen de
color gris o marrón.

El tejido conectivo tiene forma de membranas o paquetes filamentosos. Se


puede confundir con moco. Para diferenciarlo se añadirá ácido acético al 30% y
si desaparece es tejido conectivo.

El moco se puede presentar de varias formas: amorfo, transparente, opaco (con


restos celulares) y membranoso (en forma de paquetes o moldes de la mucosa).
La presencia de moco es importante, salvo en los recién nacidos, y siempre
deberá resaltarse en el informe.

SI
PUEDE SER INDICATIVO
OBSERVAMOS
INSUFICIENCIA GÁSTRICA:
FRAGMENTOS - Falta de secreción.
DE CARNE - Tránsito acelerado.
INDIVIDUO GASTRECTOMIZADO
FRAGMENTOS
DE FÉCULAS INSUFICIENCIA GÁSTRICA Y PANCREÁTICA
(PATATAS, ESCASA PERMANENCIA EN EL COLON
REMOLACHA)
TEJIDO INSUFICIENCIA GÁSTRICA
CONJUNTIVO
MOCO INFLAMACIÓN DE LA MUCOSA INTESTINAL
MOCO
COLITIS ULCEROSA
AMORFO,
DISENTERÍA BACILAR
SANGRE, PUS
MOCO ENTEROCOLITIS PSEUDOMEMBRANOSA
MEMBRANOSO MIXORREAS NERVIOSAS
FALSAS
ARTEFACTOS: Piel de embutidos, chicle...
MEMBRANAS

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ANÁLISIS MICROSCÓPICO

Nos aporta datos más


fidedignos acerca de los
trastornos de la
digestión. Para ello
habrá que instaurar la
alimentación explicada
anteriormente, si no se
hace así la significación
del estudio es muy
limitada.
Para este estudio se
hace una suspensión de
heces en agua destilada
o suero fisiológico.

1. Se coge una cantidad de heces, del tamaño de una castaña, y se coloca


en un mortero, copa, vaso de precipitado o tubo de ensayo.
2. Se añade agua o suero fisiológico y mezclar con una varilla hasta formar
una papilla homogénea y fina, ni muy fluida ni muy espesa.
3. Se coloca una gota de esta suspensión en un portaobjetos y se pone un
cubreobjetos encima, cuidando que se extienda formando una capa
delgada, homogénea, sin burbujas de aire. No se debe aplastar el cubre.

Se observará con el objetivo de x10 aumentos, obteniendo una visión de


conjunto, y luego se enfoca con el de x40 aumentos.

Cuando se trata de heces líquidas, se debe hacer una mezcla homogénea y se


coloca una gota directamente al portaobjeto.

Podremos observar:

A) CÉLULAS: Normalmente epiteliales de las últimas porciones del intestino.


No son patológicas.

B) LEUCOCITOS: Se observarán deformados. Si se encuentran en poca


cantidad no es patológico. Se observan mejor mezclando la gota de la
suspensión fecal con otra de azul de metileno de Loefler.

C) HEMATÍES: Es muy raro observarlos ya que se digieren. Si aparecen


será a causa de evacuación muy rápida o hemorragias en tramos
intestinales bajos.

D) CRISTALES: Presentan el mismo aspecto que en el sedimento urinario.


Hay unos, característicos del parasitismo intestinal, llamados cristales de
Charcot-Leyden, presentando una forma típica de agujas de brújula.

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E) FIBRAS MUSCULARES: Se pueden observar de diferentes formas


dependiendo del grado de digestión:

a) Mal digeridas:

Fragmentos rectangulares estriados, débilmente amarillos. Las estrías


son transversales y longitudinales. Los bordes del rectángulo son
rectos.

b) Parcialmente digeridas:

Trozos más pequeños con los bordes redondeados y las estrías


longitudinales.

c) Bien digeridas:
Trozos muy pequeños con los bordes redondeados y sin estrías.

La presencia de fibras musculares mal digeridas se llama CREATORREA. Se


puede deber a una insuficiencia gástrica o pancreática.

F) TEJIDO CONJUNTIVO. Se observa como fibras o filamentos que se


reúnen en fascículos y se entremezclan entre si. Son incoloros y no
poseen estriación. Se podría confundir con el moco, pero se distinguen
porque se transparentan al añadirle ácido acético al 30 %.

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TEMARIO DE T.E.L.

G) ALMIDÓN. Para su investigación se añade a la gota de emulsión fecal


una gota de lugol. Los gránulos de almidón tomarán un u otro
dependiendo del grado de digestión. También podrán estar dentro de
células o aislados:

a) No digeridos: Azul oscuro, casi negro.

b) Parcialmente digeridos: Rojo o rosa.

c) Digeridos: Amarillos o color arenilla.

El tejido muscular, al añadir almidón a la preparación toma un color rojo-caoba.


La presencia de almidón no digerido en las heces se llama AMILORREA.

H) LÍPIDOS.

Para observarlas mejor usaremos el reactivo Sudam III. Una gota de este
colorante se mezclará con una gota de la suspensión fecal. Los lípidos o
grasas se encuentran en las heces en forma de:

a) Ácidos grasos: Tienen aspecto cristalino,


en forma de escamas o agujas finas
rectas o curvadas. Difícilmente se tiñen.

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b) Grasa neutra: Aparece como gotitas de


color rojo o naranja
Si la temperatura es fría (< 20º C) las
gotas se transforman en masas o placas
algo amarillentas o rojas.

c) Jabones: Difíciles de reconocer al microscopio. No se tiñen. Se presentan


como masas amorfas o cristales en forma de agujas cortas. En la
observación lo mas importante son las grasa neutras. Se informa
positivamente a partir de 15-20 gotas/campo (objetivo x40). El aumento
patológico de grasas en heces se llama ESTEATORREA. Si en el
microscopio se observa mas de 60 gotas /campo es seguro esteatorrea
.
Algunas veces, para observar las grasas se calienta el portaobjetos
suavemente a la llama. De esta forma todas las grasas (ácidos grasos,
neutros y jabones) se transforman en gotitas de color rojo-anaranjado
(con Sudam III). En el estudio de las grasas en heces puede inducirnos a
error, los supositorios, los enemas oleosos y los portaobjetos y
cubreobjetos mal desengrasados.

ANÁLISIS MICROSCÓPICO

SI OBSERVAMOS INDICA
DIGESTIÓN NORMAL DE
Bien digeridas.
PRÓTIDOS
FIBRAS Medianamente ALTERACIÓN INTESTINAL
MUSCULARES digeridas MEDIANA
Poco o nada
ALTERACIÓN INTENSA
digeridas
TEJIDO Unido o no a
INSUFICIENCIA GÁSTRICA
CONJUNTIVO fibras musculares
Células desgastadas
DIGESTIÓN NORMAL DE
sin granos de
GLÚCIDOS
almidón.
CÉLULAS
TRANSITO INTESTINAL
AMILÁCEAS
Células sin digerir ACELERADO
llenas de almidón. O INSUFICIENCIA
PANCREÁTICA
Neutras. INSUFICIENCIA PANCREÁTICA
INSUFICIENCIA BILIAR O MALA
Ácidos grasos.
GRASAS ABSORCIÓN
PRESENCIA de Ca y Mg en EL
Jabones.
INTESTINO
MOCO, LEUCOCITOS, ALTERACIONES DE LA
HEMATÍES, EPITELIO MUCOSA

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TEMARIO DE T.E.L.

ESTUDIO FÍSICO-QUÍMICO
pH

Varía entre 6,8 y 7,2 dependiendo del régimen alimenticio. Los valores normales
se van a modificar según el proceso digestivo. La medición se hace impregnando
un papel indicador con una varilla de vidrio que contenga heces. La lectura se
efectúa por el reverso del papel.

SANGRE

También se llama este análisis investigación de hemorragias ocultas. Se puede


observar sangre en heces, de color rojo, proveniente de fisuras anales o
hemorroides. Esto no se considera importante.

Cuando proviene de hemorragias gástricas, duodenales, cáncer de colon, etc., la


sangre se digiere, tomando las heces un color oscuro, casi negro. Esta sangre si
es importante.

Para este análisis es importantísimo que el paciente durante los 2-3 días
anteriores a la toma de muestras se someta a un régimen riguroso (“blanco”), sin
carne, pescados, embutidos, lentejas, espinacas, plátanos etc., es decir
alimentos ricos en peroxidasas. Tampoco deberá tomar medicamentos que
contengan hierro o hemoglobina, o que puedan provocar pérdidas sanguíneas
como salicilatos o esteroides. La alimentación permitida consiste en: Huevos,
patatas, cebolla, arroz, garbanzos, pan y leche.

La mayoría de las pruebas para detectar hemorragias ocultas en heces se basan


en la determinación de peroxidasas como indicativo del contenido de
hemoglobina. Las más importantes son:

A) REACCIÓN DE LA BENCIDINA:
Sobre un papel de filtro manchado de heces, se ponen unas gotas de
bencidina y agua oxigenada de 10 volúmenes. Si el resultado es (+),
como resultado de la presencia de peroxidasa, se formará un halo de
color verde-azulado en torno a la mancha.

B) REACCIÓN DE WEBER O DEL GUAYACO:


La prueba es igual que la anterior pero en lugar de poner bencidina se
pone guayaco. La reacción es la siguiente:

HEMOGLOBINA + H 2O2 ⇒ H2O + O2↑


BENCIDINA
O2 + o ⇒ Color Azul-verdoso

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TEMARIO DE T.E.L.

GUAYACO

Estas pruebas son muy inespecíficas y dan habitualmente falsos


positivos. La reacción de la bencidina es más sensible que la del guayaco.

Actualmente existe una técnica que no se basa en la peroxidasa:

C) PRUEBA DEL CROMO RADIOACTIVO:


Tiene más sensibilidad y especificidad que las anteriores. Se basa en la
capacidad del Cr radioactivo (Cr51) para ser fijado por los hematíes y por
el hecho de no ser reabsorbido en el tracto gastrointestinal. Así pues, es
excretado por las heces en las que puede ser medido por
espectrofotometría de rayos ã.

PIGMENTOS BILIARES

Investigaremos en las heces la presencia de bilirrubina y estercobilinógeno


mediante 2 métodos:

A) PRUEBA DEL SUBLIMADO:


Más sensible para Estercobilina. Se hace poniendo en un tubo de ensayo:

• Dilución de heces.................................... 5 ml.


• Sublimado (ClHg).................................... 5 ml.

Se agita y se incuba a 37º C durante 1-2 horas y se observan los


resultados:

• ROJO.............................. ESTERCOBILINA o ESTERCOBILINÓGENO


• VERDE............................ BILIRRUBINA.
• BLANCO......................... Ausencia de Pigmentos.

B) PRUEBA DE GRIGAUT:

Más sensible para bilirrubina. Se hace poniendo en un tubo de ensayo:

• ClH concentrado...................................... 5 ml.


• Cl3Fe (10%)............................................. 2 gotas.
• Dilución de heces.................................... 5 ml.

Se agita y se calienta ligeramente observando los resultados:

• VERDE..................................... BILIRRUBINA.
• ROJO........................................ ESTERCOBILINÓGENO.

Las 2 pruebas se hacen simultáneamente, debido a su diferente sensibilidad, y


los resultados se interpretan así:

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TEMARIO DE T.E.L.

SUBLIMADO GRIGAUT
ESTERCOBILINOGENO + + Heces normales
BILIRRUBINA + + Tránsito intestinal acelerado
ESTERCOBILINÓGENO + - Tránsito intestinal medianamente
acelerado
BILIRRUBINA - + Obstrucción biliar
- -

ENZIMAS PROTEOLÍTICAS:

Se intenta comprobar la presencia de Tripsina, Quimiotripsina, etc. Las heces


normales (hasta una dilución 1/100) licuan la gelatina.

La prueba se realiza aplicando una gota de diferentes diluciones (1/5, 1/10, 1/50,
1/100) de la heces a estudiar de heces sobre una película de gelatina. Se
considera un resultado positivo si la gelatina queda disuelta en ½ hora.

• Positivo hasta una dilución 1/100........................... Digestión normal.


• Positivo hasta una dilución 1/50............................. Digestión media.
• Positivo hasta una dilución 1/10..............................Digestión deficiente.

DETERMINACIÓN CUANTITATIVA DE GRASA EN HECES

Una persona normal digiere y reabsorbe casi toda la grasa de su dieta. Para
valorar cuantitativamente esta grasa tendremos que pesar las heces del paciente
durante varios días. El paciente debe llevar una dieta estricta durante seis días.
Hay varios métodos.

A) REACCIÓN DE AZUL DE NILO PARA GRASA FECAL:

Técnica:

1. Diluir en un tubo de ensayo una porción de muestra con 9 volúmenes de


agua.
2. Añadir:
• 1 ml. de esta suspensión fecal.
• 1 ml. de agua.
• 3 gotas de ClH al 10 %.
• 3 gotas de Oxalato amónico saturado.

3. Calentar a ebullición durante unos segundos. Enfriar.


4. Echar el líquido en un vaso de precipitado.
5. Lavar el tubo de ensayo con 2,5 ml. de solución de CO3Na2 al 20 % y
añadirlos al contenido del vasito.

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6. Agregar 15 ml. de agua y 1 ml. de solución de Azul de Nilo (0,05 % en


agua) dejando resbalar por las paredes.
7. Leer los resultados inmediatamente:

NEGATIVO: Rosado que vira a gris (aproximadamente < 7 g./día)


DUDOSO: Gris azulado.
POSITIVO: Azul (aproximadamente > 7 g./día)

Cuando la reacción de azul de Nilo es negativa, la grasa fecal no excede


nunca de 5% en peso. Una reacción claramente positiva corresponde a
más del 5 % de grasa.

B) MÉTODO DE VAN DE KAMER:

Se separan los lípidos de las heces mediante tratamiento de estas con


una solución de hidróxido potásico alcohólico y que contenga pequeñas
cantidades de alcohol amílico. De ésta manera se produce la formación
de jabones.

Posteriormente se hidrolizan los jabones con ClH y se convierten en


ácidos grasos, extrayéndose estos a continuación con éter de petróleo.
Por último se titulan los ácidos grasos con NaOH 0,1 N

Peso total de heces x Vol. cc. NaOH


g. de grasa =
Peso de la muestra

CUERPOS REDUCTORES O AZÚCARES REDUCTORES EN HECES

Las heces deben de ser recientes, no debe dejarse pasar más de una hora
desde que son emitidas hasta que se realiza el examen.

Hay que diluir una parte de heces en dos partes de agua destilada, mezclar bien
y centrifugar a un número bajo de revoluciones (1.500 rpm.). Se toman 15 gotas
del sobrenadante, se colocan en un tubo de vidrio y se le añaden dos gotas de
ClH 1 N. Luego calentamos para desdoblar la sacarosa.

Una vez que ha enfriado el líquido anterior, se añade una tableta de


CLINITEST (Ames) para azúcares reductores y se deja disolver. A
continuación comparamos con la escala de colores que lleva el reactivo.

El resultado se da en g./litro. El resultado será negativo si es inferior a 2,5 g./l.


Entre 2,5 y 5 es dudoso y será positivo si es mayor de 5 g./l.

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TEMARIO DE T.E.L.

TEMA 8.- HEMOGRAMA. RECUENTO


CELULAR Y FÓRMULA
LEUCOCITARIA.
RECUENTOS CELULARES Y VALORES HEMATOLÓGICOS
NORMALES.

Glóbulos rojos:

Neonatos.................4.0-5.6x1012/l.
Hombres.................4.5-6.5x1012/ l.
Mujeres...................3.8-5.6x1012/l.

Plaquetas:

150-400 x109 / l.

Leucocitos:

Niños de un año.........6-18x109/l.
Adultos....................4-10x109/l.

Recuento leucocitario diferencial:

Relativo Absoluto por 7000 leucocitos


Adultos:
Neutrófilos..................40-75%..................................2800-5250.
Linfocitos...................20-45%...................................1400-3150.
Monocitos..................2-10%.....................................1400-3150.
Eosinófilos..................1-6%.......................................70-420.
Basófilos.....................<1%.........................................0-70.

DEFINICIONES.

En caso de aparición de citopenia en el hemograma, el autoanalizador utilizado


nos lo indica. La citopenia puede ser general, pancitopenia, o de algún tipo
celular concreto:

Leucopenia; recibe este nombre la disminución del número de leucocitos en


sangre por debajo de los valores normales, es decir, por debajo de 5000/mm3.

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Considerando cada tipo de leucocito:

Neutropenia.
Eosinopenia.
Basopenia.
Monocitopenia.

Puede aparecer leucopenia en los siguientes casos:

• infección vírica (rubéola, varicela, gripe).


• infección bacteriana (brucelosis).
• intoxicación por metales pesados (bismuto).
• intoxicación medicamentosa por benzol, sulfamidas, terapia
citostática.
• comienzo de una mononucleosis.
• consecuencia de exposición a material radiactivo....etc.

Oligocitemia; recibe este nombre la disminución del número de glóbulos rojos


sobre las cifras normales.

En hombre valores menores de 4.5x1012/l.


En mujeres valores menores de 3.8x1012/l.

La disminución del número normal de glóbulos rojos es frecuente en anemias


carenciales posthemorrágicas, hemolíticas, etc.

Trombopenia; recibe este nombre la disminución del número de plaquetas por


debajo de los valores normales, es decir, valores inferiores a 150000/ mm3.

Es frecuente la aparición de trombopenia asociada a:

• la acción tóxica de medicamentos.


• radiación.
• infecciones víricas (paperas, varicela, rubéola)
• infecciones bacterianas (meningitis meningocócica).
• alcoholismo agudo.

REVISIÓN DE LAS TÉCNICAS.

Ante la aparición de algún tipo de citopenia en el recuento hematológico, hay que


comprobar, en primer lugar el utillaje y las técnicas utilizadas, prestando especial
atención en contadores electrónicos a:

• comprobar que no ha habido bloqueo parcial del orificio de contaje


(100 micras).

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TEMARIO DE T.E.L.

• comprobar que se ha realizado el recuento de leucocitos después


de completarse la hemólisis, pero en un periodo inferior a 30
minutos.
• la recogida y manipulación de sangre ha sido la adecuada (no hay
coágulos).
• el electrodo exterior estará completamente inmerso en líquido.
• se lava correctamente el tubo entre sucesivas mediciones.
• no hay pequeñas burbujas de aire en el propio tubo.
• el manómetro estará limpio interiormente.

Si en la técnica manual, el recuento de leucocitos nos da valores inferiores a


3000/mm3, hay que volver a repetir el contaje, pero en vez de diluir 1:20, como
es habitual, la dilución se hará 1:10.

En pacientes anémicos, para el recuento de hematíes en cámara, la dilución en


vez de hacerse al 1:200, se hará al 1:100.

Igualmente si en el contaje de plaquetas, por ejemplo por el método de Rees-


Ecker, se sospecha una cifra muy reducida, la dilución, en vez de 1:200 se hará
al 1:100 y se repetirá el recuento.

PREPARACIÓN DE UN FROTIS.

Tras comprobar lo anterior, y ante la persistencia de citopenia en el hemograma,


el siguiente paso a realizar, es la preparación de un frotis.

El frotis se puede realizar por una de las siguientes técnicas:

• técnica del portaobjetos.


• técnica del cubreobjetos.

TINCIÓN.

Para la tinción del frotis, en los estudios de sangre, suelen utilizarse colorantes
de anilina de dos tipos:

-básicos como las tiacinas (azul de metileno).


-ácidos como la eosina.

El método de Romanowsky se basa en combinar colorantes ácidos y básicos


que tiñen diferencialmente las estructuras sanguíneas. En general utilizan
eosinatos de tiacinas.

Entre los métodos de este tipo más conocidos destacamos:

• La tinción de Wright.

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TEMARIO DE T.E.L.

• La tinción de Giemsa (ideal para teñir parásitos y protozoos


del paludismo).
• La tinción de May-Grümwald.

PATOLOGÍAS DE LAS CÉLULAS SANGUÍNEAS.

En el estudio de la extensión sanguínea se buscan anormalidades que ayuden a


indicar la naturaleza de la citopenia, sea del tipo que sea.

Toda célula sanguínea que no coincida con los modelos de normalidad, debe
considerarse atípica. La mayor variabilidad en la morfología de las células
hemáticas tiene lugar en las degeneraciones neoplásicas.

ALTERACIONES EN LA SERIE ROJA.

VARIACIONES DE TAMAÑO.

En general se conocen bajo el término de anisocitosis.

• Macrocitosis; hematíes con tamaño de 8 a 11 micras (déficit de vitamina


B12 y de ácido fólico).
• Microcitosis; hematíes con tamaño <6 micras (anemia perniciosa).
• Megalocitosis; hematíes con tamaño > 11 micras (fisiológico en recién
nacidos y también en anemia perniciosa).

ALTERACIONES DE COLOR.

• Anisocromía; desigual distribución de a hemoglobina


(trasfusiones).
• Hipocromía; mucha zona pálida central por disminución de la
concentración de hemoglobina (anemia ferropénica).
• Hipercromía; aumento de la intensidad del color por aumento de la
concentración de hemoglobina.
• Policromasía; anormal coloración (azul, gris, rosa) indica
inmadurez por producción acelerada.

ALTERACIONES DE FORMA.

• Acantocitos; hematíes esféricos con prominencias que les dan aspecto de


erizo
• (Uremia, acantocitosis )
• Dacriocitos; forma de lágrima (alteraciones eritropoyéticas)
• Dianocitos; aspecto de diana por acúmulo de hemoglobina en el centro
(talasemia).

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• Drepanocitos o células falciformes; forma de hoz o de media luna


(anemia falciforme).
• Eliptocitos; forma oval o en elipse.
• Esquizocitos; restos de hematíes tras su ruptura.
• Estomatocitos; presentan hendidura en parte central.
• Hematíes crenados; forma de sierra o rueda dentada.

ALTERACIONES ESTRUCTURALES, PRESENCIA DE INCLUSIONES


INTRAERITROCITARIAS.

Punteado basófilo; son acúmulos de ARN que se tiñen de azul con Giemsa
(saturnismo).

Corpúsculos de Heinz; son zonas de hemoglobina desnaturalizada, de más de 3


micras que se tiñen de:

• azul oscuro con sulfato de Nilo.


• azul claro con azul cresil brillante.
• púrpura oscura con cristal violeta.

Se presentan en alfa-talasemia y también en anemias tóxicas.

Anillos de cabot; son restos de membrana nuclear que toman forma de anillo. Se
observan en anemia perniciosa e intoxicaciones con plomo.

Granulación azurófila; pueden ser restos del núcleo tras su destrucción, o


eritroblastos. Se tiñen violeta púrpura.

Corpúsculos de Howell-Jolly; son restos de cromatina que se tiñen con Giemsa


de rojo brillante. Indican anemia megaloblástica u otra forma anormal de
eritropoyesis.

SERIE BLANCA.

POLIMORFONUCLEARES NEUTRÓFILOS.

Los neutrófilos sufren alteraciones morfológicas cualitativas, algunas de las


cuales son adquiridas y desaparecen después que el estímulo que las provoca lo
ha hecho.

Aumento de los lóbulos nucleares; (anemia).

Núcleo en anteojo (Pelger-Huet); núcleo con dos segmentos. Es una alteración


autosómica dominante.

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TEMARIO DE T.E.L.

Corpúsculos de Döhle; son restos de ribosomas libres, o del R.E.R. que se tiñen
de color azul pálido en el citoplasma.

Granulaciones tóxicas; son gránulos citoplasmáticos de mayor volumen y con


coloración más intensa de lo normal, que aparecen asociados a procesos
infecciosos severos.

Gránulos violeta; son gránulos citoplasmáticos azurófilos que están presentes en


la anomalía de Alder-Reilly.

LINFOCITOS.

Linfocito activado, presenta mayor tamaño y basofília clara, sin gránulos


(estimulación linfocitaria).

Célula Turk; linfocito hiperbasófilo (infección vírica).

MONOCITOS.

A veces aparecen con núcleo grande escotado y presentan vacuolas donde está
lo que han fagocitado, otras veces se presentan degenerados. Puede deberse a
los anticoagulantes.

A veces se observan otras células como:

Células de Reider.
Células de Turk.
Células en cesto, etc.

SERIE TROMBOCÍTICA.

A. Alteraciones de tamaño, podemos encontrar:

• microtrombocitos.
• macrotrombocitos.
• megacariocitos.

B. Alteraciones de forma o dismorfias plaquetarias, aparecen en las


trombopatías.

C. Alteraciones de distribución:

• satelitismo plaquetario; fenómeno en el que se presentan


varias plaquetas rodeando a los segmentados. Se da a
veces al utilizar EDTA como anticoagulante.
• agregados plaquetarios; son el comienzo de un trombo.

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TEMARIO DE T.E.L.

OTROS TIPOS ANORMALES DE CÉLULAS.

CÉLULAS “LE “, O DE HARGRAVES.

Son leucocitos polimorfonucleares neutrófilos que presentan un gran cuerpo de


inclusión, que desplaza su propio núcleo. Este cuerpo de inclusión es otro núcleo
leucocitario destruido por una Ig G o factor LE. Aparecen entre otras
enfermedades en el Lupus Eritematoso.

SIDEROCITOS.

Son hematíes que contienen gránulos de hemosiderina. Estos hematíes son


normales en las células precursoras de los hematíes de médula ósea, pero no
deben aparecer en sangre periférica. Su presencia en un frotis de sangre indica
proceso patológico.

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TEMARIO DE T.E.L.

FÓRMULA LEUCOCITARIA SANGUÍNEA: DIFERENCIACIÓN


CELULAR Y RECUENTOS
INTRODUCCIÓN

Nos podemos encontrar diferentes tipos de leucocitos o glóbulos blancos en


sangre según sus características morfológicas:

A) Polimorfonucleares o granulocitos
a) Neutrófilos
b) Eosinófilos
c) Basófilos
B) Mononucleares o agranulocitos
a) Linfocitos
b) Monocitos

El estudio del porcentaje de cada uno de ellos es lo que se denomina fórmula


leucocitaria. A partir de ella y conociendo el número total de leucocitos por
milímetro cúbico de sangre se puede calcular el numero de cada tipo de
leucocitos por volumen de sangre.
Figura 1. Tipos de células en un frotis de sangre periférica.
La fórmula leucocitaria o
recuento diferencial leucocitario
se puede hacer de forma manual
o de forma automática.

MORFOLOGÍA DE LOS
LEUCOCITOS

Vamos a estudiar la morfología


de los leucocitos sobre una
extensión sanguínea teñida. La
figura 1 es una representación
arbitraria de un frotis de sangre
periférica, siendo el número de
leucocitos con relación a los
eritrocitos y trombocitos mayor
de lo que suele observarse en un
campo microscópico real. En la
figura aparecen las siguientes
células:

A: Eritrocitos
B: Linfocito grande
C y E: Neutrófilos segmentados
D: Eosinófilo
F: Monocito

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G: Trombocitos
H: Linfocito
I: Neutrófilo en banda
J: Basófilo.

NEUTRÓFILOS, POLIMORFONUCLEADOS NEUTRÓFILOS (PMN),


GRANULOCITOS NEUTRÓFILOS.

Son células redondeadas de aproximadamente 12 micras de diámetro, más


pequeños que los monocitos y eosinófilos y ligeramente mayores que los
basófilos.

El citoplasma es abundante y se tiñe de color rosado. En él hay numerosas


granulaciones neutrófilas que se tiñen de color rosa-azulado y son de pequeño
tamaño.

El núcleo se tiñe intensamente de azul, es irregular y polilobulado, variando el


número de lóbulos de 2 a 5. Con frecuencia parece que hay varios núcleos
separados, pero un análisis detallado permite observar los finos hilos de
cromatina que los une. Esta sería la morfología de un neutrófilo segmentado.

El estadío anterior es el neutrófilo en banda o cayado, en los que el núcleo no


está todavía lobulado y presenta aspecto de S o C.

Puede aparecer en sangre, aunque no con frecuencia, algún metamielocito, que


es el estadío anterior al cayado. Es de mayor tamaño y el núcleo presenta forma
arriñonada. Lo normal es que en la fórmula aparezca un 0%.

Se puede hacer un recuento de las lobulaciones, de forma que las proporciones


normales son:

Células con 1 lóbulo: 6%


Células con 2 lóbulos: 34%
Células con 3 lóbulos: 41%
Células con 4 lóbulos: 17%
Células con 5 lóbulos: 2%

Cuando aumenta el número de células con núcleos polilobulados se habla de


una desviación a la derecha, mientras que cuando aumentan las formas en
cayado, metamielocitos o incluso estadios anteriores, se habla de una desviación
a la izquierda.

El neutrófilo se origina en la médula ósea y después de diferentes estadios de


maduración pasa al torrente circulatorio, donde permanecen unas pocas horas
(aproximadamente siete) antes de pasar a los tejidos donde realizan su función y
mueren.

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La función principal de los neutrófilos es la defensa del organismo contra las


infecciones mediante el fenómeno de fagocitosis (motivo por el cual la
membrana del neutrófilo emite pseudópodos)

La neutrofilia o leucocitosis neutrofílica constituye un aumento del resultado


absoluto, mientras que la neutropenia representa una disminución.

EOSINÓFILOS, POLIMORFONUCLERES EOSINÓFILOS (PME),


GRANULOCITOS EOSINÓFILOS.

Los eosinófilos tienen un diámetro medio de 13 micras. La estructura de estas


células se parece a la de los neutrófilos segmentados, pero con algunas
diferencias.

El núcleo se tiñe algo menos y tiene 2 ó 3 lóbulos, normalmente 2 dispuestos de


forma característica.

Las granulaciones citoplasmáticas son de mayor tamaño, redondas u ovaladas,


y con gran afinidad por los colorantes ácidos, tiñéndose por tanto de color rojo-
anaranjado con un colorante que contenga eosina. Los gránulos poseen
numerosas enzimas, entre las que destaca la mieloperoxidasa.

Los eosinófilos se forman en la médula ósea y después de diferentes estadios de


maduración pasan a sangre periférica donde sólo permanecen algunas horas
(aproximadamente ocho), ya que la mayor parte de la población corporal de
eosinófilos se encuentra bajo la capa epitelial en los tejidos expuestos al
ambiente externo, como son los conductos nasales, piel y vías urinarias.

El papel biológico de estas células es el de modular las reacciones anafilácticas


y las reacciones antígeno-anticuerpo en el proceso alérgico. También intervienen
en el control de la infestación por ciertos parásitos, cuyo ataque no se hace por
fagocitosis, sino por adherencia y subsiguiente citotoxicidad al segregar diversas
sustancias nocivas.

La disminución de los eosinófilos o eosinopenia sólo puede detectarse por


recuento de gran número de células. Un aumento en los valores de eosinófilos
representa una eosinofilia.

BASÓFILOS, POLIMORFONUCLEARES BASÓFILOS (PMB),


GRANULOCITOS BASÓFILOS.

En general, los granulocitos basófilos son semejantes en tamaño a los


anteriores. El núcleo es menos irregular y ligeramente lobulado. Las
granulaciones del citoplasma son grandes y muy abundantes. Tienen gran
afinidad por los colorantes básicos, apareciendo de color azul oscuro o
prácticamente negro. Recubren normalmente toda la célula, por lo que el núcleo
resulta difícil de distinguir.

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Los basófilos son los menos numerosos de los leucocitos en la sangre normal.

Los basófilos se originan en la médula ósea y, después de diferentes procesos


de maduración, pasan a la sangre periférica donde realizan su función. Los
basófilos que se encuentran en los tejidos se denominan células cebadas o
mastocitos y presentan ciertas diferencias en la composición de sus gránulos
con respecto a los basófilos sanguíneos.

La función de los basófilos es actuar como mediadores en las respuestas


inflamatorias, en especial las de hipersensibilidad.

El aumento del número absoluto de basófilos lo constituye una basofilia o


leococitosis basofílica, mientras que el menor recuento absoluto de basófilos lo
constituye una basopenia.

LINFOCITOS

Los linfocitos son células mononucleadas pequeñas, de aproximadamente 10


micras de diámetro, que carecen de gránulos citoplasmáticos específicos.

El linfocito típico presenta un núcleo bien definido que contiene bloques pesados
de cromatina. El núcleo ocupa prácticamente toda la célula y tiene forma
redonda o un poco dentada. Se tiñe de color azul oscuro.

El citoplasma es escaso y se tiñe de un color azul pálido, exceptuando una zona


perinuclear clara, pudiendo aparecer en algunas granulaciones de color rojizo.

Se pueden observar linfocitos de mayor tamaño, de 12 a 15 micras de diámetro,


con núcleos menos densos y citoplasma más abundante, especialmente en la
sangre de los niños, y puede ser difícil de distinguir de los monocitos.

Los linfocitos son las principales células implicadas en la respuesta inmunitaria,


reconociendo por sus receptores de membrana los determinantes antigénicos
con la colaboración de otras células, como los macrófagos.

Un aumento de los valores absolutos se denomina linfocitosis, mientras que una


disminución de estos valores se denomina linfocitopenia.

MONOCITOS

El monocito es la célula de mayor tamaño de la sangre normal con un diámetro


medio de 16 micras.

Contiene un único núcleo, generalmente excéntrico y con forma redondeada,


lobulada o en forma de herradura. Se tiñe de un azul más débil que los linfocitos.
El citoplasma es abundante y se tiñe de un color azul grisáceo conteniendo a
veces gránulos finos de color entre rojo y púrpura, menos diferenciados y

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pequeños que los gránulos de los leucocitos neutrófilos. Ocasionalmente pueden


detectarse gránulos de color azul.

Los monocitos se producen en la médula ósea para después pasar a sangre


periférica, donde permanecen entre 4 y 10 horas antes de migrar a los tejidos,
convirtiéndose en ellos en las células llamadas macrófagos o histiocitos, donde
cumplen su función.

La función principal de los monocitos y macrófagos es la fagocitosis, que realiza


de manera semejante a los neutrófilos. Actúan como defensa contra
microorganismos, en el proceso de la formación antigénica y en la eliminación de
células viejas, dañadas o tumorales. Además, el sistema monocito-macrófago
desempeña un papel principal en la iniciación y regulación de la respuesta
inmunitaria.

El aumento y disminución de sus valores se denominan monocitosis y


monocitopenia respectivamente.

VALORES DE REFERENCIA.

El número total de leucocitos oscila en condiciones normales según la edad,


variando desde el nacimiento hasta los 16 años, a partir de los cuales las cifras
se estabilizan dentro de unos márgenes de normalidad. Asimismo, el porcentaje
normal de los distintos tipos de leucocitos varía también con la edad (Tabla 1)

RN 1 MES 4 AÑOS 6 AÑOS ADULTO


Neutrófilo 37-57% 25-35% 25-45% 45-50% 50-65%
Cayados 0-4% 0-4% 0-4% 0-4% 0-4%
Eosinófilos 1-5% 1-5% 1-5% 1-5% 1-5%
Basófilos 0-2% 0-2% 0-2% 0-2% 0-2%
Monocitos 4-10% 4-10% 4-10% 4-10% 4-10%
Linfocitos 25-35% 45-65% 40-60% 40-45% 25-40%
Leucocitos/mm3 9.000- 5.000- 5.500- 5.000- 4.000-
30.000 21.000 15.500 14.500 10.000
Tabla 1. Valores de leucocitos en sangre periférica.

FÓRMULA LEUCOCITARIA O RECUENTO DIFERENCIAL LEUCOCITARIO


(RDL)

El recuento diferencial leucocitario se puede realizar de forma manual al


microscopio o de forma automática.

RECUENTO DIFERENCIAL LEUCOCITARIO MANUAL

Consiste en determinar el porcentaje de cada tipo de leucocitos por observación


directa al microscopio de un frotis sanguíneo teñido. Cuanto mayor sea el
número de células contadas, mayor será la exactitud del resultado.

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Se entiende por frotis o extensión sanguínea la formación de una fina película de


sangre sobre una superficie, generalmente un portaobjetos, de forma que pueda
ser observada al microscopio sin que las células se superpongan entre sí. Una
vez preparado y secado el frotis, debe ser fijado y teñido para poder diferenciar
los distintos tipos celulares.

Los colorantes más comúnmente utilizados para las tinciones hematológicas son
los derivados de la anilina, colorantes de Romanowsky, que pueden combinar
colorantes ácidos (eosina), básicos (azul de metileno) y neutros. Las distintas
estructuras celulares se teñirán con el colorante de pH antagónico. Así, los
colorantes ácidos teñirán las estructuras básicas como la hemoglobina o los
gránulos de los leucocitos eosinófilos y los colorantes básicos teñirán estructuras
ácidas como el ADN o los gránulos citoplasmáticos basófilos. Las estructuras
neutrófilas serán aquellas que tienen afinidad por ambos tipos de colorantes.

Existen diversos métodos de tinción, como por ejemplo: el método de Wright, el


método de Giemsa, el método de May-grümwald-Giensa o el método del
panóptico rápido.

A la hora de hacer el recuento diferencial de leucocitos hay que tener en cuenta


que la distribución de las células no es uniforme. Las células grandes (monocitos
y neutrófilos) se sitúan en los bordes, mientras que las células pequeñas
(linfocitos) lo hacen en el centro de la extensión. Por esta razón, en el recuento
se debe seguir una trayectoria que cubra todas las partes de la extensión.

Antes de comenzar el recuento se evalúa si la extensión ha sido bien realizada,


si la distribución de las células es uniforme, y su tinción, satisfactoria. Se
examina la extensión al microscopio con bajo aumento, para observar si la
distribución celular y la tinción es buena; se cambiará a un objetivo de inmersión
para la identificación de los distintos tipos celulares.

El registro de los distintos tipos de leucocitos se puede realizar utilizando


aparatos registradores específicos para fórmulas leucocitarias o bien
manualmente, anotando cada una de las células aparecidas en un papel.

A medida que se va viendo un leucocito, éste se clasifica, hasta haber contado


un número determinado de leucocitos. Cuanto más elevado es este número,
mayor es la precisión, aunque por razones prácticas normalmente se realizan
recuentos de 100 ó 200 células.

Todos los leucocitos que no puedan clasificarse deberían agruparse


conjuntamente en un grupo no identificado. En algunas alteraciones,
especialmente en la leucemia, pueden detectarse muchos de estos leucocitos no
identificados.

Con el número total de leucocitos por mm3 y el tanto por ciento de cada tipo, se
puede hallar el valor absoluto para cada uno de ellos.

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RECUENTO DIFERENCIAL LEUCOCITARIO AUTOMATIZADO

El recuento diferencial leucocitario es una de las determinaciones más


solicitadas al laboratorio de análisis clínicos, por ello, unos resultados exactos y
precisos son de vital importancia.

Actualmente, la automatización permite mejorar la especificidad, la exactitud,


disminuir los errores y abaratar los costes de los recuentos diferenciales de
leucocitos

En los sistemas disponibles hasta la fecha, se han utilizado dos principios


generales:

a) los sistemas de elaboración digital de la imagen, que identifican por


ordenador las células sobre extensiones sanguíneas teñidas.
b) los sistemas de flujo continuo, que analizan las células suspendidas en
un líquido y utilizan la medida de diferentes propiedades de los
leucocitos. Se basan en:
• Medida de la impedancia y de la conductividad celular que
informarán sobre el tamaño de la partícula y su estructura celular
interna.
• Medida de la dispersión de la luz láser o halógena.
• Utilización de técnicas citoquímicas sobre la suspensión
leucocitaria y estudio de las distintas poblaciones leucocitarias
por métodos ópticos.

ANÁLISIS DIGITAL DE IMAGEN

Se basa en la identificación de los leucocitos mediante análisis con ordenador de


las imágenes, de frotis sanguíneos teñidos, obtenidas al microscopio.

La extensión de sangre, uniformemente teñida, se coloca sobre la platina de un


microscopio. El movimiento de la platina es controlado mediante ordenador. De
esta forma se recorre la superficie del frotis y el ordenador detiene el movimiento
cuando encuentra un leucocito en su campo de visión.

Las imágenes ópticas (tamaño, color, gránulos citoplasmáticos, etc.) son


registradas por una cámara de televisión y digitalizadas por el ordenador, que
compara las características de la célula con una memoria en la que se incluyen
las características correspondientes a los distintos tipos celulares. Si las
características “coinciden”con las de un tipo celular normal, se identifica como
tal; de lo contrario, se clasifica como desconocido. Las coordenadas de estas
últimas células son archivadas, para que el técnico las pueda clasificar.

Los leucocitos son clasificados en cinco categorías: polinucleares neutrófilos


(segmentados y no segmentados), linfocitos, monocitos, polinucleares
eosinófilos y polinucleares basófilos. Algunos sistemas son capaces de captar

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otros elementos celulares que eventualmente pueden aparecer en sangre


periférica como mielocitos, metamielocitos, promielocitos, células plasmáticas,
linfocitos atípicos o blastos.

Estos sistemas identifican los leucocitos en base a aspectos morfológicos, por lo


que además de requerir células perfectamente conservadss necesitan una muy
pequeña variación tintorial para evitar la clasificación errónea de células. Es por
ello de gran importancia el empleo de sistemas de realización de frotis
sanguíneos adecuados, para la obtención de preparaciones homogéneas y con
la mayor similitud tintorial. Se recomienda, por ello, la utilización de sistemas
automáticos de tinción.

Junto a la fórmula leucocitaria, muchos de estos contadores proporcionan


además información sobre morfología de glóbulos rojos y cuantificación de
plaquetas.

Este método es el más parecido al método microscópico convencional, pero


tiene grandes inconvenientes como su bajo rendimiento, tanto por el número de
células analizadas, como por su escasa velocidad en la clasificación de las
mismas, aunque actualmente se están consiguiendo velocidades aceptables.

SISTEMAS DE FLUJO CONTINUO

El recuento y análisis de células sanguíneas se hacen en aparatos cuyo principio


de funcionamiento se basa en uno o en los dos principios que señalamos:

a) Resistencia eléctrica por impedancia.

Con el método de la resistencia


eléctrica, las células en
suspensión pasan a través de una
apertura situada entre dos
electrodos, entre los que existe
una corriente eléctrica continua de
intensidad constante; cada célula
al pasar produce un incremento
momentáneo de la resistencia
eléctrica que se traduce en un
impulso eléctrico. El número de
pulsos generados es proporcional
al de células que pasan. La
amplitud de cada pulso es
proporcional al volumen celular
(Figura 2.)
Figura 2. Dispositivo de recuento por impedancia

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b) Difracción de la luz en citometría de flujo, con o son citoquímica.

El método de la difracción de la luz en citometría de flujo se basa en iluminar con


un haz de luz láser o halógena un flujo por el que pasan alineadas una
suspensión celular. El paso de las células dispersa la luz. La medida de la
dispersión de la luz en dos ángulos diferentes hace posible la determinación del
volumen celular (Figura 3.)

Figura 3. Métodos de dispersión de la luz.

Todos los aparatos, sea cual fuere el método de medida empleado, están
dotados de un sistema de preparación de las muestras: realizan una aspiración
de sangre total (0,2-0,3 l) que es alicuotada, diluida y distri buida en dos
circuitos independientes: uno para el análisis de hematíes y plaquetas y otro
para leucocitos y hemoglobina.

El recuento de leucocitos se realiza al medir en el circuito correspondiente, con


los hematíes lisados, los volúmenes de las partículas y en algunos instrumentos
también al medir la actividad mieloperoxidasa.

Vamos a estudiar a continuación los siguientes sistemas de flujo continuo:

a) Sistemas de análisis del volumen leucocitario


b) Métodos de difracción de la luz en citometría de flujo
c) Analizadores que incorporan modificaciones de una o ambas
tecnologías
d) Analizador NE-800

SISTEMAS DE ANÁLISIS DEL VOLUMEN LEUCOCITARIO

Los autoanalizadores diferenciales basados en este principio pueden obtener las


poblaciones leucocitarias por análisis de los volúmenes del núcleo previa
eliminación del citoplasma mediante un agente lisante (Sistemas Coulter) o
mediante análisis de los volúmenes de las células intactas (serie ELT de Ortho).

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Generalmente, el histograma de distribución de los glóbulos blancos no


representa el volumen de los leucocitos en la sangre circulante, sino el resultante
tras la acción de un agente lisante. Este agente actúa al mismo tiempo sobre la
membrana y el citoplasma de las células, lo que provoca alteraciones diferentes
según el tipo de célula. Los linfocitos aparecen más pequeños que los monocitos
y estos más pequeños que los granulocitos. De hecho, la posición de las células
en la curva de distribución viene determinada por la morfología del núcleo:

a) A la izquierda las células con un núcleo esférico: los linfocitos.


b) En la zona central los monocitos, cuyo núcleo suele presentar una o
varias hendiduras.
c) A la derecha, los granulocitos con el núcleo menos segmentado
seguido de los polinucleares.

En el histograma de distribución pueden diferenciarse tres picos, cada uno de los


cuales corresponden a un tipo celular. De aquí que se les conozca también como
sistemas de tres poblaciones (Figura 4).

a) Linfocitos: en el pico comprendido entre 35 y 90 fl.


b) Mononucleares: entre 90 y 160 fl.
c) Granulocitos: entre 160 y 450 fl. El aparato proporciona una cifra global
de granulocitos, ya que no puede distinguir entre neutrófilos, eosinófilos
y basófilos.

Esta fórmula de tres poblaciones puede considerarse como una fórmula


orientativa. Cuando el aparato advierte una distribución celular anómala, lo indica
señalando unas alarmas.

Figura 4. Histograma normal de la serie blanca.

METODOS DE DIFRACCION DE LA LUZ EN CITOMETRIA DE FLUJO

Los aparatos que usan este procedimiento son los denominados H1, H2 y H3 de
la casa Technicon. Estos sistemas obtienen el análisis diferencial de leucocitos
de acuerdo con su tamaño, su comportamiento citoquímico ante determinados
colorantes y su actividad mieloperoxidasa.

Estos aspectos son analizados y comparados por la parte informática del aparato
para producir unos resultados precisos, exactos y fiables.

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De estos parámetros se obtienen los datos referentes a cuatro poblaciones


leucocitarias: linfocitos, monocitos, neutrófilos y eosinófilos. Y adicionalmente
dos poblaciones más: las grandes células inmaduras (LUC) y los linfocitos
atípicos (Figura 5.)

Figura 5. Citograma de peroxidasa.

En la figura 5 aparece un citograma de peroxidasa, donde en la casilla A


aparecen los linfocitos, los más pequeños y desprovistos de actividad
peroxidasa. En la casilla B se encuentran los monocitos, ligeramante mayores y
con ligera actividad peroxidasa. En la casilla C se encuentra la población más
numerosa, los neutrófilos, mayores y cargados de peroxidasa. Los eosinófilos,
de menor tamaño y muy cargados de peroxidasa se encuentran en la casilla D.
Y por último, en la casilla E aparece un tipo celular adicional, son los LUC o
grandes células no teñidas: son
células normalmente presentes en la
sangre en una pequeña proporción,
como linfocitos grandes hiperactivos y
todas las células patológicas sin
actividad peroxidasa (linfoblastos,
mieloblastos, tricoleucocitos,…)

Los basófilos son detectados en un


canal independiente (canal de
lobularidad). Mediante un reactivo
lisante, son destruidas las membranas
de todos los leucocitos excepto las de
los basófilos (Figura 6.)

Figura 6. Citograma de basófilos

La peroxidasa es una enzima contenida en el citoplasma de todos los leucocitos,


en cantidad variable, excepto en los linfocitos, y esta característica es utilizada
para la obtención de la fórmula leucocitaria clásica.

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Para la correcta comprensión de los histogramas por esta tecnología, se ha de


tener en cuenta que las células linfoides son peroxidasa negativas y de volumen
pequeño.

Los monocitos son mayores que los linfocitos y más ricos en peroxidasa. Los
neutrófilos son mayores que los linfocitos y con mucha peroxidasa. La
peroxidasa aparece en los promielocitos y aumenta progresivamente conforme
se completa la maduración de la serie mieloide. Los eosinófilos poseen mucha
peroxidasa. Los basófilos son peroxidasa negativos.

En el citograma de peroxidasa los linfocitos se sitúan abajo y a la izquierda. Los


monocitos arriba de los linfocitos y hacia la derecha. Los neutrófilos ocupan la
parte central del citograma. Los eosinófilos se sitúan debajo de los neutrófilos.
Las células LUC ocupan la zona superior izquierda del citograma.

En el citograma de basófilos en la zona derecha se sitúa los neutrófilos. En la


zona izquierda los mononucleares y en la zona de arriba los basófilos. Las
células blásticas se situarían a la izquierda de las mononucleares.

ANALIZADORES QUE INCORPORAN MODIFICACIONES DE UNA O AMBAS


TECNOLOGÍAS

Es el caso del analizador Coulter STKS, que mide:

1. Volumen celular por el principio de la variación de la impedancia


2. Conductividad celular por medio de una corriente de alta frecuencia
3. Estructura celular por la difracción de la luz láser monocromático
4. Estos tres parámetros son integrados y analizados conjuntamente en
un sistema de tres ejes.

De esta manera se consigue una diferenciación celular en cinco poblaciones:


linfocitos, monocitos, basófilos, neutrófilos y eosinófilos, así como detectar
poblaciones anormales: blastos, linfocitos atípicos, granulocitos inmaduros,
bandas,…

La tecnología VCS mantiene los leucocitos en un estado casi nativo y efectúa


una lectura en tres dimensiones. Los resultados se pueden examinar en tres
planos: DF1, DF2 y DF3, siendo el más usado el DF1, por ser donde se
visualizan mejor todas las poblaciones. En la figura 7 se aprecian los resultados
vistos desde tres ángulos, donde 1: Neutrófilos, 2: Linfocitos, 3: Monocitos, 4:
Eosinófilos y 5: Basófilos.

