Guia Relacre 13

Guia 13
VALIDAO

DE

MTODOS INTERNOS DE ENSAIO

EM

ANLISE QUMICA

Associao de Laboratrios Acreditados de Portugal

.

FICHA TCNICA

TTULO:
Guia RELACRE 13
VALIDAO DE MTODOS INTERNOS DE
ENSAIO EM ANLISE QUMICA

EDIO: RELACRE
DESIGN GRFICO: RELACRE
CAPA: Alda Rosa
IMPRESSO: Espao 2 Grfico
TIRAGEM: 500 exemplares
DEPSITO LEGAL: 149304/00
ISBN: 972-8574-02-9

Guia RELACRE 13
EDIO: FEVEREIRO 2000

VALIDAO

DE MTODOS INTERNOS

DE ENSAIO

EM

ANLISE QUMICA

A presente edio foi elaborada pelo grupo de trabalho GT03 Validao de
Mtodos Internos , da Comisso Tcnica 03 da RELACRE.
inteno da RELACRE proceder reviso deste documento sempre que se
revele oportuno.

Coordenador do grupo : Augusto F. Rodrigues Castro - SMAS - Porto

Coord. substituto do grupo : Lus Jos Cabrita - Lab. Ref. Sines Petrogal

Colaboradores :
Aida Marques CTIC
Ana Contreiras DGFCQA
Arsnio Ferreira L. LUB - PETROGAL
Brbara Alfaiate IST
Berta Cardiga INDEP
Elsa Rola
ARSENAL DO ALFEITE
Helena Loureno IPIMAR
Hlia Fernandes LNEC
Ilda Damas Mra INSA
Isilda Andrade INETI
Judite Correia EPAL
Manuela Cunha ARSENAL DO ALFEITE
Maria da Luz Ferreira LNIV - Lisboa
Maria do Cu Bernardes LPQ
Maria Ismnia N. Soares LNIV - Lisboa
Maria Lgia Martins LNIV - Lisboa
Maria Nomia Gomes LNIV - Porto
Teresa Carreira SMAS - Loures
Vitor Vale Cardoso EPAL
Carlos Ferreira DRAEDN
Jorge Ribeiro L. REF. PORTO PETROGAL
Lcia Sousa Santos SMAS - Oeiras e Amadora
Regina Marques SMAS - Loures

Agradecimentos :
- Eng Leopoldo Cortez (Coordenador CTR03), pelo apoio prestado na elaborao
deste guia;
- Dr Maria Jos C. Machado (IGM) e Eng Maria Joo Monteiro (Centro de
Qualidade Alimentar - ESB) pela ajuda prestada, na discusso de alguns assuntos
deste Guia.
Direitos de Autor protegidos segundo
legislao em vigor.
Probida cpia total ou parcial sem
autorizao escrita da RELACRE.

NDICE

1. ASPECTOS TERICOS 1
1.1 OBJECTIVO 1
1.2 INTRODUO 1
1.3 DEFINIES 1
2. VALIDAO DE MTODOS INTERNOS DE
ENSAIO 3
2.1 DESCRIO DO MTODO 3
2.2 GRAU DE EXIGIBILIDADE 4
2.3 AVALIAO INDIRECTA 6
2.3.1 ESPECIFICIDADE/SELECTIVIDADE 6
2.3.2 QUANTIFICAO 7
2.3.2.1 Curvas de Calibrao 7
2.3.2.2 Limiares Analticos do Mtodo de ensaio 16
2.3.2.3 Sensibilidade 20
2.3.3 PRECISO 21
2.3.3.1 Repetibilidade 21
2.3.3.2 Reprodutibilidade 23
2.3.3.3 Preciso Intermdia 27
2.3.3.4 Comparao da Preciso Entre Mtodos 30
2.3.4 EXACTIDO 30
2.3.5 ROBUSTEZ 30
2.4 AVALIAO DIRECTA 34
2.4.1 MATERIAIS DE REFERNCIA CERTIFICADOS 34
2.4.2 ENSAIOS INTERLABORATORIAIS 38
2.4.3 TESTES COMPARATIVOS 40
3. BIBLIOGRAFIA 48

VALIDAO DE MTODOS INTERNOS DE ENSAIO EM ANLISE QUMICA

GUIA RELACRE N 13 - EDIO 1 FEVEREIRO 2000 PGINA 1 DE 50

1. ASPECTOS TERICOS

1.1 OBJECTIVO

Este documento - Validao de Mtodos Internos de Ensaio em Anlise Qumica - tem como
objectivo a uniformizao de critrios utilizados para demonstrar que um mtodo interno de ensaio,
nas condies em que praticado, tem as caractersticas necessrias para a obteno de resultados com
a qualidade exigida.

Este documento estabelece linhas de orientao a seguir pelos Laboratrios Qumicos que pratiquem
mtodos internos de ensaio.

1.2 INTRODUO

Um mtodo de ensaio um processo que envolve manipulaes susceptveis de acumularem erros
(sistemticos e/ou aleatrios), podendo assim, em algumas situaes, alterar de forma significativa o
valor do resultado final.

fundamental que os Laboratrios disponham de meios e critrios objectivos, para demonstrarem,
atravs da Validao, que os mtodos internos de ensaio que executam, conduzem a resultados
credveis e adequados qualidade pretendida.

