1 981
El problema de la determi naci n de clorofila a en
el fi tomicrobentos: di scusi n sobre
la metodol oga
MANUEL VARELA
Instituto Espaol de Oceanografa. Muelle de Animas s/n. Aptdo. I3O. La Corua
INTRODUCCiN
Est demostrado que l os productos
de degradacin de la clorofi la represen
tan en el bentos una fraccin importante
del total de pigmentos verdes presentes .
Estas formas degradadas o inactivas ab
sorben luz en la parte roja del espectro
y esta abso.cin no es di stinguible de
la de l as formas activas . Las tcnicas
empleadas para la determinacin de pig
mentos deben por tanto tener en cuenta
esta c ircunstancia, porque de lo contra
rio los resul tados obtenidos seran poco
fiables .
El esquema de l a degradacin de
la clorofi la-a es el s iguiente ( YENTSCH ,
1 967 ) :
-Mg - r.o1
_
reor:t.oa-
_
c:oror.:a-_ Feof6rbido- .
c:oror.:.da-a
-r.o: -
Mg
La prdida del ncleo magnsico
y de la cadena fitol degrada la clorofi-
* \ \ 00 t
0
C
v
<
,
''' -
o"
4U
..., ......
UU U
LLNLl1O OE NO^
MANUEl VARELA
l lega a incrementar de forma consi dera
ble la absorcin de fondo , uti lizada.
para corregir la turbidez de la solu
cin , introduc iendo de e sta forma nuevos
errores en el clculo de pi gmentos . Este
incremento de la absorcin a 760 nm se
debe a la escisin de la fucoxantina
en productos de tipo furano ( fig . 2).
El empteo de metanol como solvente
presenta prob lemas semejantes al de la
acetona , con desplazami entos de los m
ximos de absorcin hac ia l ongitudes de
onda menores de la esperada ( fi g. 3 ) .
Esta reaccin es mucho ms rp ida
en metanol acuoso que en acetona acuosa .
La tran
.
sformacin de monoca "iones de
feofitina en sus respectivos dicationes
ti ene lugar a un pH < 2 en me tanol acuo
so y slo a pH < 0, 6en acetona acuosa .
Este desplazamiento del espectro es com-
FucOxD!1D
UU U 7UO
Fi g. 2 . Espectros de absorcin de la fucoxant ina antes (- ) y despus (---) de ser acidi ficado
el extracto lJUU % de acetona) hasta una molaridad final de ClH de 4, 4XlO
-2
M (MOED & HALLEGRAEFY,
\9701
Fig. 2. Absortion spectra of fucoxantin befare ( -) and after (----) acidification with Clli. Final molar"ity
of the acid. 4. 4XIO
-2
M (MOED & IIIL['F.CRAEF"F. 1978).
o
z
"
m
a
O
"
DFTERMI NACI 6N DE CLOROFILA ' EN EL FITOMICROBENTOS
!1
anles acidificar
_ (664)
presente formacin de dicationes . HOLM
-HANSEN & RIEMANN ( 1978 ) aconsejan e l
empleo d e 25 mg d e C0
3
Mg por ml d e ex
tracto , para una concentrac in final
de c ido 3x10
-3
M, con un tiempo de reac
cin de 10 minutos y agitac in suave .
MEDIDAS DEL pH ANTES Y DESPUS
DE LA ACIDI FICACIN
MOED & HALLEGHAEFF ( 1978 ) han l l e-
600 650
LONGITUD DE ONDA (nml
vado a cabo un completo estudia acerca
700
de la influencia del pH del extracto
en la absorbancia de los pigmentos , que
Fig. 3 . Espectros
'
de absorcin de pigmentos
extrados en metaol de un cultivo de Dunalie
lla tertiolecta ( HOLM-HANSEN & RIEMNN , 1978 ) .
Fig. 3 . Absortion spectra _f pigments extracted
in methaol from a culture of Dunaliella tertiolecta
(HOLM-HANSEN & RIEMANN, 1978).
pletamente revers ible mediante neutral i
zacin con CI
3
Mg , lo cual indica la
exi stencia de un cambio fsico ms que
de uno qumico de transformacin en feo
frbido .
Estos cambios espectrales de l a
feofi tina en relac in con e l pH , han
si do sealados para metanol al 80 , 90 ,
95 y 100 % ( LIVINGSTONE et al . , 1 93 ;
MARKER , 1 972 ) y 100 % de acetona ( MOED
& HALLEGRAEFF , 1978 ) , y no fueron de-
tectados en acetona al 80 , 90 y 95 %.