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Figura 7. Resultados vistos desde tres ángulos

La localización de poblaciones anormales se aprecia en la figura 32.8,


donde: 1: Sospecha de blastos; 2: Granulocitos inmaduros, 3: Neutrófilos
envejecidos, 4: Plaquetas gigantes, 5: Eritroblastos, 6: Linfocitos atípicos, 7:
Sospecha de blastos, 8: Linfocitos no definidos y 9: Sospecha de blastos.

Figura 8. Localización de poblaciones anormales.

ANALIZADOR NE-800

En el analizador NE-800 se sustituye el haz de luz por una corriente eléctrica,


bien directa o de radiofrecuencia. Este analizador utiliza tres canales y tres
hemolizantes diferentes, específicos para separar cinco poblaciones celulares.
Estas células son analizadas por los métodos de Radio Frecuencia (RF) y
Corriente Directa (CD) que realiza un scattegrama tridimensional que se
visualiza en pantalla, expresándose los datos de RF en el eje de ordenadas y los
de CD en el de abcisa, discriminándose las poblaciones celulares de los
hematíes lisados y separándose tres poblaciones: linfocitos, monocitos y
granulocitos. La determinación de neutrófilos y basófilos se hacen por canales
independientes, utilizándose hemolizantes diferentes y selectivos para cada una
de estas poblaciones, controlándose el tiempo y temperatura de la reacción con
el hemolizante. Los neutrófilos se determinan mediante la fórmula:

Neutrófilos = granulocitos - (eosinófilos + basófilos).

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Los hematíes y plaquetas se analizan mediante el método de corriente directa.

Este analizador proporciona de cada muestra un mensaje positivo o negativo. El


mensaje negativo significa que todos los parámetros de cada muestra están
dentro de los límites considerados normales, no necesitando la muestra ninguna
verificación adicional.

Un mensaje positivo indica que la muestra excede los límites aceptables y


requiere posterior investigación y estudio

El analizador proporciona un scattegrama, donde se representan los linfocitos,


monocitos, granulocitos y células anormales, en áreas diferentes, según la figura
8 donde:

L: Linfocitos normales
M: Monocitos
G: Granulocitos
1. Blastos: por debajo de la situación normal de linfocitos y granulocitos
2. Granulocitos inmaduros: por debajo y hacia la derecha de la situación
normal de los granulocitos.
3. Cayados: por debajo y hacia la derecha de los granulocitos normales.
4. Eritroblastos: en la zona de los estromas de los hematíes.
5. Linfocitos atípicos: entre la zona de linfocitos normales y monocitos.
6. Agregados plaquetarios: Siguiendo, por arriba, la línea divisoria del
scattegrama.

Figura 8. Analizador NE-800

Junto al scattegrama, también nos presenta tres histogramas: de WBC, de


eosinófilos y de basófilos.

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TEMA 9. COAGULACIÓN:
REALIZACIÓN TÉCNICA Y MEDICIÓN
DEL TIEMPO DE PROTROMBINA,
TIEMPO DE TROMBOPLASTINA
PARCIAL ACTIVADA Y FIBRINÓGENO
INTRODUCCIÓN
CONCEPTO DE HEMOSTASIA
La hemostasia es el proceso encargado de prevenir la extravasación sanguínea
espontánea, evitar la hemorragia excesiva a nivel de los vasos lesionados y
mantener la fluidez de la sangre circulante.

El mantenimiento de una hemostasia normal requiere el correcto funcionamiento


de cuatro factores: a) pared vascular; b) función plaquetaria; c) coagulación
sanguínea; y d) fibrinolisis. La alteración de uno sólo de ellos es siempre causa
de patología.

De forma resumida, el proceso de la hemostasia es como sigue: Al producirse la


lesión vascular, el vaso afectado se contrae transitoriamente, disminuyendo el
paso de sangre a su través (reacción vascular). A continuación, las plaquetas
circulantes se adhieren al colágeno del tejido subendotelial, que queda expuesto
debido a la lesión, y liberan adenosín-difosfato (ADP), lo que facilita la
agregación y formación de un trombo plaquetario (función plaquetaria). Este
trombo detiene momentáneamente la hemorragia, siendo primero reforzado y
luego sustituido por la formación de fibrina (coagulación sanguínea o
plasmática). Finalmente se inicia la cicatrización de la herida vascular, a la vez
que la fibrina es degradada por un sistema enzimático (fibrinolisis).

COAGULACIÓN PLASMÁTICA

El proceso de coagulación sanguínea consiste en una serie de reacciones


enzimáticas donde cada factor de la coagulación es la enzima del
inmediatamente inferior y el sustrato del inmediatamente superior (reacción en
cascada). Este proceso continua hasta que el fibrinógeno se transforma en
fibrina, lo que provoca la modificación del estado físico de la sangre, que pasa de
un estado líquido a un estado de gel (la red de fibrina insoluble encierra entre
sus mallas a los elementos formes de la sangre y refuerza el trombo plaquetario
para detener de forma definitiva la hemorragia).

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TEMARIO DE T.E.L.

En la coagulación sanguínea se pueden distinguir tres grandes etapas: a)


activación de la protrombina; b) formación de la trombina; y c) formación de la
fibrina.

El activador de la protrombina es un complejo lipoprotéico formado por el factor


X, el factor V, el factor 3 plaquetario (fosfolípido) y los iones Ca++. La activación
previa del factor X puede realizarse a través de 2 vías diferentes: vía extrínseca
y vía intrínseca.

VÍA INTRÍNSECA VÍA EXTRÍNSECA


FOSFOLÍPIDOS
TROMBOPLASTINA TISULAR

F XII F XIIa

FVIIa FVII
FXI FXIa

FX
Ca++
FIX FIXa FVII

FV
FXa

PROTROMBINA F F IIa TROMBINA


II

FIBRINÓGENO FIBRINA

La coagulación se limita a la zona de la lesión vascular gracias a la existencia de


inhibidores fisiológicos, que neutralizan a los factores de la coagulación
activados. Los más importantes son antitrombina III o cofactor de la heparina,
α2-macroglobulina, α1-antitripsina, y proteínas C y S.

Fibrinolisis

Una vez que el trombo de fibrina ha cumplido su función hemostática, es


destruido mediante la fibrinolisis, proceso fisiológico que se realiza gracias a la
plasmina, proteasa activa que se origina a partir de un precursor plasmático
inactivo: el plasminógeno.

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FIBRINA

t- Plasmina
Plasminógeno
u-

Productos de degradación
Plasmina de la Fibrina. (D-D)

EXPLORACIÓN DE LA COAGULACIÓN PLASMÁTICA

Toda trastorno de la hemostasia primaria, debido generalmente a una


plaquetopenia, estando el tiempo de sangría excesivamente alargado. Si el
recuento de plaquetas y el tiempo de sangría son normales, hay que considerar
la posible existencia de hemorragia es el resultado de una alteración vascular,
plaquetaria o de los factores plasmáticos de la coagulación. En el diagnóstico de
los trastornos hemorrágicos es fundamental la orientación clínica, que dirigirá la
exploración hacia uno de los factores citados. Ante un paciente que sangra se
debe pensar en la existencia de un defecto en algún factor de la coagulación.

La exploración de la coagulación sanguínea se basa en la realización de dos


pruebas globales: el tiempo de protrombina (TP) y el tiempo de tromboplastina
parcial activada (TTPA), que se complementan con una valoración de la
fibrinoformación mediante la determinación funcional del fibrinógeno o la
realización del tiempo de trombina (TT). Sobre la base de los resultados de estas

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TEMARIO DE T.E.L.

pruebas podemos realizar una aproximación diagnóstica, cuya confirmación


puede requerir la determinación específica de factores de la coagulación.
Aunque actualmente la casi totalidad de las pruebas de coagulación se realizan
mediante coagulómetros semiautomáticos, las técnicas las describiremos de una
forma general aplicable a cualquier método.

Todas ellas se realizan a partir del plasma, en el que se ha bloqueado el


desarrollo de la coagulación mediante un agente capaz de eliminar el Ca++:
citrato u oxalato. Las pruebas se inician mediante la adición de la suficiente
cantidad de Ca++ y del agente activador de la coagulación correspondiente a la
etapa de ésta que se desee explorar, midiendo el tiempo necesario para la
formación del coágulo.

Una anomalía en alguna de estas pruebas básicas puede deberse a dos tipos de
causas: presencia de un anticoagulante circulante y/o déficit de uno o varios
factores de la coagulación.

OBTENCIÓN DE LAS MUESTRAS PARA PRUEBAS DE COAGULACIÓN

1. La toma de sangre se realizará por punción venosa limpia, no debiendo


existir un éxtasis prolongado por torniquete.

2. Se puede emplear jeringuilla o dispositivos para tubos al vacío. Si hay que


extraer más de una jeringuilla o tubo, se aconseja que el destinado al
estudio de la coagulación no sea el primero.

3. Se utilizarán tubos de plástico o de vidrio siliconado que contengan citrato


sódico a concentración de 0,1 mol/L, una parte de citrato por cada 9
partes de sangre. Una vez introducida la sangre, se mezclan suavemente
sin producir espuma.

4. La sangre anticoagulada se centrifuga durante 10-15 minutos a 3.000


r.p.m. El plasma sobrenadante se pipetea cuidadosamente en otro tubo
de plástico o siliconado.

5. Debe analizarse en las 2 horas siguientes a la extracción (aunque puede


conservarse hasta 4 horas a 4º C). Si no, congelar a -20º C hasta su
procesamiento. La conservación prolongada a temperatura ambiente
conlleva una inactivación parcial de los factores V y VIII, mientras que la
refrigeración prolongada activa el factor VII.

Normas generales para la realización manual de las pruebas de coagulación:

A) MATERIAL

1. Baño María a 37º C muy preciso.


2. Tubos estándar de hemólisis de plástico (70 × 10 mm).

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3. Pipetas automáticas de 100 y 200 µL.


4. Cronómetros contrastados.

B) REALIZACIÓN DE LA PRUEBA

1. Introducir el plasma en dos tubos de hemólisis e incubar 2 minutos a


37º C en el baño María.

2. Añadir los reactivos en el orden y con los intervalos que señalen las
técnicas concretas, agitando suavemente el tubo para su mezcla.

3. La adición del último reactivo a la mezcla debe ser brusca e


instantánea, poniendo simultáneamente en marcha el cronómetro.
Inmediatamente agitar suavemente para mezclar y dejar el tubo en el
baño un breve tiempo, variable según la duración normal de la prueba;
luego mover rítmicamente el tubo, bajo una correcta fuente de luz,
hasta ver aparecer la fibrina, momento en el que se detiene el
cronómetro.

4. Las pruebas se realizarán por duplicado y la diferencia entre dos


determinaciones será siempre inferior a 1 segundo; de lo contrario se
realizará una nueva determinación.

5. Simultáneamente a la valoración de la muestra debe realizarse la de


un plasma control obtenido de una mezcla de plasmas frescos de 15 -
20 sujetos sanos o de una mezcla similar liofilizada (comercial).

Causas de error

A) EN LA OBTENCIÓN DEL PLASMA:

a) Éxtasis venoso demasiado prolongado. Favorece la fibrinolisis local.


b) Punción venosa inadecuada.
c) Dilución errónea del plasma. Proporción sangre-anticoagulante
inexacta.
d) Tiempo de centrifugación inadecuado.
e) Presencia de hemólisis en el plasma.
f) Conservación muy prolongada del plasma antes de realizar la prueba.

B) EN LA REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA:

a) Errores de pipeteo
b) Empleo de reactivos inadecuados o caducados
c) Empleo de reactivos mal preparados
d) Empleo de una temperatura inadecuada
e) Tiempos de incubación inexactos
f) Empleo de agua no destilada

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g) Errores en la realización de la técnica

TIEMPO DE PROTROMBINA:

Valoración global de la vía extrínseca:

A) PRINCIPIO

El tiempo de Quick o de protrombina (TP) es el tiempo necesario para la


coagulación de un plasma recalcificado en presencia de un exceso de
tromboplastina hística. Explora fundamentalmente la función de la vía
extrínseca de la coagulación (específicamente el factor VII y también los
factores V y X), así como la función de la protrombina (factor II) y del
fibrinógeno (Factor I).

B) MATERIAL

a) Tromboplastina cálcica comercial.


b) Plasma citratado del paciente.
c) Plasma citratado control.
d) Coagulómetro o equipo para la determinación manual.

La tromboplastina hística se prepara a partir de extractos de cerebro o pulmón


humanos o de tejidos animales, fundamentalmente de conejo. Existen muchas
tromboplastinas comerciales preparadas a partir de tejidos animales, cuya
sensibilidad suele variar según la firma comercial que la prepara, por lo que la
OMS elaboró un patrón de referencia internacional a partir de cerebro humano
(actualmente considerado como patrón primario), y también patrones a partir de
tejidos bovino y de conejo.

Estos últimos deben utilizarse para verificar la calidad y sensibilidad de los


diferentes preparados comerciales, en los que además debe venir indicado su
índice internacional de sensibilidad (ISI), calculado en relación al del patrón de
referencia internacional, que se considera de 1,0.

El Índice Internacional de Sensibilidad (ISI) es el valor de la recta de regresión de


los tiempos de protrombina de pacientes anticoagulados obtenidos con la
tromboplastina comercial y con la tromboplastina de referencia internacional.

Para los estudios de carácter diagnóstico es conveniente utilizar una


tromboplastina simple de buena sensibilidad (ISI cercano a 1). Para el control del
tratamiento anticoagulante esta recomendación se hace imperativa, existiendo
tromboplastinas simples o combinadas (aportan fibrinógeno y factor V) de muy
alta sensibilidad.

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C) MÉTODO

Precalentar la tromboplastina reconstituida, a 37º C durante 10-15 minutos.


Introducir 0,1 mL (100 µ L) de PPP del paciente en un fibrotubo, y 0,1 mL de
PPP control en otro fibrotubo, e incubar 2 minutos a 37º C.

*Añadir 0,2 mL de tromboplastina cálcica, a la vez que se dispara el


cronómetro.

Medir en segundos el tiempo que tarda en aparecer el coágulo.

D) INTERPRETACIÓN DEL RESULTADO

Los resultados se expresan en segundos, acompañados del TPNM, y se


aconseja añadir la razón o cociente “tiempo del paciente /TPNM”, para
una más fácil interpretación. El Tiempo de Protrombina Normal Medio
(TPNM) es el valor correspondiente al plasma control.

También es conveniente indicar la marca de la tromboplastina utilizada


por la gran variabilidad en la sensibilidad entre dos distintos reactivos
comerciales. Cuando la tromboplastina tiene una calidad idónea, debe
suministrar un tiempo de Quick para plasmas normales (plasma testigo)
de 12 a 14 segundos.

La aplicación de la prueba a un número elevado de sujetos


presuntamente libres de alteraciones de la coagulación, como ocurre en
los grandes laboratorios, permite corregir ligeras desviaciones en el
TPNM. Para ello se toma el valor de la razón de un mínimo de 50
individuos sin patología coagulativa, se eliminan los resultados que se
hallen fuera de ± 2DE, se establece de nuevo la media y se calcula el
número por el cual ésta debería multiplicarse para que su valor fuera
exactamente 1,0.

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Valor inverso de las diluciones

Actividad de Protrombina (%)


5 20

4 25

3 33

2 50

1 100
10 20 30 40 50 60
Tiempo de coagulación (segundos)

Figura 1
Este número es el factor por el que deberán multiplicarse todos los resultados
que se obtengan (mientras no se cambien las condiciones de trabajo o el lote del
reactivo) para que realmente se adapten a la población atendida en dicho
laboratorio.

Para expresar el resultado en porcentaje de actividad hay que elaborar una


curva de calibración (Figura 1) a partir de diluciones en tampón citratado del
plasma testigo, considerando como 100% el plasma sin diluir (Tabla 1).

El tiempo en segundos obtenido del plasma problema se lleva a la curva de


calibración y obtenemos la actividad global en % (actividad protrombínica). El
plasma testigo empleado para realizar la curva está generalmente constituido por
una mezcla de plasmas normales obtenidos a partir de 15 a 20 donantes sanos.
La curva debe volver a realizarse cada vez que se emplee un nuevo lote de
tromboplastina, ya que ésta puede hacer variar ligeramente el valor de los
testigos.

concentración 100 % 50 % 25 % 12,5 %


suero 0 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL
fisiológico o
tampón Owren
plasma control 1 mL 0,5 mL 0,5 mL de la 0,5 mL de la
dilución anterior dilución anterior

Tabla 1: Llevando los tiempos y las concentraciones a un papel semilogarítmico


se obtiene una recta (Curva de calibración: Figura 1).

La determinación del TP se utiliza:

Para comprobar la normalidad de la vía extrínseca y común de la coagulación.

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Como indicador de la función hepática (ya que la mayor parte de los factores de
la coagulación son de síntesis hepática).

Para controlar los tratamientos con anticoagulantes orales.

Si el TP está alargado, se realiza un TP de la mezcla a partes iguales de plasma


del paciente con plasma control. Si “corrige” (es decir, si el TP se normaliza),
indica un déficit de factores. Si “no corrige” indica la presencia de anticoagulante
(heparina, endógena o exógena, o PDF).

TIEMPO DE TROMBOPLASTINA PARCIAL ACTIVADA:

Valoración global de la vía intrínseca:

A) PRINCIPIO

El tiempo de cefalina o TTP es el tiempo necesario para la coagulación de


un PPP recalcificado en presencia de cefalina (mezcla de fosfolípidos). Si
además de la cefalina se añade una sustancia que facilite la activación del
sistema de contacto (caolín, celite u otras), se le denomina tiempo de
cefalina activado o TTPA.

El TTPA explora la vía intrínseca y común de la coagulación (factores XII,


XI, IX, VIII, V, X y II).

B) MATERIAL

a) Cefalina activada (extracto fosfolipídico para la realización del TTPA


que contiene un activador del sistema de contacto: silicato en
suspensión o ácido elágico).
b) Solución de cloruro cálcico 25 mmol/L.
c) Plasma citratado del paciente.
d) Plasma citratado control (mezcla de 10 ó más plasmas de donantes
sanos) preparado en el laboratorio o comercial.
e) Coagulómetro o equipo para la determinación manual.

C) MÉTODO

En dos tubos de hemólisis se introducen 0,1 mL de PPP del paciente y del


control, respectivamente.
A continuación se añaden 0,1 mL de la suspensión de cefalina y la mezcla
se deja incubar durante 2 ó 3 minutos a 37º C (según las instrucciones del
reactivo).

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Finalmente se añaden 0,1 mL de CaCl2 (equilibrado a 37º C) a la vez que se


dispara el cronómetro
Se mide el tiempo necesario para el inicio de la formación del coágulo.

D) INTERPRETACIÓN DEL RESULTADO

Se da el resultado del tiempo en segundos de paciente y control y se


aconseja acompañarlo del cociente paciente/control para una más fácil
interpretación, especialmente cuando se destina al control del tratamiento
con heparina.

El tiempo normal varía según la mezcla de cefalina-activador utilizado y


generalmente oscila entre 30 y 35 segundos para el plasma normal. Para
corregir pequeñas desviaciones en el valor del plasma control se procede
de forma similar a como se indicó en el TP.

El TTPA se utiliza:

Para el estudio global de la coagulación, junto al TP.


Para valorar la existencia de déficit de factores de la coagulación: Un
alargamiento respecto al control indica una alteración de los factores
antihemofílicos (VIII y IX), de los del sistema de contacto (XI y XII) o de los
factores pertenecientes a la vía común (V, X y II).
Para monitorización de la terapia con heparina.

Si el TTPA está alargado, hay que realizar un nuevo TTPA de una mezcla
apartes iguales de plasma del paciente y plasma control. Si “no corrige” significa
la presencia de heparina o anticoagulante circulante. Si “corrige” indica un déficit
factorial, y entonces hay que valorar conjuntamente TP y TTPA:

TP TTPA Factor deficitario


Normal Alterado VIII, IX, XI, XII
Alterado Normal VII
Alterado Alterado X, V, II

Si el TP y el TTPA están alargados, hay que valorar el Nº de plaquetas y el


fibrinógeno para descartar una coagulopatía de consumo.

Dosificación del fibrinógeno:

Puede realizarse mediante tres procedimientos: ponderal, precipitación por el


calor y medida del tiempo de coagulación. Este último es el más preciso y el más
utilizado, valorando el fibrinógeno funcional.

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La determinación inmunológica por inmunodifusión radial ofrece una buena


precisión y existen dispositivos comerciales que hacen muy simple la prueba.

La valoración turbidimétrica a partir del coágulo obtenido en el TP, que ofrecen


algunos coagulómetros, proporciona resultados aceptables en el screening,
especialmente dentro del intervalo de normalidad.

MÉTODO PONDERAL: PRINCIPIO E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Se coagula el fibrinógeno contenido en un volumen determinado de plasma. El


coágulo se lava, se seca y se pesa, obteniéndose la cifra de fibrinógeno en g/L.
La cifra normal de fibrinógeno varía entre 2 y 4 g/L, considerándose que existe
hipofibrinogenemia cuando es inferior a 1,5 g/L, e hiperfibrinogenemia si es
superior a 6 g/L.

MÉTODO DE LA PRECIPITACIÓN MEDIANTE CALOR: PRINCIPIO E


INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

El fibrinógeno humano precipita a 56º C. La medida de la altura del precipitado


después de su centrifugación es proporcional a su concentración en el plasma.
Es un método poco preciso, pero rápido y orientativo. Es importante tener en
cuenta que los productos de degradación de la fibrina (PDF) precipitan también a
56º C y pueden falsear los resultados.

MÉTODO DE LA MEDIDA DEL TIEMPO DE COAGULACIÓN

(Método de Von Clauss)

A) PRINCIPIO

En presencia de concentraciones elevadas de trombina y baja


concentración de fibrinógeno, el tiempo de coagulación es proporcional a
la tasa de fibrinógeno.

B) MATERIAL

a) PPP del paciente (sangre total con citrato sódico 0,1 mol/L,
centrifugada 10-15 min. a 3.000 r.p.m.). Se puede guardar refrigerada
no más de 3-4 horas.
b) Tampón veronal-acetato, pH 7,35 (Tampón de Michaelis), o tampón de
Owren.
c) Solución de trombina bovina liofilizada a concentración de 100
NIH/mL.
d) Solución de CaCl2 mol/L.
e) Plasma citratado control con tasa de fibrinógeno previamente
conocida.

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f) Coagulómetro o equipo para la determinación manual. La lectura


manual de esta prueba es difícil por simple observación de la
formación del coágulo y requiere el uso de un gancho o asa de platino.
Todos los coagulómetros de lectura mecánica y la mayoría de los
modelos modernos de lectura óptica son adecuados para la
realización de la prueba.

C) MÉTODO

Diluir el plasma problema en tampón de Michaelis o en tampón Owren


(dilución 1/10).
Introducir en la cubeta del fibrómetro 0,2 mL de la dilución 1/10 y esperar 2
minutos para equilibrar la muestra (37º C).
Añadir 0,1 mL de la solución de trombina concentrada, al mismo tiempo
que se dispara el cronómetro del fibrómetro.
Determinar el tiempo necesario para la coagulación.
Las cifras obtenidas se transforman en valores de concentración de
fibrinógeno (g/L) mediante el empleo de una curva de calibración elaborada
previamente: se determina el fibrinógeno de un plasma control por otro
método (preferentemente ponderal) y se mide el tiempo de coagulación
correspondiente a diferentes diluciones de este plasma (1/5, 1/10, 1/20,
1/30, 1/40, 1/50) en presencia de una solución de trombina (según lo
indicado anteriormente).

Tampón 0,8 mL 0,9 mL 1,9 mL 2,9 mL


Patrón 0,2 mL 0,1 mL 0,1 mL 0,1 mL
Dilución 1/5 1/10 1/20 1/30

En la línea de abscisas se colocan las concentraciones de fibrinógeno en g/L


y en la de ordenadas los tiempos de coagulación obtenidos (en segundos)
(Figura 2).

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Figura 2

D) INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

En las hipofibrinogenemias, la dilución 1/10 es prácticamente


incoagulable; mientras que en las hiperfibrinogenemias hay que aumentar
el número de diluciones hasta entrar en la zona de sensibilidad de la recta
de calibración.

Si la tasa de fibrinógeno es superior a 500 mg/dL, se hace una dilución


1/20 (0,1 mL de plasma problema y 1,9 mL del tampón), se realiza una
nueva determinación y el resultado se multiplica por 2 para obtener la cifra
real de fibrinógeno. Si la cifra de fibrinógeno es inferior a 100 mg/dL se
realiza la prueba en plasma diluido 1/5 (0,1 mL de plasma y 0,4 mL de
tampón, y el resultado se divide por 2.

La presencia de un inhibidor de acción antitrombina (heparina o PDF)


pueden falsear los resultados por alargamiento del tiempo de coagulación,
independientemente de la tasa de fibrinógeno.

TIEMPO DE TROMBINA

Es el tiempo que tarda en coagular un PPP citratado al añadir un exceso


de trombina. El valor normal oscila entre 12 y 16 segundos. Si el TT
excede más de 3 segundos al tiempo control (que se realiza
simultáneamente), hay que sospechar patología del fibrinógeno. La
prueba se alarga también por la presencia de heparina, PDF o fibrinógeno
anormal, por lo que ante un tiempo de trombina largo se recomienda la
realización de un tiempo de Reptilase, y si éste está también alargado,
deben dosificarse el fibrinógeno y los PDF.

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TIEMPO DE REPTILASE 

Mide el tiempo que tarda en coagular un PPP citratado al añadir reptilase


(derivado del veneno de víbora), que actúa directamente sobre el
fibrinógeno, escindiendo el fibrinopéptido A por un mecanismo
independiente de la trombina, por lo que no se altera por la presencia de
heparina.
El tiempo de reptilase permite diferenciar si el alargamiento del tiempo de
trombina se debe a un trastorno en la formación de fibrina o a la presencia
de heparina.

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TEMARIO DE T.E.L.

TEMA 10. GRUPOS SANGUÍNEOS:


ABO Y RHO. REALIZACIÓN, TÉCNICA E
INTERPRETACIÓN. TÉCNICA DE LA
ANTIGLOBULINA HUMANA (COOMBS
DIRECTO): PRINCIPIO, REALIZACIÓN
TÉCNICA E INTERPRETACIÓN. ESTUDIO DE
LA COMPATIBILIDAD SANGUÍNEA: PRUEBA
CRUZADA MAYOR, FASES DE LECTURA E
INTERPRETACIÓN
ABO Y RHO. REALIZACIÓN, TÉCNICA E
INTERPRETACIÓN.
INTRODUCCIÓN

En épocas anteriores al siglo XX se habían realizado transfusiones entre seres


humanos e incluso entre animales de otras especies y el hombre, aunque los
resultados adversos frecuentes se consideraban ocasionados por enfermedades
transmitidas del donante al receptor.

Hasta 1901 con Landsteiner, no se inicia un estudio riguroso al mezclar plasma y


hematíes de diferentes personas, analizando la existencia o no de aglutinación,
llegando a clasificar las sangres en los diferentes grupos. En 1928, la Comisión
de Higiene de la Sociedad de Naciones acepta la nomenclatura que hoy en día
se utiliza para el sistema ABO, conocido también comúnmente como grupo
sanguíneo.

A partir de entonces, se va avanzando en el conocimiento de otros componentes


antigénicos de la membrana del hematíe, estableciéndose numerosos sistemas
eritrocitarios que, hoy en día, nos permiten evitar cualquier reacción de
incompatibilidad al poner en contacto dos tipos de sangre.

CONCEPTOS GENERALES

Un antígeno eritrocitario es toda aquella sustancia presente en la membrana del


hematíe que reúne las características necesarias de tamaño, complejidad,
accesibilidad, etc... para que, al ponerse en contacto con las células
inmunocompetentes de un sistema inmunitario, de lugar a la activación de dichas
células, siendo una de las respuestas la formación de anticuerpos; estos

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TEMARIO DE T.E.L.

anticuerpos formados se unen a los antígenos correspondientes, iniciándose la


destrucción de la célula portadora. La destrucción de la célula se consigue por
activación del complemento y/o por fagocitosis
Los antígenos eritrocitarios pueden estar pegados a la membrana del hematíe o
formando parte de ella. Si forman parte integral de la membrana, suelen estar
menos accesibles para conectar con los receptores específicos de los antígenos
de las células inmunocompetentes, disminuyendo por este motivo su capacidad
antigénica.

La capacidad antigénica va a depender, por tanto, del número de veces que se


repite el antígeno en la membrana del hematíe. Esta característica se denomina
densidad de puntos antigénicos.

A los antígenos eritrocitarios se les pueden denominar factores. Cuando varios


factores son regulados por una serie de genes interrelacionados, forman un
sistema (ABO, Rh...)

SISTEMA ABO
SUSTANCIAS QUE COMPONEN EL SISTEMA

El sistema ABO está formado por los antígenos A y B, que pueden estar
presentes en la membrana del hematíe, en otras células y en las secreciones
(saliva, líquido amniótico, líquido seminal...) dependiendo su existencia y
localización de un control genético.

Las sustancias A y B empiezan a formarse en las primeras semanas del


desarrollo fetal, pero no adquieren toda su potencia inmunológica hasta pasados
varios meses, incluso 18-20 meses después del parto. Esto es debido a que el
número de veces que se repite la sustancia en la membrana del hematíe al
principio es reducido, adquiriendo la densidad máxima de una forma progresiva.
La densidad de estos puntos antigénicos puede llegar, para las sustancias A y B,
hasta casi un millón por célula. La localización de estas sustancias es
extramembranosa y en su composición podemos diferenciar dos partes:

Oligosacáridos: donde se presentan las variaciones antigénicas y, otra menos


conocida;

Glucoproteínas (o soporte): cuando está fijado a la membrana de hematíes,


leucocitos u otras células epiteliales o endoteliales.

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TEMARIO DE T.E.L.

FORMACIÓN Y CONTROL de LAS SUSTANCIAS A y B

Antígenos.

Los antígenos que componen el sistema ABO y el sistema Lewis proceden de


sustancias precursoras muy similares. Hay dos tipos de sustancias precursoras:
tipo I y tipo II,
La sustancia precursora tipo I posee todas las uniones entre sus monosacáridos
por los carbonos que se encuentran en las posiciones 1 y 3, y el soporte está
formado por glucoproteínas.

La sustancia precursora tipo II posee todas las uniones entre sus monosacáridos
por los carbonos que se encuentran en posición 1 y 3, excepto entre la N-
acetilglucosamina y la galactosa final, que se produce entre los carbonos en
posición 1 y 4. El soporte está formado por glucolípidos.

Sobre estas sustancias van a actuar un conjunto de transferasas, controladas


por genes que se encuentran en el brazo corto del cromosoma 9, dando lugar a
los distintos componentes de los sistemas ABO y Lewis.

Los genes que controlan el sistema ABO son el H, A, B y Se. Los genes A y B
son codominantes entre sí y dominantes sobre el O.

La sustancia precursora tipo II es el origen de los antígenos A y B unidos al


eritrocito y otras células.

El proceso se desarrolla de la siguiente forma: el gen H controla la formación y la


acción de una fucosil-transferasa, que cataliza la unión de una fucosa a la
galactosa final de la sustancia precursora tipo II, formándose la sustancia H.

A continuación, si el gen A está presente, controlará la formación y la acción de


una N-acetilgalactosaminil-transferasa, catalizando la unión de una N-acetil-
galactosamina a la sustancia H; formándose la sustancia A.

En cambio si es el gen B el presente, controla la formación y la acción de una


galactosil transferasa, uniéndose una galactosa a la sustancia H, formándose la
sustancia B.

Si en la dotación genética se encuentran los genes A y B, sobre el hematíe


aparecen las dos sustancias A y B y si en la dotación genética no se encuentran
los genes A y B, por ser homocigótico OO, sobre el hematíe no habrá sustancia
ni A ni B. El gen O se considera un “gen mudo” ya que no controla ninguna
transferasa que actúe sobre la sustancia H.

Los hematíes que tienen los antígenos A y B poseen menos cantidad de


sustancia H en su membrana que los hematíes carentes de dichos antígenos, ya
que parte de la sustancia H se utiliza en la formación de los antígenos A y B.

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TEMARIO DE T.E.L.

En la especie humana, siempre que no haya alteraciones genéticas, las


sustancias precursoras y la sustancia H son isoantígenos, ya que las poseen
todos los individuos de la especie. Sin embargo, las sustancias A y B son
aloantígenos porque no se encuentran en todos los individuos de dicha especie.

Hay determinados casos, aunque poco frecuentes, en los que el hematíe no


presenta en su membrana la sustancia H; como consecuencia de ello tampoco
hay en la membrana del hematíe sustancias A y/o B, aunque en la dotación
genética estén los genes A y/o B. Esto puede ser debido a varias causas:

La persona posee el genotipo homocigoto hh y, por lo tanto, no forma la


sustancia H ni en el hematíe ni en las secreciones. Esta sangre se tipifica como
Bombay.

El gen H está parcialmente reprimido, formándose muy poca sustancia H, que


resulta insuficiente para actuar como sustrato para las enzimas controladas por
los genes A y B, no produciéndose, por tanto, las sustancias correspondientes.
Este tipo de sangre se denomina para-Bombay serie 1ª.

Hay un fallo en los genes reguladores que mantienen fijas las sustancias H, A y
B al hematíe. El individuo posee sustancia H y las sustancias A y B que le
correspondan genéticamente, pero no fijadas al hematíe. Esta sangre se tipifica
como para-Bombay serie 2ª.

Esta alteración genética hace que, para las personas con sangre tipificada como
Bombay, la sustancia H sea un aloantígeno. No sucede así en los casos de
sangre para-Bombay series 1ª y 2ª, ya que las personas que poseen este tipo de
sangre tienen sustancia H (en poca cantidad o fuera del hematíe) siendo por lo
tanto isoantígeno para ellas.

El último gen regulador es el Se (ya sea de forma homocigótica: Se/Se ó


heterocigótica Se/se), este gen controla la formación y acción de una
fucosiltransferasa, permitiendo la unión de una fucosa a la galactosa final de la
sustancia precursora tipo I. Así se forma la sustancia H, sobre la que pueden
actuar los genes A y/o B con formación de sustancias A y B en secreciones.

Por lo tanto, para que un individuo sea secretor de sustancias A o B necesita


poseer el gen Se de forma homocigótica o heterocigota.

La frecuencia de los diferentes tipos de sangre en personas de raza blanca es la


siguiente: O (43-47%), A1 (34-41%), A2 (10%), B (8-9%) y AB (3%)

Anticuerpos del sistema ABO.

Al nacer, una persona posee en la membrana de sus hematíes los antígenos


que le corresponden dependiendo de su dotación genética. En su plasma no
existe ningún tipo de anticuerpos respecto a las sustancias A o B, pero de forma

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progresiva, se inicia la formación de anticuerpos contra los antígenos hemáticos


que ella no posee. Estos anticuerpos se denominan naturales. Hoy en día se
piensa que estos anticuerpos se forman como respuesta a sustancia que se
encuentran en la membrana de determinadas bacterias, neumococos o que
forman parte de algunos jugos vegetales.

Estas sustancias son muy parecidas a los antígenos que componen el sistema
ABO. Los anticuerpos naturales reaccionan con antígenos A o B por reacción
cruzada. Estos anticuerpos son preferentemente de tipo IgM y no atraviesan la
placenta. Se les denomina también completos o aglutinantes porque al unirse al
hematíe lo aglutinan con facilidad en medio salino.

Los títulos de anticuerpos naturales anti-A o anti-B pueden variar a lo largo de la


vida. En términos generales, sangres tipificadas como O, tienen títulos de anti-A
y anti-B naturales más altos que las de los grupos A y B.

Cuando los hematíes tipificados como A, B o AB se transfunden a otra persona


que no posea algunos de estos antígenos, el sistema inmunocompetente de ésta
se estimula formando anticuerpos contra el antígeno desconocido. Este tipo de
anticuerpos se denominan inmunológicos ya que el estimulante es
perfectamente conocido (el antígeno hemático) y la unión antígeno-anticuerpo no
tiene lugar por reacción cruzada.

La mayoría de estos anticuerpos inmunológicos son de tipo IgG, atraviesan la


placenta y se les denomina también incompletos porque para detectarlos en el
laboratorio es necesario facilitar la aglutinación de diferentes formas, ya que en
medio salino no se consigue.

Es importante diferenciar entre anticuerpos anti-A y anti-B naturales e


inmunológicos. La existencia de anticuerpos inmunológicos anti A y anti B
pueden ser causa de anemia hemolítica en el recién nacido. Sangre con títulos
altos de anticuerpos naturales y/o inmunológicos no es adecuada para realizar
transfusiones.

Grupos y subgrupos del sistema ABO.

El sistema ABO está formado por cuatro grupos diferentes

Grupo sanguíneo Antígenos hemáticos Anticuerpos en suero


A A Anti-A
B B Anti-B
AB AyB Ninguno
O Ninguno Anti-A y Anti-B

Cada grupo presenta en el hematíe, en otras células y en secreciones (si está


presente el gen Se), el antígeno correspondiente a la denominación del grupo, y
en el plasma, el anticuerpo contra el antígeno que no posee.

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En grupo AB, al tener los dos antígenos, no presenta ni anti-A ni anti-B (se
conoce tradicionalmente como receptor universal)

En el grupo O, al no tener ninguno de los dos antígenos, presenta anti-A y anti-B,


expresando toda la sustancia H sin utilizar (se conoce tradicionalmente como
donante universal)

Se conocen algunas variaciones antigénicas que dan lugar a diferentes


subgrupos, solo los subgrupos A1, A2, A1B y A2B tienen interés, ya que el resto
son muy poco frecuentes y sus antígenos tienen muy poca capacidad antigénica.

Los fenotipos-genotipos del sistema son los siguientes:

Fenotipos Genotipos
O OO
A1 A1A1
A1A2
A1O
A2 A2A2
A2O
B BB
BO
A1B A1B
A2B A2B

El gen A1 es dominante sobre el gen A2, siendo los genes A y B codominantes y


dominantes sobre el O.

Características del sistema ABO

Grupo Ag hemáticos Ac plasma


A1 A1 y A Anti-B
A2 A Anti-A1 y anti-B
B B Anti-A1 y anti-A
A1B A1, A, B -
A2B AyB Anti-A1
O - Anti-A1, anti-A y anti-B

El subgrupo A1 es mucho más frecuente que el A2, siendo su capacidad


antigénica más elevada. Una persona con sangre A2, si recibe hematíes A1, es
posible que forme anticuerpos anti-A1

En cambio los anticuerpos anti-A1 procedentes de sangres A2 y A2B suelen ser


débiles y por lo tanto poco útiles para su utilización in vitro para tipificar hematíes
A1.

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Determinación del grupo ABO.

La tipificación de la sangre con respecto al grupo ABO es la más importante a


realizar debido a las graves consecuencias que puede tener un error en su
realización en caso de transfusiones.

Esta importancia va a radicar en la existencia de anticuerpos naturales muy


potentes que diferencian este sistema de otros (por ejemplo el Rh), provocando
una incompatibilidad desde la primera transfusión (el Rh necesita una transfusión
sensibilizante previa).

Tipos de muestra y conservación:

Sangre total con ácido cítrico, citrato y dextrosa (ACD): se conserva unos 21 días
a 2-10º C.

Sangre total con etilen-diamino-tetraacético (EDTA): se conserva 48 horas a 2-


10º C.

Sangre coagulada: se conserva 5 días a 2-10º C.

La toma de muestra por punción dactilar o en el lóbulo de la oreja no es


aconsejable, ya que en caso de duda no permite la comprobación por medio de
otra técnica.

Tipos de suero:

La mayoría de los sueros para el diagnostico son de origen humano,


preparándose de mezclas de sueros seleccionados.

Los sueros son: anti-A, anti-B y anti-AB. Este último se utiliza de sangre de
paciente de grupo O, y se utiliza para confirmar los resultados obtenidos con los
anti-A y anti-B o bien cuando la respuesta obtenida es muy débil.

Para diferenciar los grupos A1, A2, A1B y A2B se utiliza principalmente el suero
anti-A1, compuesto por una lectina de las semillas del Dolichus biflorus y para la
identificación de la sustancia H un suero anti-H vegetal (lectina del Ulexz
europaeus).

También pueden emplearse sueros formados por anticuerpos monoclonales de


origen murino (hibridación de células B productoras de anticuerpos con células
de mieloma de ratón) o humano (hibridación de células B infectadas con EBV y
células de mieloma). Los anticuerpos policlonales captan mejor los antígenos
débiles que los monoclonales.

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Técnicas.

Prueba en porta.

o En un porta colocar una gota de sangre problema y una gota de suero


anti-A y en otro diferente otra gota de sangre con suero anti-B.

o Mezclar. Aunque la aglutinación debe ser inmediata, conviene mover dos


minutos a temperatura ambiente para poder captar los antígenos débiles.

o Si no aglutina ni con anti-A ni con anti-B el grupo es el O (se puede


confirmar con la negatividad de la prueba al anti-AB).

o Si aglutina con anti-B es B y si lo hace sólo con el anti-A será A. En este


ultimo caso se deberá diferenciar el grupo A1 del A2. Si aglutina con los
dos, el grupo será el AB.

En aquellos casos en los que el paciente tenga la VSG elevada o el plasma sea
lipémico, es posible que existan dudas en la interpretación de la prueba. Para
solucionarlo deben lavarse los hematíes o bien realizar la prueba en tubo.

Prueba en tubo.

o Lavar aproximadamente 0.2 ml de sangre con solución salina isotónica 2-


3 veces. Centrifugar y eliminar el sobrenadante.

o Tomar 0.1 ml del concentrado de hematíes y mezclar con 2 ml de solución


salina isotónica (concentración aproximada: 4%), a continuación depositar
una gota de la dilución en dos tubos, añadiendo a uno suero anti-A y al
otro anti-B. Mezclar y centrifugar 1 minuto a 1000 rpm, resuspender y
comprobar la aglutinación.

EL SISTEMA RHESUS (Rh)

En 1940 Landsteiner descubre otro antígeno en los hematíes, que era el


responsable de que los recién nacidos de madres que no tenían ese antígeno en
sus hematíes pero si el anticuerpo correspondiente en su plasma, murieran
dentro del útero durante el embarazo o padecieran una enfermedad muy grave
tras el nacimiento (enfermedad hemolítica del recién nacido). A este antígeno lo
denominó “Rh” por haberse realizado los primeros descubrimientos en el mono
“MACACO RHESSUS”. Observó que al introducir hematíes humanos a estos
monos, estos fabricaban un anticuerpo que era capaz de “aglutinar” los hematíes
del 85% de la población blanca. Llamó “ Rh positivos “ a los hematíes que eran
aglutinados por ese anticuerpo, (llevaban el antígeno Rh en su superficie) y “Rh
negativos” a los que no eran aglutinados (no tenían antígeno Rh en su
superficie).

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El sistema Rhesus está constituido por unos cuarenta antígenos distintos cinco
de los cuales revisten una importancia especial. Para designar los diferentes
antígenos del sistema Rh existen dos nomenclaturas principales que se utilizan
indistintamente la de Fisher-Race y la de Wiener.

La terminología de Fisher-Race se basa en la suposición de que se heredan de


cada progenitor tres genes situados en loci muy próximos. Los alelos más
comunes que pueden ocupar dichos loci se designan con los símbolos D y d, C
y, E y e. Cada gen (con excepción del d) codifica un antígeno específico, que
puede ser detectado en la membrana del hematíe. Es posible que sea una alelo
silencioso. La presencia o ausencia del antígeno D es la que determina si un
individuo es Rh positivo o negativo.

La nomenclatura de Wiener se basa en la herencia de un solo gen procedente


de cada progenitor. Cada gen tendría una estructura en mosaico, que
comprendería un número variable de antígenos sanguíneos. Así, el gen R1
codificaría factores que corresponderían a C, D, y e de la nomenclatura de
Fisher-Race. El gen reproduciría los antígenos c y e pero no D, C ni E.

El 85% de los individuos caucasoides expresan el antígeno D y se les denomina


Rh positivos. Si el antígeno D no se expresa se denomina al individuo Rh
negativo, estos heredan los antígenos C o E pero no el D. El genotipo de la
mayoría de los individuos Rh negativos es rr (dce/dce).

El antígeno D es un potente inmunógeno. Aproximadamente el 70% de los


individuos Rh negativos producen anti-D si reciben sangre Rh positiva. Los
antígenos C y E no son tan inmunógenos.

TEORIA DE FISHER-RACE TEORIA DE WIENER

3 GENES ESTRECHAMENTE 1 GEN Rh


UNIDOS, HEREDADOS HEREDADO DE
DE CADA PROGENITOR CADA PROGENITOR

GEN EN MOSAICO
QUE CODIFICA MULTIPLES
FACTORES SANGUÍNEOS

Finalmente, Rosenfield, tan solo propone una nomenclatura, en la cual cada uno
de los diversos antisueros Rh recibe un número Rh1, Rh2, etc. Este sistema
hace posible una determinación del fenotipo basada tan solo en los resultados
observados con los antisueros empleados.

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NOMENCLATURA ANTIGENOS DEL SISTEMA Rh

FISHER-RACE WIENER ROSENFIELD


D Rh Rh1
C rh Rh2
E rh” Rh3
C hr Rh4
E hr” Rh5
Tabla 1.

ANTÍGENOS DEL SISTEMA Rh

Los antígenos del sistema Rh son proteínas que forman parte integrante de la
membrana de los eritrocitos únicamente. (No se encuentran en otras células o en
las secreciones.

A parte del antígeno D, que permite clasificar a los individuos en Rh positivos y


Rh negativos, existen otros antígenos en el sistema Rh. De estos los principales
son C, c, E, e. Anticuerpos hacía cualquiera de estos antígenos pueden ser
producidos por un individuo cuyos glóbulos rojos carecen de los mismos.

EL D

El D es una variante débil del antígeno D poco frecuente entre los individuos
caucasoides, pero común entre los individuos de raza negra (22%). Los
hematíes D generalmente dan reacciones débiles o negativas con el anti-D,
siendo generalmente detectados gracias a la prueba indirecta de la antiglobulina
(prueba D). Los hematíes D pueden ser clasificados en tres categorías.

D ADQUIRIDO. La herencia del gen C en posición trans con relación al gen D


(dce/DcE) tiene como resultado una expresión débil del antígeno D en los
hematíes (D). Los individuos que representan estas características no producen
anti-D si reciben sangre Rh positiva.

D DEPRIMIDO

GENOTIPO Dce/dce Dce/dCe

C en posición cis con C en posición trans con


respecto a D respecto a D

Expresión normal del


Fenotipo como D
antígeno D

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VARIANTE D. El antígeno D presenta una estructura que consta como mínimo


de cuatro partes. Si faltan una o más partes del antígeno el resto de este puede
tener una expresión débil. Un individuo con la variante D puede producir
aloanticuerpos contra la parte del antígeno D que le falta. Estos deben ser
transfundidos con sangre Rh negativa.

VARIANTE D

Antígeno D Normal
Variante D falta parte del antígeno D

D HEREDITARIO. Algunos individuos D no pueden ser clasificados como D


adquirido ni como variante D, puesto que, si bien poseen el antígeno D completo,
éste está débilmente expresado, desconociéndose la causa de este hecho.

Antígeno D Normal
D Hereditario

HEMATÍES CON DELECCIÓN Rh (- D -) y Rh nulo

De los hematíes que no poseen los antígenos dependientes de los loci C ni E se


dice que presentan delección (- D -). El número de lugares antigénicos D está
muy aumentado en estos hematíes y por tanto el anti-D de tipo IgG puede
aglutinarlos.

De los individuos que no expresan ninguno de los antígenos del sistema Rh en


sus hematíes se dice que tiene Rh nulo (- - -). Los hematíes de éstos tienen
alterado el transporte de sodio y potasio. Esto da lugar a una anemia hemolítica
caracterizada por estomatocitosis, esferocitosis y aumento de la fragilidad
osmótica.

ANTICUERPOS DEL SISTEMA Rh

Los anticuerpos del sistema Rh son casi siempre IgG, siendo estimulada su
producción por transfusión o por embarazo (Enfermedad hemolítica del recién
nacido). No activan el complemento debido a que la situación de los antígenos
Rh de la membrana del hematíe no permite la formación de dobletes de IgG
necesarios para la activación del mismo.

Los anticuerpos anti-D se emplean para prevenir la inmunización de las


personas Rh negativas que han recibido hematíes Rh positivos a través de una
transfusión o de un embarazo. La administración antes de 72 horas de
inmunoglobulina anti-D consigue destruir los hematíes Rh positivos circulantes
antes de que el sistema inmune del receptor se active.

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GENOTIPO

El término Rh positivo se refiere tan sólo a la presencia del antígeno D en los


glóbulos rojos. No indica si la formación genética de la persona es homocigota
(D/D) o heterocigota (D/d). En cualquier persona puede determinarse el genotipo
presuntivo.

DETERMINACION DEL Rho

TIPOS DE MUESTRAS Y CONSERVACIÓN:

Ver el apartado referido a la determinación del grupo ABO.

TÉCNICAS:

Se emplean anticuerpos anti-D de tipo IgG conseguidos a partir de una mezcla


de sueros humanos obtenida de donantes inmunizados.

Prueba en porta.

• Se toman dos portaobjetos convenientemente rotulados. En uno


ponemos una gota de suero anti-D, en el otro una gota del CD (Control
negativo).

• Añadimos dos gotas de sangre total, a cada uno de los dos portas.

• Se mezcla bien la sangre y el reactivo con distintos palillos


mezcladores.

• Se colocan los portas sobre el visualizador precalentado.

• Conviene mover el visualizador durante dos minutos. A continuación


se observa macroscópicamente la presencia de aglutinación.

La lectura de cada uno de los portaobjetos admite dos posibilidades.

o Reacción negativa: no hay ningún signo visible de aglutinación, debe ser


confirmada con la prueba del D.

o Reacción positiva: la sangre con anti-D muestra aglutinación visible, y el


control negativo no.