1.3 DEFINIES

Para os fins deste documento adoptaram-se as seguintes definies:

Ensaio

- Operao tcnica que consiste em determinar uma ou mais caractersticas de um produto,
processo ou servio, segundo um modo operativo especificado (NP EN 45001).
Mtodo de Ensaio

- Procedimento tcnico definido para a realizao de um ensaio (NP EN 45020).

PGINA 2 DE 50 GUIA RELACRE N 13 - EDIO 1 FEVEREIRO 2000

Mtodo Normalizado

- Mtodo de ensaio que segue o indicado numa norma de ensaio ou documento
normativo equivalente. Assume-se que, estes mtodos foram devidamente validados, esto sujeitos a
actualizao peridica, e so reconhecidos pela comunidade laboratorial nacional ou internacional
(Guia Lab G03). Incluem-se neste tipo de mtodos, mtodos internacionalmente reconhecidos, tais
como os da A.O.A.C., Standard Methods, para os quais, devem ser verificados os parmetros
fundamentais de validao, nas condies de execuo e para os fins especficos de cada Laboratrio,
de forma a evidenciar a fiabilidade dos resultados obtidos.
Mtodo Interno

- Mtodo de ensaio que no segue uma norma de ensaio (nacional ou internacional) ou
documento normativo equivalente. Excluem-se desta situao as tradues e as reformataes (sem
alterao do contedo tcnico) de normas existentes (Guia Lab G03). Incluem-se nesta definio, os
mtodos adaptados/modificados, cujo contedo tcnico deriva de Normas, mas que no segue as
mesmas na ntegra.
Norma de Ensaio

- Norma que define mtodos de ensaio, por vezes acompanhadas de outras
disposies respeitantes ao ensaio, tais como amostragem, utilizao de mtodos estatsticos e
sequncia de ensaios (NP EN 45020).
Norma

- Documento estabelecido por consenso e aprovado por um organismo reconhecido, que
fornece, para utilizao comum e repetida, regras, linhas orientadoras ou caractersticas, para
actividades ou seus resultados, visando garantir um nvel de ordem ptimo, num dado contexto. As
normas devem fundamentar-se em conhecimentos conjugados da cincia, da tcnica e da experincia
(NP EN 45020).
Documento Normativo

- Documento que define regras, linhas orientadoras ou caractersticas para
actividades ou seus resultados. Incluem-se nesta definio, normas, definies tcnicas, cdigos de boa
prtica e regulamentos (NP EN 45020).
Organismo Reconhecido

- Organismo de normalizao ou outra organizao com reconhecida
credibilidade internacional no sector tcnico em causa.


Material de Referncia Certificado

- Material de Referncia em que os valores de uma ou mais
propriedades foram certificados por um processo tecnicamente vlido, e que acompanhado de um
certificado (ou outro documento) emitido por um organismo de certificao (Guia ISO 30).
Material de Referncia

- Material ou substncia com uma ou mais propriedades suficientemente bem
estabelecidas para serem usadas na calibrao de aparelhos, avaliao de mtodos de anlise ou
atribuio de valores a materiais (Guia ISO 30).
Ensaio Interlaboratorial

- Organizao, realizao e avaliao de ensaios da mesma amostra (ou
similares) ou material por dois ou mais Laboratrios diferentes, de acordo com condies previamente
definidas (Guia ISO 43).

2. VALIDAO DE MTODOS INTERNOS DE ENSAIO

2.1 DESCRIO DO MTODO

Quando se pretende validar um mtodo interno de ensaio ter-se- de efectuar a sua descrio e
caracterizao.

A descrio dos mtodos internos de ensaio deve ser feita em documentos, de forma detalhada, de
modo que qualquer pessoa com preparao adequada o possa executar. Estes documentos devero
conter os mesmos elementos de uma norma, nomeadamente:

Elementos identificadores do documento
- Ttulo ou designao do ensaio;
- Cdigo identificador do ensaio;
- Reviso/edio;
- Data de entrada em vigor e responsveis pela sua elaborao e aprovao;
- Nmero de cada pgina e nmero total de pginas.


Elementos descritivos do mtodo
- Resumo ou referncia aos princpios tericos da determinao indicando as grandezas
influentes no resultado;
- Campo de aplicao (tipo de produtos, grandeza a determinar, gama de medio, restries,
etc);
- Equipamento, material e reagentes;
- Processo de calibrao (utilizao de padres, ensaios de referncia ou em branco, traado da
curva de calibrao, etc);
- Procedimento de ensaio (condies operatrias, condies ambientais, critrios de
aceitao/rejeio, etc);
- Processo de clculo dos resultados (frmulas, tratamento de dados, apresentao de
resultados, etc).

Elementos bibliogrficos e normativos
- Referncias bibliogrficas e normativas.

Devero, quando aplicvel, existir elementos/registos complementares sobre:

- Amostragem (colheita, preparao, conservao e acondicionamento das amostras);
- Caractersticas do mtodo utilizado pelo Laboratrio;
- Precaues de segurana;
- Validao do mtodo;
- Validao e controlo do Software (clculos e apresentao de resultados);
- Controlo de aplicao em rotina;
- Clculo de incertezas.