Esto e s debido a que e n acetona acuosa
es necesario alcanzar un pH tan baj o
como 0 , 5 para que comience la formacin
de dicationes de feofitina , mientras
que en metanol acuoso esta transforma
c in tiene lugar ya a un pH de 2 . Por
tanto , cuando se emplee el metanol como
66 espu s de la acidi ficac in
es necesario neutral izar el extracto
hasta un nivel de pH en el cual no se
permite expl i car de forma cl ara numero
sos problemas que plantea la acidi fica
c in , en un intento de caracterizar l as
condiciones ptimas de l a misma en rela
c in con l a molari dad final del cido .
En este sentido , l a determinac in del
pH en los extractos parece ser un crite
rio ms adecuado que el clculo de la
molaridad del cido puesto que aqul
no depende nicamente de l a cantidad
de cido aadido s ino tambin del con-
tenido en agua del sol vente . De todas
formas l as medidaS de pH en solventes
acuosos orgnicos deberan ser interpre
tadas con grandes precauc iones , ya que
el concepto de pH ha si do definido ni
camente en relacin con el agua como
solvente .
La adicin de in
-
-
-
-
Q
--
--
-
-
-
Q ------- _____
-3 -2 -1
-
-- -g---
-
_ ACETONA
--:
0--__ _
-'(---
HEXANO
`
r 01 ofSVI"CION DE l' _, DE .aSO....NCI .. M"XIM4
Fig. S. Variacin del valor de R (relacin de
las abso!bancias a 663 nr antes y dfspus de
aCidi!icar) con la longitud de onda para la
clorofila-a pura, en acetona al 90 % Y hexano.
(WHITNEY & DARLE Y , 1979).
Hexano
R
feofitina 6630: 663a C1a feofitina
0,002 2,227 23,898 0,009
1,138 2,105 34,083 7,139
2,215 1,798 3,592 1,926
4,548 1,711 7,648 5,547
7,270 1,057 0,200 4,085
4,651 1,050 0, 164 3,958
Tabla IV - Comparacin de los valores de cloro
fila-a y feopigmentos obtenidos por los mtodos
de acetona y hexano. En el caso de la clorofi
la, los porcentajes corresponden a la relacin
entre los valores de hexano y acetona, conside-
'
rando que los primeros representa la forma
activa del pigmento y los segundos el total
(activa + degradada = clorofila + cloroflida).
En el caso de los feopigentos, los porcentajes
expresan la relacin entre los valores obteni
dos por uno y otro mtodo. Las muestras seala
das con un * representa cantidades de feopig-.
mentos ms elevados en acetona que en hexao.
Muestras procedentes de la ra de Arosa (VARELA
& PENAS , en preparacin). N , nmero de mues
tra .
% Cl-a activa
Clorofila-a FEOPIGMENTOS
(mg/m
2
) (mg/m
2
)
N acetona hexano % acetona hexano %
373 , 8 198,4 53 285,1 348 , 5 122
2 Z57,3 133,1 51 301,7 399 , 8 132
3 377,8 217 , 7 58 283 , 2 453 , 7 160
Fig, 6, Dependence af befare-ta-after acidificatian
' 4 133,4 52 , 3 39 365,8 628,5 171
ratic, E. wavelength faI' pure chlaIaphyl1-a
9:: ' % aceane an hexane (WHITNEY & DARLEY,
1979) ,
5 203,0
6 245,2
118 , 5 58 225,9 210,1 *107
123,4 50 226,7 204 , 9 *110
DETERMI NACI N DE CLOROFI LA a EN EL FI TOMI CROBENTOS
1 7
Las di ferenc ias entre las concen-
trac iones de feofitina no son consisten-
tes ; en algunos casos e l mtodo del he
xano :propopciona una mayor cantidad de
feofi tina . l de acetona ( tabl as TTT
y IV ) . E, el caso de muestras de sedi
mentos :procedentes de l a ra de Arosa
( VARELA
'
& PENAS , en preparacin ) , e l
hexano proporc ion e n l a mayora de l os
casos valores ms el evados que la aceto
na ( tabl a I V) , en ocasiones hasta un
170 % mayores . Esto resulta probabl emen
te de la di ferencia en el nivel de feo-
frb ido en l as muestras ( WHITNEY & DAR
LEY , 1979 ) o de algn t ipo de interfe-
renc ia no conocida , puesto que la aceto
na debera proporcionar valores de feo
pigmentos ms e l evados que e l hexano ,
pues en ste l os feofrbidos son e l imi
nados en l a hipofase acetnica durante
la partic in y no son medidos como feo
fi tina .
EL USO DE C03Mg DURANTE EL PROCESO
DE EXTRACCIN
El C0
3
Mg es ampl iamente util izado
durante la extracc in de p igmentos en
fi toplancton , macrfitos y fi tomi croben
tos , para pr