Prueba en tubo.

• Rotular dos tubos, uno para el anti-D, y el otro para el control negativo
(CD).

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• Preparar una suspensión de hematíes del paciente al 5%. Lavar tres


veces con salino, centrifugando durante un minuto a 3.500 r.p.m.

• En el tubo del D poner una gota de anti-D, y añadir una gota de la


suspensión de hematíes, en el tubo del control poner una gota del control
negativo y una gota de la suspensión de hematíes.

• Agitar ligeramente los dos tubos y centrifugar 15 segundos.

• Leer los resultados macroscópicamente en el visualizador.

Siempre que resulte, el control del D, positivo, hacer test de Coombs Directo.

A todo Rho negativo se le efectuará un D y un CDE.

TEST PARA EL D

1. Incubar a 37° C durante media hora, el mismo tubo en el que se haya


realizado el anti-D, que dio negativo.

2. Lavamos 3 veces, los hematíes con solución salina isotónica.


Decantamos el último sobrenadante.

3. Se añade una gota e suero antiglobulina humana y se mezclan.

4. Se centrifuga durante 30 segundos. Leemos macroscópica y


microscópicamente.

5. Si no hay aglutinación se dará como D (-) y D (-).

6. Si hay aglutinación se hará un anti-D salino, para ello:

o Echar en un tubo 1 gota de anti-D salino, más una gota de


suspensión de hematíes al 5%.

o Incubar a 37° C durante 15 minutos.

o Centrifugar y leer macroscópicamente. Sólo si el anti-D salino da


negativo se considera D positivo. En caso contrario se dará como
D positivo.

CDE

1. Rotular un tubo CDE y poner en el mismo una gota de anti-CDE.

2. Añadirle una gota de suspensión de hematíes al 5% del paciente.

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3. Incubar a 37° C durante 15 minutos.

4. Centrifugar 15 segundos y leer microscópicamente si hay aglutinación.

GENOTIPO

1. Rotular cuatro tubos: C, E, c, e.

2. Preparar una suspensión de hematíes al 5% del sujeto a genotipar.

3. Poner en cada tubo, una gota de la suspensión de hematíes, y una gota


del antisuero correspondiente. (anti-C, anti-E, anti-c, anti-e).

4. Incubar durante 15 minutos, los cuatro tubos, a 37° C en baño María.

5. Centrifugar 15 segundos a 3.500 r.p.m., y leer macroscópicamente.

6. Apuntar resultados, ver en tablas genotipo correspondiente.

Rho positivo
D C E c e Genotipo Símbolo

+ + - + + Dce/dce Rr
Rho negativo
D C E c e Genotipo Símbolo

- + - - + dCe/dCe rr
Tabla. 2

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TÉCNICA DE LA ANTIGLOBULINA HUMANA


(COOMBS DIRECTO) PRINCIPIO, REALIZACIÓN
TÉCNICA E INTERPRETACIÓN
PRINCIPIO
La fijación de anticuerpos de tipo IgM a los hematíes generalmente produce
aglutinación, a diferencia de los anticuerpos IgG (denominados anticuerpos
“bloqueantes” o “incompletos”), que no suelen producir aglutinación.

La prueba de Coombs sirve para poner de manifiesto estos anticuerpos


incompletos. Esta prueba puede aplicarse básicamente de dos formas: directa e
indirecta. Ambas tienen el mismo fundamento: las dos detectan el anticuerpo o el
complemento unido a la célula.

La Prueba Directa de la Antiglobulina es positiva cuando los hematíes han sido


sensibilizados en su propio organismo (sensibilización in vivo).

La Prueba Indirecta de la Antiglobulina detecta la existencia de anticuerpos


antieritrocíticos en el suero de un enfermo, que provocan la sensibilización de
hematíes in vitro, por lo que aglutinan al añadirles el suero de Coombs.

En ambos casos, el anticuerpo sensibilizante o el complemento actúan como


antígeno para el reactivo antiglobulina humana (suero de Coombs). Dicho
reactivo se prepara inmunizando animales (conejos generalmente) con IgG y
complemento (C3) humanos. La aglutinación se produce porque el anti-IgG y el
anti-C3 se unen al antígeno correspondiente (IgG y C3, respectivamente), que a
su vez está unido a hematíes colindantes, actuando así como puente (Fig. 1).

REALIZACIÓN TÉCNICA
Se llama “directa” porque los hematíes se toman directamente del paciente y son
examinados sin manipulación intermedia. Antes del examen es importante lavar
los glóbulos rojos para que queden libres de proteínas plasmáticas, que podrían
reaccionar con el suero antiglobulina y dar falsos positivos.

MATERIAL

• Centrífuga.
• Tubos de hemólisis (12 × 75 mm).
• Pipetas de Pasteur.
• Solución salina fisiológica.
• Sangre del paciente anticoagulada con EDTA.
• Eritrocitos control (Coombs-control).

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Suero antiglobulina (suero de Coombs) estandarizado. Algunos anticuerpos de


tipo IgG y la mayoría de los IgM pueden fijar el complemento a los hematíes in
vivo. El componente del complemento detectado en dichos hematíes es C3d,
razón por la cual el reactivo antiglobulina utilizado para la prueba de Coombs
directa debe contener anti-IgG y anti C3d.

MÉTODO

a) Centrifugar la sangre del paciente 5 minutos a 3.000 r.p.m. y separar el


plasma.
b) Lavar cuatro veces los eritrocitos con solución salina fisiológica, teniendo
cuidado de decantar completamente después de cada lavado.
c) Preparar una suspensión de eritrocitos al 2-5 % en un tubo de hemólisis.
d) Colocar una gota de los eritrocitos del paciente y una gota del suero
antiglobulina humana.
e) Mezclar y centrifugar 1 minuto a 1.000 r.p.m.
f) Resuspender suavemente el botón de células (sin sacudir, usando sólo
una suave agitación por medio de un suave temblor del tubo) y girar los
tubos cuidadosamente para la lectura macroscópica.

Fig. 1: Test de Coombs directo

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Una reacción positiva mostrará aglutinados visibles macroscópicamente (Fig. 1).


Una reacción negativa se reconocerá por la suspensión homogénea de todos los
hematíes. Las reacciones negativas deben leerse también microscópicamente
después de hacer una extensión en porta.

Puntuación de las aglutinaciones:

Símbolo Aglutinados Puntuación


C Un único aglutinado 12
+++ Varios aglutinados grandes 10
++ Aglutinados más pequeños 8
+ Gránulos 5
(+) Gránulos pequeños 3
w Lectura microscópica; aglutinados 1
pequeños
o Lectura microscópica: negativa 0

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS

Una prueba de Coombs directa positiva suele significar la presencia de


inmunoglobulinas fijadas en la superficie de los eritrocitos, del tipo:

1. Autoanticuerpos contra antígenos intrínsecos de los hematíes (con o sin


anemia hemolítica autoinmune).
2. Aloanticuerpos en un receptor reciente de una transfusión que reacciona
con los hematíes transfundidos.
3. Anticuerpos presentes en el plasma del donante que reaccionan con
antígenos de los hematíes del receptor (poco frecuente).
4. Aloanticuerpos maternos que atraviesan la placenta y se fijan a los
hematíes del hijo (suelen provocar EHRN).

Sin embargo, esta prueba no sólo puede ser positiva en presencia de


anticuerpos antieritrocitarios, sino que también puede indicar:

a) Adsorción sobre la superficie eritrocitaria de complejos inmunes formados


por ciertos medicamentos y su correspondiente anticuerpo (penicilina,
quinidina, fenacetina).
b) Alteración de la superficie eritrocitaria por efecto de ciertos medicamentos
como la cefalotina, la metildopa y otros.
c) Fijación inespecífica de inmunoglobulinas a los hematíes en pacientes
con hipergammaglobulinamia (por ejemplo: cirróticos) o en pacientes
tratados con dosis altas de Ig vía IV.

Por tanto, la prueba de Coombs está indicada siempre que exista sospecha
clínica o biológica de hemólisis por mecanismo inmune:

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1. Anemia hemolítica autoinmune (hematíes sensibilizados por


autoanticuerpos).
2. Anemia hemolítica inducida por fármacos.
3. Enfermedad hemolítica del recién nacido (hematíes sensibilizados por
anticuerpos anti-Rh producidos por la madre).
4. Reacción hemolítica postransfusional.

Cuando la prueba de Coombs sea positiva, debe procederse a investigar si lo


que recubre la superficie eritrocitaria es una inmunoglobulina, el complemento o
ambos simultáneamente. Asimismo, debe investigarse la naturaleza del
autoanticuerpo existente (IgG, IgM).

Por otra parte, no hay que olvidar la posibilidad de errores capaces de


enmascarar el resultado de la prueba de Coombs, dando lugar en la práctica a
falsos positivos y falsos negativos, cuyas causas generales son:

1. Falsos positivos:

• Sensibilización eritrocitaria in vitro por efecto de anticuerpos naturales o


del complemento cuando se mantiene la sangre durante cierto tiempo a 4
º C antes de su análisis.
• Lavado insuficiente de los hematíes.
• Fijación inadecuada de suero antiglobulínico que contiene anticuerpos
capaces de unirse a hematíes no sensibilizados.
• Reacción con la sílice coloidal de los tubos de cristal.
• Elevada reticulocitosis en la muestra de sangre analizada.

2. Falsos negativos:

• Tiempo insuficiente de incubación, que no permite alcanzar la aglutinación


eritrocitaria.
• Dilución incorrecta del suero antiglobulina.
• Suero antiglobulina de mala calidad.
• Cuando el antisuero es de naturaleza IgA (debido a que los sueros
antiglobulina normalmente empleados carecen de anti-IgA).
• Alteración del suero antiglobulina debido a mala conservación o
contaminación bacteriana.
• Lavado inadecuado de los hematíes, que facilita la neutralización de los
anticuerpos fijados sobre ellos por las inmunoglobulinas plasmáticas o el
complemento.
• Eliminación de los anticuerpos fijados sobre la superficie eritrocitaria
mediante el lavado.
• Empleo de sangre caducada.
• Empleo de placas o portaobjetos sucios, húmedos o con residuos de
jabón.

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El denominado Coombs-control se utiliza para detectar los falsos negativos.


Consiste en hematíes sensibilizados con IgG, que se añaden a los tubos con
resultado negativo (sin aglutinación). Dichos hematíes control sólo serán
aglutinados si el suero de Coombs está libre (lo que confirma la negatividad del
test). Si los tubos negativos no aglutinan con el suero Coombs-control, el test no
es fiable y hay que repetirlo.

Un test de Coombs positivo no indica necesariamente un acortamiento de la


supervivencia de los hematíes. Este acortamiento que aparece cuando existe
hemólisis se demuestra mediante el correspondiente estudio eritropatológico:
haptoglobina, recuento de reticulocitos, determinación de bilirrubina y LDH, etc.
El resultado de estas pruebas es lo que confirmará la existencia o no de
hemólisis.

PRUEBA DE COOMBS DIRECTO EN TARJETA

Las tarjetas son un moderno método de rutina utilizado actualmente en los


bancos de sangre para los estudios pretransfusionales.

El sistema está formado por tarjetas que llevan varias microcolumnas, que
constan de:

Una zona superior donde se depositan los hematíes con o sin los sueros o
antisueros (según la técnica), y en la que se originará la reacción de
aglutinación.
Una zona inferior que contiene un gel filtrante de dextrano (donde va el suero de
Coombs o los antisueros específicos, según la técnica), que durante la
centrifugación permitirá el paso de los hematíes libres, pero no el de los
aglutinados, que serán retenidos por su mayor tamaño. Cuanto mayor sean los
aglutinados, menos hematíes atravesarán el gel, lo que indica una mayor
intensidad de reacción, que se expresa en cruces.

Existen varios tipos de tarjetas:

a) Tarjetas que llevan un medio salino inerte con o sin enzimas (se utilizan
para estudio ABO, pruebas cruzadas en frío, etc) y
b) Tarjetas que llevan suero antiglobulina humano, también denominado de
Liss-Coombs (el medio tiene un potencial iónico bajo que facilita la
sensibilización), y que se utilizan para el Coombs directo, para pruebas
cruzadas en fase de Coombs indirecto, etc.

Material

• Tarjetas de Liss-Coombs.
• Diluyente 2 ó Liss.

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Procedimiento

• Se diluyen 10 µL del sedimento de la sangre del paciente


(anticoagulada con EDTA) en 1 mL del diluyente 2 y se mezcla.
• Coger 50 µL de la mezcla y echar en un microtubo.
• Incubar 2 minutos a temperatura ambiente.
• Centrifugar y leer.
• Si es positivo, montar la técnica con sueros monoespecíficos (anti-IgG,
anti-IgM, anti-IgA, anti-C3).

Interpretación

La misma que la de la técnica en tubo.

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ESTUDIO DE LA COMPATIBILIDAD
SANGUÍNEA:
PRUEBA CRUZADA MAYOR, FASES DE
LECTURA E INTERPRETACIÓN

INTRODUCCIÓN

La inmunohematología es la parte de la hematología que estudia los procesos


inmunitarios que tienen lugar en el organismo en relación con los elementos
sanguíneos. Uno de los aspectos más importantes comprende el estudio y la
cuantificación de los llamados grupos sanguíneos eritrocitarios (componentes
antigénicos presentes en la superficie de los eritrocitos) ya que están
relacionados directamente con la terapéutica transfusional y la prevención de
accidentes hemolíticos graves secundarios a ella.

Todas las pruebas pretransfusionales intentan detectar reacciones antígeno-


anticuerpo potenciales antes de que la sangre sea transfundida. Para descartar
incompatibilidades entre el donante y el receptor, las premisas generales son las
siguientes:

1. Asegurar la compatibilidad ABO. Pueden usarse concentrados de


hematíes ABO-compatibles si no se dispone de sangre ABO-específica.

2. Utilizar sangre del mismo grupo Rh0 (D), lo que es especialmente


importante en mujeres antes de la menopausia. En una gran emergencia
puede transfundirse sangre Rh0 (D) positiva a un paciente Rh0 (D)
negativo no sensibilizado, pero ésta es una decisión que debe tomar el
director médico y el clínico del banco de sangre, porque existe un 60-70
% de riesgo de formar anti-Rh0 (D). Puede darse inmunoglobulina anti
Rh0 (D), sobre todo si el paciente es una mujer en edad fértil. Cuando el
donante y el receptor pertenecen al mismo grupo ABO y RH0 (D), la
transfusión será compatible en el 98 % de los casos.

3. Para asegurar la compatibilidad del 2 % restante, son fundamentales:

a) El estudio de anticuerpos irregulares clínicamente importantes en el


suero del receptor.
b) La prueba de compatibilidad directa entre el suero del receptor y los
hematíes del donante.

No debe olvidarse que la identificación inequívoca de las muestras de sangre,


tanto del receptor como del componente o componentes a transfundir, es un
aspecto fundamental, dado que la mayor parte de las reacciones hemolíticas
tienen su origen en errores de identificación y/o de trascripción. Por ello, el banco

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TEMARIO DE T.E.L.

de sangre debe disponer de un sistema que garantice la identificación correcta


del paciente y el etiquetado correcto de la sangre que ha sido objeto de la
prueba cruzada.

La clasificación ABO, las pruebas Rh0 (D) y la detección de anticuerpos


irregulares se hacen con cada nueva muestra de paciente. No es posible confiar
en registros anteriores para esta información, aunque todos los resultados de
pruebas de laboratorio deben conservarse para poder comparar los actuales con
los anteriores. Cualquier discrepancia debe resolverse antes de entregar la
sangre al paciente.

Mientras las pruebas cruzadas se están realizando, aplicar a la unidad de sangre


un rótulo con los datos de identificación del posible receptor, y colocarla en la
zona del refrigerador reservada a “sangre de pruebas cruzadas”.

Las pruebas de compatibilidad se efectúan antes de transfundir la sangre, para


asegurarse de que los hematíes del donante son compatibles con el paciente.

Comprende las siguientes determinaciones:

1) Tipaje correcto del grupo ABO y Rh del receptor. El grupo sanguíneo y Rh


de una persona no cambian, pero siempre existe el peligro de
identificación incorrecta de las muestras sanguíneas.
2) Determinación de anticuerpos irregulares en el suero del receptor, para
poder administrar sangre solamente de aquellos donantes que carecen de
los antígenos específicos.
3) Tipaje correcto de los grupos ABO y Rh del donante.
4) Realización de un autocontrol de los hematíes del receptor. Si es positivo
(los hematíes autólogos en diluyente Liss muestran aglutinación), se
realiza un Coombs directo con los hematíes del receptor.
5) Pruebas cruzadas. Son el último estudio que se realiza en busca de
incompatibilidad entre la sangre del donante y del receptor. Aún cuando
no es posible efectuar un estudio completamente exhaustivo en busca de
incompatibilidad antes de cada transfusión, la prueba cruzada debe ser lo
más completa posible, a fin de proteger al paciente. Hay que tener en
cuenta que, excepto en las transfusiones entre gemelos univitelinos y en
las transfusiones autólogas, ninguna sangre puede ser 100 % compatible.

PRUEBA CRUZADA MAYOR

Las pruebas cruzadas son importantes, ya que confirman “in vitro” que la
transfusión prevista será bien tolerada y probablemente eficaz. Se distinguen:

a) Prueba cruzada mayor: Consiste en enfrentar suero del paciente con


hematíes del donante bajo condiciones óptimas para la actividad de los
anticuerpos en el laboratorio. Se realiza para demostrar la posible
existencia en el suero del paciente de anticuerpos hemolizantes, de

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TEMARIO DE T.E.L.

revestimiento (incompletos) y/o aglutinantes contra los hematíes del


donante.

b) Prueba cruzada menor: El suero del donante se enfrenta con los hematíes
del paciente. Debido al empleo generalizado de concentrados de
hematíes, esta prueba ya no se utiliza en muchos hospitales. Y aunque
toda unidad con investigación de anticuerpos irregulares positiva es
rechazada por el banco de sangre, puede ocurrir que posea anticuerpos a
bajo título o de baja incidencia no detectados por los reactivos habituales,
por lo que cuando se administre un gran volumen de plasma es
aconsejable la realización de esta prueba cruzada menor, para detectar la
posible existencia en el donante de estos anticuerpos contra los hematíes
del receptor.

Para la prueba cruzada debe utilizarse suero del receptor y no plasma, ya que la
mayoría de los anticoagulantes actúan quelando los iones calcio, lo que impide
la activación del complemento, por lo que algunos anticuerpos que fijan el
complemento no podrán ser detectados si se emplea sangre anticoagulada.

Además las muestras de sangre deben estar completamente coaguladas, pues


si no los restos de fibrina atrapan los hematíes del donante y la diferenciación
entre coágulos y aglutinados es difícil de establecer.

Para preparar la suspensión de hematíes del donante se debe usar sangre de


los segmentos herméticamente sellados derivados de la bolsa hemática (tubo
colector).

Los hematíes y el suero han de ser incubados durante el tiempo suficiente para
que puedan reaccionar incluso los anticuerpos muy poco potentes. En general,
sólo los anticuerpos reactivos a 37º C y/o en fase de antiglobulina serán
importantes desde el punto de vista clínico. Por ello es necesario añadir suero
antiglobulina después de la incubación, para detectar los anticuerpos que
recubren a los hematíes pero que no llegan a aglutinarlos. La prueba debe
comprobarse mediante controles.

Es muy importante para la sensibilidad de la prueba el cociente suero/células,


por lo que siempre que sea posible la proporción debe ser de 4 volúmenes de
suero por cada volumen de la suspensión de hematíes al 2-5 % en suero salino
isotónico.

La prueba cruzada mayor puede hacerse usando uno o dos tubos. Cuantos
menos tubos se usen en el procedimiento sanguíneo cruzado, menos son las
posibilidades de confusión y error. La prueba debe ser lo más sencilla posible
para evitar las equivocaciones.

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TEMARIO DE T.E.L.

Debe usarse en todo el banco de sangre una forma única de clasificación de los
resultados en grados, para facilitar su comparación. Un sistema comúnmente
utilizado es el siguiente:

4+ 1 agregado sólido
3+ Varios agregados grandes
2+ Agregados de tamaño mediano con fondo claro
1+ Agregados pequeños con fondo rojizo
W+ Agregados diminutos, con fondo rojizo turbio
0- Suspensión lisa sin agregados
H Hemólisis, que debe interpretarse como reacción positiva

También puede hacerse una “prueba cruzada titulada” empleando diluciones


dobles progresivas.

REALIZACIÓN

1. Colocar en un tubo de hemólisis rotulado 2 gotas de suero del


paciente y 1 gota de la suspensión salina al 5 % de los hematíes del
donante (Fig. 1).
2. Incubar a temperatura ambiente (22 - 24 ºC) durante 15 minutos.
Centrifugar a unas 1.500 r.p.m. durante 1 ó 2 minutos.

Fig. 1: Prueba cruzada mayor.

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3. Leer la reacción (fase salina) con ayuda de un espejo de aumento


iluminado, rotando suavemente las células del botón de hematíes, y
registrar los resultados en ese mismo momento (no confiar en la
memoria, pues aumenta las posibilidades de error).
4. Agregar 2 ó 3 gotas de albúmina bovina 20 -30 % al tubo anterior.
5. Incubar a 37º C durante 30 minutos. Centrifugar.
6. Leer (fase albuminosa) y registrar los resultados como en el punto 3.
7. Lavar 3 ó 4 veces los hematíes con solución salina isotónica y
después del último lavado decantar completamente.
8. Agregar 2 gotas de suero antiglobulina al tubo. Centrifugar.
9. Leer (fase de antiglobulina o fase de Coombs) y registrar los
resultados como en el punto 3. Si la prueba cruzada es negativa:
10. Agregar una gota de hematíes de control de Coombs a cada tubo
negativo. Centrifugar, leer y registrar.

Pueden aplicarse diversas modificaciones de la Prueba Indirecta de la


Antiglobulina para favorecer la detección de anticuerpos:

Hematíes tratados con enzimas: Los hematíes que se utilizan en la fase de


antiglobulina de las pruebas cruzadas pueden tratarse con enzimas proteolíticas
(papaína, ficina, bromelina o tripsina), que separan de la membrana del hematíe
las proteínas portadoras de ácido siálico, cargado negativamente. Por ejemplo,
la bromelina resulta útil como prueba cruzada “adicional” en el estudio de
receptores que han sufrido reacciones transfusionales. Esto favorece la
sensibilización y la aglutinación por algunos anticuerpos clínicamente
significativos (como Rhesus y Kidd). Algunos antígenos (como M, N, S y Duffy)
son destruidos por el tratamiento enzimático, por lo que sus anticuerpos no son
detectados.

El tratamiento enzimático también aumenta la reacción de algunos


autoanticuerpos de frío que clínicamente carecen de importancia, como el anti-I.
Solución salina de bajo potencial iónico (LISS): Cuando la técnica de la
antiglobulina se efectúa con los hematíes del donante suspendido en solución
salina normal, se necesita un tiempo de incubación de 30-60 minutos para lograr
un máximo de fijación de los anticuerpos a los antígenos de los hematíes. Si los
hematíes se suspenden en una solución LISS, el período de incubación puede
reducirse a 5-10 minutos.

Albúmina: La adición de albúmina a los hematíes suspendidos en medio salino


normal aumenta la tasa de sensibilización, permitiendo un tiempo de incubación
más corto.

Después de completar las pruebas sanguíneas cruzadas, si hay compatibilidad


consignarlo en el rótulo de la unidad y completar el registro de compatibilidad.
Este rótulo o etiqueta debe permanecer unido a la bolsa de sangre hasta
completar la transfusión.

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TEMARIO DE T.E.L.

INTERPRETACIÓN

La aglutinación indica que algún anticuerpo del suero del receptor se ha unido a
hematíes del donante, por lo que se dice que la prueba cruzada es incompatible.
La prueba cruzada es compatible si no existe aglutinación, pues indica que no
hay anticuerpos eritrocitarios en el suero del receptor. Como ya se ha indicado,
todas las pruebas de antiglobulina negativas deben ser comprobadas para
asegurar que la técnica se ha realizado correctamente. Si los resultados son
correctos, los hematíes del control de Coombs deben ser aglutinados; si esto no
ocurre, la prueba no es válida y debe repetirse.

Entre las causas de una prueba falsamente negativa están:

Olvidarse de añadir el suero antiglobulina humana.


Reactivo de antiglobulina carente de anticomplemento.
Lavado incorrecto de los hematíes reaccionantes (se dejan residuos de proteínas
plasmáticas humanas que neutralizan el suero antiglobulina, invalidándolo).
Uso de suero viejo. La muestra empleada no debe tener más de 48 horas,
conservada en refrigeración.
Uso de una suspensión celular densa (debe ser del 2-4 %).
Centrífugas mal calibradas.
Incubador a temperatura inapropiada.

Investigación
de anticuerpos Prueba Causa de la aglutinación Compatible para la
irregulares cruzada transfusión

*El Ac reacciona con algún Posiblemente (fenotipar los


+ _ Ag de los hematíes reactivo, hematíes del donante para
pero no reacciona con los confirmar la compatibilidad)
hematíes del donante

*El Ac reacciona con un Ag


_ + de baja incidencia
*Los hematíes del donante No
son Coombs directo positivo
*Error de técnica→ repetir

*El Ac reacciona con algún


+ + Ag de los hematíes del No
donante y de los hematíes
reactivo

_ _ *No se detecta Ac Sí

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TEMARIO DE T.E.L.

Los anticuerpos solamente serán detectados mediante la prueba cruzada si los


hematíes del donante poseen el antígeno correspondiente. Para asegurar la
detección de todos los anticuerpos clínicamente significativos, el suero del
paciente se incuba con 2 ó 3 muestras seleccionadas de sangre del grupo 0, que
expresen los antígenos más corrientes de los principales sistemas de grupos
sanguíneos. Esto se denomina investigación de anticuerpos irregulares.

La aglutinación de alguna de las muestras de hematíes reactivo empleadas


significa la presencia de un anticuerpo específico. Dicho anticuerpo puede
identificarse enfrentando el suero del receptor con un panel de hematíes
fenotipados (el mismo procedimiento que se utiliza en la prueba cruzada, pero
sustituyendo los hematíes del donante por hematíes del grupo 0 extensamente
fenotipados). Los anticuerpos dirigidos contra antígenos de baja frecuencia que
no están en los hematíes reactivo, no serán detectados. Si los hematíes del
donante en potencia poseen dicho antígeno de baja frecuencia, la
incompatibilidad sería detectada en la prueba cruzada.

OBSERVACIONES GENERALES SOBRE LAS PRUEBAS CRUZADAS:

Un factor que puede confundir las pruebas cruzadas es el fenómeno “rouleaux”,


donde los hematíes aparecen formando como pilas de monedas. Para
comprobar que no se trata de una aglutinación, se usa la técnica del reemplazo
salino:

1. Después de incubación y resuspensión, volver a centrifugar la mezcla


suero-células y remover el suero.
2. Reemplazar el suero con 2 gotas de solución salina y mezclar.
3. Centrifugar la mezcla de células salinas.
4. Volver a suspender la mezcla de células salinas y observar la
aglutinación. Los rouleaux se dispersan pero la verdadera aglutinación
permanece.

Una prueba cruzada negativa no asegura una supervivencia normal de los


eritrocitos después de transfundir la unidad. Los pacientes pueden tener
anticuerpos muy débiles (concentración menor del nivel de detección) en el
momento de la prueba cruzada, pero al transfundir, el antígeno específico queda
expuesto al sistema inmune, y a menudo el anticuerpo reaparece con título y
avidez mayores (respuesta inmune secundaria), y la supervivencia de los
glóbulos rojos se acorta después de la transfusión.

Cada vez que un paciente es transfundido existe la posibilidad de que esos


hematíes produzcan una estimulación secundaria. Por ello, tras 24 horas de la
transfusión, si se precisa otra, se debe extraer una nueva muestra de sangre del
receptor y realizar una nueva prueba cruzada. Con esto se podrá poner en
evidencia cualquier anticuerpo recién adquirido, a la vez que se asegura la
presencia de complemento en la prueba cruzada (los niveles de complemento en
suero viejo son muy bajos, por lo que las reacciones Ag-Ac que fijen el

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TEMARIO DE T.E.L.

complemento no podrán ponerse de manifiesto, y esa incompatibilidad no será


detectada).

Como medida de precaución, se deben conservar en el refrigerador muestras del


donante y del receptor al menos hasta 4 días después de la transfusión.

Las pruebas realizadas en fase salina a temperatura ambiente son capaces de


descubrir varios tipos de incompatibilidades en el sistema ABO, anticuerpos anti-
P, anti-MNSs, anti-Lewis y algunos otros anticuerpos aglutinantes fríos.

Las pruebas realizadas en fase albuminosa a 37 ºC se realizan tras la de


temperatura ambiente si ésta ha sido negativa. Estas pruebas permiten evitar “in
vivo” reacciones debidas a anticuerpos aglutinantes de los sistemas Rhesus y
Lewis fundamentalmente.

Las pruebas en fase de antiglobulina detectan anticuerpos de clase IgG, es


decir, inmunoglobulinas no aglutinantes. Esta prueba detecta prácticamente la
totalidad de anticuerpos Rhesus y algunos otros anticuerpos dirigidos contra
antígenos de los sistemas Duffy, Kell y Kidd.

La responsabilidad final de la calidad de la sangre que se transfunde recae en la


persona que efectúe la prueba cruzada. Por ello es muy importante recordar:

Leer cuidadosamente las etiquetas.

No utilizar nunca muestras contaminadas o de fechas atrasadas.

Examinar siempre la unidad de sangre que se va a transfundir, para descartar la


presencia de coágulos, ictericia, turbidez anormal y hemólisis (cualquiera de
estas situaciones es causa de rechazo de la bolsa hemática, por lo que no podrá
transfundirse).

Indicar el nombre del receptor en la etiqueta, de modo que pueda leerse sin
confusión.

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TEMA 11. DIAGNÓSTICO


SEROLÓGICO. PRINCIPIOS,
TÉCNICAS Y UTILIDAD.

INTRODUCCION

Inmunología es la rama de la ciencia que estudia la inmunidad. Esta se


considera como la resistencia del organismo a las agresiones que pueda sufrir,
sean de microorganismos, venenos, etc.

El hombre, como cualquier otro animal, posee unos sistemas que ante la
invasión de sustancias extrañas al organismo, generalmente microorganismos,
las reconoce y posteriormente las destruye.

Los animales vertebrados tienen dos grandes tipos de sistemas que confieren la
resistencia o el estado de inmunidad frente a los agentes patógenos:

A) Uno, del que forman parte elementos celulares como fagocitos


(macrófagos), células NK (natural killer o asesinas naturales), factores humorales
bactericidas o bacteriostáticos (lisozima, PCR, complemento, interferón).

• Este sistema es natural, es decir, sus componentes están siempre


presentes y dispuestos para actuar inmediatamente sin requerir
ningún fenómeno que induzca su generación.
• Carece de especificidad, es decir actúan sobre gran variedad de
microorganismos sin que posean un mecanismo de reconocimiento
que les permita distinguir selectivamente unos de otros.
• Tampoco presenta memoria, es decir que no aumentan su eficacia
al responder al mismo microorganismo en un segundo contacto
con él.

B) El segundo sistema inmunitario es mas complejo y eficaz. Son


responsables de este sistema los linfocitos y los anticuerpos. Aquellos se unen a
las sustancias extrañas (Antígenos) provocando su destrucción. Asimismo
producen unas sustancias, llamadas anticuerpos, que también se unen a las
sustancias extrañas provocando una serie de reacciones tendentes a eliminar el
antígeno del organismo.

• Este segundo sistema tiene la capacidad de memoria. Es decir que en un


futuro contacto con el mismo antígeno, se repite el mismo proceso
inmunitario pero con mayor intensidad y en un tiempo mucho más corto.

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TEMARIO DE T.E.L.

• También es específico, es decir, las células y las sustancias (Ac.) que


forman parte de él, reconocen a las sustancias extrañas (antígenos)
actuando sobre ellas. Es decir tienen receptores específicos por cada uno
de los antígenos que puedan existir.
• Finalmente, y al contrario que el primer sistema, los anticuerpos necesitan
un estímulo antigénico para que se produzcan en el organismo.

Los dos sistemas el innato y el adaptativo no actúan separadamente sino que


interaccionan ayudándose uno a otro

REACCION ANTIGENO - ANTICUERPO

Las técnicas inmunológicas se basan, casi todas, en las reacciones Ag.-Ac. y


enlas manifestaciones que de dicha reacción se derivan.

Definiremos los conceptos de antígeno y anticuerpo.

ANTÍGENO:

Es una sustancia extraña al organismo capaz de inducir una respuesta


inmunitaria, es decir, capaz de provocar la aparición de anticuerpos o de células
que actúan sobre ella.

En la superficie del antígeno existen unas estructuras, trozos o fragmentos


moleculares, que son las que verdaderamente van a reaccionar con el
anticuerpo y con las células que las van a atacar. Estos fragmentos se llaman
determinantes antigénicos o epítopos. Un Ag. es más inmunogénico cuanto
mayor número de determinantes antigénicos posea.

Puede haber en un Ag. varios determinantes antigénicos del mismo tipo o


diferentes. Pueden reaccionar todos con el Ac. o Acs. o no.

El nº de determinantes antigénicos presentes en un Ag. es la valencia total del


antigeno. El nº de moléculas de Ac. que se pueden unir al mismo tiempo con el
Ag., o lo que es lo mismo, el nº de determinantes antigénicos expuestos, es la
valencia efectiva o funcional del antígeno.

La composición química del Ag. puede ser variada. En general son proteínas,
aunque también pueden ser lípidos o glúcidos, pero tienen menor poder
antigénico o inmunogénico.

Los antígenos particulados, como virus, bacterias o hematíes extraños, son


altamente inmunogénicos.

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A) FACTORES QUE AFECTAN LA ANTIGENICIDAD:

Naturaleza química: Dependiendo de si son proteinas, hidratos de carbono o


lípidos, son mas o menos antigénicos.

Tamaño: Cuanto mayor sea la molécula de antígeno mas poder inmunogénico


tendrá. Ejemplo, si el Ag. tiene 25 aminoácidos será mas inmunogénico que si
tiene 6.

Complejidad: Cuanto mas complejo sea el antígeno mayor poder


inmunogénico. Ej., Si el Ag. está formado por cadenas polipeptídicas de un sólo
aminoácido, será menos inmunogénico que las de varios aminoácidos
diferentes.

Conformación: La configuración espacial (tridimensional), es decir, la estructura


3º de las moléculas influyen en su antigenicidad. Ej. Ags. que químicamente son
iguales tienen diferente poder antigénico cuando varía la situación espacial de
algunos determinantes antigénicos.

Accesibilidad: Cuanto mas soluble es un Ag. mas poder antigénico tendrá, ya


que será mas accesible a todas las partes del organismo.

Concepto de extraño: Generalmente las sustancias extrañas son las que


provocan respuestas inmunes. Serán mas inmunogénicas las sustancias mas
distantes, evolutivamente hablando, entre el Ag. y el huesped. Ej., si la albúmina
de un ratón se inyecta a un hombre tendrá más poder inmunogénico que si
inyectamos la albúmina de un primate.

Genética: La respuesta inmune está bajo control genético. Ej., a ratones se le


inyecta un Ag., y responden fuertemente, a otros ratones, con otra base
genética, al inyectarle ese mismo Ag. no responden de la misma forma o no
responden.

Modo de administrar los antígenos: El hecho de que un Ag. induzca una


respuesta inmunitaria depende de la dosis y de la forma de administración.

B) HAPTENOS:

Hay sustancias de estructura química muy simple que son capaces de unirse a
los Acs., una vez formados estos, ya que por si mismas son incapaces de
provocar su formación. Son los llamados HAPTENOS.

Para que sean inmunogénicas (que provoquen la producción de Acs.) hay que
unirlas a otras sustancias más complejas, generalmente proteínas. Estas
sustancias se denominan transportadores o "carrier".

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TEMARIO DE T.E.L.

ANTICUERPOS:

Son moléculas sintetizadas por los linfocitos B, en respuesta a un estímulo


antigénico, que tienen la propiedad de unirse específicamente al Ag. que indujo
su formación.

Son proteínas de peso molecular elevado a las que se les llama


Inmunoglobulinas (Ig.), ya que migran en la electroforesis a la fracción
globulínica.

Existen 5 tipos de Igs.: Ig. G, Ig. A, Ig. M, Ig. D, Ig. E. Dentro de estos tipos
existen una gran variedad de subtipos, clases, subclases etc. Difieren según su
carga, tamaño, composición de aminoácidos, contenido en carbohidratos,
enlaces entre cadenas, etc.

Dado que un animal puede fabricar Acs. específicos contra todas las moléculas
que existen en la naturaleza, el nº de Acs. específicos que puedan hallarse en un
momento dado puede ser del orden de varios millones.

Los Acs. pueden encontrarse libres y circulante por el plasma, pero algunos,
como las Ig.E se encuentran asociadas a células.

Normalmente el organismo no desarrola Acs. contra sus propios componentes.


Cuando lo hace estamos ante una enfermedad autoinmune.

Cuando un Ac. entra en contacto con un Ag. contra el que está dirigido, ambos
se unen formándose un complejo Ag-Ac o complejo inmune o inmunocomplejo.
Esta unión es reversible y su permanencia depende del grado de adaptación
entre ambas moléculas y de la fuerza y estabilidad de los enlaces que las unen.

Una característica de la reacción Ag.-Ac. es la especificidad. Cuando un Ac. solo


es capaz de reaccionar contra un Ag., se dice que ese Ac. es muy específico. La
reacción Ag.-Ac. puede mostrar un alto grado de especificidad distinguiendo
pequeñas variaciones de la estructura del Ag., carga, configuración óptica,
conformación espacial, etc.

METODOS SEROLOGICOS

Se llaman así porque el suero sanguíneo es el vehículo habitual de los Acs.


Estos métodos están basados generalmente en la reacción Ag.-Ac. Otros
métodos se basan en el aislamiento de las diferentes poblaciones linfocitarias.

Son muy útiles ya que podemos estudiar un Ag. disponiendo de su Ac.


correspondiente o viceversa.

Las pruebas serológicas se caracterizan por su:

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A) Especificidad: Es la capacidad que presenta la prueba de distinguir entre


Ags. o Acs. (depende de lo que busquemos) de estructura muy similar.

B) Sensibilidad: Es la cantidad de Ag. o Ac. (depende de lo que busquemos)


que es capaz de detectar.

Fines de las pruebas serológicas:

A) Cualitativos: Cuando sólo se persigue conocer si en una muestra existe o no


Ag. o Ac., no nos interesa la cantidad.

B) Cuantitativos: Cuando pretendemos saber la cantidad de Ag. o Ac. presente


en la muestra. Lo podemos saber:

• Semicuantitativamente: Se logra saber de manera aproximada la


cantidad de Ag. o Ac. presente en la muestra. Esto se consigue mediante
el título de Ac.: La inversa de la máxima dilución de la muestra que
enfrentada a una cantidad standard del Ag. sigue manifestando
positividad.
• De una manera exacta: o cuantitativas propiamente dichas, en los que el
resultado se expresa de una manera exacta. Se dará en mg, ml, ìg, ìl.
etc.

INMUNOANALISIS CON MARCADORES

Se basan en utilizar moléculas indicadoras unidas al Anticuerpo o al Antígeno


con el fin de demostrar que ha tenido lugar la reacción Ag- Ac., es decir
demostrar la existencia del Ag. o el Ac. buscado.

Estas pruebas se caracterizan por:

• Utilizar cantidades pequeñas de reactivos, se decir son


microtécnicas.
• Ser muy rápidas en ofrecer los resultados (desde minutos a horas,
generalmente menos de 24 horas.
• Poseen una máxima sensibilidad, es decir detectan cantidades
muy pequeñas de Ac. o Ag.
• Son automatizables.

Se clasifican según las moléculas indicadoras utilizadas:

• ENZIMOINMUNOANALISIS ( E.L.I.S.A. o E.I.A.): Se usa una enzima.


• INMUNOFLUORESCENCIA (I.F.): Se usa un fluorocromo (colorante
fluorescente)
• RADIOINMUNOANALISIS (R.I.A.): Se usa un isótopo radioactivo.

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INMUNOFLUORESCENCIA (I.F.)

Son pruebas que utilizan sustancias fluorescentes (fluorocromos) unidas al Ac o


al Ag. para demostrar que ha tenido lugar la reacción Ag.- Ac., es decir para
demostrar que existe el Ac. o el Ag. buscado.

Los fluorocromos son sustancias que sometidas a una fuente luminosa absorben
luz a una determinada longitud de onda y emiten luz a una longitud de onda
mayor. Absorben luz ultravioleta y emiten fluorescencia (luz visible).

Los fluorocromos usados habitualmente son:

• Fluoresceína: emiten fluorescencia de color verde.


• Rodamina: " " " " anaranjada.

Para detectar la fluorescencia emitida se usarán:

• Microscopio de fluorescencia.
• Fluorímetros.

TIPOS DE REACCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA:

A) INMUNOFLUORESCENCIA DIRECTA:

Se utiliza para la detección de Antígenos con ayuda de un Ac. marcado. Se usa


para identificar microrganismos en un material clínico (líquidos, tejidos, etc.).

Fases:

1.- Fijación de la muestra (Ag.) en un portaobjetos.


2.- Se cubre la preparación con el Ac. específico marcado.
3.- Se lava para eliminar el exceso de Ac: fluorescente.
4.- Se observa al microscopio de fluorescencia.

La observación de microorganismos fluorescentes indica que se ha producido la


reacción Ag.- Ac.

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Es una técnica rápida, pero su uso está limitado por la necesidad de disponer de
un Ac. específico marcado por cada Ag. que queramos detectar.

Se usa esta técnica en la detección de diferentes gérmenes en las muestras


biológicas. Ejemplo para el bacilo de Koch.

B) INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA:

Se utiliza para la identificación de Ac. libres presentes en el suero.

Fases:

1. 1. Fijamos en una fase sólida (portaobjetos) Ags. específicos de los


Acs. que buscamos.(Estos portaobjetos se obtienen en el mercado
con sus correspondientes Ags.)
2. Se añade la muestra problema (Ac buscado).
3. Se añade Antisuero marcado (Antiglobulina marcada) uniéndose
de esta forma con el Ac. de la muestra causando la fluorescencia
del Ag.

Este método es mas sensible que el anterior y además tiene la ventaja de que
para la investigación de Acs. en suero humano solo requiere un Ac. marcado, la
antiglobulina marcada. Tiene muchísimas aplicaciones. Ejemplo, para detectar
Acs. contra los toxoplasmas, contra el virus de Epstein-Barr (mononucleosis
infecciosa),para el diagnóstico de la sífilis, etc.

C) MÉTODO SANDWICH:

Se usa para detectar Acs. unidos a células.

Fases:

1.- Se fija el material clínico en un portaobjetos.

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2.- Se añade el Ag. específico del Ac. buscado.


3.- Se añade un Ac., igual al buscado, pero marcado.
4.- Observación al microscopio de fluorescencia.

Este último método, al igual que otro que usa el complemento, no se usa
frecuentemente.

ENZIMOINMUNOANALISIS (ELISA)

Son pruebas que se basan en la detección de la reacción Ag.-Ac. mediante el


empleo de Ags. o Acs. marcados con una enzima. La presencia de la enzima en
el inmunocomplejo es detectada por una reacción coloreada que se produce al
añadir un sustrato.

Una sola molécula de enzima puede convertir millones de moléculas de sustrato


en moléculas de producto. De ahí la alta sensibilidad de este procedimiento.

Las enzimas usadas habitualmente como marcadoras son: peroxidasa, glucosa


oxidasa, fosfatasa, etc.

La medición de los cambios de color, como resultado de la conversión


enzimática del sustrato a producto, se lleva a cabo habitualmente mediante un
espectrofotómetro. Actualmente, al ser casi todas las técnicas automatizadas, se
utilizan lectores de placas que llevarán un espectrofotómetro incorporado.

Se pueden dividir los ensayos de ELISA en:

* ELISA homogéneos, en los que la interacción antígeno-anticuerpo modula la


actividad de la enzima por lo que no hay que separar los componentes marcados
enzimáticamente de los no marcados.

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* ELISA heterogéneos, en los que la reacción antígeno-anticuerpo no modifica la


actividad del marcador enzimático. Estos métodos requieren la separación física
del inmunocomplejo Ag.-Ac. de los constituyentes no fijados. Son los más
usados

Aunque se pueden hacer estas pruebas en fase líquida casi siempre se harán en
fase sólida, es decir se utilizará un soporte para fijar el Ac. o el Ag. Los soportes
pueden ser placas de microtiter, tubos de plástico, perlas de vidrio, etc.

TIPOS DE REACCIONES DE ELISA EN FASE SÓLIDA:

I) METODOS PARA DETECTAR ANTIGENOS:

A) MÉTODO SANDWICH:

Sirve para detectar Ags. grandes ( virus de la hepatitis, gonococo ...). Tienen que
ser polivalentes ya que se tienen que unir a dos moléculas de Ac.

Habrá varias etapas:

1. Se fija el Ac. específico del Ag. buscado en un soporte.


2. Se añade la muestra problema (con o sin el Ag. buscado).
3. Se añade el Ac. específico del Ag. buscado pero marcado con una
enzima.
4. Se añade un sustrato incoloro, específico de la enzima empleada,
y se mide el cambio de color producido al transformarse el sustrato
en producto.

La intensidad del color medido será directamente proporcional a la cantidad de


Ag. que haya en la muestra.

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Los resultados se compararán con soluciones patrones.

B) MÉTODO DE UNIÓN COMPETITIVA:

Se utiliza para detectar drogas, hormonas, etc, en líquidos biológicos.

Etapas:

1. Se fija el Ac. específico del Ag. buscado a un soporte:


2. Se añade una mezcla que contiene la muestra problema (Ag.
buscado) y una solución con Ag.( igual al que queremos estudiar)
marcado con una enzima
3. Se mide la cantidad de Ag. marcado que se ha fijado al Ac. unido
al soporte, mediante la adición de un sustrato:

La concentración del Ag. problema será inversamente proporcional a la


intensidad del color medido.

Se compararán los resultados con soluciones patrones.

II) METODOS PARA DETECTAR ANTICUERPOS:

A) MÉTODO INDIRECTO:

Etapas:

1. Fijamos a un soporte el Ag. específico del Ac. que buscamos.


2. Se añade la muestra problema( tendrá o no el Ac. buscado).
3. Se añade la antiglobulina marcada con una enzima.
4. Se mide el cambio de color producido al añadir un sustrato incoloro.

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La intensidad del color medido será directamente proporcional a la cantidad de


Ac. presente en la muestra. Los resultados se compararán con soluciones
patrones.

Es la técnica de mayor aplicación para detectar Acs. por su elevada sensibilidad


y especificidad, a la vez que por su posibilidad de automatización. Se utiliza, por
ejemplo, para diagnosticar la rubéola, SIDA, citomegalovirus, etc.

B) MÉTODO SANDWICH:

Etapas:

1.- Se fija al soporte una antiglobulina del Ac que buscamos.


2.- Se añade la muestra problema (con o sin el Ac que buscamos).
3.- Se añade un Ag. específico del Ac. que buscamos.
4.- Se añade un Ac., igual al buscado pero marcado con una enzima.
5.- Se mide el cambio de color al añadir un sustrato incoloro.

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La intensidad del color medido será directamente proporcional a la cantidad de


Ac. presente en la muestra.

Se compara los resultados con soluciones patrones.

C) MÉTODO DE UNIÓN COMPETITIVA:

Se usan sobre todo para detectar Ac del tipo Ig.M.

Etapas:
1. Se fija a un soporte el Ag. específico del Ac. que buscamos.
2. Se añade el suero problema (con el Ac. buscado) mezclado con
Ac. (igual al buscado) marcado con enzima:

3. Se mide la cantidad de Ac. marcado que se ha fijado al Ag.,


midiendo la cantidad de color que se forma cuando se añade un
sustrato incoloro.

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La concentración de Ac. en la muestra será inversamente proporcional al color


medido por el espectrofotómetro.

Se compararán los resultados con soluciones patrones.

RADIOINMUNOENSAYO (R.I.A.)

Son pruebas que detectan el complejo Ag. - Ac. formado mediante el marcaje
con isótopos radiactivos del Ag. o del Ac.

Los isótopos radiactivos usados habitualmente son:

- Carbono 14 (14C), Fósforo 32 (32P), Tritio (3H). Emiten radiación â.


- Iodo 125 (125I), Iodo 131 (131I), Cobalto 57 (57Co). Emiten radiación ã.

Los aparatos detectores de la reacción son los contadores de centelleo de rayos


ã o â, según el radioisótopo usado como marcador. Estos aparatos miden la
radiactividad.

Aunque son las pruebas más sensibles, presentan una serie de desventajas:

o Hay que manipular radioisótopos, con el peligro que esto


conlleva.
o Hay que tener una serie de normas de seguridad muy
estrictas. No todos los laboratorios pueden aplicarlas..
o El instrumental que hay que utilizar es complicado y caro.
o La vida media de los isótopos usados habitualmente es muy
corta, en comparación a la de las enzimas. 57Co: 271,3 días,
125
I: 60 días.

Hay métodos en los que se inmoviliza el Ag. o el Ac. en una fase sólida y otros
en los que no (fase líquida). Los más utilizados son los primeros.

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Los métodos del RIA son los mismos del ELISA, los que mas se utilizan son los
de unión competitiva.

REACCIONES DE PRECIPITACION.

Son unos métodos serológicos que se basan en detectar la reacción Ag.-Ac. por
la formación de un precipitado visible y reversible. Es decir, si existe el Ag. o el
Ac. buscado se produce la unión del Ag. con el Ac. y como consecuencia de esta
unión se forma el precipitado.