2.2 GRAU DE EXIGIBILIDADE

Sempre que um Laboratrio pratica mtodos internos de ensaio ter que instruir um processo de
validao desses mtodos, que inclua todos os registos obtidos. A validao dos mtodos internos deve
ser adaptada a cada caso, sendo progressivamente mais exigente para as situaes indicadas:



1- Uma modificao menor da tcnica e/ou do equipamento e/ou do produto relativamente a
uma norma (ou documento normativo equivalente) existente. Neste caso as alteraes no levantam
dvidas sobre a equivalncia tcnica dos resultados;

2- Uma modificao maior da tcnica e/ou do equipamento e/ou do produto relativamente a
uma norma (ou documento normativo equivalente) existente. Neste caso as alteraes originam dvidas
sobre a equivalncia tcnica dos resultados.

3- Mtodo baseado em tcnica de ensaio conhecida, cuja aplicao ao ensaio pretendido venha
descrita em literatura cientfica no existindo norma de ensaio correspondente.

4- Mtodo de ensaio baseado em tcnica de ensaio conhecida, mas cuja aplicao ao ensaio
pretendido no venha descrita em literatura cientfica.

5- Mtodo baseado em tcnicas de ensaio, inovadoras, no descritas na literatura cientfica.

Geralmente as situaes 1 e 2 so as mais frequentes, enquanto as situaes 4 e 5 se encontram mais
em Laboratrios de Investigao.

Avaliado o grau de exigibilidade requerido para um mtodo interno ser necessrio realizar alguns
estudos de validao antes de o colocar em rotina, durante a sua implementao ou sempre que ocorra
uma alterao relevante do mesmo.

Os requisitos mnimos para a validao de mtodos internos de ensaio dependem do tipo de mtodo
em causa e compreendem o estudo e conhecimento dos parmetros seguintes:

- Gama de trabalho/Linearidade;
- Limiares analticos (Deteco e Quantificao);
- Sensibilidade;
- Preciso;
- Exactido.


Isto , para anlises qualitativas, no faz sentido determinar o limite de quantificao, a preciso, a
exactido e a linearidade/gama de trabalho. Neste tipo de anlises, o limite de deteco, a
selectividade/especificidade e a robustez so os pontos mais importantes na validao. Em anlise
quantitativa, e caso o mtodo seja aplicado em gamas vestigirias, j todos os requisitos acima citados
so importantes. No caso de mtodos quantitativos, com aplicaes a gamas de concentraes elevadas,
no faz sentido estudar os limiares analticos. Para mtodos inovadores, o estudo da robustez do
mtodo poder ser um factor chave para validar o mesmo. Assim, cabe ao Laboratrio analisar quais
os parmetros a incluir no seu plano de validao, perante o tipo de metodologia em questo.

O processo de validao envolve o estudo de parmetros por avaliao directa e por avaliao
indirecta e dever pelo menos abranger as partes ou alteraes cuja validao no tenha sido feita por
um organismo reconhecido.

2.3 AVALIAO INDIRECTA

Este tipo de validao efectuada por determinao e evidncia dos seus parmetros caractersticos.

2.3.1 ESPECIFICIDADE/SELECTIVIDADE

A Selectividade a capacidade de um mtodo identificar e distinguir um analito em particular numa
mistura complexa sem interferncia dos outros componentes. Esta caracterstica essencialmente
funo do princpio de medida utilizado, mas depende no entanto do tipo de compostos a analisar.

Diz-se que um mtodo especfico quando permite discriminar o analito relativamente a outras
substncias, eventualmente presentes na amostra a analisar, ou seja, quando oferece garantias que a
grandeza medida provm apenas do analito. Assim, ser necessrio averiguar a possvel interferncia de
outras substncias eventualmente presentes na amostra, utilizando para o efeito uma amostra complexa
(multi-componente).

Para avaliar as interferncias poder-se- realizar um teste de recuperao utilizando uma srie de
amostras, com a mesma matriz, em que apenas varia a concentrao do analito em propores bem
conhecidas e ao longo de toda a gama de trabalho. Convm que as amostras sejam analisadas em
duplicado e em condies de repetibilidade.


Um mtodo analtico pode ser considerado aplicvel (especfico e selectivo) quando na prtica, e aps a
realizao de testes de recuperao, se verificar que as taxas de recuperao so prximas de 100%. O
xito das taxas de recuperao depende obviamente do tipo de metodologia praticada, isto , se para
alguns mtodos se admite intervalos de recuperao mais alargados devido s prprias caractersticas do
mtodo, para outros no podero ser tolerados grandes intervalos. Caber ao Laboratrio, que realiza
ensaios de recuperao, ter critrios de aceitao relativos s taxas de recuperao conseguidas,
baseados em dados e factos credveis.

2.3.2 QUANTIFICAO

Para interpretar as informaes veiculadas pelos estudos e ensaios efectuados, o analista apoia-se no
clculo de vrios parmetros, entre os quais se destacam:

Curvas de calibrao;
Limiares analticos do mtodo de ensaio;
Sensibilidade.

2.3.2.1 Curvas de Calibrao

Em anlises quantitativas, a calibrao indica um processo pelo qual a resposta dum sistema de medida
se relaciona com uma concentrao ou uma quantidade de substncia conhecida.

Em mtodos instrumentais de anlise, a calibrao analtica do equipamento processa-se geralmente do
seguinte modo:

O analista prepara uma srie de solues padro em que a concentrao do parmetro a
dosear conhecida;
Estas solues padro de calibrao so medidas num equipamento analtico, nas mesmas
condies das amostras a analisar;
Estabelece-se um grfico de calibrao (sinal do equipamento em funo da concentrao) e
determina-se a concentrao do parmetro nas amostras, por interpolao.


Consideraes:

desejvel que a calibrao analtica seja efectuada aquando da anlise, devendo existir
critrios para aceitao das curvas de calibrao relativos linearidade e estabilidade entre
calibraes, definidos internamente. Recomenda-se o uso da norma ISO 8466-1 como
referncia para calibraes analticas, designadamente para efectuar regresses lineares pelo
mtodo dos mnimos quadrados;
Quando no efectuada a curva de calibrao diria, para cada srie de amostras, caber ao
Laboratrio definir um processo para verificao da validade da curva usada, face a critrios
de aceitao de desvios (Ex: evidenciar a sua estabilidade atravs de um histrico de curvas
de calibrao);
Os padres de calibrao devem distribuir-se equitativamente pela gama de trabalho;
O branco de calibrao (soluo com todos os reagentes, com excepo do analito a
analisar) muitas vezes diferente de zero e deve ser includo na curva de calibrao, quando
aplicvel;
Caso se utilize o mtodo dos mnimos quadrados, o eixo vertical (eixo y) representa sempre
a resposta instrumental do equipamento e, o eixo horizontal, (eixo x) representa sempre as
concentraes dos padres, uma vez que se assume que os erros associados aos valores de x
so desprezveis face aos de y. No caso do equipamento/software efectuar os clculos de
outro modo, o Laboratrio deve evidenciar em que condies se obtm resultados
comparveis;
Quando a curva de calibrao representa uma funo polinomial do primeiro grau, isto ,
uma recta, e caso se utilize o mtodo dos mnimos quadrados para as regresses lineares,
pressupe-se que os erros tm uma distribuio normal e que existe homogeneidade de
varincias ao longo da recta.

A forma algbrica da equao de uma recta dada por :

y = a + b x

Em que a representa a ordenada na origem e b o declive da recta.



Esta recta formada por um conjunto de pares ordenados e independentes, (x1,y1); (x2,y2);...; (xi,yi);...;
(xN,yN) que dever corresponder a N pontos marcados na recta. O ponto (x1,y1) pertence geralmente ao
branco. A mdia de valores de x (concentrao dos padres utilizados) representa-se por x e a mdia
dos valores de y (sinal instrumental) representa-se por y .

O clculo do coeficiente de correlao, () pode ser usado como um dos parmetros para avaliar uma
calibrao analtica :

( ) ( ) { }
( ) ( )
(
)
`
= =
=
N
i
N
i
N
i
y yi x xi
y yi x xi
1
2
1
2
1

O valor do coeficiente de correlao, pode tomar valores entre 1 e +1 (-1 +1). Na figura
seguinte abaixo, verifica-se que um valor de = +1 representa uma correlao positiva (recta de declive
positivo) e que um valor de = -1 representa uma correlao negativa (declive negativo).

Em anlise qumica, dependendo dos critrios internos do Laboratrio e do prprio mtodo analtico,
as curvas de calibrao, geralmente, devem ter valores de coeficientes de correlao superiores a 0,995.

= +1 = -1
0
2
4
6
8
0 5 10

0
2
4
6
8
0 5 10

Gama de trabalho

Quando se utiliza uma metodologia que envolve o traado de uma curva de calibrao, a gama de
trabalho pode ser avaliada pelo teste de homogeneidade das varincias. Recomenda-se a norma ISO
8466-1 para modelos lineares e a norma ISO 8466-2 para modelos polinomiais de 2 grau. O recurso a
ajustes polinomiais deve ser devidamente fundamentado.

Para mtodos que no envolvam o traado de curvas de calibrao, a gama de trabalho ter de ser
definida previamente e poder ser funo de alguns factores como a quantidade de amostra disponvel,
da boa visualizao dos pontos de viragem e volumes gastos no caso de volumetrias.

Neste Guia ser abordada a avaliao da gama de trabalho para mtodos que utilizem modelos de
calibrao lineares, dado serem os mais frequentes. De acordo com a norma ISO 8466-1 so
recomendados dez pontos de calibrao, no devendo ser em nmero inferior a cinco, distribuindo-se
de igual modo na gama de concentraes. O primeiro e o ltimo padro so analisados em 10 rplicas
independentes. Para um exemplo com padres como recomendado na ISO 8466-1 o quadro tpico ser
:

i xi yi,1 yi,2 yi,3 yi,4 yi,5 yi,6 yi,7 yi,8 yi,9 yi,10
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10

representando xi a concentrao e yij o sinal instrumental.



Teste de homogeneidade de varincias
Determinam-se as varincias associadas ao primeiro e ltimo padro (S
2
1 e S
2
10) do seguinte modo:

( )
S
y y
n
sendo
y
y
n
i
i j i
j
i
i
i j
j
i
2
2
1
10
1
10
1
=

=
=
=
,
,
:

para i=1 e i=10.