Es un efecto "in vitro" de la reacción Ag.-Ac., es decir solo se produce en el


laboratorio para poner de manifiesto la reacción Ag.-Ac. Para que se produzca la
reacción de precipitación es necesario que los Ags. y los Acs. sean
multivalentes, ya que se tiene que formar una malla o red que finalmente
precipita. Habrá unos Acs. que precipiten mejor que otros.

El Ag. tiene que ser soluble, no particulado, por lo que se tendrá que formar una
gran red antes de que el precipitado sea visible, requiriendo esto una gran
cantidad de anticuerpos. Es pues una reacción poco sensible. Sin embargo es
una prueba muy específica.

Si a una solución con exceso de Acs. le vamos añadiendo concentraciones


crecientes de Ag., y se representa el porcentaje de precipitación frente a la
cantidad de Ag., se obtiene la curva siguiente:

Vemos que existen 3 zonas bien diferenciadas:

1. Prozona (Exceso de Ac.): Inicialmente no se forma precipitado. Se forman


uniones Ag.-Ac. pero son altamente solubles debido al exceso de Acs.
Cada molécula de Ag. está saturada de Acs. La formación de precipitado
aumenta conforme aumenta la concentración de Ag.

2. Zona de equivalencia: Es la zona de máxima precipitación. Cada Ag. está


ligado a un Ac., que a su vez está ligado por su otra(s) valencia(s) a otro
Ag. formándose de esta forma una gran red que precipita.

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3. Postzona (Exceso de Ag.): La adición continuada de Ag. da como


resultado la solubilización del precipitado debido a la formación de
pequeños complejos con exceso de Ag. Cada molécula de Ac. está
saturada de Ag., se une con varias moléculas de Ag., tantas como
valencia tenga el Ac.; por tanto no se puede formar la malla necesaria
para que se produzca la precipitación.

Para una mejor cuantificación del Ac. o Ag. es conveniente que la zona de
equivalencia sea lo mas estrecha posible. Esto se conseguirá utilizando Ags.
fácilmente solubles, así como que la muestra no tenga una mezcla excesiva de
Acs. similares, ya que si no se producen diferentes uniones Ag.-Ac.
ensanchando la zona de equivalencia.

Aparte de la relación de proporción Ag.-Ac., existen otros factores que pueden


afectar la precipitación:

- Especificidad y afinidad del Ac.


- pH y la fuerza iónica del buffer en el que se desarrolle la reacción.
- temperatura a que se incube la reacción.
- peso molecular de los reactantes.

TIPOS DE REACCIONES DE PRECIPITACION:

Las reacciones de precipitación se pueden realizar en un medio sólido o en


medio líquido. Atendiendo a este criterio las vamos a clasificar.

PRECIPITACION EN MEDIO LÍQUIDO:

A) PRUEBA DEL ANILLO:

La mezcla de un Ag. soluble y su Ac. correspondiente en un tubo da lugar a un


precipitado visible unicamente si la proporción de Ag. y Ac. son las apropiadas.

Se puede hacer la prueba de una manera cualitativa o cuantitativa.

Cualitativa: Nos permite identificar un Ag. disponiendo de su Ac. específico, y


viceversa. Las etapas de la reacción son:

1.- Colocar el Ac. en el fondo del tubo

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2.- Añadir el Ag. problema


3.- Reacción de precipitación

En caso de que exista el Ag. problema se


formará, en la interfase de ambos
líquidos, un disco de precipitado de color
blanquecino.

Esta reacción se usa para detectar la


PCR, identificación de los grupos de
Lancefield de los Streptococcus.

La prueba cuantitativa se hace de la misma forma pero utilizando varios tubos


con Ac y añadiendo a ellos cantidades crecientes de Ag. Se mide la cantidad de
precipitado que se forma en cada tubo. Los resultados se llevan a una gráfica,
como la anterior. En el tubo donde aparezca más cantidad de precipitado se
cuantifica el Ag. problema, tubo que corresponde, en la gráfica a la zona de
equivalencia.

PRECIPITACION EN MEDIO SÓLIDO:

Los Ags. y los Acs. pueden incorporarse a un medio gelificado (sólido) donde
podrán difundir. En el lugar donde se encuentren en sus proporciones óptimas
aparecerá una línea de precipitado.

Se utiliza, fundamentalmente, para el estudio de Ags, disponiendo de Acs


adecuados. Cada unión Ag.- Ac. da una línea de precipitado diferente e
independiente.

Se pueden hacer las pruebas de una manera cualitativa o cuantitativa. Las más
importantes son:

A) INMUNODIFUSIÓN SIMPLE EN TUBO (MÉTODO DE OUDIN):

1. El Ac., específico del Ag. que buscamos, se incorpora al agar fundido a 45ºC.
Se introduce en tubos de pequeño diámetro
donde solidifica.

2. Se deposita encima una solución adecuada


del Ag..

3. El Ag. difunde a traves del agar encontrandose


con el Ac., que está repartido por todo el medio.
En la zona donde el Ag. y el Ac. se encuentren
en las proporciones adecuadas aparecerá una
línea de precipitado.

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Es una prueba cualitativa.

B) INMUNODIFUSIÓN RADIAL SIMPLE (MÉTODO DE MANCINI):

Es una prueba cuantitativa. Las etapas son:

1. Se incorpora el Ac., específico del Ag. que buscamos, al agar


fundido, que se deposita en placas de Petri o en láminas de vidrio.
Una vez solidificado, se realiza sobre el agar diferentes pocillos.

2. Se añaden a los pocillos el Ag. a determinar. Se añadirán varios


Standard y las muestras problemas. El Ag. difundirá por el medio

sólido.
3. Donde se encuentren el Ac. (que está repartido por todo el medio)
y el Ag. en las proporciones adecuadas se producirá una línea de
precipitado circular (anillo de precipitado).

El diámetro del anillo, su cuadrado, será


proporcional a la cantidad de Ag. presente
en cada pocillo.

Se hará una curva de referencia con los


Standards. En el eje de abcisa pondremos
el cuadrado del diámetro de los anillos, y
en el eje de ordenadas la concentración
del Ag. Una vez hecha la curva se calcula
la concentración de Ag. de la muestra problema.

Se usa para cuantificar las diferentes proteínas plasmáticas.

C) INMUNODIFUSIÓN RADIAL DOBLE (MÉTODO DE OUCHTERLONY):

Este método cualitativo se realiza tambien en placa, pero a diferencia del


anterior, donde solo se desplazaba el Ag., se desplazan tanto el Ag. como el Ac.
en el medio soporte (agar).

1. Añadir a una placa o lámina de vidrio una capa de agar virgen fundido.

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Una vez solidificado se le hacen 2 pocillos adecuadamente separados,


uno para el Ac. y otro para elAg.
2. El Ag. y el Ac. difunden radialmente en el seno del agar. Donde se
encuentren en las proporciones adecuadas se formará una línea de
precipitado.

La precipitación se produce en el punto de equivalencia Ag.- Ac.

La posición y forma de la línea de precipitado están dictadas por la


concentración y el ta-maño del Ag. y del Ac.. La línea estará mas cerca del
pocillo con el reactante de menor concentración, ya que la distancia recorrida es
directamente proporcional a la concentración. Se suele utilizar para la detección
de infecciones por Candidas y Aspergillus.

D) ELECTROINMUNODIFUSIÓN SIMPLE O INMUNOELECTROFORESIS EN


COHETE (ROCKET):

Este método se basa en la aplicación de la


corriente eléctrica a la inmunodifusión simple,
obteniéndose resultados que también se
pueden cuantificar.

Un medio gelificado que contenga Acs. se


introduce en un campo eléctrico, perpendi-
cularmente al sentido de la corriente eléctrica
se disponen pocillos que contienen las
muestras problemas y los Standards. La
difusión electroforética del Ag. a través del gel que contiene el Ac. permite la
aparición de líneas de precipitado en forma de conos o cohetes.

La distancia entre el pocillo y la punta del cono (altura del cohete) esm
directamente proporcional al logaritmo de la concentración de Ag. que haya en la
muestra.

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E) ELECTROINMUNODIFUSIÓN DOBLE

El Ac. y el Ag. se colocan en pocillos próximos, como en una inmunodifusión


doble. A continuación se aplica una
corriente eléctrica de tal forma que el Ag.
vaya a encontrarse con el Ac.

Si se utiliza un pH óptimo (8) y un bajo


voltaje permite que el Ac se desplace
linealmente hacia el cátodo arrastrado por
la fuerza endosmótica, en una dirección
contraria a la corriente eléctrica,
encontrándose con el Ag. que migra hacia
el ánodo arrastrado por la fuerza eléctrica.
En la zona donde el Ag. y el Ac. se encuentren en las proporciones optimas se
formará una línea de precipitado.

Es un método cualitativo muy rápido y más sensible que la inmunodifusión radial


doble.

F) INMUNOELECTROFORESIS:

Es un procedimiento que se utiliza para identificar diferentes Ags. de una


muestra.

Esta técnica consta de 2 fases:

1º.- Electroforesis: Separación de los diferentes componentes (Ags.) de una


muestra a estudiar, por su migración diferencial cuando se somete la muestra a
un campo eléctrico. La diferente velocidad de migración dependerá de la carga
de la partícula, pH del tampón, fuerza iónica del tampón, tamaño y forma de la
partícula y el potencial del campo eléctrico aplicado.

2º.- Inmunodifusión: Los Ags separados se enfrentarán a sus Acs. específicos en


el mismo medio soporte donde se han separado. Difundirán ambos; donde se
encuentren en las proporciones optimas, se formarán tantas líneas de
precipitado como uniones Ag.-Ac. haya.

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Pasos a seguir:

1. Colocar la muestra en un medio soporte


y separarla electroforéticamente.
2. Colocar los Acs., específicos de los Ags.
buscados, paralelamente al eje de
migra-ción de los Ags.
3. Difusión de los Ags. y los Acs. Donde se
encuentren en las proporciones óptimas
se formarán las líneas de precipitado,
que revelarán la presencia de los Ags
buscados.

Se usa esta técnica, sobre todo, para


identificar anomalías cualitativas de
proteínas específicas o para analizar la
composición de una mezcla de proteínas en líquidos biológicos.

G) INMUNOELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL:

Este método se utiliza como técnica de investigación para la separación analítica


de Ags. estrechamente relacionados, con propiedades electroforéticas afines
(variantes genéticas de algunas proteínas, heterogeneidad del factor VIII de
coagulación etc.).
Este procedimiento se realiza en 2 etapas y en ambas se emplea la
electroforesis.

1. La mezcla de Ags., normalmente suero, orina, LCR, se somete a


electroforesis en agarosa para separar sus componentes según su
carga.

2. La tira de agarosa que contiene las proteínas separadas se transfiere a


una placa de soporte mayor. Sobre esta se vierte agarosa líquida que
llevará disuelta Acs. contra todos los Ags. a analizar, haciendo contacto
en un extremo con la tira de agarosa que contienen los Ags.

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3. Una vez solidificada la agarosa que contiene los Acs. se aplica una
corriente eléctrica en dirección perpendicular a la primera separación
electroforética a fin de que los Ags. migren hacia la agarosa que contiene
los Acs. Se obtienen de esta forma unos arcos de precipitado nítidos, en
forma de picos.

REACCIONES DE AGLUTINACIÓN

Es una reacción serológica que comprende la agregación de una suspensión de


Ags particulados cuando se unen a sus Acs. específicos. Es un método
secundario ya que primero se une el Ag. y el Ac. que van formando agregados,
estos empiezan a aumentar y finalmente se depositan.

Cuando los Ags. que intervienen en la reacción son particulados "per se" la
reacción se llama: aglutinación directa o activa. Como ejemplos de estos Ags.
están las bacterias y los hematíes.

Cuando los Ags., para que se produzca la reacción de aglutinación, tienen que
ser acoplados a la superficie de células o partículas inertes (látex, bentonita...) la
reacción se llama: aglutinación indirecta o pasiva.

Cuando un Ac. se une a su Ag. particulado específico y se produce la


aglutinación, se llama: Anticuerpo completo.

Cuando un Ac. se une a su Ag. específico particulado y no se produce


aglutinación se llama: Anticuerpo incompleto.

Características de las reacciones de aglutinación:

o Son bastantes sensibles, ya que detectan cantidades


pequeñas de Ag. o Ac.
o Son menos específicas que las reacciones de precipitación.
o Son métodos cualitativos o semicuantitativos.
o Son pruebas muy útiles, ya que se puede acoplar el Ag. o el
Ac. deseado a una partícula y así detectar su Ac. o Ag.
específico.
o Se pueden observar a simple vista.

Factores que influyen en la reacción de aglutinación:

* Carga de las partículas: Las partículas poseen en suspensión una carga


superficial negativa (potencial zeta) repeliéndose entre ellas. La unión con el Ac.
ayuda a establecer puentes de unión entre las diferentes partículas
produciéndose la aglutinación. Algunas veces no es suficiente y habrá que
emplear diferentes sistemas para disminuir el potencial zeta. Uno de ellos es
aumentar la viscosidad añadiendo sustancias como la albúmina. Otro es el
tratamiento con enzimas proteolíticas cuando las partículas son hematíes.

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Tambien el buffer empleado puede disminuir las cargas (-) superficiales de las
partículas.

* Tipo de anticuerpo: Las Inmunoglobulinas del tipo Ig.M, debido a su tamaño,


siempre van a aglutinar. Las del tipo Ig.G podrán aglutinar o no dependiendo de
la subclase o de otros factores. En caso de no aglutinar se llamarían Acs.
incompletos.

* Concentración de electrolitos: Ya hemos comentado la influencia del buffer


en las cargas (-) superficiales de las partículas. Para una mejor aglutinación será
conveniente que la fuerza iónica del buffer sea lo mas baja posible.

* pH: Debe ser el mas próximo al fisiológico.

* Viscosidad: Cuanto mas viscoso sea el medio mejor se produce la reacción de


aglutinación. Esto se puede conseguir añadiendo sustancias como la albúmina o
el dextrano.

* Antígenos: Un Ag. con un solo determinante antigénico nunca podrá aglutinar.


Cuantos más determinantes antigénicos posea un Ag. la aglutinación se
producirá mejor.

* Temperatura y tiempo de incubación: La temperatura debe ser lo mas


próxima a la fisiológica, aunque hay algunos casos en que la tª optima es 4º C.
El tiempo de incubación será el mayor posible.

* Agitación: Las técnicas que facilitan el contacto Ag. -Ac. como la agitación o la
centrifugación facilitan la aglutinación.

Tipos de reacciones de aglutinacion:

A) AGLUTINACION DIRECTA:

Se produce cuando se unen el Ac. y su Ag. específico particulado "per se", es


decir de forma natural.

Se puede utilizar esta reacción de manera cualitativa o cuantitativa.

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a) Cualitativa: Se realiza en un portaobjetos o en un tubo, enfrentando un Ac. a


una suspensión de Ags., de los que uno de ellos es desconocido. Tras una breve
agitación se observa si hay aglutinación. Es una reacción de uso común para la
identificación de bacterias y la determinación de grupos sanguíneos.

b) Cuantitativa: Nos permite una estimación aproximada de los Acs. presentes


en el suero, mediante la determinación del título de Ac. Esta técnica de utiliza
habitualmente para el diagnóstico serológico de las infecciones por Brucella y
Salmonella. Hay que tener en cuenta el efecto zona, es decir, cuando hay un
exceso de Acs. en el suero problema se puede solubilizar el aglutinado. Esto se
evitará empleando una batería amplia de tubos.

B) AGLUTINACION INDIRECTA:

Es la reacción de los Acs. con sus Ags. específicos solubles pero que han sido
acoplados a la superficie de partículas. Se usan con frecuencia eritrocitos,
humanos o no, bacterias, partículas inertes como látex o bentonita.

Así un Ag. soluble al adsorberse en


una partícula convierte la reacción
Ag.-Ac. de precipitación a
aglutinación, incrementándose
enormemente la sensibilidad de la
prueba. Son más sensibles las
pruebas que usan como partículas
portadoras de Ags. los eritrocitos
que las que usan látex o bentonita.

También se puede utilizar esta


reacción de manera cualitativa o
cuantitativa.

Para detectar antígenos solubles se utiliza una variación de esta técnica, la


aglutinación indirecta inversa, en la que en lugar de acoplar el antígeno a la
+partícula acoplamos el anticuerpo específico del antígeno buscado.

Esta técnica es la más utilizada en serología, por su bajo coste, su rapidez y su


buena sensibilidad. Tiene el inconveniente de ser poco específica, por lo que
ofrecerá falsos positivos. Pruebas típicas basadas en este método son: las
pruebas reumáticas (Proteína C reactiva, Factores reumatoides, Waale- Rose,
Singer-plotz, Antiestreptolisina), la RPR, la VDRL y la TPHA, que se usan en el
diagnóstico de la sífilis, la del látex Criptococo etc.

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C) INHIBICION DE LA AGLUTINACION:

Los Acs. reconocen y reaccionan con sus Ags. específicos. Puede suceder que
en la muestra problema el Ag. esté en forma soluble (no unido a una partícula)
por lo que se producirá la reacción Ag.-Ac. pero no se observará la aglutinación.

Esta prueba es una adaptación de las reacciones de aglutinación que nos


permite la detección y cuantificación de los Ags. solubles.

La prueba se realiza en varias etapas:

1. Se añade a la muestra problema (Ag. soluble buscado) el Ac. específico del


Ag. buscado. Si no se produce aglutinación puede deberse a 2 causas:

a) Que no exista el Ag. buscado:

b) Que exista el Ag. buscado, pero que esté en forma soluble:

Para saber si existe el Ag. en forma soluble o no existe el Ag. buscado, se hace
la 2ª etapa:

2. Se añade a la mezcla anterior partículas recubiertas con el Ag. buscado en la


muestra problema. Puede ocurrir:

a) Que se produzca una aglutinación:

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Esto significa que no existe el Ag. buscado, ya que los lugares de unión del Ac.
añadido en la 1ª etapa (específico del Ag. buscado) estaban libres y han
reaccionado en la 2ª etapa con las partículas añadidas que tenían el Ag.
recubriéndolas.

b) Que no se produzca la aglutinación:

Esto significa que existe el Ag. soluble que estamos buscando, ya que los
lugares de unión del Ac. añadido en la 1ª etapa (específico del Ag. buscado)
estaban ocupados por el Ag de la muestra problema y por tanto no ha podido
reaccionar, el Ac añadido, con el Ag. particulado añadido en la 2ª etapa.

Esta prueba, de inhibición de la aglutinación también se puede realizar


cuantitativamente. Para ello utilizaremos diferentes diluciones de la muestra
problema.

Una aplicación de esta prueba es el diagnóstico del embarazo, en el que se


detecta la hormona GCh, antígeno soluble.

D) TEST DE COOMBS O ANTICUERPOS NO AGLUTINANTES:

Algunos tipos de IgG pueden unirse a los Ags. fijados a las partículas, pero no
aglutinarlos. Son los llamados Acs. incompletos.

Esta prueba detecta estos Acs. no aglutinantes mediante la adición de


antiglobulinas-IgG (antiinmunoglobulinas), que ayudarán a formar puentes de
unión entre las partículas.

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Hay 2 tipos de pruebas:

a) Prueba de coombs directa:

Ayuda a detectar Acs. unidos a partículas. Ej. los hematíes en el recién nacido
con enfermedad hemolítica por incompatibilidad Rh están sensibilizados por Acs.
no aglutinantes (IgG materna). La adición de antiglobulinas humanas permite el
establecimiento de puentes entre los hematíes a través del Ac. anti-IgG y hace
posible la aglutinación.

b)- Prueba de coombs indirecta:

Detecta Acs. no aglutinantes libres en el suero. Se realiza e 2 fases:

a) Se añade a la muestra problema (Ac. no aglutinante buscado) Ags.


específicos particulados. No se producirá la aglutinación

b) Se añade antiglobulinas (anti-IgG) a la mezcla anterior. Las antiglobulinas se


unirán a los Acs.no aglutinantes fijados y provocarán la aglutinación de las
partículas.

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Se usa esta prueba para el diagnóstico serológico de la brucelosis crónica.


También para detectar los Acs. no aglutinantes maternos en el caso de
incompatibilidad Rh.

REACCIONES CON INTERVENCION DEL COMPLEMENTO

Son procedimientos muy sensibles, pero actualmente han sido superados por el
RIA, el IF. y el ELISA. Todavía hay técnicas, que usan la fijación del
complemento para el diagnóstico de enfermedades fúngicas, víricas y
parasitarias.

El término COMPLEMENTO se usa para designar una serie de proteínas


plasmáticas, cerca de 20, que son activadas en secuencia (en cascada) después
de producirse la reacción Ag.-Ac. La primera proteína del complemento que se
activa se une a un sitio del interior del Ac. que seria inaccesible si el Ac. no ha
reaccionado con el Ag. Después de esta reacción hay cambios conformacionales
en la molécula del Ac. de tal manera que hace que la región de articulación se
abra quedando expuesta al sitio de fijación del complemento.

Las proteínas del complemento tienen la capacidad de lisar las células cuando la
reacción Ag-Ac. se produce con Ags. situados en las superficies celulares.

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PRUEBAS DE FIJACION DEL COMPLEMENTO:

Se pueden utilizar, como todas las pruebas serológicas, para detectar Ags. o
Acs. Se basan en que los complejos Ag.-Ac. formados al fijar el complemento
impiden la hemólisis que ese mismo complemento produciría sobre un sistema
hemolítico incompleto ( hematíes (Ag.)- Acs. hemolíticos.).

La prueba se realiza en 2 etapas:

1º.- Se pone en contacto el Ag. y el Ac., de los cuales uno es conocido y el otro
no, en presencia de complemento.

2º.- Se investiga la presencia de complemento libre por la adición de un sistema


hemolítico incompleto (hematíes + hemolisinas) Podremos observar 2
resultados:

a) Que exista el Ag. o el Ac. buscado:

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b) Que no exista el Ag. o el Ac. buscado:

INMUNOTURBIDIMETRIA Y INMUNONEFELOMETRIA

Cuando un haz de luz choca con una partícula en suspensión, sufre una serie de
fenómenos, parte de la luz es transmitida, parte absorbida, parte reflejada, y por
último parte es dispersada.

INMUNOTURBIDIMETRIA

Esta técnica se basa en la medición de la luz que no se ha transmitido a través


de una suspensión cuando sobre ésta incide un rayo de luz colimado. Es por
tanto la medida de la disminución de la intensidad de la luz incidente (causada
por dispersión, reflexión y absorción de la luz). Se puede medir como %T o como
absorbancia.

Cuando un antígeno y un anticuerpo se unen en un medio líquido, se forman


inmunocomplejos que quedan en suspensión, dando una turbidez al líquido que
es proporcional a la cantidad de antígeno o anticuerpo de la muestra.

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INMUNONEFELOMETRIA

Se basa en la medición de la luz dispersada por las partículas de una


suspensión cuando sobre ésta incide una luz colimada. Se mide la luz desviada
en un determinado ángulo (de 15º A 90º), con respecto a la dirección del rayo
incidente.

La formación de inmunocomplejos antígeno-anticuerpo es capaz de dispersar la


luz que atraviesa la solución donde se desarrolla la reacción. Por tanto mediante
esta técnica podremos determinar la existencia de antígenos o anticuerpos en
una muestra.

REACCIONES DE TRANSFERENCIA O INMUNOBLOTTING

Se basan en la transferencia de una sustancia desde un gel, donde se hayan


separado sus diversos componentes, a un soporte fácilmente manejable.

Las sustancias a estudiar se separan en un gel de poliacrilamida mediante la


electroforesis. Una vez separadas todas las sustancias se realiza la
transferencia, por capilaridad o por electroforesis (electrobotting), a una
membrana, generalmente de nitrocelulosa. Esta membrana tiene una gran
capacidad para fijar las proteínas. También se pueden bloquear fácilmente los
sitios de unión libres.

Las diferentes sustancias que se han transferido se podrán estudiar por


diferentes métodos, fundamentalmente ELISA o RIA, añadiendo a la membrana
los anticuerpos específicos de las sustancias a estudiar.

Es una técnica cualitativa y los resultados se observaran en forma de unas


bandas correspondientes a cada una de las sustancias estudiadas presentes en
la muestra problema. La técnica se llama Western blot

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Actualmente tiene una gran aplicación como técnica para confirmar la infección
por VIH (SIDA), ya que a una buena sensibilidad, comparable al ELISA, une una
gran especificidad, eliminándose de esta forma los falsos positivos. Se haría de
la siguiente forma:

o Fraccionamiento, mediante electroforesis en un gel de


poiacrilamida, del virus VIH desorganizado y parcialmente
purificado. Las diferentes proteínas víricas se separarán según su
peso molecular.
o Transferencia a una membrana de nitrocelulosa de las proteínas
separadas, que actuarán como antígenos.
o Se añade la muestra problema (suero con sospecha de tener
anticuerpos contra el VIH) a la membrana anterior. Si existen los
anticuerpos se unirán a sus antígenos correspondientes.
o Se añade antiglobulina conjugada con un marcador que se unirá a
los complejos Ag.-Ac. formados anteriormente.
o Se visualiza según el método empleado (ELISA o RIA)
o Se compara el resultado con un control.

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También se utiliza este método para la determinación de ácidos nucleicos. Si


determinamos DNA la técnica se llamará Southern blot, y si es RNA se llamará
Northern blot.

METODOS TERCIARIOS

Están basados en los efectos biológicos que siguen a la unión Ag-Ac. o a las
consecuencias derivadas de dicha unión.

Algunos de estos efectos son:

a.- Fagocitosis.
b.- Opsonización: preparación del Ag. para ser fagocitado.
c.- Adherencia inmunitaria: facilita la fagocitosis.
d.- Desgranulación celular.
e.- Bacteriolisis.
f.- Inmovilización de microorganismos. etc.

Casi todos estos efectos biológicos están basados en la actividad del


complemento.

PRUEBAS MÁS IMPORTANTES:

A) PRUEBAS DE PROTECCIÓN:

Estudian, mediante pruebas "in vivo", los Acs. protectores, que son los
responsables de la inmunidad adquirida, y sus Ags. correspondientes. Pueden
ser activas o pasivas:

a) Activas: Sirven para determinar la capacidad vacunante de una preparación


antigénica. Para ello se administra ésta a un lote de animales y tras un periodo
de tiempo (para que pueda fabricar Acs.), se les inocula el germen virulento. La
protección se medirá por la supervivencia de los animales.

b) Pasivas: Se usan para medir el poder protector de un suero inmune. Para ello
se administra el suero a un lote de animales y, tras un periodo de tiempo se
inocula el germen virulento. La protección se medirá, al igual que antes por la
supervivencia de los animales.

B) PRUEBAS DE NEUTRALIZACIÓN:

Cuando un Ag. se une a su Ac. correspondiente puede perder su capacidad


patógena, tóxica, hormonal, enzimática etc., de que está dotado el Ag. Esto se
manifestará por la posterior inoculación de la unión Ag.-Ac. a un animal de
experimentación, a un cultivo, etc. Ejemplo: si unimos una toxina con su
correspondiente antitoxina se neutralizará el efecto tóxico. Esto se demuestra
inoculando a un animal de experimentación la mezcla.

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C) TEST DE NELSON: Prueba utilizada en el diagnóstico de la sífilis.

Entre los métodos 3º también podemos encontrar las pruebas que pueden
ayudarnos a determinar la hipersensibilidad de un individuo a diferentes
sustancias como medicamentos, pólenes, productos químicos, polvo de la casa,
alimentos etc.

Se entiende por hipersensibilidad a la respuesta inmunitaria que causa daño en


el individuo que la produce.

Las pruebas más comunes son:

D) TEST CUTÁNEOS POR INTRADERMOREACCIÓN DEL ALERGENO:

Consiste en inyectar bajo la piel las sustancias a estudiar, como alergenos, y


observar la reacción que se produce al cabo de poco tiempo

E) PARCHES CUTANEOS:

Se escarifica la piel y posteriormente se coloca un parche impregnado con la


sustancia a estudiar en la zona escarificada. Tras un periodo de tiempo se
observa los resultados.

F) PRUEBAS DE PROVOCACIÓN:

Las sustancias o alergenos se administran por vía natural (inhalación, vía oral
etc.) para provocar la reacción alérgica.

G) TEST DE PRAUSNITZ-KUSTNER O DE ANAFILAXIA CUTÁNEA PASIVA:

El suero de un paciente alérgico se inyecta en la piel de un individuo sano. A las


24 horas se inocula en el mismo lugar el alergeno. Si existe el Ac., se origina una
reacción alérgica (prurito, eritema, edema).

H) PRUEBA DE MANTOUX O DE LA TUBERCULINA:

Consiste en inyectar intradérmicamente en el brazo una preparación de


tuberculina. Tras un periodo de 48-72 horas se observará una inflamación en el
lugar de la inyección. Se medirá el diámetro de la inflamación para dar como (+)
o (-) la prueba.

ESTUDIO DE LAS DIFERENTES POBLACIONES LINFOCITARIAS

En los métodos inmunológicos no solo hay que estudiar la reacción antígeno-


anticuerpo y sus consecuencias correspondientes, a veces hay que estudiar las
diferentes células pertenecientes a la inmunidad celular, en concreto los
linfocitos T y B.

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Hay técnicas que permiten el aislamiento de los linfocitos del resto de los
componentes de la sangre. Se basan generalmente en la velocidad de
sedimentación o en la centrifugación en gradiente de densidad.

También hay métodos que permite la identificación de las diferente


subpoblaciones linfocitarias como la prueba de la formación de rosetas E. Se
basa en la capacidad que tienen los linfocitos T de formar rosetas de manera
espontánea con los glóbulos rojos de carnero, sin la intervención de
inmunoglobulinas.

En algunas ocasiones hay que determinar la capacidad funcional de los


linfocitos, parámetro más adecuado para valorar el estado inmunológico del
individuo que su cantidad. Se valora la capacidad de producción de anticuerpos,
la respuesta a los mitógenos etc. Entre las técnicas más importantes están: la
transformación linfoblástica, el cultivo mixto de linfocitos, y la proliferación de
linfocitos frente a diversas sustancias, como por ejemplo las lecitinas vegetales.

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TEMA 12.- ESTUDIOS DE


PATERNIDAD POR ADN.

¿Cómo se hace un estudio de paternidad por


ADN?

La molécula de ADN (ácido desoxirribonucleico) es la portadora de toda la


información genética que pasa de una generación a la siguiente y contiene
todas las instrucciones necesarias para la formación de un organismo nuevo, así
como para el control de todas las actividades de las células durante el tiempo de
vida del organismo. Está presente en todos los organismos vivos desde virus
y bacterias hasta plantas y animales.

En organismos superiores el ADN es único para cada individuo de cada


especie e invariable durante el periodo de vida del organismo. Esta característica
es lo que se conoce como "huella genética" y es la base de los estudios de
identificación genética de individuos.

Salvo unas pocas excepciones (glóbulos rojos en mamíferos, etc.), todas las
células de un organismo vivo tienen ADN. Gracias a ello es posible extraer el
ADN a partir de cualquier muestra biológica (sangre, pelo, semen, huesos
etc.) e incluso a partir de muestras degradadas.

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M ediante la técnica del PCR o "reacción en cadena


de la polimerasa", es posible amplificar la molécula
de ADN de forma exponencial en el laboratorio. Para
realizar un análisis genético se necesita muy poca
cantidad de muestra ya que a partir de una simple
molécula de ADN se pueden obtener millones de
copias.

Desde un punto de vista estructural, el ADN está


formado por una sucesión de moléculas simples
llamadas nucleótidos, compuestos por un azúcar
(desoxirribosa), un grupo fosfato y una base
nitrogenada, que puede ser púrica (Adenina o
Guanina) o pirimidímica (Citosina o Timina). Los
nucleótidos aparecen unidos entre sí mediante
enlaces químicos de forma específica (una adenina
siempre se aparea con una timina y una citosina con
una guanina) creando una hebra de longitud variable.
La naturaleza física de estas moléculas hace que dos
hebras se asocien de forma complementaria
formando una doble cadena helicoidal. Mediante el
proceso de secuenciación, y empleando unos
aparatos muy sofisticados llamados secuenciadores
automáticos, es posible conocer la secuencia exacta
de nucleótidos que forman cada molécula de ADN.

Dentro de las células el ADN sufre un proceso de


plegamiento y empaquetamiento dando lugar a los
cromosomas. Los humanos poseen 46 cromosomas, 23
procedentes de la madre y 23 procedentes del padre.
Esta es la base de los análisis de paternidad ya que
estudiando una serie de marcadores genéticos situados
en los diferentes cromosomas (los STRs o "secuencias
cortas repetidas en tandem") es posible determinar de
forma inequívoca la paternidad de un individuo.

La molécula de ADN tiene una gran estabilidad lo que


facilita su transporte y almacenamiento. Así, es posible
mantener congeladas muestras de ADN durante mucho
tiempo para realizar con ellas estudios genéticos
posteriores.

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UN POCO DE HISTORIA
La demostración por parte de Avery y colaboradores en la década de los 40 de
la existencia del DNA como la estructura sobre la que recae toda la información
genética y el posterior descubrimiento en los años 50 de la estructura de doble
hélice del DNA por Watson y Crick (pulse aquí para ver una copia del trabajo
original de Watson y Crick), dieron lugar a toda una serie de trabajos
experimentales en las décadas de los años 60 y 70 encaminados a la
elucidación de las claves de la codificación genética que nos han conducido a la
revolución científica que se vive actualmente en el campo de la genética y la
biología molecular.

Posteriormente, el descubrimiento de la "reacción en cadena de la polimerasa"


(PCR) por K. Mullis en 1987 permitió la amplificación in vitro de fragmentos de
DNA de interés, abriendo todo un nuevo abanico de posibilidades en la
manipulación del DNA que se completó posteriormente en los años 90 con el
desarrollo de la secuenciación automática de DNA por el método de Sanger
con reactivos fluorescentes en lugar de radiactivos, permitiendo conocer
exactamente el orden de los nucleótidos en la secuencia del fragmento de DNA
en cuestión. En la actualidad, las técnicas de PCR y de secuenciación
automática de DNA son totalmente rutinarias en la mayoría de los laboratorios de
Bioquímica y Biología Molecular.

En fechas recientes, el inicio del denominado Proyecto Genoma Humano por


parte de diferentes laboratorios de todo el mundo, está permitiendo la ordenación
y asignamiento de diferentes segmentos de DNA a localizaciones conocidas
dentro de los cromosomas, lo que está facilitando el descubrimiento continuo de
los denominados marcadores genéticos, localizaciones físicas y perfectamente
identificables en un cromosoma cuyo paso hereditario de generación en
generación puede ser monitorizado. Estos marcadores genéticos pueden ser
regiones de DNA que se expresan en forma de proteínas, o segmentos de DNA
sin función codificante pero con un patrón hereditario que puede ser
determinado.

El PCR permite la amplificación específica de una secuencia requerida de DNA


cientos de millones de veces en un tiempo de pocas horas, independientemente
de su origen (virus, bacterias, plantas, animales o humanos). Esta técnica es
especialmente valiosa y prácticamente insustituible teniendo en cuenta su alta
especificidad, fácil automatización y alta capacidad para amplificar insignificantes
cantidades de muestra de DNA. El PCR también puede ser utilizado para
detectar la existencia de una secuencia definida en una muestra de DNA.

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Durante mucho tiempo la aplicación de estas técnicas de Bioquímica y Biología


Molecular han estado prácticamente restringidas al ámbito académico e
investigador. Sin embargo, en los últimos años estas técnicas se están
convirtiendo en una herramienta fundamental e imprescindible en muchas áreas
como la biomedicina, biología forense, agricultura, ganadería, tecnología de
alimentos, etc. Como ejemplo, en biología forense, la utilización de PCR es
prácticamente insustituible debido a que las características ambientales, de
almacenamiento, etc. de las muestras, pueden llevar a la degradación del DNA y
llegar a impedir la utilización de otras técnicas alternativas. En países como
Estados Unidos o el Reino Unido, la aplicación de este tipo de técnicas se lleva a
cabo de forma continua y rutinaria en diversos campos de la ciencia. Sin
embargo, en España es un campo nuevo y de reciente implantación.

Extracción del ADN:


La muestra biológica (sangre, uñas, hisopados o cualquier otro tejido que
contenga células humanas con núcleo) se somete a la acción de detergentes,
que disuelven los lípidos; y enzimas proteolíticas, que cortan las proteínas.

Luego de incubar la mezcla una


noche a 60 grados centígrados, se
produce la ruptura de la estructura
celular liberando todo su
contenido a la solución.

La mezcla se limpia mediante


sucesivos lavados con solventes
orgánicos (fenol, cloroformo), que
coagulan proteínas y extraen los
lípidos, y finalmente el ADN se
separa por precipitación con
alcohol en medio salino.

Eventualmente, en los casos de manchas antiguas o huesos, se realizan


purificaciones posteriores por diálisis o adsorción a soportes sólidos.

Existen métodos alternativos en los cuales la muestra sanguínea se deposita


sobre un papel especial, que la mantiene inalterada por años a temperatura
ambiente. Previo al análisis, se cortan con un sacabocados pequeño
fragmentos del papel (alrededor de 1 mm) y se extraen las impurezas mediante
lavados. El papel así procesado, con el ADN adherido, se analiza directamente
colocándolo en la mezcla de amplificación.

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Análisis del ADN:


Existen dos metodologías diferentes:
a) Corte con enzimas de restricción, corrimiento electroforético en geles de
agarosa, transferencia a una membrana de nylon o celulosa y tratamiento
con sondas de locus múltiple o de locus específico. Estas técnicas han
caído en desuso, por lo cual no serán tratadas aquí.

b) Amplificación mediante PCR o reacción en cadena de la polimerasa: es


un proceso que consiste en imitar una actividad normal de la célula: la
copia de ADN, aunque en este caso limitado a pequeños fragmentos, en
los cuales están ubicadas las regiones variables.

Para ello, se coloca en cada tubo una porción del ADN extraído de cada
persona y una mezcla que contiene nucleótidos, sales, una enzima que "copia"
ADN (denominada polimerasa) y los "primers" que reconocen la zona variable.

La mezcla se somete a variaciones de temperatura en un ciclador térmico, que


produce sucesivamente tres temperaturas diferentes: una que desnaturaliza o
separa las cadenas del ADN, otra que facilita que los "primers" reconozcan y se
adhieran a la región a copiar, y la tercera que permite la extensión de la cadena
copiada, mediante la unión de los nucleótidos que se encuentran en la solución,
con la ayuda de la polimerasa.

Luego, los amplificados se someten a un campo eléctrico en el interior de un


soporte semisólido o gel (electroforesis). Como el ADN está cargado
negativamente, se dirige hacia el polo positivo, los fragmentos pequeños más
rápido que los grandes, produciendo su separación.

Finalmente, los fragmentos separados se visualizan mediante diferentes


métodos:

• Radiactivos: si uno de los nucleótidos estaba marcado radiactivamente,


basta poner el gel en contacto con una película radiográfica, que se revela
para observar las variantes.
• Tinción con plata: se trata el gel con sales de plata, que por su carga
positiva son atraídas por la carga negativa de los fragmentos de ADN, y
se revela de modo similar a una fotografía.

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Tanto los métodos radiactivos como los de tinción con plata están cayendo en
desuso, y en la actualidad son empleados solamente por laboratorios que
poseen un escaso volumen de trabajo.

• Sistemas automatizados: son los de última generación, en los cuales al


proceso de electroforesis lo efectúa un secuenciador automático, que lee
mediante un rayo laser los "primers", marcados con un fluorocromo,
adheridos a las zonas variables. Una computadora permite determinar
qué variantes son las que se encuentran en cada muestra.

Interpretación de los resultados:


Según las metodologías empleadas, los resultados se visualizan como "bandas"
(en los formatos radiactivos o de tinción) o como "picos" en un gráfico (sistemas
automatizados). Dado que la interpretación es idéntica, en los ejemplos
utilizaremos los gráficos obtenidos de un secuenciador automático.

Madre:
Considerando que cada individuo hereda una variante
de su madre y la otra de su padre biológico,
supongamos los siguientes resultados para un
hipotético "sistema A":

Hijo:
Es evidente que el hijo comparte una variante con su
madre y la otra con su padre alegado, por lo cual podría
ser hijo de ambos. Sin embargo, esa situación puede
darse por azar, ya que hay
Padre muchos individuos de la
alegado: población general que
presentan esa variante Madre:
compartida.

Entonces, repetimos el
estudio con otro sistema,
que analizará una zona
variable diferente. El resultado para ese "sistema B" Hijo:
podría ser:

Y se confirmaría la inclusión. Para que el estudio


resulte suficientemente creíble, se acepta a nivel
mundial que deben analizarse un mínimo de 12 Padre
sistemas de microsatélites, por supuesto, con alegado:

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inclusión en todos los casos. Para las técnicas actuales automatizadas, ello no
presenta ningún inconveniente, ya que existen métodos de amplificación de 15
regiones variables en una sola reacción.

El estudio completo, con sistemas de última generación, se vería así:

Madre:

Hijo:

Padre
alegado:

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Madre:

Hijo:

Padre
alegado:

Madre:

Hijo:

Padre
alegado:

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En el ejemplo anterior, se observan 15 sistemas variables y además el


denominado "amelogenina", que sirve para determinación de sexo: en lo varones
se aprecian dos picos ("XY") y en las mujeres, sólo uno ("XX"). Los números
debajo de cada variante indica el número de repeticiones que posee la
secuencia "core" que define al sistema cuyo nombre se coloca en la parte
superior del registro gráfico (ej.: D5S818, D13S317, etc).

Otra posibilidad para el sistema B sería:

Madre:
Que indicaría la exclusión del padre alegado como
padre biológico (obsérvese que la variante 11 está
en el hijo pero no en la madre ni en el padre alegado).
Para asegurarse que no se deba a una falsa exclusión
Hijo: debida a una mutación, se sugiere continuar el estudio
hasta observar al menos tres situaciones como ésta,
de no compartición de variantes entre padre e hijo
alegado.

Las variantes mencionadas se codifican por


Padre convención mediante un número (ubicado en el
alegado: esquema en la parte inferior de cada pico), que
expresa el número de veces que está repetida la
secuencia que caracteriza al sistema. Así, en nuestro
hipotético "sistema A", los resultados se expresarían
como:

Madre: 8-12.

Hijo: 8-13.

Padre alegado: 12-13.

Cualquier otro estudio, realizado en cualquier lugar del mundo, del mismo
"sistema A", debe necesariamente arrojar los mismos resultados numéricos. Si
eso no ocurre, alguno cometió un error.

Finalmente, se realiza un cálculo estadístico de la probabilidad de paternidad e


índice de paternidad, basándose en análisis efectuados previamente de las
variantes observadas en individuos no relacionados de la población general.

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Cuanto menos frecuentes en la población sean las variantes obtenidas, mayores


serán la probabilidad y el índice de paternidad.

Habitualmente, para individuos vivos, la "probabilidad de paternidad" es superior


al 99,99%. Por ejemplo, un "índice de paternidad" de 1,2 x 106 indica que 1 de
cada 1200000 individuos de la población general podrían ser asignados como
padres biológicos del hijo en cuestión, sin serlo, es decir, por azar.

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TEMA 13.- MÉTODOS ÓPTICOS


PARA EL DIAGNÓSTICO DE LAS
ENFERMEDADES INFECCIOSAS
INTRODUCCIÓN

Cuando se establece el diagnóstico clínico de una enfermedad infecciosa, con


frecuencia es crucial el poder identificar rápida y provisionalmente el agente
etiológico con el fin de poder instaurar las adecuadas medidas terapéuticas y en
ocasiones epidemiológicas; en todo caso siempre es conveniente llegar a la
confirmación bacteriológica.

En realidad las técnicas utilizadas actualmente han variado muy poco desde el
inicio de la era bacteriológica; más o menos sofisticadamente, se continúa con la
identificación de los gérmenes por visualización directa, por técnicas de cultivo y
en ocasiones por inoculación animal.

VISUALIZACION DIRECTA O EXAMEN MICROSCÓPICO

El estudio microscópico directo de una muestra no permite por sí solo, más que
en raras ocasiones, la identificación precisa del microorganismo observado. No
obstante, nunca se debe prescindir de él como orientativo, salvo en algunos
casos, en relación con la naturaleza de la muestra examinada, cuando no existe
probabilidad de obtener ninguna información.

El examen microscópico sirve de pauta para el uso de técnicas complementarias


de cultivo o de estudio bioquímico y evita, muchas veces, incurrir en errores
graves. Este examen permite obtener información respecto a la presencia de
bacterias y su abundancia, observar su morfología y disposición (por ejemplo los
Streptococcus se disponen en cadena y los Staphylococcus en forma de
racimos), determinar sus características de tinción, la reacción celular, e incluso
conocer la citología del material examinado. Si se parte de un cultivo, la
información puede ampliarse aún más y apreciarse mejor la forma, tamaño,
disposición y las peculiaridades de tinción.

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El examen microscópico comporta habitualmente dos modalidades diferentes:


examen en fresco y mediante tinción.

EXAMEN EN FRESCO

También conocido como montaje húmedo, consiste en colocar el material a


examinar entre un porta y un cubreobjetos; si se trata de un producto sólido, se
realizará previamente una suspensión del mismo en agua destilada o s.s.f
estériles. Para la observación se coloca el condensador bajo y el objetivo seco
fuerte (40X).La microscopía de contraste de fases y la de campo oscuro facilitan
la observación de estructuras con bajo índice de refracción que pasarían
inadvertidas con el microscopio de campo claro; sus indicaciones son muy
precisas (por ejemplo, la identificación de espiroquetas).

El examen en fresco se dirige principalmente a la detección de microorganismos


directamente en las muestras, a cuantificar su concentración, a obtener alguna
información sobre su morfología y, con frecuencia, a determinar la movilidad de
una especie aislada. Además, tambien permite observar otro tipo de células
(hematíes, leucocitos, células epiteliales), cristales y algunas estructuras que
ayudan para la valoración clínica de determinadas muestras.

El examen en fresco puede ayudarse de recursos que facilitan la visualización de


ciertos microorganismos:

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• La simple adición de azul de metileno u otro colorante favorece la


diferenciación de elementos celulares.

• La preparación con tinta china (método de Burri) o nigrosina permite la


evidenciación de la cápsula microbiana. Se utiliza para el diagnóstico de
infección por Cryptococcus.

• El montaje con potasa al 10% en caliente o con azul de lactofenol es de


gran utilidad para el estudio de estructuras fúngicas, sobre todo de
hongos dermatofitos.

• La preparación con solución yodada(lugol) es de elección para la


identificación de algunas parasitosis intestinales.

EXAMEN POR TINCIÓN

El examen del material teñido, ya sea directamente a partir de muestras clínicas


o del desarrollo en los cultivos, es el método más útil para la identificación
presuntiva de las bacterias y de ciertos virus y para la identificación definitiva de
la mayoría de los parásitos y de muchos hongos.

Las preparaciones teñidas se visualizan al microscopio con el condensador alto y


el objetivo de inmersión de gran aumento (100X).

De forma resumida podemos decir que la coloración o tinción es un proceso


mediante el cual un elemento toma color bajo la acción de una sustancia
colorante.

Un colorante es una sustancia capaz de comunicar su color a otros cuerpos.


Pueden ser: ácidos (tiñen a estructuras básicas; ejemplos: Eosina, ácido
Pícrico,Aurantina.), básicos (tiñen estructuras ácidas). Son colorantes nucleares.
Ejemplos: Azul de metileno, Verde malaquita, Fuchina, Violeta de genciana,
Safranina,...) y neutros (son capaces de teñir tanto las estructuras ácidas como
básicas. Ejemplos: Eosinato de Azul de metileno.

En Microbiología se utilizan sobre todo colorantes básicos o nucleares debido a


la gran basofilia del citoplasma bacteriano, rico en ARN. Estos colorantes se
presentan generalmente asociados a un mordiente (ácido fénico) para reforzar
su acción, aunque algunas técnicas de tinción aplican, además, otro mordiente
suplementario (lugol en la tinción de Gram).

Preparación de un frotis.

Todas las técnicas de tinción exigen una preparación previa del frotis antes de
proceder a la tinción en sí. Los pasos a seguir son :

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Extensión

• Cuando el producto a teñir es líquido se depositará con asa de Pt,


previamente flameada, una gota del mismo sobre el portaobjetos y se
extenderá formando una capa fina y uniforme de aproximadamente 1,5
cm. de lado.

• Cuando se parte de un medio sólido o semisólido se depositará una gota


de agua destilada o s.s.f. en el porta y, utilizando asa de Pt previamente
flameada, se suspenderá en ella una pequeña cantidad de cultivo. Se
extiende de la misma forma que en el caso anterior. Hay que cuidar no
poner demasiada masa de microorganismo, pues se formaría una capa
gruesa que dificultaría la observación.

• Cuando se trata de una muestra tomada con escobillón se pueden


extender directamente o se suspenden en 2 c.c. de suero fisiológico
estéril contenidos en un tubo. Se deposita una gota de la suspensión en el
centro del portaobjetos y se extiende.

Desecación.

Se deja secar al aire o manteniendo el portaobjetos alto por encima de la llama.

Fijación.

Cuando la extensión está bien seca hay que proceder a fijarla. Tiene por objeto
adherir los gérmenes al portaobjetos para que al lavar no se arrastre. Se
consigue mediante la coagulación de las proteínas de los gérmenes.

En Microbiología, el agente fijador que se suele emplear es el calor: una vez


seca la extensión, se pasa el portaobjetos dos o tres veces por la llama del
mechero con la extensión hacia arriba. El portaobjetos debe notarse caliente
pero no quemar cuando se coloca en el dorso de la mano.

Una vez fijada la preparación se dejará enfriar antes de proceder a la coloración


ya que de lo contrario precipitaría el colorante.

También se puede realizar la fijación mediante el empleo de fijadores químicos


tales como el alcohol metílico o etílico, dejándolos en contacto dos o tres
minutos, eliminando después el exceso.