Sendo :
i - o nmero do padro (neste caso i vai de 1 a 10)
j o nmero de repetio efectuadas para cada padro

As varincias so testadas para examinar se existem diferenas significativas entre elas, nos limites da
gama de trabalho efectuando o clculo do valor teste PG:

a PG
S
S
b PG
S
S
)
)
=
=
10
2
1
2
1
2
10
2

sendo :

a) quando S
2
10 > S
2
1
b) quando S
2
1 > S
2
10


Compara-se este valor de PG com o valor tabelado da distribuio F de Snedecor / Fisher, para n-1
graus de liberdade :

Se PG F : diferenas de varincias no so significativas e a gama de trabalho est bem
ajustada.
Se PG > F : diferenas de varincias so significativas e a gama de trabalho deve ser reduzida
at que a diferena entre as varincias relativas ao 1 e ltimo padro permitam obter PG
F.

Linearidade

A linearidade pode ser avaliada atravs de um modelo estatstico, de acordo com a norma ISO 8466-1.
A partir de um conjunto de pares ordenados, calcula-se a funo de calibrao linear (ISO 8466-1) e a
funo de calibrao no linear (ISO 8466-2), bem como os respectivos desvios-padro residuais, Sy/x e
Sy2.

A diferena das varincias (DS
2
) calculada pela equao seguinte :

DS
2
= ( N - 2 ) . S
2
y/x - ( N - 3 ) . S
2
y2

em que N o nmero de padres de calibrao.

Calcula-se o valor teste, PG:

PG
DS
S
Y
=
2
2
2

Compara-se este valor de PG com o valor tabelado da distribuio F de Snedecor / Fisher :

Se PG F : a funo de calibrao linear.
Se PG > F : a funo de calibrao no linear.



No caso de PG > F, deve-se avaliar a possibilidade de reduzir a gama de trabalho. Caso se justifique
recorrer ISO 8466-2 ou a uma funo susceptvel de bom ajuste.

Para avaliar a linearidade poder-se- tambm recorrer a uma representao grfica da funo
juntamente com o clculo e anlise do coeficiente de correlao. Este teste de linearidade deve ser bem
interpretado, pois os coeficientes de correlao so bons indicadores de correlao, mas no
necessariamente de linearidade.

A anlise da gama de trabalho e da linearidade, tal como descrito anteriormente, deve ser encarada
como um estudo que deve ser realizado durante a fase de validao/implementao do mtodo de
ensaio, ou sempre que se justifique. Todavia, no caso da gama de trabalho estar j definida em
referncia bibliogrfica reconhecida, pode tornar-se desnecessrio analisa-la. Isto , em rotina, apenas a
linearidade da curva de calibrao utilizada num determinado mtodo analtico dever ser sempre
avaliada atravs da sua representao grfica juntamente com a anlise do coeficiente de correlao.

Mtodo dos mnimos quadrados
Por este mtodo demonstra-se que os coeficientes a ( ordenada na origem ) e b (declive ) da recta de
regresso de y em x, y = a + b x, so dados por:

( ) ( )
| |
( )
b
x x y y
x x
a y b x
i i
i
N
i
i
N
=

=
=
=
1
2
1

Sendo :

xi - valores individuais de concentrao
yi - valores individuais de sinal instrumental
x - mdia de valores de x (concentrao dos padres utilizados)
y - mdia dos valores de y (sinal instrumental)

Os coeficientes a e b do uma estimativa da verdadeira funo que limitada pela disperso inevitvel
do mtodo. A preciso da estimativa quantificada pelo desvio padro residual (S y/x) da recta de
regresso:

( )
| |
S
y a b x
N
y
x
i i
i
N
=
+
1
2
2

Este desvio padro exprime a disperso dos valores do sinal instrumental em torno da curva de
calibrao.

Os desvios padro do declive b e da ordenada na origem a, so dados por:

( )
( )
S
S
x x
S S
x
N x x
b
y
x
i
i
N
a y
x
i
i
N
i
i
N
=
=

=
=
=
2
1
2
1
2
1

e podem ser usados para calcular os limites de confiana de a e b:

a t .Sa e b t.Sb

sendo t o valor da varivel de Student para o nvel de confiana desejado e (N - 2) graus de liberdade.

Nota prtica : a utilizao de software, como a folha de clculo Microsoft Excel, atravs de algumas
ferramentas disponveis (Ferramentas - Analisar Dados - Regresso), permite aceder facilmente aos
parmetros estatsticos aqui citados.



A concentrao do analito na amostra (x0) pode ser obtida a partir das equaes seguintes :

a) Valor obtido a partir de um sinal instrumental y0 :

b) Valor mdio obtido a partir de uma srie de replicados, independentes, y
0
sobre uma mesma
amostra :

A incerteza do valor interpolado de uma concentrao x0 qualquer, a combinao da incerteza da
determinao do valor medido e a incerteza da estimativa dos coeficientes de regresso. Da propagao
dos erros, segue-se que para cada valor de concentrao x0, existe um intervalo de confiana do
verdadeiro valor de y0, cujos limites descrevem duas hiprboles que envolvem a recta de calibrao.
Assim, o desvio padro estimado para uma concentrao qualquer x0 dado por :

( )
( )
S
S
b N n
y y
b x x
x
y
x
i
i
N 0
0
2
2
2
1
1 1
= + +

=

Sendo :
n nmero de ensaios independentes (replicados) efectuados para a amostra

Os limites de confiana de x0 podem ser calculados pela equao:

x0 t . Sx0

em que t representa a varivel de Student para (N-2) graus de liberdade, a determinado nvel de
confiana.
y
0
a
x
b
=
y
0
a
x
b
=

O desvio padro do mtodo (Sm) uma caracterstica que permite ao analista verificar a qualidade do
seu trabalho:

S
S
b
m
y
x
=

O coeficiente de variao do mtodo, CVm , expresso em %, dado por:

100 =
x
S
CV
m
m

2.3.2.2 Limiares Analticos do Mtodo de ensaio

Existem vrias formas de calcular os limiares analticos. Em seguida so sugeridas algumas abordagens,
recomendadas na bibliografia internacional, que podero ser utilizadas para determinar estes
parmetros da Qualidade.