Una vez preparada y fijada la extensión, el siguiente paso sería la tinción.

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TIPOS DE TINCIONES

TINCIÓN SENCILLA.

Se realiza utilizando un sólo colorante. Se puede emplear cualquier colorante


básico, preferiblemente azul de metileno o fucsina.

Técnica:

1. Extensión.
2. Desecación.
3. Fijación. Dejar enfriar.
4. Tinción: Se cubre la preparación con el colorante (azul de metileno)
durante 1-2 minutos.
5. Lavado: Se lava con abundante agua para eliminar el exceso de
colorante. Lo idóneo es usar agua destilada, pero tambien se puede usar
agua corriente (esto puede causar errores, como por ejemplo depósitos
de cal).
6. Secado: Se secará primeramente entre papel de filtro, evitando presionar
directamente sobre la extensión. Se limpiarán los restos de colorante que
queden en el portaobjetos fuera de la extensión y se dejará que acabe de
secarse al aire.
7. Observación al microscopio. Se observarán las bacterias con su forma y
agrupación característica, teñidas de azul.

TINCIONES DIFERENCIALES

TINCIÓN DE GRAM

Se estudia con esta coloración la morfología de las bacterias y su forma de


agrupación y a la vez tiene interés taxonómico ya que se emplea para diferenciar
los dos tipos clásicos de microorganismos: Gram (+) y Gram (-).

Las bacterias que son capaces de retener el primer colorante usado (Cristal
violeta o Violeta de genciana) aun después de la decoloración son las
denominadas Gram (+). Las bacterias Gram (-) pierden el colorante al ser
tratadas con el decolorante.

Como se ha indicado la diferencia entre los dos tipos reside en la pared celular:

Las Gram (+) tienen una pared muy gruesa, con una malla bien engarzada,
reteniendo bien el colorante durante la coloración. La pared de las Gram (-) es
mas delgada y su malla es más floja, por lo que el decolorante destiñe a este tipo
de bacterias.

Además las Gram (+) tienen en su pared celular un contenido de lípidos (1-4 % )
menor que en las Gram (-) ( 11-20 % ). Estos lípidos van a ser disueltos por el

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decolorante orgánico empleado, aumentando la permeabilidad de la membrana y


eliminando el colorante, decolorándose con facilidad las Gram (-).

El valor diagnóstico de esta tinción es variable; normalmente permite una buena


orientación al microbiólogo para seleccionar las técnicas de cultivo más
adecuadas y también tiene valor en orientar hacia un diagnóstico etiológico, en
especial para instaurar un tratamiento inicial; en otras ocasiones el diagnóstico
puede considerarse prácticamente cierto, como ocurre en el caso de la uretritis
gonocócica aguda masculina, la meningitis purulenta por meningococo o
neumococo, etc.

Técnica:

1. Extensión.
2. Desecación.
3. Fijación. Dejar enfriar.
4. Coloración: Se cubre la preparación con Violeta de Genciana o Cristal
violeta y se deja actuar durante 1,5 o 2 minutos.
5. Lavar ligeramente con agua para eliminar el exceso de colorante o
simplemente volcar el portaobjetos y escurrir el colorante. A continuación
se cubre la preparación con Lugol (mordiente) durante 2 minutos. El
mordiente produce una unión mas intima entre el colorante y la estructura
a colorear. La función de mordiente la tiene el Iodo; el Ioduro potásico se
utiliza para favorecer la disolución del Iodo metálico en el agua.
6. Decoloración: Escurrir la solución de Lugol, lavar con agua y sosteniendo
el portaobjetos entre el pulgar y el índice decolorar con Alcohol-acetona
hasta apenas arrastrar colorante violeta. Al añadir cristal violeta se tiñen
todas las bacterias, pero al decolorar solo las G (-) pierden el colorante.
7. Lavar con agua abundante a fin de detener la decoloración.
8. Coloración de contraste: Se cubre la preparación con Fucsina fenicada
diluida o con Safranina (preferentemente) y se deja actuar durante 1-2
minutos.
9. Lavar con agua.
10. Secado.
11. Observación al microscopio. Las bacterias gram positivas se observan de
color azul violeta y las gram negativas de color rosa.

Existe una variante de la tinción de Gram ideada para daltónicos en la que en


lugar de usar Safranina o Fucsina fenicada como colorante de contraste, se
emplea el marrón de Bismarck durante 30-60 segundos. Las bacterias G (-) se
observarán, en este caso, de color pardo-amarillento.

Hay ciertos grupos de bacterias que pierden sus características tintoriales


cuando envejecen, pasando de G (+) a G (-); a estas bacterias se les denomina
Gram lábiles o Gram variables. Se recomienda realizar la tinción de Gram a
cultivos de 24 horas.

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TINCIONES PARA ÁCIDO-ALCOHOL RESISTENTES

Existen una serie de microorganismos que poseen en su pared celular ciertos


lípidos complejos, que dificultan la penetración de los colorantes en la célula.
Solamente utilizando colorantes enérgicos como la fucsina fenicada, y forzando
su acción mediante la aplicación de calor o prolongando el tiempo de contacto,
estos microorganismos logran retener el colorante. Y lo hacen de tal manera,
que incluso decolorantes muy enérgicos como el alcohol-ácido no consiguen
decolorarlos. Por esto se denominan ácido- alcohol resistentes.

Los géneros Mycobacterium, Nocardia, y los parásitos coccídeos como


Cryptosporidium, se caracterizan por sus propiedades de ácido-alcohol
resistencia.

Estas tinciones constituyen una importante ayuda para la búsqueda del bacilo de
Koch (Mycobacterium tuberculosis).Entre ellas podemos citar: la tinción de
Zhiehl-Neelsen y la de Kinyoun.

TINCIÓN DE ZIEHL-NEELSEN

Los colorantes y reactivos usados en esta tinción son:

o Fucsina fenicada.
o Alcohol-ácido (decolorante). Alcohol de 961: 97 ml.; ClH : 3 ml. Hay
que añadir lentamente el ácido al alcohol ya que puede haber
desarrollo de calor.
o Azul de metileno o Verde de malaquita.

Técnica:

1. Extensión.
2. Desecación.
3. Fijación. Dejar enfriar.
4. Coloración: Cubrir la preparación con fucsina fenicada y calentar el
portaobjetos o bien directamente sobre el mechero o bien utilizando un
algodón impregnado en alcohol, hasta la emisión de vapores por parte de
la preparación. Cuando se observa la emisión de vapores se retirará el
foco calorífico, volviéndolo a aplicar 2 0 3 veces de modo que se
mantenga dicha emisión durante 5 minutos. Hay que evitar la ebullición
del colorante y que en ningún momento la preparación quede sin
colorante. También se puede realizar la coloración cubriendo la
preparación con un rectángulo de papel de filtro y añadiendo el colorante
de modo que quede perfectamente impregnado el papel de filtro. A
continuación se irá calentando manteniéndose la emisión de vapores
durante 5 minutos sin dejar que se seque el papel de filtro.

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5. Se dejará enfriar y se lavará con agua. En el caso de utilizar papel de filtro


se retirará este mediante unas pinzas y a continuación se lavará con
agua.
6. Decoloración: enérgicamente con alcohol-clorhídrico hasta que la
preparación quede con un ligero tinte rosa. A continuación se lavará con
agua.
7. Coloración de contraste: Cubrir la preparación con azul de metileno
durante 2-3 minutos.
8. Lavar con agua.
9. Secar y observar el microscopio.

Los microorganismos ácido-alcohol resistentes se observarán de color


rojo y los restantes de color azul. Si como colorante de contraste en vez de azul
de metileno se hubiera empleado verde malaquita, los microorganismos no
ácido-alcohol resistentes se observan de color verde.

TINCIÓN DE KINYOUN

Es una tinción ácido-alcohol resistente, modificación de la de Ziehl-Neelsen,


llamada tambien como método frío debido a que en lugar de emplear calor para
facilitar la penetración del colorante se aumenta la proporción ed fenol y fucsina
en la fórmula del colorante con respecto a la fucsina de Ziehl.

Técnica:

1. Extensión.
2. Desecación.
3. Fijación. Dejar enfriar.
4. Coloración: Cubrir la preparación con la fucsina de Kinyoun y dejar actuar
durante 5-7 minutos-min., sin calentar.
5. Lavar con agua o simplemente escurrir el colorante.
6. Decolorar con alcohol-HCl.
7. Lavar con agua.
8. Coloración de contraste: azul de metileno durante 2-3 min.
9. Lavar, secar y observar al microscopio.

La observación será similar a la expuesta en la tinción de Ziehl-Neelsen.

Cuando se observa una tinción AAR se recomienda hacer una valoración


cuantitativa de los bacilos presentes en la muestra. El objetivo se ha de colocar
en el extremo de la preparación y se recorre toda una línea (100 campos en
objetivo de inmersión) contando los bacilos AAR encontrados. Una forma de
informar número de BAAR observados en frotis teñidos es la siguiente:

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N1 de BAR observados Informe del método CDC


0 Negativo para BAR (-)
1 - 2/300 F N1 visto ( )
1 - 9/100 F N1 promedio/100 F (1+)
9 - 9/10 F N1 promedio/10 F (2+)
1 - 9/F N1 promedio/F (3+)
> 9/F > 9/F (4+)

Estos datos se refieren a observación en microscopio con objetivo de inmersión.

Existen factores para establecer una equivalencia entre estos datos y los
correspondientes a la observación con objetivo 25X o 40X.

TINCIONES ESTRUCTURALES

Utilizan más de un colorante y sirven para poner de manifiesto distintas


estructuras bacterianas.

TINCIÓN DE ESPORAS. MÉTODO DE WIRTZ-CONKLIN

Algunos microorganismos tienen la propiedad de formar esporas, que son


formas de resistencia. Su formación se debe a una concentración de
protoplasma bacteriano. Pueden ser de forma esférica u oval y de diverso
tamaño. Pueden ser de localización central, subterminal, o terminal. También
pueden salir al exterior.

La pared de las esporas es bastante impermeable, por lo que cuesta trabajo


teñirlas, de modo que en las preparaciones teñidas por los métodos corrientes,
las esporas aparecen como cuerpos incoloros y refringentes. Pero si se fuerza la
coloración mediante el calor, el colorante llegará a teñir las esporas.

Debido a la citada impermeabilidad de la pared de las esporas, durante el


periodo de decoloración, se decolorará toda la célula bacteriana excepto las
esporas.

Se necesitan cultivos de al menos 48 horas, para que el microorganismo haya


tenido tiempo suficiente de formarlas.

Técnica:

1. Extensión.
2. Desecación.
3. Fijación. Dejar enfriar.
4. Coloración: Cubrir la preparación con verde malaquita al 5% en solución
acuosa, manteniéndola a emisión de vapores durante 5 min, teniendo las

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mismas precauciones que las especificadas en la tinción de Ziehl-


Neelsen.
5. Dejar enfriar.
6. Lavar con abundante agua. La espora sigue teñida de verde y la célula
vegetativa pierde el colorante.
7. Colorante de contraste: Safranina y dejar actuar durante 1 min.
8. Lavar con agua.
9. Secar y observar al microscopio. Las esporas se verán de color verde y
las células vegetativas se observarán de color rosa. La disposición y
tamaño de las esporas tiene gran interés en taxonomía.

Existe otra tinción de esporas, el método de Moeller, que utiliza como reactivos:
solución acuosa de ácido crómico, fucsina fenicada de Ziehl-Neelsen, solución
acuosa de clorhidrato de anilina, azul de metileno y alcohol absoluto.

TINCIÓN DE FLAGELOS

Para su observación, se debe partir de cultivos jóvenes, de entre seis y doce


horas.

Se prepara una suspensión del germen en agua destilada, mezclando


suavemente hasta obtener una suspensión lechosa. Si se sospecha que el
germen es patógeno, se debe utilizar agua formolada al 5-10%.
Se deposita unas gotas de la suspensión en un extremo del portaobjetos
inclinado, de forma que las gotas se extiendan a lo largo del cristal. Se dejará
secar al aire sin aplicar calor.

A) MÉTODO DE RHODES

o Se cubre la extensión con el mordiente de Rhodes durante 3-5 min.


Lavar cuidadosamente con agua destilada, mejor por inmersión.

o Cubrir con la solución de nitrato de plata amoniacal, calentándolo


hasta casi ebullición y dejándolo actuar de 3-5 min.

o Lavar con agua destilada y secar.

Se observa con objetivo de inmersión, directamente o bajo un cubreobjetos.

Los flagelos podrán observarse gracias al precipitado de nitrato de plata que se


deposita en torno suyo.

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B) MÉTODO DE TRIBONDEAU

o Se fija el frotis con alcohol y se cubre con la mezcla formada por 5


ml del mordiente de Tribondeau y 0,5 ml de cristal violeta
previamente sometida a ebullición. Se deja actuar durante 20
segundos.

o Se lava rápidamente con agua, sin volcar previamente el colorante,


se seca y se observa al microscopio con objetivo de inmersión.

Los flagelos se verán de color castaño.

C) MÉTODO DE LEIFSON

o Se cubre la preparación con el colorante de Leifson y se deja


actuar durante unos 10 minutos.

o Se lava con agua, sin volcar el colorante, se seca y se observa al


microscopio con objetivo de inmersión.

Los flagelos se observan de color rojo oscuro a azul negruzco.

TINCIÓN DE CÁPSULAS

La cápsula es una capa mucosa, más o menos gruesa, que envuelve la pared
celular de algunas bacterias.

A) MÉTODO DE HISS

o Realizar un frotis espeso de una mezcla de suspensión bacteriana


con solución fisiológica y suero sanguíneo. Secar a temperatura
ambiente y fijar al calor.
o Cubrir la preparación con solución de cristal violeta al 1% y
calentar con vapor fluyente durante un minuto.
o Lavar con solución de sulfato de cobre al 2%, secar y observar al
microscopio con objetivo de inmersión.

Las cápsulas se colorean de azul pálido y las bacterias de color púrpura.

B) MÉTODO DE LA TINTA CHINA

o Sin fijar el frotis, se cubre con fucsina diluida durante dos minutos.
Lavar con agua destilada y secar al aire.
o Se colocan en un extremo del porta dos gotas de nigrosina o de
tinta china y se hace una extensión por el método de los dos
portaobjetos. Se deja secar y se observa al microscopio con
objetivo de inmersión.

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El fondo aparecerá negro, las bacterias teñidas de rojo y la cápsula como un


halo blanco que las envuelve.

TINCIÓN DE CORPÚSCULOS METACROMÁTICOS

El género Corynebacterium presenta unos gránulos de reserva de fosfato,


llamados gránulos o corpúsculos metacromáticos.

A) MÉTODO DE ALBERT

o Se fija el frotis al calor, se cubre con el colorante de Albert, se deja


actuar durante 15 minutos y se lava con agua destilada.
o Se cubre la preparación con lugol durante un minuto, lavar con
agua, secar a temperatura ambiente y observar con objetivo de
inmersión.

Los corpúsculos metacromáticos se tiñen de color azul oscuro.

B) MÉTODO DE LOEFFLER

o Fijar el frotis con calor, cubrir con el colorante de Loeffler y dejar


actuar durante tres minutos.
o Lavar con agua destilada, dejar secar y observar con objetivo de
inmersión.

Los gránulos se verán de color azul intenso.

C) MÉTODO DE ERNST-NEISSER

o Fijar el frotis al calor, cubrir con azul acético y dejar actuar durante
10 min, calentando hasta emisión de vapores los primeros minutos.
o Lavar con agua destilada y cubrir con una solución de vesuvina
durante un minuto.
o Lavar, secar y observar con objetivo de inmersión.

TINCIONES DIFERENCIALES PARA PARÁSITOS

Diversas coloraciones diferenciales son empleadas para mejorar la visualización


y destacar la estructura interna de quistes, trofozoitos u otras formas de
parásitos, especialmente de los que se encuentran en heces. Entre éstas
podemos destacar la de Wheatley-tricromo y la de hierro hematoxilina.

La coloración con toluidina O, se emplea para el examen rápido de material del


tracto respiratorio con el fin de determinar la presencia de Pneumocystis carinii.
Una modificación rápida de la coloración de Gomori con metenamina-plata ha
demostrado ser muy valiosa para el diagnóstico de P. carinii en lavados
bronquiales y otras muestras.

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TINCIONES DIFERENCIALES PARA FROTIS DE SANGRE Y CORTES DE


TEJIDOS

Los parásitos que circulan en la sangre con frecuencia se encuentran dentro de


los eritrocitos o libres en el plasma. Se han desarrollado diversas coloraciones
que permiten diferenciar estos parásitos de los componentes celulares normales.
Las dos coloraciones que se emplean más comúnmente son la de Wright y la de
Giemsa.

La tinción de Giemsa también se emplea para visualizar inclusiones virales o de


otro origen en las células infectadas que se obtienen directamente de materiales
clínicos, como la base de vesículas que se supone son herpéticas o raspados de
córnea en casos sospechosos de conjuntivitis por Chlamydia trachomatis.

También puede detectarse mediante la coloración de Giemsa la presencia de


otros parásitos como toxoplasma en tejido cerebral. Ni la tinción de Wright ni la
de Giemsa teñirán en forma regular los elementos fúngicos o bacterianos, de
modo que deben usarse junto con otras coloraciones si se desconoce totalmente
la etiología de la supuesta infección.

Se conocen otras tinciones que son empleadas para propósitos especiales,


como la coloración con yodo para detectar la presencia de inclusiones en
monocapas celulares infectadas con clamidias, la de Sellers para cuerpos de
inclusión en tejidos infectados con el virus de la rabia y la de Giménez para
Chlamydia y Legionella.

TINCIONES PARA HONGOS

Los elementos de los hongos pueden visualizarse en materiales fijados por


diversas coloraciones. La coloración con ácido preyódico-Schiff (PAS) es
probablemente una de las mejores tinciones generales ya que la mayoría de los
hongos presentes en materiales clínicos (esputo, tejidos, etc.) tomarán la
coloración. La metenamina-plata, además de teñir a ciertos parásitos, también
colorea las paredes de las células micóticas de marrón oscuro-negro. El
polisacárido capsular de ciertos hongos, especialmente Cryptococcus
neoformans, toma un color rosa brillante con la coloración de mucicarmín, que
ha demostrado ser muy útil para diferenciar este hongo en los tejidos.

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TINCIONES FLUORESCENTES

Algunos colorantes denominados


fluorocromos tienen la propiedad de
ser excitados cuando absorben luz
ultravioleta (luz de longitud de onda
corta). A medida que las moléculas
excitadas regresan a su estado
normal, liberan el exceso de energía
en forma de luz visible de mayor
longitud de onda que la radiación
excitante. Esta propiedad se
denomina fluorescencia. Los objetos
fluorescentes aparecen
brillantemente iluminados contra un
fondo oscuro, según el color del colorante usado. En la figura anterior se
representa un diagrama de un microscopio de fluorescencia.

TINCIÓN FLUORESCENTE CON AURAMINA-RODAMINA

Es una tinción muy usada para micobacterias, cuando el volumen de muestras a


examinar es elevado. Se fundamenta en la afinidad que poseen los ácidos
micólicos de la pared celular de las micobacterias por los colorantes
fluorescentes o fluorocromos Auramina y Rodamina. Estos colorantes se fijan a
las bacterias que aparecen de color amarillo o naranja brillante contra un fondo
oscuro.

Un aspecto importante de la coloración rodamina-auramina es que luego los


frotis pueden ser reteñidos con la coloración de Ziehl-Neelsen o Kinyoun
directamente sobre la tinción con el fluorocromo, si se elimina antes el aceite de
inmersión.

Técnica:

1. Extensión.
2. Desecación.
3. Fijación. Dejar enfriar.
4. Coloración: Cubrir la preparación con el colorante auramina-rodamina
previamente filtrado. Mantenerlo así durante 15 min. No hay que calentar.
5. Lavar con agua destilada.
6. Decoloración con alcohol -HCl. Cubrir la preparación con el decolorante y
dejar actuar de 3 a 4 minutos.
7. Lavar con agua destilada.
8. Añadir permanganato potásico al 0,5% en agua destilada y dejar actuar
de 2 a 4 minutos. El permanganato se utiliza para eliminar la
fluorescencia residual de los desechos de fondo. Pero debe evitarse el

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tratamiento excesivo con el contracolorante porque puede rebajar la


intensidad fluorescente de los bacilos coloreados.
9. Lavar con agua destilada.
10. Secar al aire y observar con el microscopio de fluorescencia.

El agudo contraste entre las micobacterias coloreadas brillantemente y el fondo


oscuro ofrece las grandes ventajas de una fácil, rápida y completa observación.
Puede usarse un objetivo de 25X (100X en la tinción de Ziehl-Neelsen y
similares), para observar el frotis, lo que permite la inspección de un área
extensa en poco tiempo. Otras ventajas son el mejor contraste, el mínimo
esfuerzo visual y la relativa falta de importancia de la agudeza para el color del
observador.

TINCIÓN FLUORESCENTE CON NARANJA DE ACRIDINA

Se basa en la tinción de los ácidos nucleicos de los microorganismos por el


fluorocromo naranja de acridina.
Esta tinción se utiliza principalmente para el estudio de microorganismos en
hemocultivos y líquido cefalorraquídeo.
La técnica es muy simple:

o Cubrir la preparación ya fijada con solución de naranja de acridina


durante 2 min.
o Lavar con agua destilada.
o Dejar secar.
o Observar al microscopio de fluorescencia. Las bacterias se
observan de color naranja fluorescente.

TINCIÓN FLUORESCENTE CON BLANCO DE CALCOFLÚOR

Las paredes celulares de los hongos fijan el colorante blanco de calcoflúor


aumentando considerablemente su visibilidad en los tejidos y otras muestras.

En algunos laboratorios ha suplantado al azul de lactofenol en muchas


aplicaciones. Los organismos fluorescen con luz blanco-azulada o verde
manzana, según la fuente luminosa.

TINCIONES DE INMUNOFLUORESCENCIA

Estas tinciones se basan en el uso de colorantes conjugados con anticuerpos.


Se emplean con profusión en el laboratorio los anticuerpos monoclonales, que
son muy específicos, conjugados con isotiocianato de fluoresceína. Sus
indicaciones son de dos tipos:

o La tinción de inmunofluorescencia directa (IFD) es útil para el


diagnóstico de Legionella, Neisseria gonorrhoeae y

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microorganismos difíciles de cultivar como Treponema,


Pneumocystis, Chlamydia, y virus Herpes.

o La tinción de inmunofluorescencia indirecta (IFI) se utiliza


preferentemente para el diagnóstico de algunas viriasis,
investigando los anticuerpos en el suero (virus Epstein-Bar).

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

El microscopio electrónico emplea electrones en vez de luz para visualizar


objetos pequeños. Mediante el empleo del microscopio electrónico se han
descubierto muchas características morfológicas de las bacterias, componentes
bacterianos, hongos y parásitos.

La microscopía electrónica permite efectuar el diagnóstico directo presuntivo de


diversas infecciones víricas, en particular las gastroenteritis e infecciones por
herpes simple.

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TEMA 14.- TÉCNICAS DE CULTIVO Y


AISLAMIENTO DE PATÓGENOS
INTRODUCCIÓN.

Para estudiar las reacciones metabólicas de las bacterias es necesario


cultivarlas en medios de cultivo, que son mezclas de sustancias que
proporcionan en forma asimilable todos los elementos necesarios para su
crecimiento y multiplicación.

Los medios de cultivo deben incluir los elementos indispensables para la vida
bacteriana, tales como carbono, nitrógeno, hidrógeno y oxígeno, elementos
minerales (fósforo, azufre, calcio, magnesio e hierro), micronutrientes o
elementos traza (Zn, Co, Cu, Mn,...) y factores de crecimiento (vitaminas, bases
púricas y pirimidínicas, aminoácidos,...)

COMPONENTES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

COMPONENTES BÁSICOS:

• Agua: Para asimilar los alimentos, las bacterias necesitan agua. También
da condiciones de humedad necesaria para la vida. El agua será destilada
ya que la del grifo contiene calcio y magnesio que pueden formar
precipitados con otros compuestos del medio de cultivo.

• Peptonas: proteínas parcialmente hidrolizadas. Principalmente son fuente


de nitrógeno, y también de carbono, azufre...

• Extracto de carne: Constituye una fuente de carbono, nitrógeno, sales


inorgánicas y factores de crecimiento.

• Cloruro sódico: Tiene como fin proporcionar un adecuado equilibrio


osmótico. Incrementa la presión osmótica del medio para evitar la lisis de
las bacterias.

• Agentes solidificantes: Los contienen los medios sólidos y semisólidos.


El agar es el más usado; la gelatina y la albúmina se usan escasamente.

OTROS COMPONENTES:

• Sustancias inhibidoras de crecimiento: Son sustancias que impiden el


crecimiento de los microorganismos que no nos interesan que se
desarrollen. Entre éstas podemos citar colorantes como el cristal violeta,

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el verde brillante que inhiben a gram positivos; sales biliares que también
inhiben a gram positivos; antibióticos, etc.

• Indicadores: Se utilizan para detectar variaciones en la acidez o


alcalinidad del medio causadas por el metabolismo bacteriano. Estas
variaciones se aprecian por el cambio de color del indicador.

• Sustancias enriquecedoras: Son sustancias que se añaden para


favorecer el crecimiento de ciertos microorganismos que son más
exigentes. Ej.: suero, leche, sangre, huevo.

• Agentes reductores: Se añade a los medios para promover la


anaerobiosis. Entre los más empleados están: tioglicolato sódico, cisteína,
ác. ascórbico.

• Hidratos de carbono: sobre todo mono y disacáridos. Se pueden


adicionar con fines de nutrición o para realizar pruebas de identificación
bioquímica.

• Sales minerales: sulfatos y fosfatos de calcio, potasio, magnesio, hierro,..

• Tampones estabilizadores del pH: ya que éste puede variar durante el


proceso de preparación del medio o como consecuencia de la
acumulación de los productos del metabolismo bacteriano.

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO.


NORMAS GENERALES.

Los medios de cultivo se comercializan desecados, en forma de polvo, para su


disolución y esterilización. Actualmente se pueden adquirir también medios
sólidos ya preparados, dispuestos en frascos, que se licuan mediante ebullición y
se dispensan en placas; medios en tubos y medios sólidos en placa, listos para
su inoculación.

Aunque esta última práctica se ha extendido enormemente facilitando el trabajo


rutinario, conviene conocer las operaciones necesarias para preparar un medio
de cultivo en buenas condiciones. Para ello seguiremos los siguientes pasos:

A) PESADA DE LOS COMPONENTES:

Debe ser lo más precisa posible. Como hemos dicho anteriormente, actualmente
los medios vienen deshidratados y no habría que pesar uno por uno cada
componente.

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B) DISOLUCIÓN DE LOS COMPONENTES:

Siempre se hace en agua destilada, salvo indicación contraria. El agua


desionizada no se aconseja. Los recipientes deben ser de vidrio y estar limpios.
El calor favorece o es imprescindible para la disolución de algunos productos,
pero debe limitarse al estrictamente necesario, sin llegar a la ebullición
prolongada. Para evitar el desborde por ebullición, los envases con soluciones
que deben ser esterilizadas en el autoclave, sólo deben contener dos tercios de
su volumen total de líquido.

C) AJUSTE DEL pH:

Es muy importante para la calidad del medio. Se realiza con tiras indicadoras y
soluciones de ácidos y bases. Normalmente se ajustan a pH neutro.

D) REPARTO EN RECIPIENTES:

Si el medio preparado se va a utilizar en tubos o frascos, se repartirá en éstos


con ayuda de un dosificador, se les pondrá un tapón y una vez rotulados se
dispondrán en gradillas o cestillos de autoclave y se procederá a su
esterilización. Si el medio se fuera a repartir en placas de Petri, se esterilizará en
el matraz donde se hubiese preparado y posteriormente se repartirá ante
mechero en placas estériles.

E) ESTERILIZACIÓN:

Se suele realizar en el autoclave a 1 atm. de sobrepresión (121º C), durante 15-


20 min..En caso de medios de cultivo que no se puedan esterilizar a estas
temperaturas, se recurrirá a la filtración esterilizante o bien a la tindalización.

Una vez que el ciclo de esterilización ha finalizado, debe reducirse lentamente la


presión dentro del autoclave. El medio no debe permanecer dentro de éste una
vez que se ha equilibrado la presión, ya que el calentamiento prolongado puede
alterar alguno de los componentes.

F) CONSERVACIÓN DE LOS MEDIOS:

Deben conservarse en el refrigerador (las placas, invertidas e introducidas en


bolsas de plástico; los tubos, convenientemente tapados). Transcurrido un mes,
no se debe usar ningún medio.

Si se quiere comprobar la esterilidad del medio, se incuban las placas o tubos a


37º C durante 48 h. y se comprueba si hay crecimiento.

La calidad final del medio de cultivo preparado depende de la forma en que se


prepara, por lo que es de real importancia que se sigan las normas expuestas
anteriormente.

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CLASIFICACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.

Se pueden clasificar atendiendo a distintos criterios:

ATENDIENDO A SU ESTADO FÍSICO:

• Líquidos: favorecen mucho el desarrollo y multiplicación de las bacterias


porque al difundirse estas por todo el medio encuentran fácilmente las
sustancias que necesitan para nutrirse. No contienen agar.

• Sólidos: contienen de 15 a 17 g de agar por litro. Las bacterias crecen


con mayor dificultad; no obstante, son de gran utilidad para el estudio de
las características de crecimiento, de la producción de hemólisis y otras
peculiaridades.
• Semisólidos: se utilizan mucho para observar la movilidad de los
microorganismos. Contienen agar en una proporción de 3 a 5 g. por litro.

ATENDIENDO A SU UTILIDAD:

GENERALES O COMUNES:

Son apropiados para el cultivo de la mayoría de los microorganismos por la


facilidad con que se desarrollan en ellos. Se usan para cultivar bacterias poco
exigentes.

Entre ellos podemos citar el caldo nutritivo, el TSB, el agar nutritivo y el TSA.

MEDIOS ESPECIALES:

Conocidos también como específicos, van dirigidos al cultivo de determinadas


especies bacterianas o son utilizados con fines de diferenciación.

Entre éstos tenemos:

A) MEDIOS ENRIQUECIDOS: son medios generales a los que se les añade


ciertos productos (sangre, suero, glucosa,...), favoreciendo así el crecimiento de
ciertos microorganismos muy exigentes. Ejemplos: agar-glucosa (agar nutritivo
añadido de glucosa), agar sangre (agar nutritivo añadido de sangre), agar
chocolate, etc.

B) MEDIOS SELECTIVOS: estos medios contienen componentes que inhiben el


desarrollo de ciertos microorganismos, lo cual permite aislar el microorganismo
que se busca. Entre estos medios podemos citar: agar Salmonella-Shigella (agar
SS, selectivo para Salmonellas y Shigellas), agar MacConkey (se utiliza para el
aislamiento de Enterobacterias), agar de Thayer-Martin (selectivo para
Neisseria), agar Manitol salado (Chapman, selectivo de Estafilococos coagulasa
positivos), agar de Lowenstein-Jensen (selectivo para el cultivo de

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micobacterias, especialmente Mycobacterium tuberculosis, agar de Sabouraud


(para el cultivo de la mayoría de las levaduras y hongos patógenos).

C) MEDIOS DIFERENCIALES: son aquéllos en los que además de crecer las


bacterias, al actuar éstas sobre alguno de los componentes específicos del
medio, demuestran alguna de sus propiedades bioquímicas. Contienen
azúcares e indicadores, concebidos para provocar una respuesta bioquímica
conocida (si la bacteria es capaz de fermentar el azúcar que lleva el medio, se
producirá una acidificación del medio con el consiguiente viraje de color del
medio por el cambio de pH).

Ejemplos:Agar hierro de Kligler, Agar de MacConkey (diferencia los bacilos


entéricos fermentadores y no fermentadores de la lactosa.

Fermentadores de lactosa---> colonias rosas;


No fermentadores de lactosa (lactosa negativos) ---> colonias incoloras).

D) MEDIOS DE ENRIQUECIMIENTO: son medios líquidos que favorecen o


permiten la multiplicación de unas bacterias, inhibiendo parcial o totalmente la de
otras. Ejemplos: agua de peptona alcalina (favorece la multiplicación de Vibrio
cholerae), caldo selenito (favorece el crecimiento de Salmonellas y Shigellas,
fundamentalmente Salmonellas).

E) MEDIOS DE TRANSPORTE: se utilizan para asegurar la viabilidad de las


bacterias desde el momento de la toma de las muestras hasta su posterior
siembra en el laboratorio o para su envío de unos laboratorios a otros.
Actualmente los medios de transporte más utilizados son los de Stuart, Amies, y
el medio de Cary-Blair.

F) MEDIOS DE CONSERVACIÓN: son una variación de los medios de


transporte. Aseguran las características morfológicas y fisiológicas de las
bacterias por un periodo largo de tiempo. Ejemplo: agar de tripticasa y soja.

Un gran número de medios de cultivo utilizados en el laboratorio de


microbiología se podrían englobar en varios de los grupos anteriormente
expuestos. Ej.: agar sangre, es un medio enriquecido y diferencial.

CONDICIONES NECESARIAS PARA EL DESARROLLO DE LOS


PATÓGENOS.

Para que las bacterias y hongos puedan desarrollarse en un medio artificial,


además de tener los nutrientes necesarios, se deben cumplir una serie de
condiciones:

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CONDICIONES ATMOSFÉRICAS:

Los microorganismos patógenos pueden ser aerobios, anaerobios,


microaerófilos, anaerobios facultativos y capnófilos.

Aerobios; es decir, utilizan el oxígeno como aceptor terminal de electrones y


presentan un desarrollo abundante en una atmósfera con la concentración
normal del aire.

Anaerobios: relativamente intolerantes a la presencia de oxígeno.

Microaerófilos: crecen bien en atmósferas con menor presión de oxígeno.

Anaerobios facultativos: pueden crecer en condiciones aerobias o anaerobias.

Capnófilos: crecen mejor en una atmósfera con mayor concentración de CO2


que la ambiental.

Los microorganismos aerobios y anaerobios facultativos pueden ser incubados


en una concentración de aire ambiental sin mayor dificultad.

Los microorganismos capnófilos pueden ser cultivados en una estufa de


incubación con puertas selladas, en una atmósfera de 5-10% de CO2.Una
mezcla adecuada de gas, contenido en cilindros cercanos, penetra
automáticamente en la estufa. Como rutina debe controlarse la concentración de
CO2.

El sistema más comúnmente usado para crear una atmósfera específica


anaerobia o capnófila es la jarra anaerobia. Las que se encuentran en el
comercio son la GasPak y las de Scott Laboratories y Oxoid U.S.A. Ambos
sistemas utilizan una jarra de plástico transparente, pesada, con una abrazadera
para evitar pérdidas.

Existen modelos que presentan en la tapadera un manómetro y válvulas para


hacer el vacío y para introducir la mezcla gaseosa que proporciona la
anaerobiosis. En la cara interior de la tapadera hay una especie de "clip" para
sujetar la bolsa que lleva el catalizador.

Las jarras para anaerobiosis se emplean principalmente para cultivos en placas.

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La atmósfera anaerobia en el interior de estas jarras se puede conseguir según


varios procedimientos:

A) TÉCNICA DE EVACUACION/REEMPLAZO:

En este procedimiento se precisa primero crear el vacío mediante una bomba de


vacío y una vez hecho ésto se introducirá la mezcla gaseosa que suele estar
constituida por un 10% de H2 , 5% de CO2 y 85% de N2 . Se usa un indicador
redox que nos permite controlar si se ha producido o no la atmósfera anaerobia.

B) TÉCNICA QUE EMPLEA UN SISTEMA GENERADOR DE H 2 Y CO2:

En este sistema utilizaremos:

* Generador descartable de H2-CO2, que consiste en una envoltura sellada de


papel de aluminio que contiene dos tabletas, una de las cuales contiene a su vez
ácido cítrico y bicarbonato sódico y la otra borohidruro de sodio. Cuando se
introduce agua en este sobre, la primera tableta libera CO2 y la segunda libera
H2. El H2 producido, en presencia del catalizador, reaccionará con el oxígeno
presente, produciendo agua.

2H2 + O2 ------> 2H2O

Existen sobres generadores de atmósferas especiales requeridas por


determinados microorganismos.

* Indicador de anaerobiosis: los hay de tipo bacteriológico y químico.

Los bacteriológicos consisten en introducir en la jarra un cultivo de un aerobio


estricto; si éste crece, indica un fallo en el establecimiento de la atmósfera de
anaerobiosis. El inconveniente de estos indicadores es que los resultados no son
conocidos hasta el final del período de incubación.
Por ello, son más usados los indicadores químicos, los cuales se decoloran
cuando están reducidos. En el mercado existen indicadores químicos como son
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las tiras de azul de metileno y tiras de resazurina. El azul de metileno es azul


cuando está oxidado y la resazurina es rosa.

* Catalizador en "frío": consta de unas bolitas de alúmina recubiertas de


paladio. Este catalizador se inactiva por el SH2 y otros productos metabólicos
volátiles producidos por las bacterias, así como por el exceso de humedad. Se
asegura una actividad óptima del catalizador reemplazándolo por uno nuevo
cada vez o bien "reactivándolo" después de cada utilización, lo cual se consigue
calentándolo en el horno a 160-170ºC durante 2 horas, y manteniéndolo en
recipiente seco y limpio después del calentamiento.

El proceso a seguir en esta técnica es el siguiente:

1. Reemplazar el catalizador por uno nuevo o "reactivado."


2. Colocar los materiales a incubar en la jarra; si son placas se colocaran en
el portaplacas de forma invertida
3. Abrir el sobre del indicador y exponer unos 10 mm de la tira.
4. Añadir 10 ml de agua al sobre generador.
5. Cerrar la jarra herméticamente y meterla en estufa para incubación.
6. Se puede comprobar el buen desarrollo del proceso por los siguientes
datos:

a. La tapadera, con el catalizador en su superficie interna, debe estar


caliente al tacto.
b. Debe aparecer en el interior de la jarra agua de condensación a los
15-30 minutos de haber añadido el agua al generador.
c. El indicador cambiará de color a las dos o tres horas.
d. Si la jarra lleva manómetro, se puede observar el buen desarrollo
del proceso mediante la evolución de los cambios de presión: la
producción de gas origina una presión positiva de
aproximadamente 0,3 bar. La presión bajará en un período de
30-40 minutos a 0,1 bares aproximadamente.

C) TÉCNICA QUE EMPLEA UN SISTEMA GENERADOR DE CO2:

En este sistema se utiliza el generador descartable de CO2 y un indicador de


anaerobiosis (igual al descrito anteriormente.)

El generador descartable de CO2 consiste en un sobre que contiene como


principio activo el ácido ascórbico. Cuando este sobre se coloca en una jarra
cerrada, el oxígeno atmosférico de la jarra es rápidamente absorbido con la
generación simultánea de dióxido de carbono. Este método difiere del anterior en
que la reacción continúa sin producción de hidrógeno, y por tanto no requiere un
catalizador. Tampoco es necesaria la adición de agua para activar la reacción.
Precauciones: tan pronto como la bolsita es expuesta al aire se inicia la
reacción. Es por tanto esencial colocar ésta en la jarra y cerrar ésta última en
menos de un minuto.

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Las condiciones anaerobias estrictas que exigen algunos microorganismos


pueden obtenerse en sistemas cerrados como una caja con guantes anaerobios
o cámara anaerobia, que consiste en una cámara de gas sellada con puertas en
forma de guantes y una cerradura para la transferencia de materiales dentro y
fuera de la cámara. El operador coloca sus manos y brazos dentro de los
guantes para manejar los materiales de cultivo que se han colocado dentro. Para
crear la atmósfera de anaerobiosis se usa un sistema similar al descrito en la
técnica de evacuación/reemplazo en la jarra de anaerobiosis. Con objeto de
eliminar el oxígeno residual que haya podido quedar se hace circular H2 a través
de un catalizador de paladio.

Los medios se incuban dentro de una incubadora colocada dentro de la cámara


o bien manteniendo toda la cámara a 35º C.

TEMPERATURA:

La temperatura óptima de incubación para la mayoría de los patógenos humanos


está próxima a la corporal (35-37º C), pero existen variaciones. Algunos no
pueden soportar esta Tª, y otros tienen un margen más amplio. Determinados
hongos y levaduras dermatofitos, crecen mejor a temperatura ambiente, próxima
a los 30ºC.

Es muy importante que la Tª de incubación se mantenga en los límites


establecidos durante todo el proceso .La humedad puede ser controlada de
forma automática si se hace llegar agua desde una fuente externa a medida que
el sistema lo necesita o manualmente si se coloca un recipiente con agua en el
estante inferior de la estufa.

TIEMPO DE INCUBACIÓN:

Será de 18-24 h, en términos generales. Algunas bacterias necesitan una


incubación adicional para desarrollarse bien y han de mantenerse hasta 48-72 h.

A veces será necesario más tiempo, como por ejemplo las que crecen a Tª < 17º
(psicrófilas) se mantienen 5 días a 17º C.; 15 días para los hongos dermatofitos.

pH DEL MEDIO :

Las bacterias se desarrollan habitualmente a pH próximo a la neutralidad,


aunque algunas exigen un pH específico distinto.

PRESIÓN OSMÓTICA:

Debido a la composición de la pared celular bacteriana, las bacterias se adaptan


bien a las variaciones de la presión osmótica; sin embargo, "in vitro", los medios
de cultivo se preparan en condiciones de isotonía.

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CARACTERISTICAS DE ALGUNOS MEDIOS DE CULTIVO EMPLEADOS


CON MAYOR FRECUENCIA.

Existen en el mercado una extensísima variedad de medios de cultivo, útiles


para su empleo en el laboratorio de Microbiología clínica, con lo que se van a
considerar solamente aquellos de mayor interés para el diagnóstico general.

AGAR NUTRITIVO

Composición: extracto de carne, peptona, cloruro sódico, agar y agua destilada.

Es un medio de cultivo general.Sirve como base para la preparación de otros


medios enriquecidos y selectivos.

CALDO DE TRIPTICASA Y SOJA ( TSB )

Composición: tripticasa, soja y agua destilada.

Es un medio de uso general. Se puede adicionar de agar para obtener un medio


sólido que, dispuesto en tubos inclinados, es de utilidad para el mantenimiento
de microorganismos. Si se le añade cistina se obtiene un medio más reducido y
capaz de conservar microorganismos que requieren bajas concentraciones de
oxígeno.

INFUSION DE CEREBRO Y CORAZON( BHI )

Composición: infusión de cerebro y corazón, peptona, glucosa, cloruro sódico,


fosfato disódico y agua destilada.

Es un medio enriquecido. Es un excelente caldo para hemocultivo.

CALDO DE TIOGLICOLATO

Composición: caseína, extracto de levadura, cloruro sódico, glucosa, tioglicolato


sódico, L-cistina, resazurina, agar y agua destilada.

Es el caldo de enriquecimiento más comúnmente usado en microbiología clínica.

Este medio lleva agentes reductores (tioglicolato y L-cistina) que disminuyen el


cociente de óxido-reducción y favorece el desarrollo de anaerobios. La
resazurina actúa como indicador (presenta color rosa en estado oxidado).La
pequeña proporción de agar (0,75 g/l) que contiene el medio tiene como finalidad
evitar que las corrientes de convección transporten el oxígeno atmosférico a toda
la masa de caldo.

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AGAR DE STUART

Composición: ácido tioglicólico, glicerofosfato sódico, cloruro cálcico, agar y agua


destilada.

Es un medio especialmente creado para el transporte de muestras. Va dispuesto


en tubos, en estado semisólido y con una profundidad adecuada, para conseguir
el fin que pretende.

AGAR DE MUELLER-HINTON

Composición: infusión de carne, aminoácidos, almidón, agar y agua destilada.

Es un medio enriquecido, utilizado como medio de elección para realizar pruebas


de sensibilidad a los antimicrobianos (antibiograma).

AGAR SANGRE

Composición: extracto de carne, peptona, cloruro sódico, sangre, agar y agua


destilada.

Es un medio enriquecido utilizado para el cultivo de microorganismos exigentes,


así como para estudiar la actividad hemolítica.

El medio base utilizado con mayor frecuencia para la fabricación de agar sangre
es el TSA (agar tripticasa soja), al que se adiciona sangre desfibrinada de
carnero, conejo o caballo en una proporción del 5-10%.La sangre se añade al
agar esterilizado y enfriado a 45-50º C, evitando la formación de burbujas. La
sangre humana procedente de banco tiene el inconveniente de contener citrato,
que puede inhibir el crecimiento de algunos microorganismos.

AGAR SANGRE PARA ANAEROBIOS

Se trata del mismo medio de agar sangre, al que se adicionan antibióticos para
el aislamiento selectivo de anaerobios. Los aminoglucósidos y la vancomicina
son los más empleados. El medio toma el nombre del antibiótico que lleva
incorporado: ejemplo agar kanamicina-vancomicina.

Medios enriquecidos muy utilizados son los de Schaedler y Wilkins-Chalgren.

AGAR CHOCOLATE

Composición: extracto de carne, peptona, cloruro sódico, sangre, agar y agua


destilada.

Lleva como base agar nutritivo, al que se agrega sangre desfibrinada cuando el
medio está a una temperatura de aproximadamente 80º C. El calentamiento

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tiene como fin la liberación de los factores X ( hemina) y V (difosfo-piridín-adenín-


nucleótido), necesarios para el desarrollo de algunos microorganismos. Está
especialmente indicado para Neisseria y Haemophilus.

AGAR CLED

Composición: extracto de carne, peptona, triptona, L-cistina, lactosa, azul de


bromotimol, agar y agua destilada.

Utilizado para el aislamiento y recuento de microorganismos en la orina. La


deficiencia en electrolitos logra inhibir la invasión o swarming del género Proteus.
La lactosa permite diferenciar los microorganismos fermentadores por el viraje
del indicador a amarillo.

AGAR MAC CONKEY

Composición: peptona, lactosa, cloruro sódico, sales biliares, cristal violeta, rojo
neutro, agar y agua destilada.

Es el medio primario selectivo y diferencial que se emplea más a menudo para el


aislamiento y diferenciación de bacilos entéricos gram negativos fermentadores y
no fermentadores de lactosa. Las sales biliares y el cristal violeta actúan como
inhibidores de gram positivos. Las bacterias que fermentan la lactosa producen
colonias de color rojo que pueden estar rodeadas de una zona opaca debida a la
precipitación de las sales biliares; las no fermentadoras dan colonias incoloras
más o menos transparentes.

AGAR DE LEVINE O EOSINA AZUL DE METILENO (EMB)

Composición: peptona, fosfato dipotásico, lactosa, eosina, azul de metileno, agar


y agua destilada.

Es un medio selectivo y diferencial que se usa para el aislamiento, el cultivo y


diferenciación de bacilos entéricos gram negativos. Las colonias fermentadoras
de la lactosa presentan un tono violeta más o menos intenso.

AGAR XLD (Xilosa-Lisina-Desoxicolato sódico)

Composición: extracto de levadura, xilosa, lactosa, sacarosa, lisina, desoxicolato


sódico, cloruro sódico, tiosulfato sódico, citrato férrico-amónico, rojo fenol, agar y
agua destilada.

Se considera un medio de selectividad moderada recomendado para el


aislamiento de Shigella (colonias transparentes no fermentadoras) y Salmonella
(colonias transparentes y negras no fermentadoras). El citrato y tiosulfato
permiten la visualización de microorganismos productores de sulfhídrico como

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colonias con centros negros. El desoxicolato sódico actúa como agente


selectivo.

AGAR DE HEKTOEN

Composición: extracto de levadura, peptona, lactosa, sacarosa, salicina, sales


biliares, fucsina ácida, cloruro sódico, hiposulfito sódico, citrato férrico-amónico,
azul de bromotimol, agar y agua destilada.

Es un medio diferencial y altamente selectivo para Salmonellas y Shigellas. Al


igual que el agar XLD, no necesita ser esterilizado en el autoclave antes de
verterlo en las placas, debido a que son tan pocos los microorganismos que
pueden desarrollar en él.

AGAR S-S (SALMONELLA-SHIGELLA)

Composición: extracto de carne, peptona, lactosa, sales biliares, citrato sódico,


citrato férrico, tiosulfato sódico, verde brillante, rojo neutro, agar y agua destilada.

Es un medio diferencial selectivo utilizado para el aislamiento de Salmonellas y


Shigella. El desarrollo de otros bacilos gram negativos y de cocos gram positivos
está inhibido por el verde brillante, las sales biliares y las elevadas
concentraciones de tiosulfato y citrato.

CALDO DE SELENITO

Composición: triptona, fosfato disódico, lactosa, selenito sódico y agua destilada.

Se utiliza para el enriquecimiento de Salmonella. El selenito presente en el


medio inhibe a otras bacterias entéricas en las primeras horas de incubación.

CALDO GN

Composición: triptona, glucosa, manitol, citrato sódico, desoxicolato sódico,


cloruro sódico, fosfato dipotásico, fosfato monopotásico y agua destilada.

Se emplea como caldo de enriquecimiento selectivo para el cultivo de


Salmonellas y Shigellas.

CALDO DE TETRATIONATO

Composición: peptona de soja, hidrolizado trípsico de caseína, cloruro sódico,


carbonato cálcico, bilis, tiosulfato sódico y agua destilada.

Es un medio selectivo utilizado para el enriquecimiento de Salmonella.

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AGAR CIN

Composición: extracto de levadura, peptona, manitol, sales biliares, cefsulodina,


irgasán, novobiocina, rojo neutro, cristal violeta, agar y agua destilada.

Es un medio selectivo para Yersinia.

AGAR MANITOL SALADO (CHAPMAN)

Composición: extracto de carne, peptona, cloruro sódico, manitol, rojo fenol, agar
y agua destilada.

Es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de Staphylococcus, basado


en la tolerancia que poseen a una alta concentración de cloruro sódico (7,5%).
Sirve también como medio diferencial de cepas fermentadoras del manitol.
Staphylococcus aureus en condiciones anaerobias es la única especie del
género que produce esta fermentación.

AGAR DE THAYER MARTIN

Tiene como base el agar chocolate, suplementado por la adición de extracto de


levadura y otros factores de enriquecimiento. También lleva añadidos antibióticos
tales como vancomicina, colimicina y nistatina, lo que le confiere un carácter
altamente selectivo.

El medio de Thayer Martin permite el crecimiento de cepas exigentes de


Neisseria, tales como Neisseria gonorrhoeae y Neisseria meningitidis.

AGAR NEW YORK CITY(NYC)

Es un medio muy similar al anterior, usado con los mismos fines. Además de los
tres antimicrobianos del agar de Thayer-Martin, lleva añadido trimetoprim para
hacerlo más selectivo.

AGAR GARDNERELLA

Composición: extracto de carne, peptona, cloruro sódico, sangre humana, tween


80, ácido nalidíxico, colimicina, anfotericina B, agar y agua destilada.

Permite el crecimiento rápido de Gardnerella vaginalis.

AGAR GRANADA

Composición: proteosa peptona, almidón, glucosa, piruvato sódico, fosfato


disódico, MOPS hemisódico, metotrexato, colimicina, metronidazol, cristal
violeta, suero de caballo, agar y agua destilada.

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Es un medio especial y selectivo para el aislamiento, detección e identificación


de Streptococcus agalactiae (grupo B).Para que el medio ofrezca un rendimiento
del 100% debe incubarse en anaerobiosis.

AGAR DE BORDET-GENGOU

Composición: infusión de patata, proteosa peptona, cloruro sódico, glicerol


sangre, agar.

Es un medio enriquecido que se utiliza para el aislamiento de las especies del


género Bordetella.

MEDIO DE LOEFFLER

Composición: suero de buey, caldo glucosado, polvo de huevo.

Se utiliza para el cultivo de Corynebacterium y otros microorganismos exigentes.


Asimismo en él se pone en evidencia la cromogénesis y poder proteolítico de
ciertas bacterias.

AGAR SABOURAUD

Composición: peptona, glucosa, agar y agua destilada.

Este medio se adapta particularmente al cultivo de la mayoría de levaduras y


hongos patógenos. El medio contiene una cantidad mínima de nutrientes y un
pH ácido (5,6) que lo hace selectivo. Suele adicionarse de antibióticos
(gentamicina, cloranfenicol) para potenciar su selectividad.

AGAR DE LOWENSTEIN-JENSEN

Composición: fosfato monopotásico, sulfato magnésico, citrato magnésico,


asparagina, fécula de patata, glicerina, verde malaquita, huevo y agua destilada.
Es un medio utilizado para el cultivo de Mycobacterium. En este medio también
pueden crecer y diferenciarse las especies del género Nocardia. Se debe
esterilizar por tindalización.

AGAR CAMPYLOBACTER (PRESTON)

Composición: caldo nutritivo, carbón activado, hidrolizado de caseína,


desoxicolato sódico, sulfato ferroso, piruvato sódico, cefoperazona, agar y agua
destilada.

Ha sido especialmente preparado para el cultivo y diferenciación de especies del


género Campylobacter a partir de muestras fecales. La incubación a temperatura
elevada (42ºC) limita mucho el crecimiento de la flora acompañante.

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Otro medio también utilizado para el aislamiento de Campylobacter es el agar


Skirrow.

AGAR COLUMBIA

Composición: mezcla de peptonas, almidón, cloruro sódico, agar y agua


destilada.

Es un medio enriquecido que se utiliza para el cultivo de microorganismos


exigentes y como base para la preparación de agar sangre y agar chocolate.

AGAR TCBS

Composición: peptona de caseína, peptona de carne, extracto de levadura,


citrato sódico, tiosulfato sódico, agar y agua destilada.

El agar TCBS es un medio selectivo utilizado para el aislamiento de Vibrio.

TECNICAS DE AISLAMIENTO EN PLACA O INOCULACION POR ESTRIAS Y


RECUENTO DE PATOGENOS

Para el aislamiento, por lo general el inóculo se extiende sobre la superficie de


las placas según un modelo o patrón estandarizado, de modo que el desarrollo
bacteriano pueda ser determinado en forma semicuantitativa o relativa. Un
modelo útil de estrías se presenta en la figura.

Hay otras técnicas de estriación, con ligeras modificaciones, que persiguen fines
concretos: estriación de 3/4 de la placa para muestras con alto contenido
microbiano, estriación de varias placas en cadena para muestras con flora mixta
difícil de separar (aislamiento por agotamiento), descarga central con
estriaciones laterales para muestras con escaso contenido microbiano, estriación
libre, según las preferencias.

Cuando se trabaja con muestras muy espesas, como esputo, y con algunos
medios muy selectivos, como los agares para heces, se obtienen mejores
aislamientos si se lleva el asa varias veces al área de inoculación original
durante la etapa de siembra inicial. Consideremos que para la mayoría de las
muestras no es necesario quemar el asa entre dos áreas de siembra, pero

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puede ser beneficioso cuando el inóculo original proviene de una colonia


bacteriana en crecimiento.

Para facilitar el recuento de las colonias debe sembrarse la placa con una
cantidad medida de inóculo con un asa calibrada y siguiendo la técnica de
siembra masiva, como se muestra en la figura.

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TEMA 15.- MÉTODOS DE


IDENTIFICACIÓN BACTERIANA

INTRODUCCIÓN
En clínica la rápida y correcta identificación del microorganismo o
microorganismos causantes de una infección puede ser trascendental para la
implantación del tratamiento adecuado. De ahí la importancia de las pruebas que
se seleccionen para llegar a dicha identificación.

El método más extendido para llegar a la identificación de microorganismos se


basa en la realización de una batería de pruebas bioquímicas, a través de las
cuales se va a detectar el metabolismo del microorganismo, enzimas que posee,
características de resistencia a determinadas sustancias, etc... La identificación
es tanto mejor cuanto mayor es el número de caracteres investigados.

Para realizar correctamente las pruebas bioquímicas es fundamental tener


colonias perfectamente aisladas, es decir, partir de cultivos puros. Por otro
lado, se debe realizar un control periódico de medios y reactivos mediante el
empleo de microorganismos positivos y negativos.

CLASIFICACIÓN DE LAS PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Las pruebas bioquímicas de identificación bacteriana las podemos clasificar


atendiendo a varios criterios:

PROCESOS RESPIRATORIOS QUE UTILIZAN LAS BACTERIAS PARA LA


OBTENCIÓN DE ENERGÍA

A) PRUEBA DE LA CATALASA

* Fundamento: se investiga la presencia en el microorganismo de la enzima


catalasa, capaz de descomponer el peróxido de hidrógeno o agua oxigenada
(H2O2) en H2O y O2, que se desprende en forma de burbujas en el medio. El
H2O2 se forma como un producto terminal oxidativo de la descomposición
aeróbica de los azúcares; si se acumulara sería tóxica para la bacteria.

* Reactivo: H2O2 de 10 volúmenes (3%).

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* Técnica:

Con un asa o hilo de inoculación, recoger el centro de una colonia pura de 18-24
h. y colocarla sobre un portaobjetos limpio. A continuación agregar una gota de
agua oxigenada de 10 volúmenes sobre el microorganismo del portaobjetos.

No invertir el orden del método pues pueden registrarse falsos positivos


especialmente si se utilizan hilos o asas que contengan hierro. Si se están
utilizando asas o hilos de platino también se puede caer en este error ya que el
platino puede producir un resultado falsamente positivo. El nicrom no ocasiona
estos problemas. No es necesaria la mezcla del cultivo y el agua oxigenada con
la aguja o el asa de inoculación.

Si el microorganismo es catalasa [+] se observará de inmediato la aparición de


burbujas (liberación de gas).

También se puede realizar esta prueba agregando directamente el agua


oxigenada a un cultivo puro de agar en pico de flauta o en placa (sobre colonias
aisladas en este caso).

* Precauciones:

• Se debe evitar la utilización de agar-sangre como medio de cultivo ya que


los eritrocitos contienen la enzima catalasa y podemos obtener falsos
positivos.

• El H2O2 al 30% (100 volúmenes ) es una solución bastante cáustica.

• No se deben usar cultivos excesivamente viejos, ya que con el tiempo


pueden perder la actividad catalásica, pudiéndose obtener falsos
resultados negativos.

• No utilizar asas o hilos de platino, ni que contengan vestigios de hierro.

* Interés: diferenciación de los géneros:

- Streptococcus [-], Micrococcus [+] y Staphylococcus [+]


- Clostridium [-] y Bacillus [+].

B) PRUEBA DE LA OXIDASA

* Fundamento: se investiga la presencia de la enzima citocromooxidasa en el


microorganismo, la cual oxida al dimetil-parafenilen-diamina (reactivo incoloro)
dando un producto de color.

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TEMARIO DE T.E.L

El sistema citocromooxidasa se encuentra, por lo general, en microorganismos


aerobios.

* Reactivos: Dimetil-p-fenilendiamina o tetrametil-p-fenilendiamina impregnado


sobre tiras o discos de papel de filtro.

* Técnica. Lectura e interpretación de resultados:

1. Colocar una tira o disco impregnado de reactivo en un porta.

2. Tomar una colonia con el asa y depositarla sobre la tira o disco.


3. La aparición de un color azul oscuro indica la existencia del enzima
citocromooxidasa (prueba positiva).

* Precauciones:

o Proteger el reactivo de la luz ya que se altera con ella.

o Guardar en frío.

o Los medios que contienen colorantes pueden interferir la reacción.

o Algunas asas de cultivo metálicas pueden interferir la reacción. Se


ha comprobado que la presencia de un simple vestigio de hierro
puede por sí solo catalizar la oxidación del reactivo, dando una
falsa reacción positiva. Por ello deben utilizarse asas desechables
o bastoncillos.

* Interés: ayuda a la identificación de los géneros Pseudomonas (por lo general


positivo) de las Enterobacterias [-], entre otros.

C) PRUEBA DE ÓXIDO-FERMENTACIÓN

* Fundamento: mediante esta prueba se va a determinar si la utilización de los


hidratos de carbono por parte de un microorganismo se realiza por vía oxidativa
(proceso aeróbico, presencia de oxígeno) o por vía fermentativa (proceso
anaeróbico, ausencia de oxígeno).

* Medio de cultivo: Medio de Huhg y Leifson: es un medio semisólido en tubo


que lleva incorporado el azúcar y azul de bromotimol como indicador. Se
esteriliza a 112º 30 minutos.

La concentración de agar empleado (3 g/l) permite también la observación de la


movilidad, además de la capacidad oxidativa o fermentativa de un
microorganismo.

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TEMARIO DE T.E.L

La glucosa es el hidrato de carbono más comúnmente empleado en el medio


base de O/F. Sin embargo, un microorganismo puede no metabolizar la glucosa
y sí otros hidratos de carbono. Convendría emplear una batería en la que se
incluyeran otros hidratos de carbono como lactosa, sacarosa,...

El azul de bromotimol es un indicador de pH, que a pH ácido presenta color


amarillo; a pH básico, color azul y a pH neutro color verde.

* Técnica: se inocula por picadura y por duplicado, cubriendo uno de los tubos
con parafina líquida para crear condiciones de anaerobiosis. La positividad se
traduce por el viraje amarillo del indicador.

Se incuban los tubos durante 3 o 4 días a 37º C, ya que algunos


microorganismos producen reacciones lentas o débiles. La observación de los
resultados será diaria.

* Lectura e interpretación de resultados: mediante la utilización de este medio


se pueden apreciar tres caracteres:

o Movilidad: +, cuando el microorganismo no limita su crecimiento a


la línea de la siembra.

o Producción de gases: se detecta por la aparición de burbujas en el


medio.

o Vía oxidativa o fermentativa para la utilización del hidrato de


carbono:

tubo abierto tubo cerrado vía utilizada


amarillo verde oxidativa
amarillo amarillo fermentativa
verde verde no utilizan el hidrato de carbono

* Interés: generalmente para diferenciar


géneros intestinales no Enterobacterias Gram
(-) de las Enterobacterias. Ej.: Enterobacterias
fermentan la glucosa; Pseudomonas oxida la
glucosa.

Esta prueba ayuda también a la diferenciación


de los géneros de la familia Micrococcaceae
(Micrococcus, por lo general oxida la glucosa;
Staphylococcus la fermenta).

Otras pruebas incluidas en este apartado son:

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TEMARIO DE T.E.L

D) PRUEBA DE LA REDUCCIÓN DE NITRATOS (para diferenciar especies de


Haemophilus, así como para identificar Enterobacterias, generalmente positivas.

E) TEST DE BRAUM O PRUEBA DEL CIANURO POTÁSICO (para


diferenciación de Enterobacterias).

F) PRUEBA DE LOS CALDOS FECALES ( FK Y SF ), para diferenciar


Streptococcus.

PRUEBAS BASADAS EN EL METABOLISMO GLUCÍDICO

La mayoría de las bacterias son capaces de metabolizar la mayoría de los


hidratos de carbono, ya sea por vía oxidativa o fermentativa. Incluiremos las
siguientes pruebas:

A) PRUEBA DE LA â-GALACTOSIDASA (ONPG)

* Fundamento: demostrar la presencia en el microorganismo de la enzima â-


galactosidasa, utilizando el orto-nitro-fenil-â-D-galacto-piranósido (ONPG).

Si el microorganismo posee esta enzima, el ONPG que es incoloro, es


hidrolizado, produciéndose orto-nitrofenol que presenta una coloración amarilla
cuando se encuentra en solución neutra o alcalina; en condiciones ácidas es
incoloro.

Los microorganismos fermentadores de la lactosa poseen dos enzimas: la


enzima permeasa (que regula la entrada de la lactosa en la bacteria) y una
enzima â-galactosidasa (que desdobla la lactosa en glucosa más galactosa).
Los microorganismos que fermentan la lactosa poseen las dos enzimas; los no
fermentadores carecen de ambas enzimas. Hay microorganismos denominados
"fermentadores tardíos de la lactosa" que poseen la â-galactosidasa pero no la
permeasa. Cuando se utiliza una determinada concentración de lactosa, estos
microorganismos producen después de cierto período de tiempo (48 horas a
varios días o semanas) algunas células mutantes que poseen permeasa,
observándose la fermentación tardía de la lactosa, lo que indica que poseen la
enzima â-galactosidasa.

* Medio de cultivo: caldo ONPG:

Este caldo se distribuye asépticamente en tubos estériles.

El ONPG se puede encontrar comercialmente impregnado en discos.

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TEMARIO DE T.E.L

* Técnica:

Mediante la utilización de discos de ONPG:

o Realizar una suspensión bacteriana densa del microorganismo


objeto de estudio en un tubo que contenga unos 0,5 ml de S.S.F.
estéril.

o Colocar en el tubo un disco de ONPG.

o Incubar a 37º C desde 1-24 horas, dependiendo del inóculo.

* Lectura e interpretación de resultados:

o prueba [+]: aparición de un color amarillo estable por liberación del


o-nitrofenol.

o prueba [-]: incoloro después de 24 horas.

A la hora de hacer la lectura hay que tener en cuenta el pH dada la influencia


que tiene en la aparición del color amarillo. En caso de un aparente resultado
negativo se puede alcalinizar ligeramente el medio para comprobar que no se
trata de un falso resultado negativo.

* Interés: diferenciar los microorganismos fermentadores lentos de la lactosa de


los lactosa -. Ej. E.coli +, Citrobacter +, Salmonella -, Proteus -, Shigella -.

Algunas especies de Pseudomonas son ONPG [+] y otras [-].

B) PRUEBA DEL ROJO DE METILO

* Fundamento: mediante esta prueba se va a comprobar la capacidad de un


microorganismo de producir y mantener estables los productos terminales ácidos
de la fermentación de la glucosa y vencer la capacidad amortiguadora del
sistema. Es una prueba cualitativa para la producción de ácidos y requiere
microorganismos que produzcan ácidos fuertes (láctico, acético, fórmico), a partir
de la glucosa, por la vía de fermentación ácido mixta.

Todos los miembros de las Enterobacteriaceas son, por definición,


fermentadores de la glucosa. En el caldo RM/VP, después de 18-24 horas de
incubación, la fermentación resultante da productos secundarios metabólicos
ácidos; por lo tanto inicialmente todas las enterobacterias darán una reacción
RM[+]. Sin embargo, después de más tiempo de incubación, como lo exige la
realización de la prueba (2-5 días), aquellos microorganismos que son realmente
RM[+] continúan produciendo más ácidos y dan como resultado un bajo pH

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TEMARIO DE T.E.L

terminal, venciendo al sistema amortiguador de fosfato y manteniendo un medio


ácido (pH 4,2 o menos).

Aquellos microorganismos que presenten la prueba RM [-] continúan


metabolizando los productos iniciales de la fermentación, produciendo
compuestos neutros, elevando el pH hacia la neutralidad (pH=6 o más).

* Medio de cultivo: Medio de Clark y Lubs (caldo RM/VP).Se reparte en tubos.

* Reactivo: se utiliza solución alcohólica al 0,2% de rojo de metilo.

* Técnica: sembrar con asa el medio líquido con el microorganismo objeto de


estudio e incubar a 37º C de 2-5 días.

* Lectura e interpretación de resultados: después de dos días de incubación


se añaden unas 5 gotas de reactivo al medio, observándose un viraje a rojo si es
positivo y una coloración amarilla si es negativa. Si aparece un color anaranjado
indica una reacción retardada. Tanto si la prueba es negativa como si aparece el
color anaranjado se continuará la incubación hasta 5 días y se repetirá la prueba.
Si continúa color amarillo o anaranjado será prueba negativa.

Se ha desarrollado una microtécnica rápida (método de Barry) que ha permitido


disminuir el período de incubación con relación al método común (2-5 días). Se
ha demostrado que utilizando menores volúmenes de caldo para la prueba, los
microorganismos en estudio sufrían una mejor exposición al oxígeno
atmosférico, que hacía que los microorganismos RM [-] revirtieran al pH neutro
inicial con mayor rapidez.

* Interés: diferenciación de Enterobacterias.

C) PRUEBA DE VOGES-PROSKAUER

* Fundamento: observar si el microorganismo fermenta la glucosa por la vía


butanodiólica. Si es así, se forma un producto intermedio (acetoína) que forma
un complejo de color rojizo con el á-naftol.

* Medio de cultivo: Medio de Clark y Lubs o lo que es lo mismo caldo RM/VP.

* Reactivos:

o á-naftol al 5% en alcohol absoluto.

o KOH al 40%.

* Técnica: sembrar el medio (en tubos) e incubar de 24 a 48 horas a 37º C.

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* Lectura e interpretación de resultados: según el volumen de medio se añade


un volumen determinado de la solución de á-naftol y de la de potasa (0,6 ml y 0,2
ml respectivamente cuando el tubo contiene unos 2 ml de medio). Se agita para
exponer el medio al oxígeno atmosférico para que se de la reacción:

o Coloración rosa-rojiza en menos de una hora: VP [+]

o Color amarillo en la superficie del medio: VP [-]

* Interés: diferenciación de Enterobacterias.

D) PRUEBA CON AGAR HIERRO DE KLIGLER

* Fundamento: mediante esta prueba vamos a poder determinar:

a. La capacidad de un microorganismo de atacar un hidrato de


carbono específico (en este caso glucosa, lactosa o ambas)
incorporado en un medio de crecimiento básico.

b. Producción o no de gases: CO2 e H2 como productos finales del


metabolismo de los hidratos de carbono.

c. Producción de ácido sulfhídrico (SH2).

El medio de Kligler contiene como hidratos de carbono la glucosa y la lactosa.


Existe otro medio, el TSI, que posee un tercer hidrato de carbono, la sacarosa;
los fundamentos bioquímicos de ambos son los mismos, por lo que nos vamos a
referir solamente al medio de Kligler.

* Medio de cultivo: Agar hierro de Kligler. Se esteriliza a 112º durante 30 min.


y se deja enfriar en planos inclinados y profundos.

La lactosa (incluida en el medio) está presente en una concentración 10 veces


superior a la glucosa.

El sulfato de hierro se adiciona al medio para detectar la formación de SH2 por la


bacteria, originándose sulfuro ferroso que es de color negro.

El indicador de pH rojo fenol (que lleva el medio) es amarillo a un pH ácido, rojo


a pH alcalino y anaranjado-rojizo a pH inicial del medio 7,4.

* Técnica: la inoculación del medio se realiza en picadura hasta unos 0,6 cm.
del fondo.

Esta distancia se debe respetar a fin de evitar la entrada de aire en la parte


profunda y una alteración en el medio anaerobio. Se retira el hilo por el mismo

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TEMARIO DE T.E.L

camino de entrada y, sin volver a cargar el hilo, se siembra en estrías la


superficie del pico de flauta.

Se incuban los tubos inoculados a 35-37º C durante 18-24 h. Es importante


respetar estos tiempos de incubación, ya que lecturas de menor o mayor
incubación pueden dar resultados falsamente positivos o negativos.

* Lectura e interpretación de los resultados:

a) Utilización de los hidratos de carbono:

• Fermentación de la glucosa y no de la lactosa: pico alcalino (rojo) y


fondo ácido (amarillo), K/A. Ejemplo de no fermentadores de
lactosa y sí de glucosa: Shigella, Proteus, Salmonella.

• Fermentación tanto de la glucosa como de la lactosa: Pico ácido


(amarillo), fondo ácido (amarillo). A/A. Ejemplos de
microorganismos fermentadores de lactosa y glucosa son
Escherichia coli, Klebsiella y Enterobacter.

• No hay fermentación ni de glucosa ni de lactosa: Pico alcalino


(rojo) y fondo alcalino (rojo). K/K. En ausencia de fermentación de
hidratos de carbono no se forman ácidos, y la utilización de las
peptonas con la consiguiente producción de grupos básicos hace
que todo el medio aparezca de color rojo. Las bacterias que
producen este tipo de fermentación son conocidas como "no
fermentadoras" y es una importante indicación de que el
microorganismo no pertenece a las Enterobacterias. Ej.:
Pseudomonas aeruginosa (bacilo no Enterobacteriaceae Gram (-)).

b) Producción de gas:

Los gases producidos son el CO2 y el H2 , productos finales del metabolismo de


la glucosa. Se pueden apreciar por la aparición de burbujas en la parte inferior
del medio, por la producción de grietas en su interior o incluso por la elevación
del medio, que se separa del fondo.

c) Producción de ácido sulfhídrico (SH2):

El sulfhídrico es incoloro y su presencia se detecta a través de la formación de


sulfuro ferroso, que es negro. Debido a que se requiere un medio ácido para que
un microorganismo produzca sulfhídrico, un fondo negro debe leerse como
ácido aún cuando el color amarillo esté oscurecido por el precipitado negro.

Cuando se interpreta un resultado en el medio de Kligler puede observarse la


combinación de cualquiera de las reacciones características, debiendo anotarse
de la siguiente manera:

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a) Fermentación de hidratos de carbono: como ya se ha indicado.

b) Producción de gases: se registra con un círculo alrededor del símbolo que


indica la acidez o basicidad en la parte inferior del tubo.

c) Producción de SH2: se indica con una "S" junto al símbolo que indica la acidez
o alcalinidad de la parte inferior del tubo.

* Interés: Se utiliza primariamente para identificar géneros de Enterobacterias.

Reacciones de las Enterobacterias más frecuentes aisladas en clínica en agar


hierro Kligler

Alc/A Alc/A A/A Alc/A A/A


gas no gas gas SH2 SH2 Especies
+ + + - - E. Coli
Morganella sp.
+ + - - - Providencia sp.
Serratia sp.
+ - + - - Enterobacter sp.
+ - + + + Citrobacter sp.
+ + - + - Salmonella sp.
- + - - - Shigella sp.
- + + - - Yersinia sp.
- - + - - Klebsiella sp.
- - - + + Proteus sp.
alc= alcalino o rojo.
a= ácido o amarillo.

Otras pruebas incluidas en este apartado son:

E) PRUEBA DE LA FERMENTACIÓN DE AZÚCARES (para diferenciación de


Enterobacterias; todas las Enterobacterias fermentan la glucosa. Algunas
además fermenta la lactosa.)

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TEMARIO DE T.E.L

F) PRUEBA DE LA HIDRÓLISIS DE LA ESCULINA (para diferenciar los


Estreptococos del grupo D, que tienen esta propiedad, de otros Estreptococos,
que no pertenecen a dicho grupo.

PRUEBAS BASADAS EN EL METABOLISMO PROTÉICO

Se investiga la presencia en los microorganismos de enzimas con actividad


proteolítica. Incluiremos las siguientes pruebas:

A) PRUEBA DE LA COAGULASA

* Fundamento: se pretende comprobar la facultad de un microorganismo de


coagular el plasma por acción de la enzima coagulasa. La coagulasa se puede
encontrar en dos formas: libre y fija o ligada (unida a la pared bacteriana).

La coagulasa es una enzima con actividad semejante a la protrombina, capaz de


transformar el fibrinógeno en fibrina, provocando la formación de un coágulo
visible.

* Medios y reactivos:

No se debe emplear sangre citratada pues los microorganismos que utilizan


citrato, como por ej. Streptococcus faecalis, pueden dar una falsa reacción
positiva.

* Técnica:

Se pueden seguir dos tipos de técnicas:

1.- Prueba del portaobjetos: pone de manifiesto la coagulasa ligada:

o Colocar una gota de agua destilada o solución salina fisiológica


estéril sobre un portaobjetos.

o Emulsionar suavemente una gota de suspensión del


microorganismo en estudio de 24 horas en un caldo enriquecido
(Ej.: BHI) en la gota de agua, utilizando un asa o una varilla. La
prueba puede hacerse también partiendo directamente de una
colonia obtenida en una placa de aislamiento.

o Añadir una gota del plasma y mezclar bien.


o Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado.

2.- Prueba en tubo de hemólisis: pone de manifiesto la coagulasa ligada y la


libre:

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o Añadir asépticamente 0,5 ml de plasma a 0,5 ml de un cultivo puro


de 18 a 24 h. en un caldo enriquecido.

o Mezclar por rotación suave del tubo, evitando agitar el contenido.

o Incubar a 37º C, preferiblemente en un baño de agua, observando


periódicamente el tubo.

* Lectura e interpretación de resultados:

1.- Prueba en portaobjetos: una reacción positiva se detecta en 15 a 20


segundos por la formación de grumos blancos. La prueba se considera negativa
si no se observa aglutinación en 2 a 3 minutos. Todos los resultados negativos
deben verificarse mediante la prueba en tubos debido a que algunas cepas de
Staphylococcus aureus producen coagulasa libre que no reacciona en la prueba
en portaobjetos.

2.- Prueba en tubo:

o La reacción se considera positiva ante cualquier grado de


coagulación visible dentro del tubo. La reacción se observa mejor
inclinando el tubo. Si es positiva, el coágulo permanece en el fondo
del tubo.

o Reacción negativa: ausencia de coágulo tras 24-48 horas de


incubación.

* Interés: se utiliza de manera específica para diferenciar Staphylococcus


aureus (coagulasa positivo) de otras especies de Staphylococcus.

B) PRODUCCIÓN DE HEMÓLISIS

* Fundamento: los microorganismos, cuando se cultivan "in vitro" sobre medios


que contienen sangre, pueden producir alrededor de las colonias unas zonas de
hemólisis variables, según se origine una destrucción parcial o total de los
eritrocitos. Las sustancias responsables de estos fenómenos son exotoxinas,
liberadas por las bacterias al medio, llamadas hemolisinas.

* Medio de cultivo: Agar-sangre, constituido por un medio básico (Ej.: agar


nutritivo o TSA) adicionado de un 5% de sangre desfibrinada de carnero o de
caballo, preferentemente la del primero, ya que las hemólisis se visualizan mejor.

* Técnica: inocular siguiendo la técnica de aislamiento. Incubar durante 24-48


horas a 37º C.

* Lectura e interpretación de resultados: podemos hablar de á, â, o ã


hemólisis.

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TEMARIO DE T.E.L

La á-hemólisis es una hemólisis parcial, en la que los hematíes son


parcialmente dañados.

Se observa por una estrecha zona verde alrededor de la colonia.

La â-hemólisis se caracteriza por una zona clara e incolora que rodea a la


colonia, debido a la destrucción total de los glóbulos rojos. Es una hemólisis total.

En la ã-hemólisis no se observa ninguna variación alrededor de las colonias ni


actuación sobre los glóbulos rojos.

* Interés: esta prueba se emplea fundamentalmente para determinar las


diferentes especies de Streptococcus: por ej. S. pyogenes es â-hemolítico; S.
pneumoniae es á-hemolítico.

C. PRUEBA DEL INDOL

* Fundamento: se investiga la presencia en el microorganismo de la enzima


triptofanasa o triptofanodesaminasa, capaz de desdoblar el triptófano
(aminoácido) en indol más alanina. Se detecta la presencia de esta enzima
mediante la reacción del indol producido con el reactivo
p-dimetilaminobenzaldehido.

* Medio de cultivo: Agua de peptona:

* Reactivo: Reactivo de Kovacs:

- Alcohol amílico o isoamílico o butílico... 75 ml


- p-dimetilaminobenzaldehido............... 5 mg
- HCl concentrado............................. 25 ml

* Técnica: sembrar con asa de


platino el medio con el
microorganismo objeto de estudio
(tubos de hemólisis). Incubar a 37º
C durante 24-48 horas.

* Lectura e interpretación de
resultados: se agregan unas
gotas del reactivo de Kovacs
directamente sobre el tubo
incubado y se agita. En caso de
que la prueba sea positiva, es
decir, en caso de que se haya
producido indol, éste reaccionará con el p-dimetilaminobenzaldehido,
apareciendo un anillo de color rojo en la superficie del tubo. El HCl tiene como

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TEMARIO DE T.E.L

función bajar algo el pH, favoreciéndose así la reacción, y el alcohol amílico


concentra el color en la superficie.

Puede también utilizarse el reactivo de Erlich para realizar la lectura.

C) PRUEBA DE LA FENILALANINA-DESAMINASA

* Fundamento: comprobar si el microorganismo posee esta enzima. Si la


poseen, estos gérmenes transforman la fenilalanina en ácido fenilpirúvico, el cual
forma un complejo de color verde al reaccionar con el tricloruro de hierro.

* Medio de cultivo: medio de fenilalanina.

El medio se reparte en tubos, se esteriliza y se deja solidificar en pico de flauta.

* Reactivo: Tricloruro de hierro (CL3Fe) al 10% en agua destilada.

* Técnica: sembrar en tubos inclinados e incubar a 37ºC durante 24-48 h.

* Lectura e interpretación de resultados: añadir 4 o 5 gotas del reactivo sobre


la superficie del medio una vez incubado. Hacer rotar suavemente el tubo. En el
término de 1 a 5 minutos, si la reacción es positiva aparece un color verde en el
pico de flauta así como en el líquido en contacto con él.

* Precauciones: la interpretación de positiva o negativa debe hacerse dentro de


los primeros 5 minutos después de haber añadido el reactivo porque el color
verde se desvanece con bastante rapidez.

* Interés: para diferenciar los géneros Proteus y Providencia [+] del resto de los
géneros de las Enterobacterias [-].

E) PRUEBA DE LA UREASA

* Fundamento: mediante esta prueba determinamos la capacidad del


microorganismo de desdoblar la urea en CO2 y amoníaco por acción de la
enzima ureasa. Se visualiza el proceso debido a que la alcalinidad que se
produce origina un cambio de color en el indicador que lleva incorporado el
medio.

Esta prueba se puede realizar en tubo con medio sólido o sobre discos de papel
de filtro.

1.- Prueba en tubo

* Medio de cultivo: Medio de Christensen:

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El medio se esteriliza en el autoclave. Se deja enfriar hasta 50-55ºC y a esta


temperatura se le añaden 100 ml de solución de urea al 20% en agua destilada,
esterilizada por filtración. Se distribuye el medio asépticamente en tubos estériles
y se deja enfriar en posición inclinada.

* Técnica: sembrar el pico de flauta con un inóculo denso e incubar a 35-37ºC


durante 1-6 días, observando las primeras 6 horas y luego cada 24 horas.

* Lectura e interpretación de resultados:

Se considera la prueba [+], es decir, el microorganismo será ureasa [+] si debido


a la alcalinización del medio, éste toma una coloración roja-rosácea.

* Interés: todas las especies del género Proteus dan positiva esta reacción
dentro de las 6 primeras horas, virando la superficie del medio a color
rojo-rosáceo. Se puede así diferenciar el género Proteus de otros
microorganismos ureasa [+] retardados como especies de Klebsiella o
Enterobacter, así como de microorganismos ureasa [-] como E.coli.

2.- Prueba en discos de papel de filtro

* Técnica: con una solución de urea se impregna un disco de papel de filtro


colocado en una placa de Petri; se toma una colonia del microorganismo a
estudiar y se frota sobre el disco húmedo.

* Lectura e interpretación de resultados:

Si el disco vira a rosado o rojo en los dos minutos siguientes indica positividad de
la prueba.

* Interés: todas las especies del género Proteus dan positiva esta prueba.

F) PRUEBA DE LA DNasa

* Fundamento: se basa en la capacidad que poseen ciertas bacterias para


hidrolizar enzimáticamente el ADN produciendo una mezcla de mono y
polinucleótidos.

* Medio de cultivo: se utiliza el agar-DNA:

Preparar el medio, esterilizar en autoclave y distribuir en placas.

* Reactivo: ácido clorhídrico 1N.

* Técnica: sembrar una colonia del microorganismo a investigar sobre una placa
de agar DNA de forma que después de la investigación quede una estría
superficial o un botón de crecimiento denso. Incubar 24 horas a 37º C.

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* Lectura e interpretación de resultados: cubrir la placa con ClH 1N. En caso


de que el microorganismo sea productor de DNasa, se observa una zona clara
alrededor del crecimiento; en caso negativo, el medio permanece opaco.

* Interés: diferenciar S. aureus (DNasa +) de otras especies de Staphylococcus.

Otras pruebas incluidas en este apartado:

G) PRUEBA DE LA HIDRÓLISIS DE LA GELATINA (diferencia especies de


Staphylococcus, dando positivo S. aureus.

H) INVESTIGACIÓN DE DESCARBOXILASAS (para determinar grupos


bacterianos entre las Enterobacterias.)

PRUEBAS BASADAS EN EL METABOLISMO LIPÍDICO

A) PRUEBA DE LA LIPASA

Se lleva a cabo por cultivo sobre agar enriquecido con tween 80.La existencia de
lipasa se traduce por la aparición de un halo opaco alrededor de las colonias.
Esta prueba se utiliza para diferenciar ciertas Micobacterias.

B) PRUEBA DE LA LECITINASA

Se realiza por cultivo sobre un medio con yema de huevo (lecitina). Las colonias
productoras de lecitinasa, forman una zona opaca a su alrededor.

PRUEBAS BASADAS EN CARACTERES DE RESISTENCIA A CIERTAS


SUSTANCIAS

A) TEST DE LA OPTOQUINA

* Fundamento: se determina la sensibilidad de un microorganismo a la


optoquina.

* Medio de cultivo: agar sangre

* Reactivo: discos impregnados de optoquina.

* Técnica: sembrar masivamente una colonia del microorganismo a investigar


sobre una placa de agar sangre y colocar en la superficie de la placa los discos
de optoquina. Incubar a 37º durante 24 horas.

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TEMARIO DE T.E.L

* Lectura e interpretación de los resultados: en caso de que el


microorganismo sea sensible a la optoquina, se observa un halo de inhibición
alrededor del disco.

* Interés: diferenciar Streptococcus pneumoniae (sensible) de otras especies de


Streptococcus alfahemolíticos (resistentes).

B) TEST DE LA BACITRACINA

* Fundamento: se determina la sensibilidad de un microorganismo a la


bacitracina.

* Medio de cultivo: placas con agar sangre.


* Reactivo: discos impregnados con bacitracina.

* Técnica: sembrar masivamente una colonia del microorganismo a investigar


en una placa de agar sangre y colocar sobre la placa los discos de bacitracina.
Incubar a 37º durante 24 horas.

* Lectura e interpretación de los resultados: una zona de inhibición del


crecimiento alrededor del disco, aunque sea pequeña, indicará la sensibilidad.

* Interés: diferenciar Streptococcus pyogenes (grupo A de Lancefield), sensible


a la bacitracina, de otras especies de Streptococcus betahemolíticos (grupos B,
C, D, F, G) que son resistentes.

También podemos incluir en este apartado la prueba de SOLUBILIDAD EN


BILIS (para diferenciar Streptococcus Pneumoniae, que tiene esta propiedad, de
otras especies de Streptococcus alfahemolíticos.

INVESTIGACIÓN DE SUSTANCIAS ENERGÉTICAS NUTRITIVAS

A) PRUEBA DE LA UTILIZACIÓN DE CITRATOS

* Fundamento: mediante esta prueba se determina si el microorganismo es


capaz de utilizar el citrato como única fuente de carbono.

El medio incluye citrato de sodio como única fuente de carbono y fosfato de


amonio como única fuente de nitrógeno. Las bacterias que pueden utilizar citrato
como única fuente de carbono también pueden extraer nitrógeno de la sal de
amonio, con producción de amoníaco, llevando a la alcalinización del medio. El
medio lleva un indicador, el azul de bromotimol, que es amarillo a pH ácido,
verde a pH neutro y azul a pH alcalino.

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TEMARIO DE T.E.L

* Medio de cultivo: Medio de citrato de Simmons.

El medio se reparte en tubos de ensayo y una vez estériles se inclinan en pico


de flauta.

* Técnica: sembrar en pico de flauta el microorganismo obtenido en medio sólido


(los caldos pueden aportar elementos nutritivos que pueden falsear los
resultados), procurando no tocar con el asa el medio, porque sustancias
nutritivas de éste podrían igualmente falsear los resultados. Incubar a 37º C de
24-48 horas.

* Lectura e interpretación de resultados:

o Prueba positiva: crecimiento con un color azul intenso en el pico


de flauta tras 24-48 horas de incubación.

o Prueba negativa: no se observa crecimiento ni cambio de color (el


medio permanece de color verde.)

o Si se observa crecimiento sin cambio de color, se confirmará la


positividad de la prueba incubando el tubo 24 horas más, durante
las que suele aparecer el color azul.

* Interés: esta prueba junto con las de Indol, Rojo de Metilo y Voges
Proskauer constituyen el IMViC y sirven, junto con otras pruebas para la
diferenciación de los géneros de las Enterobacteriaceas.

La prueba del TUBO DE GERMINACION o TEST DE FILAMENTACION,


aunque estrictamente hablando no se trata de una prueba bioquímica, ha de ser
nombrada dado el gran valor que posee para la identificación rápida y presuntiva
de Candida Albicans y Candida stellatoidea, que son las dos únicas especies del
género Candida capaces de producir tubos germinales.
Para diferenciar anaerobios, si no se utiliza el método de cromatografía gas-
líquido o IFI, se debe introducir una batería bioquímica que investigue: indol,
urea, gelatina, catalasa, fermentación de hidratos de carbono, hidrólisis de
almidón y esculina, comportamiento en medio de infusión cerebro-corazón con
hemina, menadiona y sangre de cordero adicionada de diversas sustancias
(como sales biliares, verde brillante o antibióticos), reducción de nitratos, lipasa y
lecitinasa.

SISTEMAS MULTIPRUEBAS

En los últimos años han aparecido en el mercado numerosos sistemas o equipos


multipruebas con el fin de facilitar la identificación de algunas bacterias, sobre
todo Enterobacterias, cocos G (+), microorganismos anaerobios y levaduras.
Estos sistemas proporcionan mayor comodidad y rapidez, pueden ser más
baratos, pero no carecen de problemas si se manejan de forma incorrecta.

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TEMARIO DE T.E.L

Todos exigen unas condiciones muy precisas de concentración del inóculo, de


inoculación, de incubación y de lectura, que si no se observan pueden dar lugar
a importantes errores. Estos sistemas pueden ser manuales y automatizados.

SISTEMAS COMERCIALES MANUALES:

A) SISTEMA API

Se trata de una tarjeta de material plástico dividida en pequeños pocillos que


contienen diferentes substratos deshidratados, en los cuales se inocula una
suspensión del microorganismo a estudiar.

La lectura de los resultados se efectúa directamente, interpretando el color de


cada reacción, o tras la adición de reactivos reveladores. Con los resultados se
establece un código numérico que corresponde a una determinada especie
reflejada en unas tablas.

Existe disponible para la identificación de Enterobacterias, Estafilococos,


Estreptococos, anaerobios, levaduras y algunas bacterias exigentes.

Los resultados presentan una correlación con las pruebas clásicas superior al
90%.Su principal inconveniente radica en la incapacidad de detectar reacciones
débiles.

B) SISTEMA ENTEROTUBE

Consiste en un tubo de plástico dividido en compartimentos que contienen


sustratos en forma de agar. La inoculación se realiza directamente a partir de la
colonia, por picadura y arrastre a través de los diferentes sustratos. La lectura e
interpretación no difieren del sistema anterior.

Existe comercializado para Enterobacterias y bacterias no fermentadoras. Los


problemas de este sistema son más considerables en cuanto al inóculo, que no
siempre es uniforme, y a la conservación de los sustratos.

C) OTROS SISTEMAS

a) MICRO-ID: consta de 15 cámaras de reacción en las que hay discos de papel


impregnados de sustratos y reactivos correspondientes a cada prueba
bioquímica a ensayar.

b) MINITEK: es un sistema semejante al anterior. Actualmente hay más de 30


discos de sustratos diferentes.

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TEMARIO DE T.E.L

SISTEMAS COMERCIALES AUTOMATIZADOS:

Estos suponen un importante progreso técnico, pero no están libres de


problemas. Además no es aconsejable que estos sistemas utilizados por alguien
que no está preparado y que confía ciegamente en el sistema sin adoptar una
actitud crítica respecto a los resultados ofrecidos por éste.

Suelen consistir en paneles en los que además de encontrarse los sustratos para
el desarrollo de diversas pruebas bioquímicas, se encuentran diversos
antimicrobianos a distintas concentraciones, con lo que se realiza
simultáneamente la identificación y antibiograma del microorganismo objeto de
estudio. Existen distintos paneles para distintos grupos de microorganismos. La
inoculación y la lectura de estos paneles se suele hacer de forma automática,
incorporándose los datos obtenidos en un ordenador, el cual proporciona con un
índice alto de fiabilidad la identificación del microorganismo.

Es obvio que ningún sistema automatizado puede ser mejor que el método de
referencia, pues ante cualquier discrepancia este último se supone correcto.

TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN DE ÁCIDOS NUCLÉICOS

Una reacción de hibridación es el proceso por el que dos monocadenas de ADN,


ARN o una de ADN y otra de ARN, de distinto origen y que muestran
complementariedad de bases se unen formando una molécula estable, que
recibe la denominación de híbrido.

La técnica de hibridación se basa en el apareamiento del ácido nucleico a


estudiar con una molécula de ADN o ARN conocida y llamada sonda. Esta
reacción puede ponerse de manifiesto gracias a la incorporación de un sistema
indicador bien radioactivo o no radioactivo (colorimétrico o fluorimétrico). En la
reacción de hibridación, la unión sonda-diana se produce gracias a la formación
de puentes de hidrógeno entre bases complementarias (adenina-timina,
guanina-citosina.)

Hoy día estas técnicas se están introduciendo poco a poco en la rutina de los
grandes Laboratorios de Microbiología, utilizándose con relativa frecuencia para
la detección de patógenos humanos. En estos casos, las muestras se
procesan para la inmovilización del ácido nucleico sobre un soporte sólido y
posteriormente se realiza la hibridación con sondas específicas para el
microorganismo causal de la infección. Además, la posibilidad de poder construir
sondas frente a cualquier región del genoma de los microorganismos permite el
diagnóstico diferencial de subtipos. Otra gran aplicación de la hibridación es
que mediante ella se pueden detectar genes de resistencia a antibióticos
directamente en el producto patológico, ofreciendo una alternativa al
antibiograma.

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TEMARIO DE T.E.L

Para incrementar aún más la sensibilidad ha aparecido en la actualidad un


método que permite incrementar específicamente una secuencia determinada
de ácidos nucleicos hasta un número de copias que pueda ser detectado
mediante la hibridación; es el método de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR). Este método permite la detección de aquellos microorganismos que se
encuentran en pequeño número en la muestra y, aunque por el momento está
limitado a laboratorios de investigación debido a su complejidad y alto coste
económico, parece que en un futuro aparecerán equipos comerciales que
contribuirán a su difusión.

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TEMA 16. ANTIBIOGRAMAS. TIPOS.


INTRODUCCIÓN.

Una vez aislado e identificado un microorganismo como probable agente causal


de un proceso infeccioso, se ha de estudiar que susceptibilidad presenta a los
agentes antimicrobianos. Se entiende por antibiograma la "técnica que permite el
estudio "in vitro" de la sensibilidad de los microorganismos a los agentes
antimicrobianos (antibióticos y quimioterápicos). Tiene por objeto proporcionar
datos útiles para el tratamiento de una enfermedad infecciosa, aportando una
información valiosísima para el establecimiento de la terapéutica antiinfecciosa,
aunque para el mayor rendimiento de ésta se deben considerar también las
características del antimicrobiano, la clínica del proceso y al propio paciente que
lo padece.

Independientemente del tipo de antibiograma que se realice, es fundamental


partir de cultivos puros para obtener resultados fiables. En general, se debe
realizar siempre un aislamiento y trabajar con colonias de un solo tipo de
microorganismo. Las técnicas realizadas a partir de cultivos mixtos casi nunca
tienen valor y pueden conducir a errores terapéuticos graves.

TIPOS DE ANTIBIOGRAMA.

Existen diversos métodos siendo los más importantes los de:

• Difusión: se realizan en medio sólido; habitualmente son cualitativos,


clasificando a los microorganismos en sensibles, intermedios o resistentes
a un determinado antimicrobiano.

• Dilución: son los métodos de referencia. Se pueden realizar en medio


líquido o en medio sólido. Proporcionan resultados cuantitativos,
destacando la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI), que es la
concentración más baja de antimicrobiano que inhibe el crecimiento del
microorganismo.

Existen algunas técnicas rápidas para acortar los estudios de eficacia de


antimicrobianos, pero si es posible deben evitarse. En caso de infecciones muy
peligrosas o si, por examen microscópico del producto patológico, se sospecha
una infección monomicrobiana, puede ser conveniente intentar determinar la
susceptibilidad relativa del microorganismo directamente en la muestra; pero,
realmente, no hay ningún método adecuado que pueda obviar el cultivo de la
muestra, la identificación del posible agente etiológico y la realización de pruebas
convencionales de susceptibilidad, aunque se retrase el resultado más tiempo.

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TEMARIO DE T.E.L

Hay dos puntos clave a tener en cuenta a la hora de realizar las pruebas de
sensibilidad antimicrobiana. En primer lugar, es muy importante que se realicen
de modo estandarizado ya que los resultados pueden variar mucho en función
de las condiciones de trabajo (inóculo, medio de cultivo, concentración, pH); por
este motivo se deben aplicar las normas publicadas en relación a este tipo de
pruebas. Sin embargo, hay que señalar que estas normas solo se aplican a las
bacterias aerobias y anaerobias, no habiéndose estandarizado métodos de
prueba para hongos, parásitos y virus, y no puede asegurarse la
reproductibilidad de los resultados del mismo laboratorio o la comparabilidad con
los de laboratorios diferentes. En segundo lugar, los resultados de las pruebas
para las bacterias se obtienen en el ambiente del laboratorio, que es muy
diferente al medio interno del huésped.

ANTIBIOGRAMA AEROBIO.
MEDIO DE CULTIVO.

Debe cumplir las siguientes condiciones:

• Ser de amplio espectro nutritivo, para que permita el crecimiento de la


mayoría de los microorganismos. En algunas ocasiones será necesario
añadir sangre desfibrinada o achocolatada para microorganismos muy
exigentes, pero normalmente no es aconsejable, ya que las proteínas que
llevan incorporadas ligan a los antimicrobianos, disminuyendo su acción.

• Ser de pH estable (7,2-7,4): la acidez y la alcalinidad modifican la


actividad de determinados antimicrobianos.

• No debe contener inhibidores de antimicrobianos: Ej.:

o Las sales de Ca y Mg que forman complejos con tetraciclinas y


betalactámicos.
o Los glúcidos, que en medios mal tamponados podrían dar lugar a
disminución del pH.
o La sangre, ya comentada.
o Las peptonas, que inactivan a derivados sulfamídicos.
El medio de cultivo que mejor reúne las anteriores condiciones y que es apto
para cualquier tipo de antibiograma aerobio es el de Müeller-Hinton, que se
utiliza tanto en caldo como en forma sólida.

Previamente, antes de sembrar en el medio, hay que hacer la preparación de


inóculo.

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PREPARACIÓN DEL INÓCULO.

Se prepara sembrando 4-5 colonias iguales en 5 ml de solución salina fisiológica


estéril o en caldo nutritivo o en TSB, e incubando de 2-6 horas a 35-37ºC, hasta
que el crecimiento produzca una turbidez semejante a la del estandar número
0,5 de la escala de MacFarland, el cual se prepara adicionando 0,05 ml de Cl2Ba
0,048M (1% P/V; 1,175% P/V de Cl2Ba.2H2O) a 9,95 ml de H2SO4 0,36N (1%
V/V).

Si la turbidez fuera mayor que la del estándar, se diluye con solución salina
fisiológica estéril o con el caldo y si fuera menor se deja más tiempo incubando.

Cuando se consigue esta turbidez, equivale a una concentración de


microorganismos de aproximadamente 1,5 x 108 microorganismos/ml.