Limite de Deteco (L.D.)

Teor mnimo medido, a partir do qual possvel detectar a presena do analito com uma certeza
estatstica razovel. Este limiar analtico corresponde mais pequena quantidade de substncia a
analisar que pode ser detectada numa amostra, mas no necessariamente quantificada como valor
exacto.

Uma leitura inferior ao limite de deteco no significa, obviamente, a ausncia do analito a medir.
Apenas se pode afirmar que, com uma probabilidade definida, a concentrao do componente em
causa ser inferior a um certo valor.

Em termos qualitativos, o conceito de limite de deteco corresponde concentrao mnima que
possvel distinguir do branco, ou seja, de uma amostra que contm a mesma matriz mas no contm o
analito (note-se que existem vrios tipos de brancos).



Para uma correcta definio do limite de deteco necessrio introduzir dois conceitos de estatstica:
erro do tipo I e erro do tipo II.

O erro do tipo I (risco ) a probabilidade de concluir pela presena do componente em
anlise quando de facto no existe esse componente na amostra;
O erro do tipo II (risco ) a probabilidade de concluir pela ausncia do componente em
anlise, quando ele de facto existe.

Para uma correcta anlise dos limiares analticos, estes dois tipos de erros devem ser minimizados,
optando-se por usar as recomendaes da IUPAC ( = = 5%).

Em termos quantitativos o limite de deteco obtido por:

a) Caso geral

L.D. = X0 + K . 0

em que :

- X0 a mdia aritmtica do teor medido de uma srie de brancos ou padres vestgio (entre 10 e 20
ensaios), preparados de forma independente e lidos ao longo de vrios dias de trabalho, isto ,
reproduzindo o mais possvel a situao de rotina;
- 0 representa o desvio padro associado a X0.

Se a lei de probabilidade de X0 suficientemente conhecida e partindo do princpio que gausseana
(distribuio normal de erros) ento toma-se o valor de K 3,3 para um nvel de confiana de cerca de
99,7%.

Assim, L.D. X0 + 3,3 . 0

b) Caso em que o mtodo envolve a utilizao de uma calibrao linear


Neste caso ter-se- :

b
S
D L
x
y
(

=
3 , 3
. .

em que :
- Sy/x o desvio padro residual da curva de calibrao (ver mtodo dos mnimos quadrados)
- b o declive da mesma.

Limite de Quantificao (L.Q.)

Corresponde menor pequena concentrao medida a partir da qual possvel a quantificao do
analito, com uma determinada exactido e preciso. Na prtica, corresponde normalmente ao padro
de calibrao de menor concentrao (excluindo o branco). Este limiar, aps ter sido determinado,
deve ser testado para averiguar se a exactido e preciso conseguida satisfatria. Este teste pode ser
realizado atravs da passagem, em condies de preciso intermdia, de uma srie de padres internos,
cuja concentrao prxima ou igual ao limiar de quantificao. Segundo as recomendaes da
IUPAC, o coeficiente de variao (desvio padro a dividir pela mdia dos valores encontrados) para
estes padres no deve exceder 10%.

Quantitativamente, o limite de quantificao determinado por :

a) Caso geral

L.Q. = X0 + 10 0

em que:
- X0 a mdia aritmtica do teor medido de uma srie de brancos (entre 10 e 20 ensaios), preparados de
forma independente e lidos ao longo de vrios dias de trabalho, isto , reproduzindo o mais possvel a
situao de rotina;
- 0 representa o desvio padro associado a X0.



b) Caso do Padro vestgio ou branco fortificado

Poder-se- utilizar para estimar o L.Q. um conjunto de padres vestgio ou brancos fortificados,
independentes, testados em condies de preciso intermdia, e sobre os quais sero feitos estudos de
exactido e preciso (erro relativo em relao ao Padro vestgio e coeficiente de variao,
respectivamente). Adoptar-se- como estimativa do L.Q., a concentrao utilizada, desde que os
parmetros antes citados revelem nveis aceitveis (por exemplo : inferiores ou iguais a 10%)

c) Caso em que o mtodo envolve a utilizao de uma calibrao linear

b
S
Q L
x
y
(

=
10
. .

em que :
- Sy/x o desvio padro residual da curva de calibrao (ver mtodo dos mnimos quadrados)
- b o declive da mesma.

Este limite utilizado frequente e preferencialmente nos relatrios de ensaio, devendo ser identificado
e quantificado de forma clara.

A actualizao destes Limites (Deteco e Quantificao) dever ser efectuada :

Sempre que ocorrem alteraes de factores de influncia tais como analista, reagentes,
equipamento, ambiente, entre outros;
Sempre que se faz nova curva de calibrao e se utilize a alnea c), poder ser feito um
estudo ao longo do tempo e adoptar como limiares analticos a mdia aritmtica dos limites
de deteco e de quantificao de uma srie significativa de curvas de calibrao, desde que
se observe estabilidade nos valores de limiares obtidos.