Si las circunstancias lo precisan también se puede obtener el inóculo deseado


suspendiendo directamente en 5 ml de solución salina fisiológica estéril algunas
colonias procedentes de un cultivo joven, homogeneizando bien y ajustando
después la turbidez.

ANTIMICROBIANOS A ELEGIR.

Se utilizan productos de calidad con una actividad perfectamente conocida (en


microgramos o UI/ml). Los antimicrobianos utilizados en cada prueba de
sensibilidad se seleccionan según el tipo de microorganismo aislado o que se
sospeche y el interés terapéutico; se recomienda elegir un solo representante de
los antibióticos con estructura química similar y resistencia cruzada. A
continuación se expone una relación donde se indican los antimicrobianos a
elegir según el tipo de microorganismo, incluyendo los indicados para
microorganismos anaerobios. Cada laboratorio seleccionará dentro de esos
grupos los que considere más apropiados.

• Antibiograma de Staphylococcus.

Amicacina
Ampicilina o Amoxicilina
Ampicilina-sulbactam o Amoxicilina-clavulánico
Cefalosporina de primera generación (Cefalotina)
Cefalosporina de tercera generación (Cefotaxima)
Clindamicina
Cloxacilina (en Müeller-Hinton salino)
Cotrimoxazol (Sulfametoxazol-trimetoprim)
Eritromicina
Fosfomicina
Nitrofurantoína (en infecciones urinarias)
Norfloxacina o Ciprofloxacina (en infecciones urinarias)
Tetraciclina

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Tobramicina
Vancomicina o Teicoplanina

• Antibiograma de Enterobacterias

Amicacina
Ampicilina o Amoxicilina
Ampicilina-sulbactam o Amoxicilina-clavulánico
Cefotaxima
Cefoxitina
Ceftazidima
Cefuroxima
Ciprofloxazina
Cloranfenicol (para Salmonella)
Colistina (con fines taxonómicos)
Cotrimoxazol
Fosfomicina
Imipenem
Nitrofurantoína (en infecciones urinarias)
Norfloxacina (en infecciones urinarias)
Piperacilina
Tobramicina
Ticarcilina

• Antibiograma de Pseudomonas y afines.

Amicacina
Azlocilina
Aztreonam
Cefotaxima
Ceftazidima
Ceftriaxona
Ciprofloxacina
Colistina
Fosfomicina
Imipenem
Gentamicina
Ofloxacina
Norfloxacina (en infecciones urinarias)
Piperacidina
Ticarcilina
Tobramicina

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• Antibiograma de Streptococcus y otros microorganismos delicados.

Ampicilina
Cefalotina
Cefotaxima o Ceftriaxona
Ciprofloxacina
Cloranfenicol
Cotrimoxazol
Eritromicina
Fosfomicina
Imipenem
Tetraciclina
Vancomicina

• Antibiograma de anaerobios

Cefoxitina o Cefmetazol
Clindamicina
Cloranfenicol
Eritromicina
Imipenem
Metronidazol
Penicilina

INCUBACIÓN: Para todos los antibiogramas aerobios, 35-37º C durante 18-24


horas.

La lectura e interpretación de resultados se verán en cada tipo de


antibiograma.

CONTROL DE CALIDAD.

Debido al gran número de variables que pueden afectar los resultados, es muy
importante realizar un riguroso control de calidad periódicamente con cepas
patrón de sensibilidad conocida.

ANTIBIOGRAMA POR DIFUSIÓN EN MEDIO SÓLIDO (MÉTODO DE BAUER-


KIRBY).

Se trata de un método de fácil ejecución, exacta reproducción, facilidad de


lectura y fiabilidad de resultados. Por todo ello es el que se realiza rutinariamente
en la mayor parte de los pequeños laboratorios, recurriéndose también a él, en
los grandes laboratorios, cuando los resultados obtenidos por el método de
dilución en microplacas no son de total fiabilidad. Para ello se requiere que todos
los detalles del procedimiento estén cuidadosamente controlados y sean
uniformes.

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TEMARIO DE T.E.L

Existen distintas técnicas que aplican el método de difusión en medio sólido,


siendo una de las más utilizadas la de Bauer-Kirby.

Este método consiste en inocular una placa de agar Müeller-Hinton con el


microorganismo problema y colocar sobre la superficie del medio unos discos
que contengan concentraciones determinadas de los antimicrobianos a ensayar.
El antimicrobiano difunde por el medio, produciendo un gradiente de
concentración. Esta difusión se puede pensar como una serie de anillos
concéntricos, donde la concentración del antimicrobiano disminuye a medida que
aumenta la distancia al centro del disco.

Después de la incubación, el microorganismo se desarrolla en toda la placa


excepto alrededor de los discos cuyas concentraciones son inhibitorias. La
distancia en la que se inhibe el crecimiento del microorganismo inoculado en el
medio se denomina halo de inhibición, se mide en milímetros y es inversamente
proporcional a la CMI.

MEDIO DE CULTIVO.

Se emplea el agar Müeller-Hinton, repartido en placas de modo que el medio


alcance en la placa un espesor uniforme de 4 mm; si es más fino, los
antimicrobianos tienden a difundir más en dirección lateral, aumentando el
tamaño de las zonas de inhibición; si el agar es de más de 4 mm. de espesor, se
produce una mayor difusión hacia abajo, con tendencia a estrechar
artificialmente las zonas de inhibición.

Antes de utilizar las placas se debe comprobar que no posean agua de


condensación y se deben dejar a temperatura ambiente hasta que alcancen la
del laboratorio.

INÓCULO.

La densidad del inóculo es uno de los factores que más influye en el diámetro del
halo de inhibición, existiendo una relación inversa entre la concentración del
inóculo bacteriano y dicho halo. Por esto se debe estandarizar su preparación, lo
cual se consigue ajustando la turbidez al 0,5 de la escala de MacFarland, tal y
como ya se ha descrito.

SIEMBRA.

La inoculación se debe hacer dentro de los primeros 15 minutos después de


preparado el inóculo. Existen varios métodos de inoculación; el de Bauer-Kirby
consiste en introducir un escobillón en el inóculo ajustado, eliminar el exceso
presionando suavemente sobre las paredes del tubo y sembrar la placa por
estriación masiva en superficie, lo más homogénea posible. Antes de colocar los
discos se deja secar la superficie. No debe transcurrir más de 10 minutos entre
la siembra y la colocación de los discos.

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COLOCACIÓN DE LOS DISCOS.

Los discos utilizados son de papel de filtro estériles de 6 mm de diámetro y


contienen diferentes antimicrobianos desecados a la concentración
convenientemente expresada (expresada en ìg/ml o en UI, atendiendo a las
normas de la OMS). Se suelen comercializar en tubos de 50 unidades, algunos
de los cuales llevan un dispositivo que ayuda a la dispensación de los discos. De
todas formas, suele ser más cómodo y seguro colocar los discos sobre la placa
con pinzas estériles y frías (se mantienen en alcohol y se flamean y enfrían antes
de su uso), presionando un poco sin tocar con las pinzas el medio de cultivo.

Antes de su uso se sacan del frigorífico y se dejan a temperatura ambiente unos


30 minutos.

Una vez colocados en la placa, los discos deben quedar a unos 15 mm de


distancia entre si y del borde de la placa para que no se interfieran los halos de
inhibición. En las placas de 9 centímetros de diámetro se colocaran 6-8 discos y
en las placas de 14 cm 12 discos; para microorganismos que suelan dar halos
de inhibición muy grandes, como Haemophilus sp., se deben colocar menos
discos por placa.

Se debe evitar que los discos rueden por el medio al colocarlos, ya que el
antimicrobiano difundiría incontroladamente.

Existen dispensadores automáticos de discos, que llevan acoplado un tipo


especial de cartucho y que permiten la dispensación de tantos discos a la vez
como cartuchos sea capaz de albergar.

Antes de incubar las placas se deben dejar reposar a temperatura ambiente


unos 10 minutos para que los antimicrobianos hagan una predifusión. A
continuación se incuban a 35-37ºC durante 18-24 horas.

LECTURA E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS.

Después del período de incubación aparecen los halos de inhibición alrededor


de los discos que contienen antimicrobianos a los cuales es sensible el
microorganismo en estudio. Utilizando una regla, se medirá el diámetro del halo
de inhibición en mm. Con la medida obtenida nos vamos a unas tablas que nos
van a indicar si el microorganismo es "sensible", "moderadamente sensible" o
"resistente". Para la interpretación de los resultados ha de tenerse en cuenta la
concentración del disco, el microorganismo en cuestión y el medio de cultivo
empleado, entre otros factores.

La categoría "sensible" indica que la cepa estudiada es afectada por


concentraciones normales de antimicrobianos, alcanzadas en el organismo
administrando dosis habituales.

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TEMARIO DE T.E.L

La categoría de "sensibilidad intermedia" indica que para actuar sobre el


microorganismo se debe forzar la dosis, lo cual no siempre es posible, debido a
los efectos tóxicos.

La categoría de "resistente" indica que la concentración máxima de


antimicrobiano que se puede conseguir en el lugar de la infección no es
suficiente para afectarle.

La tendencia actual es a hacer una interpretación binaria, clasificando los


microorganismos en sensibles o resistentes, según el diámetro de la zona de
inhibición sea mayor o menor que el establecido. Las respuestas intermedias
quedan incluidas dentro de las resistentes para no inducir a errores terapéuticos.

A la hora de realizar la lectura hay que tener una serie de precauciones en


casos concretos:

• Con algunos antibióticos, como las sulfamidas, aparecen bordes borrosos


del halo de inhibición y se debe medir el diámetro teniendo en cuenta la
parte exterior de dicho borde.
• En los Proteus se puede presentar invasión de la zona interior del halo de
inhibición, observándose sin embargo un borde neto. Esta invasión no hay
que tenerla en cuenta en las lecturas y el diámetro se mide considerando
dicho borde neto.
• Staphylococcus aureus presenta resistencia cruzada a todos los
betalactámicos; esta resistencia se estudia mediante discos de oxacilina
de 1 ìg o de meticilina de 5 ìg, con incubación a 30ºC, o sobre Müeller-
Hinton salino; las cepas resistentes a estos antibióticos deben
considerarse resistentes al grupo.

LIMITACIONES DEL MÉTODO y CAUSAS DE ERROR.

Pueden clasificarse en dependientes de:

* Medio: mal estado, sin ajuste de pH, volumen inadecuado de la placa.


* Antimicrobianos:
• Para los antimicrobianos que difunden lentamente en el agar los
resultados pueden no ser fidedignos y se deben usar controles, aún
cuando se utilicen discos de elevado contenido para contrarrestar en
cierta medida la difusibilidad lenta.
• Causas de error: mala conservación de los discos (deben conservarse en
frigorífico, en recipientes herméticamente cerrados y con desecador),
caducidad de los mismos y tiempo de demora al inocularlos.
* Microorganismos:
• Las técnicas de difusión no son aplicables a microorganismos de
desarrollo lento; si se requiere una incubación prolongada para lograr
suficiente desarrollo y obtener una zona de inhibición detectable, el

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TEMARIO DE T.E.L

antibiótico puede llegar a deteriorarse hasta el punto de producir lecturas


imprecisas.
• Estas técnicas tampoco dan buenos resultados con microorganismos muy
exigentes.
• Los métodos de difusión no son aplicables a la determinación de
susceptibilidad de anaerobios. El largo período de incubación necesario
para la recuperación de muchos anaerobios ha hecho difícil establecer
esquemas interpretativos fiables.
• Causas de error: lo más habitual es el exceso de inóculo. También puede
conducir a errores la utilización de cultivos viejos, la inoculación de más
de un microorganismo (colonias distintas o cultivos contaminados), la
excesiva demora en la siembra y las condiciones de incubación.
* Observador: errores de lectura o excesiva demora en la misma y errores de
trascripción o interpretación de resultados.

ANTIBIOGRAMA POR DILUCIÓN.

Como ya hemos dicho, se pueden realizar en medio líquido o en medio sólido.


Mediante este tipo de antibiograma se determina la "CMI": menor
concentración de antimicrobiano capaz de inhibir totalmente el crecimiento
bacteriano "in vitro".

EN MEDIO LÍQUIDO.

Consiste en preparar una batería de tubos con distintas diluciones


(concentraciones crecientes) del antimicrobiano, depositar en cada tubo un
inóculo de densidad celular conocida y, tras incubación, ver en que tubos hay
crecimiento y en cuales no. El tubo cuya concentración de antimicrobiano sea
menor y en el que no haya crecimiento corresponde a la CMI.

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TEMARIO DE T.E.L

A) MEDIO DE CULTIVO: se utiliza el caldo de Müeller-Hinton o el de tripticasa soja


para aquellos microorganismos que no pueden crecer en Müeller-Hinton.

B) TÉCNICA:

• Preparar el inóculo correspondiente al 0,5 de la escala de Mac Farland.


Realizar una dilución 1/100 del inóculo, lo que equivale a 105
microorganismos/ml aproximadamente.

• Añadir 1 ml de este inóculo a una batería de tubos que contengan 1 ml de


caldo de Müeller- Hinton que lleva incorporado el antimicrobiano a
concentraciones crecientes.

• Incubar a 37º C durante 18-24 horas.

• El tubo cuya concentración de antimicrobiano sea menor y no presente


crecimiento, corresponde a la CMI.

Se debe inocular un tubo de Müeller-Hinton que se guardará en frigorífico a 4º C


como control de siembra.

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C) LECTURA E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: se considera concentración


mínima inhibitoria (CMI) la del tubo con menor concentración (mayor dilución) de
antimicrobiano que no presente aumento de turbidez respecto al tubo testigo
guardado en el frigorífico.

MICROTÉCNICA DE DILUCIÓN EN CALDO.

Hoy día, en los laboratorios con un alto volumen de trabajo, se suele utilizar la
microtécnica de dilución en caldo, cuyo fundamento es el mismo que el del
método que acabamos de describir, diferenciándose en que la sensibilidad de
los microorganismos a distintos antimicrobianos se prueba en una serie de
"pocillos" moldeados en una placa de plástico.

Cada placa puede contener 80 o más pocillos según el número de hileras


horizontales y verticales.

Ej.: una microplaca que contenga 80 concavidades dispuestas en 10 hileras


verticales y 8 horizontales, permite el estudio de 10 antimicrobianos diferentes,
cada uno a 8 diluciones seriadas. La microplaca se prepara colocando el
volumen adecuado de las distintas diluciones de antimicrobianos en los pocillos,
si bien existen ya en el mercado microplacas con los antimicrobianos liofilizados,
preparadas para su uso inmediato

A B C D E F G H
I J

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¤ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡
128 ìg/ml

64 ìg/ml
¡ ¡
32 ìg/ml
¤ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡
16 ìg/ml
¡ ¡
8 ìg/ml
¤ ¤ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡
4 ìg/ml
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2 ìg/ml
¤ ¤ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡
1 ìg/ml
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¤ ¤ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡
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¤ ¤ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡ ¡
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Una vez preparadas dichas microplacas e incubadas se observará el crecimiento


bacteriano como un botón en el fondo del pocillo.

Estudiaremos a continuación el ejemplo de la página anterior: Cada hilera


vertical corresponde a un antimicrobiano distinto. Las hileras horizontales
corresponden a diferentes diluciones del antimicrobiano.

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TEMARIO DE T.E.L

• Observamos que en la hilera "A" con un antimicrobiano determinado [A]


hay crecimiento bacteriano en todas las concavidades. Esto significa que
el microorganismo en estudio es resistente al antimicrobiano [A] en todas
las concentraciones ensayadas, o bien, que la CMI es superior a 128
ìg/ml.
• Observamos que en la hilera "B" hay crecimiento bacteriano en las seis
últimas concavidades. Esto significa que la CMI del antimicrobiano [B]
para el microorganismo en estudio es 64 ìg/ml.

EN MEDIO SÓLIDO.

Este método permite también la investigación de la CMI. Tiene la ventaja de ser


de más fácil y mejor manipulación que la técnica en medio líquido. Además
permite realizar el estudio de varias cepas distintas por placa y descubre mejor
una contaminación.

Este método implica el uso de una serie de placas de agar Müeller-Hinton, cada
una con una diferente concentración del antimicrobiano a probar. Las diluciones
de antimicrobiano suelen oscilar entre unos límites establecidos, que van desde
0,25 ìg/ml hasta 128 ìg/ml, para la mayoría de los antimicrobianos, sin
excepciones. El antimicrobiano se añadirá al medio de cultivo después de
esterilizarlo y una vez que se haya enfriado hasta aproximadamente 50º C, en
proporción 1/10 (V/V).Se procurará una distribución lo más homogénea posible,
evitando la formación de burbujas.

Paralelamente se preparan placas control sin antimicrobiano. Las placas


solidificadas se guardan refrigeradas y deben utilizarse antes de una semana.

A) MEDIO DE CULTIVO: agar Müeller-Hinton suplementado con un 5% de sangre


en caso necesario.

B) TÉCNICA:

• Preparar las placas de agar Müeller-Hinton con las distintas diluciones de


antimicrobiano.
• Preparar el inóculo ajustándolo al 0,5 de la escala de MacFarland y
diluyéndolo al 1/10.
• Inocular: la inoculación se realiza en "gota" (sin extender) mediante un
asa calibrada que dispense 1 o 2 microlitros o con un dispositivo
multidispensador que deposite este volumen de muestra, del tipo del
replicador de Steers. En ambos casos, una gota de 5-8 mm de diámetro
contiene la misma concentración microbiana. Se comienza inoculando las
placas de menor concentración, dejando las placas control las últimas con
el fin de comprobar que hubo microorganismos viables en todo el
procedimiento y ausencia de contaminación. La posible invasión de

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TEMARIO DE T.E.L

Proteus se evita presionando un cilindro de vidrio en el agar que rodea la


gota.
• Las placas inoculadas se dejan reposar hasta que las gotas del inóculo se
absorben completamente, y luego se incuban a 35-37ºC durante 18-24
horas.

C) LECTURA E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS: la CMI viene dada por la


placa con menor concentración de antimicrobiano que evite el crecimiento de la
cepa investigada.

La interpretación clínica de estos resultados se traduce en que se debe lograr


alcanzar en el lugar de la infección una concentración de antimicrobiano al
menos igual a la C.M.I..

SISTEMAS AUTOMATIZADOS PARA PRUEBAS DE


SUSCEPTIBILIDAD.

Estos sistemas aportan un resultado que se puede clasificar en susceptible,


intermedio o resistente o en una concentración mínima inhibitoria. Algunos

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TEMARIO DE T.E.L

sistemas se limitan a hacer automáticos métodos tradicionales, mientras que


otros pueden dar lecturas tras pocas horas de incubación. La mayoría utilizan un
procedimiento mecanizado de inoculación de caldo sobre las diferentes
concentraciones de atimicrobiano, congelado o liofilizado, y una fase de lectura y
procesamiento de resultados; otros sistemas inoculan placas de agar con
diferentes diluciones de antimicrobiano, de forma similar a la que se utiliza con el
replicador de Steers.

La mayoría de los sistemas se basan en la comparación del crecimiento


microbiano después de un determinado tiempo de incubación en presencia del
antimicrobiano y el obtenido durante el mismo tiempo en su ausencia. La
cantidad de crecimiento puede determinarse utilizando transmisión o dispersión
de la luz, efectuándose los cálculos por ordenador. Para la determinación de la
CMI se emplean diferentes concentraciones del antimicrobiano.

ANTIBIOGRAMA ANAEROBIO.

Los estudios de sensibilidad frente a los gérmenes anaerobios no tienen una


eficacia y reproductibilidad igual que los destinados a los gérmenes aerobios (los
vistos hasta ahora). Por este motivo hay investigadores que recomiendan la no
utilización sistemática de estos métodos y que el tratamiento se establezca
según criterios terapéuticos previamente establecidos, basados en el
conocimiento de los patrones de sensibilidad de los distintos grupos de
anaerobios, y en la probable etiología según el tipo y lugar de la infección. Hay
ocasiones, sin embargo en las que la gravedad del proceso o su larga duración
aconsejan su realización.

Se sigue una metodología similar a la descrita para los microorganismos


aerobios, siendo de elección el método de dilución, tanto en medio líquido como
en sólido, utilizando un medio de cultivo enriquecido en incubando en
condiciones anaerobias durante 24-72 horas.

Como ya se ha comentado anteriormente, el método de Bauer-Kirby no presenta


la utilidad que tiene en ambiente aerobio ya que las condiciones de este método
no son totalmente reproducibles en ausencia de oxígeno; así, el medio de
Müeller-Hinton no sirve para el crecimiento de muchos anaerobios, y tiene que
utilizarse suplementado con sangre de cordero o de caballo, falseando esta
inclusión el diámetro del halo de inhibición producido por algunos antibióticos.
Además, no existe una estricta correlación entre los citados halos y las CMIs.
Otra dificultad que presenta el método es que sólo es válido para
microorganismos de crecimiento rápido y la mayoría de los anaerobios no lo son.
Señalaremos, a continuación, una serie de factores a tener en cuenta antes de
efectuar estudios de sensibilidad para microorganismos anaerobios:

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TEMARIO DE T.E.L

MEDIO DE CULTIVO.

Para los antibiogramas anaerobios en caldo se puede utilizar el caldo infusión


cerebro corazón, el caldo Schaedler, el caldo Brucella o el tioglicolato, siendo
probablemente este último el que mejores resultados da. Estos medios deben ir
suplementados con hemina y vitamina K1 (factores de crecimiento para
Bacteroides fragilis). También se les puede adicionar extracto de levadura, que
aportará vitaminas, purinas y pirimidinas.

Para las técnicas en medios sólidos se suelen utilizar, además de los ya citados
previa adición de agar, el Eugón agar, el Müeller-Hinton agar suplementado con
un 5% de sangre de cordero o de caballo o el medio de Wilkins y Chalgren,
específicamente recomendado para la prueba de dilución en agar.

ATMÓSFERA DE INCUBACIÓN: La más recomendable es la que está


compuesta por un 5% de CO2, 10% de H2 y 85% de N2. La cantidad de CO2 no
debe exceder del 10%, pues puede disminuir la acción de algunos antibióticos
como lincomicina, macrólidos y aminoglicósidos. Además, en los medios sólidos
influye rebajando el pH superficial, con la consecuente alteración del efecto de
beta-lactámicos y aminósidos.

INÓCULO.

Es prácticamente imposible precisar la cifra ideal de microorganismos para el


inóculo del antibiograma anaerobio. Sin embargo, con el fin de estandarizar, se
considera el inóculo más apropiado el que presenta una turbidez igual a la mitad
del 1 de la escala de MacFarland.

En la práctica se llega a la citada turbidez suspendiendo directamente un cultivo


joven, con menos de 72 horas, en caldo recientemente regenerado. A
continuación se diluye al 1/200, con el fin de obtener una concentración
bacteriana situada entre 105 y 106 UFC/ml (unidades formadoras de colonias
/ml). La manipulación puede hacerse en condiciones aerobias dentro de la
primera media hora, sin que el germen anaerobio pierda viabilidad.

PRUEBAS ESPECIALES.

Ocasionalmente una determinada situación clínica puede justificar la solicitud al


laboratorio de una prueba no habitual respecto a fármacos antimicrobianos. A
continuación se describen las pruebas no habituales que se solicitan con más
frecuencia.

DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN MÍNIMA BACTERICIDA.

A partir de la técnica de antibiograma por dilución en medio líquido (macro y


microtécnica) se puede calcular la "CMB" (Concentración Mínima Bactericida)

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que se define como la "menor concentración de antimicrobiano que mata por lo


menos el 99,9% del inóculo original". Se pone de manifiesto sembrando con asa
masivamente en una placa de agar Müeller-Hinton los tubos que no hayan
presentado turbidez e incubando a 37ºC durante 18-24 horas. En la práctica la
CMB vendrá dada por la concentración del tubo con menor concentración de
antimicrobiano que impida el crecimiento sobre el medio sólido.

La determinación de la CMB está especialmente indicada en casos en que las


defensas del enfermo están seriamente comprometidas, prefiriéndose
administrar drogas bactericidas o fungicidas. La endocarditis ha sido y sigue
siendo una de las principales indicaciones para estas pruebas. La determinación
de la CMB es también una prueba frecuentemente solicitada para pacientes de
trasplante y quimioterapia del cáncer.

PRUEBA DE LA BETALACTAMASA.

El grupo de fármacos betalactámicos engloba las penicilinas y cefalosporinas. El


mecanismo de resistencia más frecuente frente a este tipo de fármacos es la
producción de una enzima bacteriana (betalactamasa) que inactiva el fármaco al
romper el anillo betalactámico.

La prueba de la betalactamasa constituye un método rápido de establecer si un


germen que se ha aislado produce betalactamasa. En la práctica diaria se realiza
de forma rutinaria in vitro para investigar, de forma más rápida que con el
antibiograma, la producción de betalactamasa por Staphylococcus aureus,
Haemophilus influenza y Neisseria gonorrhoeae. Sin embargo, hay que recordar
que a veces las bacterias son resistentes a los fármacos betalactámicos por
mecanismos que no tienen nada que ver con la producción de betalactamasa.
Por lo tanto, un resultado positivo indica una resistencia, mientras que un
resultado negativo no garantiza la sensibilidad.
La prueba se realiza exponiendo un substrato de prueba batalactámico al
germen durante un período que oscila, dependiendo del microorganismo y el
método de prueba, entre los 10 segundos y los 60 minutos. Existen tres métodos
de uso general: el método acidométrico, el método yodométrico y el método de la
cefalosporina cromógena, pudiendo realizarse tanto con un substrato líquido
como con papeles de filtro impregnados.

Quizás de estos tres métodos el más utilizado sea el de la cefalosporina


cromógena; la prueba se lleva a cabo añadiendo una suspensión concentrada
del germen en estudio a un substrato cromógeno amortiguado (en esta prueba,
una cefalosporina cromogénica como la nitrocefina), incubándolo durante diez
minutos a temperatura ambiente y observando si se produce cambio de color,
que se originaría por la ruptura de los anillos betalactámicos de la cefalosporina
cromogénica.

ESTUDIO DE SECUENCIAS DE ADN PORTADORAS DE LA RESISTENCIA


ANTIMICROBIANA: Mediante el estudio del ADN, por sondas y actualmente

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mediante tratamiento previo con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR),


puede identificarse la presencia de secuencias responsables de resistencia a
distintos antimicrobianos; por ejemplo, la secuencia TEM-1 es responsable de la
resistencia frente a penicilinas y cefalosporinas.

PRUEBAS DE SINERGIA ANTIMICROBIANA.

Cuando se administran dos o más fármacos antimicrobianos a un paciente, el


efecto de la combinación puede ser:

• Aditivo: cuando la actividad antimicrobiana de la combinación es la que


cabría prever sumando las actividades que presentan los fármacos por
separado.
• Antagónico: cuando la actividad de la combinación es notablemente
inferior a la suma de las actividades individuales.
• Sinérgico: cuando la actividad de la combinación es considerablemente
superior a la suma de las actividades individuales.

En la mayor parte de los casos la administración de fármacos de forma


combinada se realiza sobre la base de la experiencia descrita anteriormente.
Solo en casos muy concretos, cuando un resultado sea esencial para el
tratamiento de un paciente, es aconsejable estudiar el efecto de una
combinación frente al germen aislado en el propio paciente.

ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DEL SUERO.

En la actualidad el estudio de la actividad antibacteriana del suero es una prueba


que se realiza en pacientes con septicemia, endocarditis, osteomielitis y
meningitis para conocer la validez de la terapia establecida y modificarla en el
caso de que los niveles sanguíneos (séricos) sean bajos.

El propósito de esta técnica es determinar el título de actividad antimicrobiana de


la combinación suero-antibiótico contra el microorganismo aislado del proceso
infeccioso en el paciente estudiado.

La prueba bactericida del suero se realiza con muestras de suero obtenidas


inmediatamente antes de la administración del antimicrobiano (muestra en el
mínimo) y 30-90 minutos de después de la misma (según la vía de
administración y el fármaco de que se trate) (muestra en el máximo). Se diluyen
los sueros utilizando como diluyente medio de cultivo líquido (BHI, caldo de
Müeller-Hinton suplementado con Ca++ y Mg++) o preferiblemente suero humano
acumulado carente de antimicrobianos ya que permite mantener una
concentración constante de las proteínas séricas en cada tubo. A continuación
se añade una suspensión de turbidez estandarizada del germen aislado en el
paciente a cada tubo de dilución de suero y a un tubo control que no contiene
actividad antimicrobiana.

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La densidad de microorganismos en cada tubo debe ser de aproximadamente


5x105 UFC/ml. Los tubos se incuban a 35ºC durante 20 horas en una atmósfera
apropiada para el germen, se agitan para exponer a los microorganismos a la
actividad antimicrobiana que pueda haber escapado a la exposición previa al
adherirse a las paredes del tubo, y se vuelven a incubar otras cuatro horas.

En este punto se determina el título inhibitorio del suero, identificando la dilución


máxima del suero que inhibe el crecimiento visible del microorganismo. Los
tubos que no presentan crecimiento visible se subcultivan en agar sangre o agar
chocolate y se incuban durante 24 horas. Se cuenta el número de colonias de
cada subcultivo y se determina el título bactericida del suero, identificando la
máxima dilución del suero que provoca la muerte de al menos el 99,9% del
inóculo original.

Actualmente, de forma general, se considera adecuada una dosificación de


antibiótico que de un título bactericida máximo ≥32 y mínimo ≥8.

DETERMINACIÓN DE LAS CONCENTRACIONES DE ANTIMICROBIANOS


EN LOS LÍQUIDOS DEL ORGANISMO.

La determinación del nivel de antimicrobiano en el suero u otro líquido corporal


está indicada en los siguientes casos:

• Fármacos antimicrobianos (ej.: aminoglucósidos, cloranfenicol) que tienen


unos márgenes de concentraciones terapéuticas-tóxicas estrechos o se
acumulan rápidamente hasta alcanzar concentraciones tóxicas en los
pacientes con disfunciones renales o hepáticas.
• Pacientes donde no se ha demostrado el efecto clínico previsto; el fracaso
del tratamiento podría deberse a comportamiento particular del
antimicrobiano en ese paciente o a efectos del paciente, microorganismo
o antimicrobiano que pueden desviar o anular la acción del
antimicrobiano.
• Tratamiento de infecciones locales severas.
• Situaciones donde la enfermedad subyacente del paciente es tal que
puede suponerse que el antibiótico debe hacer algo más que eliminar
rutinariamente el microorganismo.

La mayoría de las determinaciones de los niveles de antimicrobianos se realizan


con inmunoensayos instrumentados rápidos. Los inmunoensayos desarrollados
para el control de las drogas son mucho más específicos que los bioensayos y
además tienen la ventaja de proporcionar los resultados en unas pocas horas,
sin requerir una incubación hasta el día siguiente.

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DIÁMETRO ESTANDAR Y CORRELACIÓN APROXIMADA CON LA CMI


ANTIMICROBIANO Carga Diámetro en milímetros Correlación con CMI
en mcg/ml
R MS S R S
A. nadilíxico y pipemídico 30 mcg ≤ 13 14-18 ≥ 19 ≥ 32 ≤ 12
Amicacina 30 mcg ≤ 14 15-16 ≥ 17 ≥ 32 ≤ 12
Ampicilina (Enterobacterias) 10 mcg ≤ 11 12-13 ≥ 14 ≥ 32 ≤8
Ampicilina para enterococos 10 mcg ≤ 16 - ≥ 17 ≥ 16 ≤4
Ampicilina para estafilococos 10 mcg ≤ 28 - ≥ 29 âlactamasa ≤ 0,2
Ampicilina para estreptococos 10 mcg ≤ 21 22-29 ≥ 30 ≥4 ≤ 0,1
Ampicilina para haemophilus 10 mcg ≤ 19 - ≥ 20 ≥4 ≤2
Azlocilina 75 mcg ≤ 14 15-17 ≥ 18 ≥ 256 ≤ 64
Aztreonan 30 mcg ≤ 17 - ≥ 26 ≥ 32 ≤8
Cafaclor para haemophilus 30 mcg ≤ 18 19-23 ≥ 24 ≥ 32 ≤8
Cefalosporinas 30 mcg ≤ 14 15-17 ≥ 18 ≥ 32 ≤8
Ciprofloxacina 5 mcg ≤ 16 17-20 ≥ 21 ≥4 ≤1
Clindamicina 2 mcg ≤ 14 15-16 ≥ 17 ≥2 ≤1
Cloranfenicol 30 mcg ≤ 12 13-17 ≥ 18 ≥ 25 ≤ 12
Cloranfenicol (haemophilus) 30 mcg ≤ 25 26-28 ≥ 29 ≥8 ≤4
Colistina 10 mcg ≤8 9-10 ≥ 11 ≥4 -
Cotrimoxazol 25 mcg ≤ 10 11-15 ≥ 200 ≥35
Eritromicina 15 mcg ≤ 13 14-17 ≥ 18 ≥8 ≤2
Fostomicina 50 mcg ≤ 11 12-14 ≥ 15 - -
Gentamicina 10 mcg ≤ 12 13-14 ≥ 15 ≥8 ≤6
Imipenem 10 mcg ≤ 14 - ≥ 16 ≥ 16 ≤4
Meticilina 5 mcg ≤9 10-13 ≥ 14 - ≤3
Netilmicina 30 mcg ≤ 12 13-14 ≥ 15 ≥ 32 ≤8
Nitrofurantoína 300mcg ≤ 14 15-16 ≥ 17 ≥ 100 ≤ 25
Norfloxacina 10 mcg ≤ 14 - ≥ 17 ≥ 16 ≤4
Ofloxacina 5 mcg ≤ 14 - ≥ 16 ≥8 ≤2
Oxacilina 1 mcg ≤ 10 11-12 ≥ 13 - ≤1
Oxacilina para neumococos 1 mcg ≤ 19 - ≥ 20 - ≤ 0,06
Penicilina para estafilococos 10 UI ≤ 28 - ≥ 29 âlactamasa ≤ 0,1
Penicilina para estreptococos 10 UI ≤ 19 20-27 ≥ 28 ≥4 ≤ 0,1
Piperacilina (Enterobacterias) 100mcg ≤ 14 15-17 ≥ 18 ≥ 256 ≤ 64
Piperacilina para pseudomonas 100mcg ≤ 17 - ≥ 18 ≥ 128 ≤ 64
Rifampicina 5 mcg ≤ 16 17-19 ≥ 20 ≥4 ≤1
Tetraciclina 30 mcg ≤ 14 15-18 ≥ 19 ≥ 16 ≤4
Ticarcilina para enterobacterias 75 mcg ≤ 14 15-19 ≥ 20 ≥ 128 ≤ 16
Ticarcilina para pseudomonas 75 mcg ≤ 14 - ≥ 15 ≥ 128 ≤ 64
Tobramicina 10 mcg ≤ 12 13-14 ≥ 15 ≥8 ≤6
Vancomicina 30 mcg ≤9 10-11 ≥ 12 - ≤5

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TEMA 17.- CONTROLES DE CALIDAD


INTERNOS Y EVALUACIÓN
EXTERNA DE LA CALIDAD.

INTRODUCCIÓN

En un sentido amplio, el control de calidad en los laboratorios debe hacerse


siempre extensivo a cualquiera de sus aspectos clínico y de laboratorio, ya que
en la práctica resulta difícil considerarlos de forma aislada o independiente.

Debe procurarse ante todo una correcta recogida de los especímenes de


sangre, su adecuada manipulación y el empleo de los métodos más fiables. Ello
obliga, por tanto, al mantenimiento periódico de los instrumentos analíticos y a
una verificación sistemática de la calidad de las técnicas y sus correspondientes
reactivos mediante la ayuda de especímenes y muestras control adecuados y
de procedencia garantizada. Finalmente, el laboratorio debe también velar por la
claridad y corrección en la forma de expresar los resultados al objeto de facilitar
en todo momento su interpretación clínica.

En los laboratorios, el empleo cada vez más extendido de autoanalizadores ha


contribuido de manera decisiva no sólo a incrementar la rapidez en la obtención
de los análisis, sino fundamentalmente a mejorar la exactitud y precisión de los
resultados. Asimismo, la posibilidad de obtener de forma sistemática parámetros
que, por el carácter engorroso de su determinación manual, sólo se
suministraban esporádicamente ha significado una gran mejora en el diagnóstico
diferencial de numerosas situaciones patológicas.

Como contrapartida, tales instrumentos precisan una atención técnica


permanente, por cuanto un fallo en su calibración o pequeñas variaciones
intrínsecas del sistema pueden repercutir de manera decisiva sobre un número
muy elevado de resultados.

El control de calidad en los laboratorios tiene especial importancia para todas


aquellas técnicas fundamentales en el diagnóstico clínico en general. Aunque
estos parámetros, hoy día, son determinados de forma sistemática por diversos
autoanalizadores, alguno de ellos a partir de una misma muestra de sangre, los
laboratorios con reducido volumen asistencial continúan empleando los métodos
convencionales o manuales donde el colorímetro, la centrífuga y el microscopio
ocupan aún un lugar destacado.

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TEMARIO DE T.E.L

Este instrumental, aunque simple y reducido, precisa, al igual que los


autoanalizadores, un control de calidad periódico, por lo que en modo alguno
debe confundirse control de calidad con automatización.

CONCEPTOS BÁSICOS

La realización de controles de calidad en el laboratorio clínico presupone el


conocimiento de una terminología básica sin la cual resulta difícil interpretar el
significado de los resultados obtenidos.

Exactitud. Es la aproximación de una medida a su valor real. Un método exacto


es, por tanto, aquel que suministra una medida correcta o real del parámetro
analizado. Lo contrario es la inexactitud. El valor real de una medida se obtiene
cuando se emplean métodos de referencia seleccionados por su calidad en
comparación con otros, de acuerdo con unos criterios emitidos por organismos
internacionales y reactivos de calidad garantizada.

Precisión. Se define como la aproximación del valor de una medida a sí mismo,


cuando se realizan varias determinaciones de la misma empleando el mismo
método. Para conocer la precisión de una medida no es necesario conocer su
valor real, ya que lo único que interesa es el grado de variación obtenido
después de realizar varias determinaciones de la misma (reproductibilidad de la
medida).

Error. Es la desviación de una medida con respecto a los criterios de exactitud y


precisión. La inexactitud no debe acompañarse forzosamente de imprecisión y
viceversa. Así, un método puede ser exacto pero impreciso, o preciso pero
inexacto o ambas cosas a la vez (Figura 1).

El error puede ser de dos tipos: aleatorio o sistemático. El error aleatorio


obedece a causas difíciles de determinar, que casi siempre surgen de forma
esporádica (fallo técnico al tomar una medida). Por el contrario, el error
sistemático suele obedecer a causas fáciles de identificar, por cuanto se repite
siempre de la misma manera (deficiente calibración de los instrumentos
analíticos, errores sistemáticos en la preparación de reactivos y otros).

Dispersión. Corresponde a la variabilidad de una medida alrededor de su valor


medio. La dispersión de una medida se determina mediante dos parámetros:
media aritmética ( X ) y desviación estándar (DE). La media aritmética es el
cociente entre la suma de todos los valores individuales (X) y el número total de
los mismos (N). Ejemplo: Si para una medida se obtienen 10 valores diferentes,
5, 8, 6, 6, 7, 8, 7, 7, 9 y 7, la media aritmética de la misma será:

5+8+6+6+7+8+7+7+9+7
X= =7
10

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Exactitud y Inexactitud y
precisión precisión
Situación ideal Error sistemático

Exactitud e Inexactitud e
imprecisión imprecisión
Error aleatorio Error aleatorio

El valor de X se conoce simplemente como media o valor medio de un conjunto


de valores y debe diferenciarse de la moda y la mediana.

La moda corresponde al valor de conjunto que se repite con mayor frecuencia.


En el ejemplo anterior la moda es 7.

La mediana es el valor situado en medio de una serie de valores ordenados


numéricamente. En el ejemplo anterior, las cifras ordenadas numéricamente son
5, 6, 7, 8 y 9, por lo tanto la mediana es 7.

Cuando, como en el ejemplo citado, la media aritmética, la moda y la mediana


tienen el mismo valor, se dice que la población estudiada presenta una
distribución normal o gaussiana.

La desviación estándar (DE) es la raíz cuadrada de la varianza (V), siendo ésta


el cociente entre la suma de los cuadrados de las diferencias entre cada valor
individual (Xi) y la media aritmética y los grados de libertad (número de
observaciones menos uno).

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TEMARIO DE T.E.L

Así, en el ejemplo anterior, el valor de la DE sería de 1,15, y el de la varianza (V)


de 1,33:

Prueba Xi Xi-X (Xi-X)2


1 5 -2 4
2 8 +1 1
3 6 -1 1
4 6 -1 1
5 7 0 0
6 8 +1 1
7 7 0 0
8 7 0 0
9 9 +2 4
10 7 0 0
N = 10 Xi = 70 (Xi-X)2= 12

70
X= =7
10

(Xi-X)2 12
V= = = 1,33
N–1 9

DE = V = 1 , 33 = 1,15

Coeficiente de variación. Corresponde al valor de la desviación estándar (DE)


expresada en tanto por ciento de la media.

DE x 100
CV (%) =
X

En el ejemplo anterior, el valor de CV sería:

1,15 x 100
CV = = 16,4 %
7

Histograma. Es la representación gráfica del número de valores obtenidos para


un determinado parámetro y proporciona una imagen de la distribución de

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TEMARIO DE T.E.L

frecuencias (Figura 2). Cuando el número de valores es muy elevado, el


histograma se transforma en una curva continua (curva de distribución).

80

70

60
Frecuencia (%)

50

40

30

20

10

0
10 30 50 70 90
Actividad Enzimática

Figura 2. Histograma.

Intervalo de confianza. El intervalo de confianza se define como un conjunto de


valores dentro de los cuales está situada la media verdadera. En general, el
intervalo de confianza mínimo corresponde al 95 %, es decir, la probabilidad de
que el valor medio sea el verdadero es del 95 % o uno de cada veinte valores
obtenidos puede hallarse fuera de los límites de confianza. En una distribución
normal el límite de confianza mínimo corresponde a todos los valores incluidos
dentro de las dos desviaciones estándar de la media (2 DE).

Patrones, muestra de referencia y controles. Un patrón es una sustancia


cuyas características han sido analizadas mediante procedimientos físicos o
químicos y a la cual se le ha asignado un determinado valor. Los patrones
pueden ser de dos tipos: a) nacionales y b) internacionales.

Los patrones internacionales son elaborados únicamente por la Organización


Mundial de la Salud (OMS) o el Comité Internacional de Estandarización en
Hematología (ICSH). La finalidad de los patrones internacionales es suministrar
un valor de referencia, con el cual se contrasta el valor de los patrones

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TEMARIO DE T.E.L

elaborados por las diferentes organizaciones nacionales de control de calidad


(patrones nacionales).

Una muestra de referencia es una sustancia estable elaborada de acuerdo con


las características de un patrón nacional o internacional y que normalmente es
utilizada para controlar la exactitud de una determinada técnica. Cuando la
muestra de referencia se emplea para calibrar un instrumento analítico o para
ajustar una medida a su valor verdadero, recibe el nombre de calibrador.

Un control es una muestra con características similares a los especímenes


problemas que se emplean para verificar la precisión o reproductibilidad de un
método o técnica y ocasionalmente pueden servir para calibrar instrumentos, si
se conoce el valor verdadero de la medida que se quiere controlar.

En hematología es muy común el empleo de controles constituidos por


suspensiones de células sanguíneas (humanas o de animales) para la
calibración de los analizadores destinados a la determinación de los parámetros
básicos (recuentos, hemoglobina, hematocrito e índices eritrocitarios
secundarios). En general, dichas suspensiones celulares tienen propiedades
físicas similares a los especímenes de sangre total humana y son preparadas
por diferentes firmas comerciales, que las recomiendan para la calibración de
sus propios instrumentos. Dado que estas muestras control comerciales vienen
convenientemente valoradas, es decir, se conoce el valor de los parámetros que
hay que controlar, son normalmente utilizadas para verificar no sólo la precisión,
sino también la exactitud de los autoanalizadores (calibración). Esta función hace
que normalmente se las conozca también como “calibradores”, aunque en
realidad tal denominación sea incorrecta debido a la inexistencia de un patrón de
referencia internacional de sangre total estabilizada.

SISTEMÁTICA DE CONTROL DE CALIDAD EN LOS LABORATORIOS

El control de calidad en un laboratorio clínico debe considerar siempre la doble


vertiente: interna y externa.

El control de calidad interno ser realiza diariamente en cada laboratorio mediante


empleo de especímenes control propios o comerciales y tiene como finalidad
asegurar la fiabilidad de los métodos e instrumentos. El control de calidad
externo se realiza periódicamente (en general cada mes) y en él participan otros
muchos laboratorios, que al analizar un mismo espécimen controlan así la
exactitud de los métodos que emplean en la realización de las técnicas.

CONTROL DE CALIDAD INTERNO

El control de calidad interno tiene como finalidad verificar la exactitud y precisión


de los diferentes métodos o técnicas diagnósticas empleadas. Para ello es
necesario el uso de controles y patrones.

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Debe hacerse extensivo no sólo a la metodología empleada en la realización de


las diferentes técnicas, sino también a todo el proceso que se extiende desde la
preparación del material que hay que utilizar y la extracción y manipulación de
las muestras de sangre hasta su procesamiento y entrega de resultados.
Asimismo, debe incluir el control periódico de los reactivos, recipientes e
instrumentos que se emplean tanto para las técnicas manuales como para las
automatizadas.

Para controlar la fiabilidad de las técnicas utilizadas para determinar los


parámetros básicos, se suelen emplear muestras control comerciales. Este tipo
de controles son en la actualidad ampliamente utilizados para la calibración de
autoanalizadores, por lo que se denominan también calibradores. Con todo, los
controles comerciales, pese a su indudable utilidad, presentan diversos
inconvenientes:

• No controlan la metódica utilizada en la extracción y preparación de los


especímenes de sangre que hay que utilizar.
• Son fácilmente reconocidos por el personal técnico del laboratorio, por lo
que suelen recibir un tratamiento especial y, por tanto, distinto al de los
restantes especímenes del día.
• Son relativamente caros, lo que hace difícil su adquisición para
determinados laboratorios.

Por todo lo mencionado, los controles comerciales pueden ser sustituidos por
muestras control elaboradas en el mismo laboratorio. En este caso, el valor
verdadero de los parámetros que hay que controlar debe determinarse
previamente mediante los llamados métodos de referencia.

En general, el control de calidad interno de parámetros básicos se consigue


mediante el empleo combinado de muestras control comerciales y especímenes
propios que se utilizan como controles. Los primeros son utilizados para verificar
la calibración de los autoanalizadores y la exactitud de los valores suministrados
por los mismos métodos u otros a lo largo del día. Los especímenes control
propios deben ser elegidos al azar y se utilizan para verificar la reproductibilidad
de los resultados correspondientes. Si tales especímenes no han de ser
utilizados para verificar la exactitud de los métodos, no es indispensable la
determinación del valor real de los parámetros que hay que controlar.

CONTROL DE CALIDAD EXTERNO

Gracias a la labor de diferentes organismos internacionales, la práctica de


controles de calidad interlaboratorios o externos mejoran la exactitud de los
resultado suministrados por los diferentes laboratorios.

En Europa existen varios programas de control de calidad externo que se aplican


a nivel local, regional y nacional, permitiendo apreciar de una manera mucho
más precisa las posibilidades o limitaciones de cada laboratorio participante en

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relación a los restantes que intervienen en el mismo programa y comprobar su


propio nivel metodológico dentro del conjunto.

La complejidad de estos programas de control de calidad viene dada por la


multiplicidad de técnicas e instrumentos que pueden emplearse en la
determinación de un mismo parámetro y por el número de parámetros
evaluados.

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TEMA 18.- RECOGIDA DE LA


MUESTRA. MÉTODOS DE
IDENTIFICACIÓN.
Como requisitos mínimos la muestra que llega al laboratorio deberá contener la
siguiente información:

* Nombre y apellidos
* Fecha de nacimiento
* Número de identificación de la muestra, o del paciente o de la hoja de petición
* Número de la sala (remitente, nombre del médico peticionario)
* Fecha y hora de la toma de la muestra (día, hora, min.)

Todas las personas involucradas en los procedimientos diagnósticos son


conscientes del problema de la identificación de las muestras. La confusión en
los nombres, peticiones, muestras o resultados de las pruebas de los pacientes
puede tener serios efectos sobre el tratamiento del paciente y podría, por lo
tanto, considerarse como una «mala praxis». Este capítulo resume brevemente
la situación actual en la identificación de muestras y pacientes durante la fase
preanalítica.

¿Nombre o número?
Cuando un paciente es admitido en un hospital, tiene que ser identificado por
mucha gente, incluyendo enfermeras, facultativos, técnicos y otras personas. Lo
mismo ha de ser válido para cualquier muestra tomada del paciente y trasladada
al laboratorio del propio hospital u otro laboratorio externo.

La comunicación entre todas las partes del proceso diagnóstico requiere la


transferencia de esta identificación del paciente. El uso del nombre y apellidos
para identificar un individuo ha demostrado ser insuficiente para asegurar la
transferencia correcta de la identidad. El nombre, apellidos y la fecha de
nacimiento es la combinación de información usada más frecuentemente para la
identificación. A fin de reducir la cantidad de información manejada, en muchos
hospitales se destina al paciente un número.

Este número no puede ser utilizado para ningún otro individuo. Idealmente, este
número se imprime junto con el nombre sobre cualquier pedido, muestra e
informe. Los números de la sala, habitación y cama pueden ser una ayuda
adicional. Esto es especialmente útil si la extracción de muestras no se hace por
la misma persona que pide los exámenes de laboratorio clínico.

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Alternativamente, un paquete de etiquetas autoadhesivas preimpresas con la


identificación del paciente pueden facilitarse en el momento de la admisión al
hospital.

Los métodos de identificación

A la llegada al laboratorio, el paciente ha de ser identificado a partir de la


información facilitada. Esto puede hacerse visualmente leyendo el nombre y sala
de la etiqueta y de la hoja de petición, transfiriendo esta información a las
planillas de laboratorio y a todas las alícuotas de la muestra. La fase siguiente
requiere la generación de un sistema de subnumeración que vincule al individuo
y el día de la obtención de las muestras (comúnmente no más largo de tres de
dígitos).

Muchas instituciones, sin embargo, usan medios electrónicos para transferir


datos de identificación: esto puede hacerse en línea usando el sistema
informático del hospital, que transfiere los datos básicos del paciente junto con la
petición directamente al sistema informático del laboratorio. En este caso, las
muestras que llegan al laboratorio tienen que estar vinculadas a una hoja de
petición determinada por el código de barras o un sistema de código alternativo
fijado a las muestras.

Recientemente, se han sugerido sistemas más sofisticados que se utilizarán


ampliamente en el futuro: un código de barras bidimensional, código de puntos o
chips fijados a la muestra que pueden contener toda la información necesaria
incluyendo la petición y la información sobre el paciente.

Identificación de la muestra en el laboratorio, forma directa


respecto a la indirecta

La identidad del paciente se vincula inequívocamente al recipiente de la muestra


en el punto de extracción o recolección de la misma, siempre que la muestra
primaria se mantenga a lo largo de todo el proceso analítico. Esto necesita
separadores suero/plasma para mantener la muestra de trabajo (plasma o
suero) en el tubo de muestra primario (sangre) y de esta forma ser identificado
directamente por el lector del analizador.

Si el lector no está disponible o se hacen alícuotas la muestra original, puede


usarse un dispositivo que automáticamente defina las posiciones de cada
muestreo en cada uno de los analizadores utilizados. Este tipo de identificación
se llama identificación indirecta (por localización). Mientras que los mecanismos
directos de identificación permiten identificar la muestra en cualquier momento y
posición, la identificación indirecta por la posición puede hacerse únicamente con
la ayuda de una lista numerada de posiciones o un sistema informático de
laboratorio.

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Además, cualquier porción alícuota tiene el peligro inherente de una confusión


adicional entre muestras.

Recomendación:

• Cualquier muestra deberá identificarse inequívocamente antes de ser


procesada.
• Los procedimientos de identificación directa de muestras primarias
deberían usarse preferentemente a la identificación indirecta y subdivisión
de la muestra en alícuotas, para reducir los errores en la identificación.
• Cualquier muestra cuya identidad y origen no esté suficientemente
documentada deberá separarse a una forma estable (suero, plasma),
guardarla en el refrigerador y completar la información omitida antes de
procesarla.

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TEMA 19.- TRANSPORTE DE


MUESTRAS. EFECTOS DEL TIEMPO
Y TEMPERATURA DURANTE EL
TRANSPORTE.
Los efectos del tiempo y temperatura durante el transporte

El traslado de muestras al laboratorio clínico puede realizarse de diferentes


maneras. Normalmente, los tiempos de traslado son cortos cuando el laboratorio
se ubica cerca, o en las mismas instalaciones clínicas y no representa ningún
problema.

Figura 1
Efecto del tiempo y la temperatura de almacenamiento sobre la concentración de diversos
componentes del suero de sangre coagulada sin anticoagulante.
(•) 4° C, (•) 23 ° C, (•) 30 ° C

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Sin embargo, el tiempo transcurrido desde la extracción de la sangre a la


centrifugación, no debería exceder de una hora. Algunos procedimientos de
medida requieren aditivos especiales tales como fluoruro de sodio/oxalato para
medir la concentración de lactato o borato de sodio serina EDTA para medir la
concentración de amonio. La medición de la concentración de hemoglobina en el
plasma requiere la manipulación cuidadosa de la muestra de con EDTA.

El traslado al laboratorio puede realizarse bien mediante un mensajero, o bien


mediante un sistema de reparto por tubo neumático.

Los adelantos actuales en los sistemas de este último tipo aseguran un traslado
cuidadoso con el fin de evitar la hemólisis. Tales muestras pueden usarse para
medir magnitudes bioquímicas, hematológicas o para la realización de
gasometrías.

Si por alguna razón técnica se requiere un traslado de la muestra a larga


distancia (p. ej. por correo o mensajeros de laboratorio), debería evitarse hacerlo
con las muestras de sangre. La Figura 1 muestra la influencia de la temperatura
y duración del almacenamiento de muestras de sangre coagulada sobre algunas
magnitudes

La liberación de ión potasio desde los eritrocitos es mínima a temperatura


ambiente debido a la actividad de la ATPasa intercambiadora de Na+/K+
dependiente de la temperatura. Este efecto aumenta tanto a 4° C como por
encima de 30º C.

Las concentraciones de glucosa disminuyen con el aumento de temperatura,


mientras que con el fosfato se observa el fenómeno opuesto, ya que las
fosfatasas del plasma y los eritrocitos aumentan la concentración de este
compuesto. Como se ha demostrado en la Figura 1, la duración del
almacenamiento a una temperatura determinada es un factor importante. Si una
muestra de sangre se almacena durante 2 h a 23° C, las concentraciones de
glucosa disminuyen aproximadamente un 10 por ciento.

En las muestras patológicas los efectos de tiempo y temperatura comúnmente


observados pueden presentar desviaciones. La disminución dependiente del
tiempo de la concentración de glucosa en las muestras de sangre es mayor en
las leucocitosis.

Del mismo modo, el aumento de la concentración de amonio dependiente del


tiempo está más acentuado en muestras con la concentración catalítica de ã–
glutamiltransferasa elevada. Los anticuerpos pueden alterar las concentraciones
de las células sanguíneas en función de la dependencia de la temperatura que
tengan dichos anticuerpos.

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Las concentraciones de muchos componentes bioquímicos tales como


electrólitos, sustratos o enzimas no resultan afectados por un tiempo de
transporte de envío de hasta cuatro días.

Las concentraciones de hemoglobina y de eritrocitos son también estables. Se


observan diferencias importantes en la fracción de volumen de los eritrocitos en
la sangre («hematocrito»), el volumen entítico de los eritrocitos (VCM) y la
concentración de bilirrubina en el plasma. Un examen fiable de los distintos
leucocitos requiere que la preparación de la extensión de sangre se realice
dentro de las 3 horas siguientes a la toma de la muestra.

Transporte de muestras
Cuando es necesario enviar sangre u otros fluidos corporales humanos a un
laboratorio distante, se han de cumplir ciertas normas de seguridad. Además,
tiene que conservarse la integridad de la muestra para asegurar su correcto
examen. Las muestras deben enviarse en recipientes que «sean resistentes a la
filtración, golpes y cambios de
presión, y otras condiciones que
puedan incidir en la
manipulación ordinaria que se
realiza en el transporte».

La Asociación Internacional de
Transporte Aéreo (IATA)
requiere que en el exterior de
paquete se escriba «Muestras
diagnósticas». En los Estados
Unidos, las regulaciones de la
Occupational Safety and Health
Administration (OSHA)
(Administración de Salud y
Seguridad Laboral) requieren
que se adhiera al paquete una
etiqueta de biorriesgo.

Las muestras deberán empaquetarse de una manera tal que puedan resistir las
condiciones ambientales (temperatura y presión) a que puedan ser sometidas
durante el transporte.

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TEMARIO DE T.E.L

Debe evitarse la exposición de


muestras a la luz directa con el fin
de proteger a los componentes
sensibles a la luz, tal como la
bilirrubina. Idealmente, deberían
llevar varias capas de embalaje, con
un recipiente primario con cierre que
debería introducirse en un recipiente
secundario que a su vez debería
ponerse dentro un recipiente
exterior, como se representa en la
Figura 2. Debe ponerse siempre un
material absorbente entre los
recipientes primario y secundario
para asegurar que se absorba
cualquier derrame durante el
transporte.

Se debe utilizar una bolsa


impermeable para asegurar que los
documentos que acompañen esa
muestra no serán dañados por
cualquier filtración o derrame de la
misma.

Las muestras de sangre seca sobre


papel de filtro deberán enviarse en
una envoltura de papel recio
introducido en un sobre con precinto
sellado para asegurar que los
manipuladores del envío estén
protegidos de la exposición a la
sangre seca, además de asegurar la
integridad de la muestra durante el
transporte.

Figura 2. Empaquetado de muestras para el transporte

Para enviar muestras congeladas y refrigeradas, son adecuados materiales


aislantes tales como un recipiente de poliestireno. Para la congelación puede
utilizarse hielo seco. LEAKAGE, NOTIFY

Deben tomarse precauciones para asegurar que el recipiente empaquetado con


hielo seco sea capaz de liberar el dióxido de carbono gaseoso para evitar una
sobrepresión que podría ocasionar el estallido del paquete.

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TEMA 20.- EL ALMACENAMIENTO


DE MUESTRAS EN EL
LABORATORIO. SISTEMAS DE
CONSERVACIÓN.

10 reglas y algunas recomendaciones


1. El procedimiento está regido por la estabilidad de los componentes de la
muestra. Las causas más importantes que pueden ocasionar alteraciones
en la calidad de la muestra son:

• Metabolismo de las células sanguíneas


• Evaporación o sublimación
• Reacciones químicas
• Descomposición microbiológica
• Procesos osmóticos
• Efecto de la luz
• Difusión de gases

2. Un transporte rápido y un corto tiempo de almacenamiento mejoran la


fiabilidad de los resultados de laboratorio.
3. Las muestras se conservan más tiempo almacenadas en frigorífico (¡pero
hay notables excepciones!).
4. Las muestras deberían almacenarse siempre en recipientes cerrados
(¡evaporación!).
5. El peligro de evaporación también existe en los refrigeradores
(condensación de humedad sobre los elementos de enfriamiento).
6. Los problemas de almacenamiento se reducen si se usan sistemas
desechables de tomar muestras.
7. Los agentes de separación (p. ej. Geles separadores) mejoran los
rendimientos de suero o plasma y permiten que estos puedan mantenerse
en los tubos originales encima de la sangre (89).
8. Evite sacudir los recipientes de muestra (¡sistemas de distribución de tubo
neumático!): riesgo de hemólisis.
9. Almacenar siempre verticalmente los recipientes de muestra que
contienen sangre; el proceso de la coagulación se acelera.
10. Etiquete el material infeccioso y manéjelo con especial cuidado.

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8 reglas especiales y algunas recomendaciones más


útiles
1. Evite el almacenamiento de la sangre. Las muestras de sangre deberían
llegar al laboratorio dentro de los 45 min siguientes a su recolección, a fin
de asegurar que la centrifugación y separación de la muestra se efectúa
dentro de la primera hora.

2. Evite la glicólisis para mantener estables las concentraciones de glucosa


y de lactato y el pH. La glicólisis puede evitarse por la adición de un
inhibidor junto con un anticoagulante.

3. Evite el efecto de la luz de otra manera habrá una disminución en las


concentraciones de bilirrubina, ascorbato, porfirinas, creatinacinasa y
folatos.

4. Reduzca el contacto con el aire tanto como sea posible. Si no se hace


esto, la evaporación o la sublimación darán como resultado un aumento
aparente en la concentración de todos los componentes no volátiles. Este
es particularmente el caso cuando el volumen de la muestra es
relativamente pequeño y el área de superficie es relativamente grande.

5. La sangre no debería almacenarse en el refrigerador. Cuando la orina se


enfría, las sales pueden precipitar (fosfato de magnesio y calcio, urato).

6. Para ciertos componentes, las muestras no deberían congelarse. Esta


congelación puede redundar en resultados erróneos para los siguientes
componentes:

Ejemplos de componentes de la sangre y la orina que no deben


almacenarse congelados
Muestra Componentes
Suero o plasma: Lipoproteínas
(fracciones electroforéticas
Lipoproteína X
Apolipoproteína A-I y B
Colesterol de LDL
(prevenida por la adición de glicerol)
Monómeros de fibrina en el plasma
Sangre con EDTA Células sanguíneas
Orina IgG
Sedimento
Urato (¡precipitaciones!)

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7. Una descongelación adecuada. La homogeneización inadecuada de las


muestras congeladas después de la descongelación es una fuente muy
común de error. Durante la descongelación se producen gradientes de
concentración que van desplazándose desde las soluciones concentradas
que primero funden hacía las capas inferiores por las paredes del
recipiente. Por tanto, después de la descongelación, la muestra deberá
invertirse varias veces, evitando la formación de espuma. Con especial
atención sobre los materiales no disueltos, disolviéndolos por
calentamiento suave si fuera necesario.

8. El almacenamiento de las muestras después de su examen se debe


realizar de tal manera que permita la confirmación de los resultados, la
comprobación de la identidad de las muestras o la realización de
exámenes adicionales por razones médicas o legales.

Tiempo y condiciones de almacenamiento recomendadas para


muestras tras ser examinadas
Muestra para Tiempo Temperatura
almacenamiento
Bioquímica: 1 semana Refrigerador
Inmunología: 1 semana Refrigerador
Hematología: 2 días Temperatura ambiente
Coagulación: 1 día Refrigerador
Toxicología: 6 semanas Refrigerador
Grupo sanguíneo: 1 semana Refrigerador

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TEMA 21.- PREPARACIÓN DE LAS


MUESTRAS. PROCESADO Y
CENTRIFUGACIÓN.

¿Qué ha de hacerse a la llegada de una muestra?

Centrifugación

La centrifugación de la sangre coagulada para obtener suero debería realizarse


después de haberse asegurado de que la sangre ha coagulado. Normalmente, el
tiempo de espera para que la sangre coagule es aproximadamente de 30 min.
Sin embargo, los pacientes que están con una terapia anticoagulante, o aquellos
con deficiencias en la coagulación tendrán una coagulación retrasada.

La centrifugación de sangre coagulada para obtener suero o de sangre


anticoagulada para obtener plasma se realiza típicamente entre 1000 y 1200 g
durante 10 a 15 min. En las pruebas de coagulación, la sangre citratada debería
centrifugarse a 2000 g durante 15 min.

La centrifugación se realiza comúnmente entre 20 y 22° C. Sin embargo, para


algunos componentes que son lábiles durante la centrifugación a temperatura
ambiente, especialmente si durante la centrifugación aumenta la temperatura, las
muestras deberían centrifugarse a temperatura refrigerada (4° C). Sin embargo,
la refrigeración puede conducir
a la filtración de ión potasio
desde la célula, aumentado el
valor de su concentración en el
plasma.

Las muestras no deberán


volverse a centrifugar después
de la obtención de suero o
plasma. La alteración de la
relación entre el agua
plasmática y la celular puede
afectar la concentración de los
componentes, y así, introducir
errores. Las muestras con una
barrera de gel nunca deben
volverse a centrifugar.
Figura 1

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El tiempo y la fuerza centrífuga aplicada al sedimento de sangre heparinizada


debería ser tal que no deje plaquetas en la capa de plasma. Un fracaso al
conseguir la sedimentación completa de plaquetas producirá aumentos
inadecuados en la concentración de ión potasio, lactato-deshidrogenasa,
fosfatasa ácida y fosfato procedentes de las plaquetas remanentes en el plasma
(Figura 1) de la muestra.

La Figura 2 muestra el control visual del plasma después de la centrifugación a


diversas velocidades.

Los tubos de micromuestra con o sin anticoagulantes pueden centrifugarse para


obtener suero o plasma en una microcentrífuga con un adaptador que acepte
estos tubos. La centrifugación de tales tubos de recolección de micromuestras se
realiza a velocidades que van desde las 6000 a las 15000 g durante un mínimo
de 90 s.

Figura 2

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TEMA 22.- ASPECTOS DE


SEGURIDAD EN EL MANEJO DE
MUESTRAS BIOLÓGICAS.
Los pasos para garantizar la seguridad son primordiales para la protección de la
salud pública de los trabajadores.

En este capítulo, se discute específicamente la eliminación de muestras, agujas,


tubos, y productos químicos.

Eliminación de agujas y otros objetos cortantes


La eliminación de todos los objetos cortantes y punzantes tales como agujas se
realiza mediante su colocación en recipientes herméticos, resistentes a la
punción, con las etiquetas y el código de color apropiados.

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Deberá evitarse reenfundar los objetos punzantes, así como doblar y romper las
agujas. Sin embargo, si fuese necesario el reencapuchar, deberá usarse o bien
una espátula de un solo uso, o preferentemente, un dispositivo para
reencapuchar.

Están disponibles dispositivos simples de reencapuchar, que permiten al


flebotomista reenfundar la aguja con un riesgo mínimo de daño por punción.

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Eliminación de tubos y muestras


Los tubos de recolección de la muestra que contienen sangre y que son
destinados a su eliminación deberán colocarse en bolsas de biorriesgo que
puedan resistir procesos de esterilización en autoclave. Estas bolsas deberían
ponerse en recipientes a prueba de fugas que luego deben cerrarse de forma
hermética.

Los fluidos corporales voluminosos tales como orina, vómitos, heces y otros
fluidos corporales pueden ser eliminados por vertido al inodoro. Los recipientes
de fluidos, tales como bolsas de sangre, deberán incinerarse después de
colocarlos en recipientes de desechos biopeligrosos.

Productos Químicos
Los residuos químicos pueden ser inflamables, corrosivos, reactivos y tóxicos.
Ejemplos de residuos químicos inflamables incluyen líquidos volátiles
combustibles tales como solventes orgánicos (p. ej., etanoles, acetona, xileno,
tolueno, etc.), oxidantes tales como peróxidos y sales de nitrato y gases
combustibles tales como butano, silano e hidrógeno. Estos materiales deben
marcarse con las etiquetas apropiadas de tóxicos y peligrosos.

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No está recomendada la eliminación de disolventes combustibles a través de un


fregadero o el inodoro. Si tales solventes son fácilmente solubles en agua,
podrían, ser eliminados en pequeñas cantidades por vertido a un desagüe,
seguido por grandes cantidades de agua. Lo mejor es recoger los disolventes
inflamables en bidones de seguridad y almacenarlos en una cabina de
almacenamiento previo a la recolección por un gestor de residuos autorizado. El
éter y los disolventes clorados se deberán recoger en latas separadas. Los otros
disolventes pueden combinarse en una sola.

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Ejemplos de disolventes corrosivos son los ácidos fuertes tales como ácido
sulfúrico, clorhídrico, y fosfórico y bases tales como hidróxido de amonio.
No deben usarse productos químicos tóxicos, corrosivos e inflamables como
conservantes en la fase preanalítica.

Nunca se ha de agregar orina a ácidos concentrados. Dichos ácidos deberán ser


diluidos añadiéndolos lentamente, dejándolos resbalar por las paredes del
contenedor de orina. La eliminación de ácidos fuertes y materiales corrosivos
deberá hacerse preferentemente por vertido al fregadero, dejando correr el agua
fría del grifo, a continuación, en cantidades abundantes contaminación para la
capa de agua.

Para estar bien informado sobre los productos químicos peligrosos, cada
laboratorio deberá tener un archivo de hojas de datos de seguridad del material
que enumere las propiedades peligrosas de cada producto químico, y que
pueden consultarse fácilmente en casos de emergencia o cuando haya duda con
respecto a la naturaleza del riesgo.

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TEMA 23. GESTIÓN DE RESIDUOS


SANITARIOS.
CLASIFICACIÓN, TRANSPORTE,
ELIMINACIÓN Y TRATAMIENTO.
Los avances tecnológicos en el campo de la atención al paciente, tiene como
contrapunto un incremento notable del volumen y diversidad de residuos
sanitarios. La clasificación, transporte, eliminación y tratamiento y su gestión han
planteado a nuestras organizaciones sanitarias numerosos problemas. Hoy, los
centros sanitarios gestionan de forma diversa y con desigual oportunidad los
residuos clínicos y no cabe duda de que una parte considerable de forma poco
justificada (normativas legales escasas, contradictorias y confusas).

¿Qué situación tiene nuestro país respecto a los Residuos


sanitarios?

En España carecemos en el ámbito estatal de un marco legal actualizado que


regule la eliminación de residuos sanitarios. Así la Ley 42/75 sobre desechos y
residuos sólidos indica que los residuos generados como consecuencia de las
actividades sanitarias en hospitales, clínicas y ambulatorios deben ser
consideradas como residuos sólidos urbanos; por tanto, su recogida y su
tratamiento son competencia de los Ayuntamientos, dejando a cada
administración local la decisión de los reglamentos, clasificación y el tratamiento
de los residuos generados. En 1986, esta ley fue modificada por el Real Decreto
legislativo 1163/1986 para adaptarse a la Directiva Comunitaria 75/442/CEE de
1975. Posteriormente el Real Decreto 833/88 por el que se aprueba el
Reglamento para la ejecución de la Ley 20/86 de residuos tóxicos y peligrosos,
completó la mencionada ley 42/75.

En España, desde los años 90, se ha realizado un gran esfuerzo, al menos


legislativo, en la regulación de los residuos sanitarios. Hoy 12 de las 17
Comunidades Autónomas, han preparado decretos específicos referentes a
ellos. Debe también mencionarse, aunque son anteriores, los intentos llevados a
cabo por diferentes Ayuntamientos como Madrid, Barcelona, Burgos, etc. con
sus Ordenanzas Municipales, y los realizados por el SAS con sus Manual de
Gestión Interna de Residuos Sanitarios, así como proyectos llevados acabo por
la iniciativa privada (Proyecto Clinhos, Instituto Cerdá), para organizar y tratar de
dar una coherencia a la gestión de estos residuos, por lo que podemos afirmar
que, aún faltando una legislación nacional, se ha tratado de regularizar este tipo
de residuos.

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Riesgos de los Residuos Sanitarios

La aproximación al hipotético riesgo infeccioso de los residuos sanitarios, exige,


al menos, la consideración acerca de los de los factores necesarios para
producir la enfermedad entre los que se encuentran: carga microbiana, la
resistencia del huésped, la puerta de entrada del agente patógeno y la virulencia
o la capacidad real del patógeno de producir una enfermedad.

Los riesgos de transmisión de enfermedades infecciosas a través de los residuos


procedente de estos enfermos infecciosos, requieren buscar las evidencias
epidemiológicas de tal riesgo. Los riesgos son remotos.

Evidencias epidemiológicas
El riesgo para el profesional sanitario que usa equipos o instrumental en el
campo de la atención al paciente y el riesgo para el personal que manipula el
residuo sanitario, es decir ese material ya desechado, es distinto.

Existen datos en la literatura científica que confirman la existencia de casos de


transmisión ocupacional, principalmente Hepatitis B, C y VIH/ SIDA, adquiridos
por TAS (Trabajador de Atención a la Salud - enfermería, médicos, técnicos de
laboratorio, etc.) como consecuencia de un accidente durante la atención medica
a un paciente fuente positiva de tales enfermedades.

Tabla. Casos definidos de transmisión ocupacional de VIH/SIDA declarados a nivel


mundial.

País Número %

E.E.U.U 49 58,34
Francia 10 11,90
España 5 5,95
Italia 4 4,76
Reino Unido 4 4,76
Alemania 2 2,38
Bélgica 2 2,38
Confederación 1 1,19
Helvética
Otros países 7 8,34

TOTAL 84 100,0

Tomada y adaptada de: De Andrés R y Nájera R: Algunos aspectos de la


exposición ocupacional a VIH en la atención de salud en el mundo. 1996

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De igual forma, se conocen, las diferentes categorías profesionales, el tipo de


exposición y los instrumentos que han intervenido en la transmisión ocupacional
de esta enfermedad. Los pinchazos con agujas son los mas frecuentes (91,4%);
cortes con escalpelo o bisturí representan el 4,3%, cortes con vidrio (material de
laboratorio) el 2,9%, siendo en un caso desconocido.

Tabla. Casos definidos de infección por VIH-1 adquirida ocupacionalmente. Distribución


por tipo de ocupación o categoría profesional.
Categoría Profesional u Ocupación Nº (%)
Personal de enfermería 40 46,62
Médico clínico (no cirujano) 7 8,34
Médico cirujano 1 1,19
Técnico de laboratorio clínico 17 20,24
Técnico de laboratorio no clínico 3 3,57
Técnico de cirugía (instrumentista) 2 2,38
Técnico de diálisis 1 1,19
Terapeuta respiratorio 1 1,19
Auxiliar de enfermería/auxiliar de
1 1,19
salud
Gobernanta/personal de
lavandería/mozo/personal de 3 3,57
mantenimiento
Otros, sin especificar 8 9,52
TOTAL 84 100,00

Fuente: De Andrés R y Nájera R: Algunos aspectos de la exposición ocupacional


a VIH en la atención de salud en el mundo. 1996

Tabla Instrumentos de Transmisión Ocupacional de VIH. EE.UU.(*) y EUROPA (Abril


1996)**

INSTRUMENTO EE.UU. EUROPA


Agujas 39 25 (Pinchazo)
1 (Corte con objeto
Escalpelo 1
agudo)
Vidrio 2 -
Desconocido? 1 -

*Cardo, D. Comunicación Personal. Mayo 1996. (Centers for Disease Control and Prevention.
Atlanta. Georgia)
** De Andrés R y Nájera R: Algunos aspectos de la exposición ocupacional a VIH en la atención
de salud en el mundo.

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Así, podemos concluir que:

• La transmisión de la enfermedad no se ha producido por contacto con


objetos no punzantes o cortantes (sábanas, guantes, etc.).

• No existe ningún caso en la literatura científica de infección VIH/SIDA


adquirida por manipulación de residuos sanitarios.

• Es muy importante resaltarse el hecho de que más del 95% de los


portadores de VIH/SIDA no están hospitalizados y que el material
potencialmente contaminado procedente de estos pacientes (jeringuillas,
agujas, etc.), se elimina sin protección, incluidos en los residuos sólidos
urbanos, comportando pues, mayor riesgo de transmitir VIH/SIDA y
cualquier otra enfermedad ya que por lo general el número de portadores
(personas sin la enfermedad clínica pero con la misma capacidad infectiva
que un enfermo y por lo tanto más peligrosos desde el punto de vista
sanitario), es mayor que el de enfermos, llegando a veces a la relación
10/1 (10 portadores por 1 enfermo) e incluso mayor.

• No conocemos en la literatura científica ninguna evidencia o caso


publicado de infección asociada a la manipulación de residuos entre los
trabajadores de las empresas externas que se dedican a la gestión de
este tipo de residuos.

Un segundo aspecto relacionado en la búsqueda de la evidencia de los riesgos


de los residuos sanitarios lo aportan los distintos estudios microbiológicos de
carga microbiana en los residuos sanitarios versus residuos domésticos:

Diferentes estudios científicos, en los que se han estudiado las cargas


bacterianas o recuentos de bacterias totales, han puesto en evidencia que en los
residuos sanitarios procedentes de hospitales grandes y pequeños, recogidos en
diferentes unidades de hospitalización, así como en clínicas privadas,
comparados con los residuos domésticos, dan como resultado que la carga
bacteriana, (concentración de bacterias), es mayor en los residuos domésticos
que en los hospitalarios, con independencia de su procedencia.

Media aritmética de la concentración total por tipo de hospital y consulta privada


en residuos sanitarios y residuos domésticos. (colonias / gramo de residuo)

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Microorganismos
FUENTE Totales

HOSPITAL GRANDE:

C.I. Quirúrgicos 1,5 x 106


Hospitalización Quirúrgica 6,3 x 106
Hospitalización Médica 8,5 x 106
Pediatría 5,9 x 106
Quirófano 6,3 x 105

HOSPITAL PEQUEÑO:
C.I.Quirúrgicos
7,4 x 105
Hospitalización Quirúrgica 1,8 x 107
Hospitalización Médica 2,7 x 106
Quirófano 2,9 x 104

CONSULTAS PRIVADAS:

Médico General 1,3 x 106


Dermatología 1,9 x 107
Pediatría 1,0 x 107
Dentista 1,5 x 104

RESIDUO DOMÉSTICO O 3,0 x 108


URBANO

Esta mayor concentración de bacterias en los residuos domésticos se mantenía


incluso cuando se diferenciaban los diferentes grupos de bacterias que
componían los residuos en: aerobios, coliformes, E. Coli, Gram positivos,
estreptococos grupo D y anaerobios facultativos.

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Tabla. Media aritmética de la concentración total y por tipo de microorganismos en


residuos sanitarios y residuos domésticos. (colonias / gramo de residuo)

Gérmenes Bacterias Estreptococos Hongos


Totales Gram Grupo D Y
Negativas Levaduras

HOSPITAL
GRANDE

C.I. 1,5 x 106 1,5 x 105 4,4 x 103 2,3 x 103


Quirúrgicos
Hospitalización
Quirúrgica 6,3 x 106 1,8 x 106 2,9 x105 2,8 x103
Hospitalización
Médica 8,5 x 106 1,2 x 106 8,3 x 104 1,2 x 102
Pediatría 5,9 x 106 6,9 x 106 1,3 x 106 1,8 x 103
Quirófano 6,3 x 105 1,3 x 104 6,9 x 103 8,1 x 102

HOSPITAL
PEQUEÑO

C.I. 7,4 x 105 2,4 x 104 1,5 x 104 4,0 x 102


Quirúrgicos
Hospitalización
Quirúrgica 1,8 x 107 1,7 x 104 6,1 x 105 8,3 x 103
Hospitalización
Médica 2,7 x 106 1,4 x 104 5,5 x 104 7,9 x 103
Quirófano 2,9 x 104 8,5 x 104 2,8 x 102 2,5 x 103

RESIDUO
DOMESTICO 3,0 x 108 6,3 x 107 6,9 x 106 6,5 x 105
O URBANO

Por lo tanto puede concluirse que:

• Los casos documentados transmisión profesional se han producido dentro


de los centros sanitarios, como consecuencia de la atención sanitaria
directa a pacientes.
• No existe ningún caso documentado de VIH/SIDA se ha debido a la
manipulación de residuos sanitarios.
• Los casos de infección recogidos en la literatura científica se han
producido por material punzante.

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• El riesgo de infección por residuos sanitarios, sin objetos punzantes, es


prácticamente inexistente.
• La carga bacteriana, por tanto el potencial patógeno, de los residuos
sanitarios es menor que el de los residuos domésticos.
• No existe ninguna evidencia de que los residuos sanitarios sean una
amenaza para la salud pública en general.
• El mayor riesgo proviene de la utilización privada de jeringuillas (ADVP,
diabéticos, asistencia domiciliaria, etc.).
• En la literatura científica no hay evidencias de casos de infección por
manipulación de residuos sanitarios entre los trabajadores de empresas
externas que se dedican a la gestión de los mismos.

Por lo tanto. La mejora de la gestión los residuos sanitarios, exige:

1. Homogeneizar la denominación, clasificación y definición de los residuos


sanitarios.
2. Facilitar la segregación, envasado, almacenamiento y transporte interno.
3. Unificar los criterios de gestión extracentro: (transporte y eliminación o
tratamiento).
4. Establecer un plan de gestión de los residuos en los centros sanitarios y
no sanitarios.

A cada una de estas propuestas que reflejan los aspectos prioritarios a tener en
cuenta a la hora de gestionar este tipo de residuos.

CLASIFICACIÓN Y DEFINICIÓN DE LOS RESIDUOS


SANITARIOS.
Residuo sanitario es el que se genera como resultado o a consecuencia de una
actividad sanitaria bien médica, farmacéutica o veterinaria en cualquiera de sus
ámbitos: asistenciales, docentes o investigadores.

Se consideran incluidos, entre otros, hospitales, centros de especialidades,


centros de salud, clínicas públicas y/o privadas, consultorios, consultas, centros
universitarios y / o de formación, farmacias, laboratorios clínicos (biológicos,
anatomopatológicos, microbiológicos), laboratorios farmacéuticos, laboratorios
industriales y cualquier centro en el que se realice actividad sanitaria médica,
farmacéutica o veterinaria.

CLASIFICACION

Definición:

Grupo I o Clase A) Residuos Generales o Urbanos.

Sin ningún tipo de contaminación específica, están regulados por la Ley 42/75
sobre desechos y residuos sólidos urbanos y el RD 1163/86 que la adapta a la

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directiva Comunitaria 75/422/CEE. Son pues aquellos generados en donde no se


realiza actividad propiamente sanitaria, tales como oficinas, comedores, cocina,
cafetería, salas de espera, almacenes etc. Incluyen papel, cartón, vidrio, restos
de comida, restos de jardinería, mobiliario, metales etc.

Grupo II o Clase B) Residuos Biosanitarios Asimilables a Urbanos (RBU)

Son aquellos que no pueden eliminarse mediante sistemas propios de los


residuos sólidos urbanos, sino con tratamiento de incineración o desinfección.
Incluye a todos aquellos que no estén definidos en el Grupo biosanitarios
especiales o Específicos. Está constituido por residuos tales como material de
curas, yesos, filtros de hemodiálisis, vendajes, gasas, tabuladuras, guantes y
otros desechables quirúrgicos, bolsas de sangre vacías etc.

Grupo III o Clase C) Residuos Biosanitarios especiales (RBE)

Son los productos biológicos y todo material de contacto con estos productos,
con excepción de las aguas residuales. En esta clase se incluyen aquellos
residuos con capacidad potencial de producir contagio y/o toxicidad para los
trabajadores sanitarios o por razones de ética y estética. Están constituidos por
residuos de pacientes con infecciones altamente virulentas y erradicadas,
Residuos de pacientes con infecciones de transmisión oral-fecal, Residuos de
pacientes con infecciones de transmisión por aerosoles, filtros de diálisis de
pacientes infecciosos, residuos punzantes o cortante, independientemente de su
origen, cultivos y reservas de agentes infeccioso, residuos de animales
infecciosos de experimentación, cantidades importantes de líquidos corporales,
especialmente sangre humana, residuos anatómicos humanos reconocibles

Grupo IV o Clase D) Residuos Químicos

Residuos tipificados en normativas especiales: Residuos Químicos aquellos


contemplados en la Ley 20/1.986 Básica de Residuos Tóxicos Peligrosos. Es el
material de desecho contaminado con productos químicos que le confieren el
carácter de residuo tóxico y peligroso. Se gestión queda regulada por el RD
833/1988.

Los más importantes están constituidos por los Citotóxicos o cistostáticos en los
que importante recordar que debe ser diferenciada su eliminación final y por su
importancia cuantitativa y su especificidad sanitaria. También se sitúan en este
grupo el formaldehido, compuestos de revelado, disolventes, mercurio,
medicamentos caducados, reactivos de laboratorio y un amplio grupo como son:
compuesto oxidante, desinfectante, pilas, gases de anestesia, aceites
lubricantes, pinturas, lámparas fluorescentes, pesticidas, fibras de amianto,
estabilizadores de material médico, etc.

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Grupo V o Clase E) Residuos Radiactivos

Son residuos Radiactivos aquellos contaminados por sustancias radiactivas cuya


eliminación es competencia exclusiva de la Empresa Nacional de Residuos
Radiactivos (ENRESA), de acuerdo con el Real Decreto 1522/84.

Grupo VI o Clase F) Restos anatómicos y humanos de entidad

Los cadáveres y los restos humanos de entidad suficiente, procedentes de


abortos, mutilaciones y operaciones quirúrgicas. Su gestión queda regulada por
el RD 2263/1974 sobre Policía Sanitaria Mortuoria

Grupo VII o Clase G) Aguas Residuales

Son líquidos que por su composición pueden ser vertidos a la red de


saneamiento. Las ordenanzas municipales establecen las condiciones que
deben reunir las aguas que se vierten a la red de saneamiento.

SEGREGACION, ENVASADO, ALMACENAMIENTO Y TRANSPORTE


INTERNO

El criterio que debe priorizarse es el de la correcta separación-segregación en


los centros, que se realizará sobre la base de la clasificación de los grupos
definidos.

Residuos Grupos Urbanos y Biosanitarios asimilables a urbanos: pueden


acumularse en un mismo envase ambos tipos de residuos. Deberán separarse
de todas las demás clases de residuos.

Los envases para estos residuos deben cumplir las especificaciones oportunas
(Normas Europeas): Bolsas con opacidad, impermeabilidad, resistencia etc. Si
se utilizan bolsas de plástico serán de galga mínima 200, volumen no superior a
70 litros. Color negro. (Iguales que las utilizadas para la recogida doméstica).
Estos residuos se podrán compactar etc.

Los residuos Biosanitarios Especiales: Acumulación separada de todas las


demás Clases o Grupos y en envases o contenedores rígidos exclusivos de un
solo uso de color amarillo y sin posibilidad de apertura una vez cerrados,
etiquetados con el Pictograma BIORIESGO.

Los Residuos Grupo Químicos Para Citostáticos utilizar envases similares de


color rojo y que contengan únicamente este tipo de residuos (Citostáticos), por
tanto deben separarse del resto de los residuos de este tipo III, etiquetados con
el Pictograma CITOTÓXICO), deben prepararse en un local destinado a tal
efecto y con las medidas de seguridad adecuadas. Otras características de los
envases: Cumplir con las Normas Europeas, volumen máximo 60 litros de
capacidad, estanqueidad, opacidad, resistencia etc. Para contener agujas,

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bisturís, objetos cortantes etc, podrán tener diferentes volúmenes de capacidad


en función de las necesidades de cada área.

Transporte Interno

Cada centro productor establecerá dentro de su programa de gestión los


circuitos más acordes con sus necesidades, así como las características de los
carros de transporte, su limpieza periódica, horarios de recogida etc.,
minimizando el riesgo para la salud de los pacientes, personal y de los visitantes.

Almacenamiento

En un local adecuado de fácil limpieza, ventilación adecuada, estanco,


señalizado, con capacidad suficiente de acuerdo al volumen de producción, la
frecuencia, características y condiciones de la recogida.

GESTIÓN EXTRACENTRO ( TRANSPORTE Y ELIMINACIÓN O


TRATAMIENTO)

Corresponde a la Consejería de Medio Ambiente de cada comunidad autónoma


que debe regular, autorizar y supervisar el correcto cumplimiento de las normas
establecidas para cada una de las operaciones que forman parte de la gestión
en el exterior de los centros sanitarios.

A.- Transporte Externo de los Residuos Biosanitarios Asimilables a


Urbanos

La recogida y el transporte externo de los Residuos Urbanos y Biosanitarios


asimilables a urbanos, podrán acumularse juntos, deberá efectuarse, como
mínimo, con las mismas precauciones que son de aplicación a los residuos
sólidos urbanos.

Los Ayuntamientos están obligados a su recogida, transporte y eliminación


externa, en las condiciones que estipula la Ley 42 / 1.975 de Desechos y
Residuos Sólidos Urbanos.

B.- Transporte Externo de los Residuos Biosanitarios Especiales

En vehículos autorizados que cumplan la normativa vigente sobre transporte de


mercancías por carretera. Los gestores de estos residuos deben tener la/s
autorizaciones correspondientes para su transporte según la normativa del
Ministerio de Medio Ambiente y las que cada Comunidad Autónoma establezca
como propias.

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C.- Tratamiento y Eliminación

Grupo o Clases Residuos Generales y Residuos Biosanitarios Asimilables a


Urbanos.

Su tratamiento y eliminación deberá respetar, como mínimo, los mismos


requisitos técnicos, operativos y de seguridad que la normativa vigente exija con
carácter general para los Residuos urbanos.

Grupo o Clase Residuos Biosanitarios Especiales

Dada la particularidad de este tipo de residuos, sería oportuno que su


tratamiento y eliminación cumpla con los siguientes criterios:

• Que no se incluyan en ningún programa de reciclado, neutralización o


valorización.
• Deberán ser obligatoriamente incinerados, esterilizados o desinfectados.
Las modernas tecnologías que aparezcan y que garanticen la correcta
eliminación de estos residuos, deberán estar validadas y autorizadas por
los organismos competentes.
• La incineración de los Residuos Biosanitarios Especiales deberá cumplir
la normativa vigente sobre la incineración de este tipo de residuos. En su
defecto deberá cumplir los siguientes requisitos mínimos:
o La carga del horno se realizará sin que exista ninguna
manipulación directa de los residuos por parte de los operarios, y
sin que se produzca la rotura de los envases que contienen los
residuos, de forma que no exista contacto directo de los residuos
con ningún elemento mecánico exterior al horno. Deben
introducirse directamente en la tolva de la carga del horno, sin
pasar por la fosa de recepción.
o Deberán cumplirse todas las especificaciones técnicas y operativas
establecidas en la normativa vigente sobre incineración de
residuos sólidos urbanos en instalaciones de más de tres
toneladas por hora de capacidad.
o Ser de funcionamiento continuo.
o Tener una capacidad superior a tres toneladas por hora.
o El contenido de inquemados en las escorias propias de la
incineración de residuos sólidos urbanos no debe ser superior al 3
por 100.
o La carga de los residuos biosanitarios especiales debe hacerse
durante el funcionamiento normal del horno. Deben excluirse, por
tanto, las fases de encendido en enfriamiento del horno.
o Para los citotóxicos se alcanzarán temperaturas de 1.200º C.
o El funcionamiento de estas plantas de incineración será autorizado
por el órgano autonómico competente.

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Se entiende por desinfección de residuos sanitarios especiales aquella


tecnología que garantice: la eliminación de las formas vegetativas de bacterias,
micobacterias, hongos y esporas de hongos que elimine los virus y que elimine
las esporas del Bacillus Antracis.

La tecnología aplicada en todo proceso de desinfección cumplirá los objetivos


definidos en este apartado. Será autorizado por el órgano autonómico
competente.

Al menos, trimestralmente deben ser realizadas pruebas de control


microbiológico para comprobar el grado o eficacia de la desinfección y de la
esterilización en toda la masa del residuo según normas UNE.

Los resultados de estos análisis deberán quedar reflejados en un documento de


control y seguimiento y siempre disponible a requerimiento de las autoridades
competentes.

Grupo o Clase Residuos Químicos Citotóxicos

Dado el problema que plantea la neutralización química y el riesgo que para los
manipuladores externos y el medio ambiente, acompaña a este tipo de residuos,
como ya he comentado, se propone la incineración como forma obligada de
eliminación en las condiciones descritas en el apartado anterior sobre
incineración de Residuos Sanitarios Específicos.

Grupo o Clase Restos Anatómicos y Cadáveres

Este tipo de restos serán gestionados según lo establecido en el Reglamento de


la Policía Sanitaria Mortuoria en el Decreto 2263/1974 y según las normativas
autonómicas existentes al respecto de restos anatómicos y cadáveres.

En perjuicio de lo establecido por la legislación especial vigente sobre obtención


de piezas anatómicas por trasplante y utilización de cadáveres para fines
científicos y de enseñanza, el destino final de todo cadáver será uno de los tres
siguientes:

• Enterramiento en lugar autorizado.


• Incineración.
• Inmersión en alta mar.

También tendrán uno de los destinos expresados en el párrafo anterior, los


restos humanos de entidad suficiente y procedente de abortos, mutilaciones y
operaciones quirúrgicas, sin otro requisito en el orden sanitario, que el certificado
facultativo en que se acredite la causa y procedencia de tales restos.

Cuando el médico que lo extienda deduzca la existencia de posibles riesgos de


contagio, lo pondrá inmediatamente en conocimiento de la Dirección Provincial

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de Sanidad de la Consejería de Salud correspondiente, que adoptará las


medidas oportunas.

PLAN DE GESTIÓN DE LOS RESIDUOS EN LOS CENTROS SANITARIOS (Y


NO SANITARIOS):

Todo Centro Sanitario debe disponer de:

A.- Plan General de minimización en el que se definan los tipos de residuos, su


clasificación, separación, acondicionamiento, circuito de transporte interno,
almacenamiento y tratamiento si lo realiza individualizado, así como acciones a
tomar para implantar esta minimización.

El término reducción en muchas ocasiones se utiliza como minimización y


aunque la más simple y eficaz medida para reducir el volumen de residuos es
introducir una clasificación o definición de los mismos que sea clara y fácil de
entender así como establecer y aplicar criterios comunes referidos
especialmente a aquellos residuos que por sus especiales características
requieran un envasado, transporte y tratamiento diferenciado, en nuestra opinión
la minimización de residuos es prioritaria e inaplazable ya que la política de
Residuos de la Unión Europea lo contempla en la Directiva 75/442, el 5º
Programa de Medio Ambiente, la Directiva 91/C 190/ 01 relativa a los Envases y
sus residuos, así como la Directiva 94/62, DOCE L, 365.

La minimización debe entenderse en el concepto más amplio de “prevenir la


generación de residuos“ y este nuevo enfoque, para los residuos sanitarios,
incluye actuaciones a llevar a efecto por el hospital, por los proveedores o
fabricantes y por el Estado o Comunidad Autónoma.

B.- Plan de Contingencia y medidas de prevención de riesgos para todo el


personal (manipulador y no manipulador)

Se deberá contemplar un Plan de Contingencia y Medidas de Prevención de


Riesgos, según los establecido mediante la Ley 31/95 del 8 de Noviembre de
Prevención de Riesgos Laborales.

La Ley de Prevención de Riesgos Laborales tiene por objeto promover la


seguridad y la salud de los trabajadores mediante la aplicación de medidas y el
desarrollo de las actividades necesarias para la prevención de riesgos derivados
del trabajo.

Esta Ley establece los principios generales relativos a la prevención de los


riesgos profesionales para la protección de la seguridad y de la salud, la
eliminación o disminución de los riesgos derivados del trabajo, la información, la
consulta, la participación equilibrada y la formación de los trabajadores en
materia preventiva.

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La Ley de Prevención de Riesgos Laborales regula las actuaciones a desarrollar


por las Administraciones Públicas, así como por los empresarios, los
trabajadores y sus respectivas organizaciones representativas.

Por tanto debe existir una normativa acorde con lo establecido en la Ley de
prevención de Riesgos Laborales y con este Plan en donde estén recogidas y
escritas las medidas que han de ponerse en práctica ante determinadas
circunstancias, (Roturas, salpicaduras, inoculaciones etc.), y otras tales como
actuación inmediata en suelos y superficies, registros, protocolos de control y
seguimiento, profilaxis etc. del trabajador que sufra algún accidente o incidente
con este tipo de residuos, así como la dotación y equipamiento para la
protección individual y las vacunaciones obligatorias de este personal que, al
menos deberían ser, frente a tétanos y hepatitis B.

C.- Se deberá contemplar un Plan de Gestión de Envases y Residuos de


Envases Farmacéuticos, clínicos y hospitalarios.

Atendiendo al objeto y ámbito de aplicación de la Ley de envases y residuos de


envases (BOE Nº 99 de 25/4/97), hay que tener en cuenta que hay que prevenir
y reducir el impacto sobre el medio ambiente de los envases y la gestión de los
residuos de envases a lo largo de todo su ciclo de vida.

Para alcanzar los anteriores objetivos se establecen medidas destinadas, como


primera prioridad, a la prevención de la producción de residuos de envases, y en
segundo lugar, a la reutilización de los envases, al reciclado y demás formas de
valorización de residuos de envases, con la finalidad de evitar o reducir su
eliminación.

Quedan dentro del ámbito de aplicación de la Ley de envases y residuos de


envases a aquellos puestos en el mercado y generados, respectivamente, en el
territorio del Estado.

Lo establecido en la Ley de envases y residuos de envases lo será sin perjuicio


de las disposiciones de carácter especial referentes a seguridad, protección de la
salud e higiene de los productos envasados, medicamentos, transportes y
residuos peligrosos.

D.- Participación del personal en el Plan Propuesto

Los profesionales sanitarios, y en general todos los empleados, son los


miembros del Hospital que están más en contacto con los residuos y emisiones
que éste genera y su manera de trabajar puede influir en su generación, por lo
que ocupan una posición privilegiada para identificar problemas y plantear
posibles soluciones.

Es importante que comprendan los motivos del plan que se desea implantar, que
se familiaricen con los cambios que se propongan y se sientan parte importante

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del programa en marcha, lo que puede lograrse mediante la formación y el


reconocimiento de sus aportaciones.

La formación puede proporcionarse organizando seminarios donde incluyan


medios audiovisuales que pueden servir para presentar ejemplos prácticos de
situaciones que aparezcan en las plantas: manipulaciones incorrectas,
clasificaciones diferentes, etc.

Mediante reuniones del equipo responsable del Plan de minimización


hospitalaria con los operarios, es posible informarles de los objetivos del Plan y
de las mejoras que se espera alcanzar por la gestión del hospital y la de los
propios trabajadores. Estas reuniones permiten resolver las dudas que los
operarios pueden tener y conseguir que comenten los problemas que hayan
identificado. En estas reuniones se debe prestar especial atención al personal
implicado en acciones con impacto directo en la generación de residuos y
emisiones y que pueden identificar oportunidades de minimización: DUE/ATS,
Facultativos médicos, auxiliares, personal interno, mantenimiento, etc.

La formación de los operarios debe mantenerse mientras dure la elaboración e


implantación del Plan, pues siempre hay nuevos empleados que desconocen las
técnicas de minimización. Además sirve para mantener el interés de todos los
trabajadores y para informarles sobre los resultados del programa en marcha. En
los grandes hospitales puede hacerse con ayuda de un boletín interno o
utilizando planes de anuncios instalados en las zonas de paso; en los pequeños
hospitales o clínicas mediante reuniones periódicas.

El procedimiento de las aportaciones de los operarios se logra por medio de una


política diseñada al efecto, que puede incluir regalos y primas por las ideas de
minimización que proporcionan buenos resultados, premios y nominaciones a las
mejoras ideas.

E.- Sistema de Evaluación y Registro.

Es necesario estar en constante evaluación de los objetivos planteados en este


plan para continuar con el mismo, si los objetivos se alcanzan, o para corregir las
anomalías o desviaciones que se detecten.

Para finalizar consideramos que la promulgación de una normativa estatal no


debe obligar a la creación de normativas específicas por parte de las
Comunidades Autónomas que carezcan de ella. Sin embargo, la promulgación
de una normativa estatal debería establecer los requisitos mínimos que todas las
Comunidades Autónomas deberían considerar en la gestión de los residuos
sanitarios, homogeneizando todos los aspectos aquí considerados.

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