Nos casos em que se utiliza, no traado de uma curva de calibrao, escalas no lineares, como o caso
de grficos semi-logartmicos, os limiares analticos devero ser avaliados de forma diferente e caso a
caso. Um exemplo tpico deste tipo de abordagem o dos mtodos potenciomtricos, em que se usa a

tcnica da interseco dos segmentos lineares. Recomenda-se, neste caso, a consulta da norma ASTM
D4127.

2.3.2.3 Sensibilidade

A sensibilidade pode ser definida como o quociente entre o acrscimo do valor lido L e a variao da
concentrao C correspondente aquele acrscimo.

Sensib
L
C
.=

Esta caracterstica avalia a capacidade de um mtodo (ou equipamento) para distinguir pequenas
diferenas de concentrao de um analito. Assim, a sensibilidade definida como sendo a derivada de
primeira ordem da curva de calibrao nessa zona de concentrao.

Se a curva de calibrao for definida por um modelo linear, a sensibilidade ser constante ao longo de
toda a gama de trabalho e igual ao declive dessa recta de calibrao.

Se a curva de calibrao for definida por uma funo quadrtica (polinmio de 2 grau do tipo y =
c.x
2
+d.x+e), a sensibilidade ser dada por y = 2.c.x+d nesse ponto de concentrao.

A sensibilidade tem bastante interesse pelo seu aspecto relativo, isto :

quando se pretende averiguar a evoluo desta grandeza ao longo do tempo;
quando se compara a sensibilidade de vrios mtodos analticos, baseados em modelos
lineares, para um mesmo analito;
quando se compara a sensibilidade para vrios analitos.

Este conceito de sensibilidade (associado magnitude do sinal), no deve ser confundido com limite de
deteco (associado capacidade de resoluo do sinal).



2.3.3 PRECISO

A preciso um termo geral que pretende avaliar a disperso de resultados entre ensaios
independentes, repetidos sobre uma mesma amostra, amostras semelhantes ou padres, em condies
definidas. importante salientar que ser mais realista estudar preferencialmente a preciso sobre
amostras, para minimizar efeitos de matriz.

Existem duas medidas extremas para avaliar esta disperso, designadas por repetibilidade e
reprodutibilidade. Entre estas duas medidas extremas de preciso existe uma situao intermdia que se
designa por preciso intermdia ou variabilidade intralaboratorial. Convm referir que geralmente a
preciso varia com a gama de concentraes.

2.3.3.1 Repetibilidade

A repetibilidade exprime a preciso de um mtodo de ensaio efectuado em condies idnticas, isto ,
refere-se a ensaios efectuados sobre uma mesma amostra, em condies to estveis quanto possvel,
tais como:
mesmo Laboratrio;
mesmo analista;
mesmo equipamento;
mesmo tipo de reagentes
curtos intervalos de tempo.

O limite de repetibilidade (r) o valor abaixo do qual se deve situar, com uma probabilidade especfica
(normalmente 95%), a diferena absoluta entre dois resultados de ensaio (Xi, Xi-1), obtidos nas
condies acima referidas.

Na prtica aceitam-se os resultados de duas determinaes efectuadas em condies de repetibilidade se
, Xi - Xi-1 , r. Caso a amplitude entre os dois ensaios seja superior ao limite, dever-se-, numa primeira
fase, fazer uma anlise crtica e, caso seja necessrio, recorrer repetio de ensaios segundo um plano
assente em dados bibliogrficos ou normas, nomeadamente a Norma ISO 5725-2 e ISO 5725-6.


Determinao da repetibilidade

A repetibilidade pode ser determinada atravs de um ensaio interlaboratorial ou a partir de ensaios
efectuados no prprio Laboratrio.

Para determinar a repetibilidade de um mtodo no prprio Laboratrio, efectuam-se uma srie de
medies (n > 10) sobre uma mesma amostra ou padres, em condies de repetibilidade. Caso se
justifique, este procedimento repetido sobre uma srie de amostras, em vrios nveis de concentrao,
cobrindo todo o domnio de aplicao do mtodo.

Quando se pretende avaliar a repetibilidade atravs de um ensaio interlaboratorial, o nmero de
medies, em cada nvel de concentraes, poder ser inferior (n 2). Em ambos os casos, o clculo
efectuado separadamente para cada nvel de concentrao i, a partir dos resultados obtidos e
eliminando os valores aberrantes (ISO 5725-2, ASTM E178).

A estimativa da variao (Sr
2
) de um mtodo de anlise pode ser determinada pela mdia ponderada das
estimativas das variaes de w sries de anlises estudadas nas condies de repetibilidade. Tendo em
conta que a repetibilidade pode variar com o teor do elemento a dosear, esta ltima condio assegura,
em princpio, a igualdade estatstica das variaes de w sries de anlises. Assim, a varincia associada
repetibilidade do mtodo de ensaio, para cada nvel i de concentrao :

( ) | |
( )
=
=

=
p
w
wi
p
w
wi wi
ri
n
S n
S
1
1
2
2
1
1

sendo:
S
2
ri - varincia de repetibilidade associada aos resultados considerados, para cada Laboratrio;
S
2
wi- varincia associada aos resultados considerados, para cada Laboratrio;
(nwi-1) - graus de liberdade da srie de anlises;
p - nmero de Laboratrios participantes.



Para um nvel de confiana de 95 %, o limite de repetibilidade (r) avaliado segundo :

ri ri
S S t r = = 2 96 , 1 2

sendo:
Sri desvio padro de repetibilidade associada aos resultados considerados;
isto :

2
8 , 2
ri
S r =

Caso o Laboratrio obtenha mais de dois resultados, o limite de repetibilidade (r) calculado de acordo
com Norma ISO 5725-6.

O Coeficiente de Variao de Repetibilidade (CVr), para cada nvel de concentraes, expresso em
percentagem, dado por :

100 =
x
S
CV
ri
r

sendo :
CVr numericamente igual ao desvio padro de repetibilidade (S
ri
) a dividir pela mdia dos
valores considerados ( x ).

2.3.3.2 Reprodutibilidade

A reprodutibilidade refere-se preciso de um mtodo efectuado em condies de ensaio diferentes,
utilizando o mesmo mtodo de ensaio, sobre uma mesma amostra, fazendo-se variar as condies de
medio, tais como:
diferentes laboratrios;
diferentes operadores;
diferentes equipamentos;
e/ou pocas diferentes;

O limite de reprodutibilidade (R) o valor abaixo do qual se deve situar, com uma probabilidade
especfica (normalmente 95%), a diferena absoluta entre dois resultados de ensaio, obtidos nas
condies referidas.

Determinao da reprodutibilidade

A reprodutibilidade de um mtodo de anlise obtida a partir de ensaios interlaboratoriais. Assim,
enviada uma srie de amostras aos p laboratrios participantes, os quais realizam ensaios sobre a
mesma amostra.

O valor da varincia associada reprodutibilidade calculado do seguinte modo:

SRi
2
= SLi
2
+ Sri
2

sendo :
SRi
2
- varincia da reprodutibilidade;
SLi
2
- varincia interlaboratorial (varincia dos erros sistemticos)
Sri
2
- varincia da repetibilidade (varincias dos erros aleatrios).

( )
(
(
(
(
=
=
=
=
p
wi
p
w
wi
p
w
wi
wi i
p
w
i wi wi di
i
ri di
Li
n
n
n
p
n
x x n
p
S
n
S S
S
1
1
1
2
1
2
2
2 2
2
1
1
1
1

sendo:
S
2
ri - varincia de repetibilidade associada aos resultados considerados, para cada Laboratrio;
S
2
wi-varincia associada aos resultados considerados, para cada Laboratrio;


nwi nmero de ensaio efectuados pelo Laboratrio para um determinado nvel de
concentraes;
p - nmero de Laboratrios participantes.
x
wi
- mdia aritmtica dada pelo Laboratrio para um determinado nvel de concentrao.
(Quando apresentam dois traos em cima, representa a mdia das mdias dessa grandeza x).

Nota :
- Caso a varincia interlaboratorial (SLi
2
) seja negativa, assume-se que esta toma o valor zero.

Do mesmo modo que a repetibilidade e, para um nvel de confiana de 95%, o limite de
reprodutibilidade (R) avaliado segundo :

Ri Ri
S S t R = = 2 96 , 1 2 (ISO 5725-6)

isto :

R S
Rj
= 28
2
,

sendo:
t valor tabelado de t de Student;
S
2
Ri - varincia de reprodutibilidade associada aos resultados considerados, para cada
Laboratrio;
SRi Desvio padro de reprodutibilidade associada aos resultados considerados, para cada
Laboratrio.

Caso se obtenha mais de um resultado, por cada laboratrio, o limite de reprodutibilidade calculado
de acordo com a Norma ISO 5725-6.

O clculo da reprodutibilidade efectuado para cada nvel, separadamente, aps eliminao dos valores
aberrantes (ISO 5725-2, ASTM E178).


O Coeficiente de Variao de Reprodutibilidade (CVR), expresso em percentagem, dado por :

100 =
x
S
CV
Ri
R

sendo :
CVR numericamente igual ao desvio padro de reprodutibilidade (SRi) a dividir pela mdia dos
valores considerados ( x ).

Relao funcional entre os desvios padres de repetibilidade e/ou reprodutibilidade e a mdia
( x ) de valores de cada nvel

Convm pesquisar se o desvio padro de repetibilidade e/ou de reprodutibilidade dependem da mdia
de valores para cada nvel de concentrao e, se assim acontecer, conveniente determinar o tipo de
relao funcional existente, de forma a permitir relacionar qualquer mdia de resultados com o
respectivo desvio padro de repetibilidade e/ou de reprodutibilidade.
Trs tipos de relao sero tidos em considerao :

a) Sr/R = b . x Recta passando pela origem

b) Sr/R = a + b . x Recta com ordenada na origem positiva

c) log Sr/R = c + b . log x relao logartmica / relao exponencial

Sendo:
a ordenada na origem;
b declive;
c - ordenada na origem quando se trata de uma relao logartmica.

NOTA - O facto de colocar Sr/R significa que os clculos tanto se aplicam repetibilidade como
reprodutibilidade.



Exemplo:

Sr/R=0,02x
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 10 20 30 40 50
X
S
r
/
R

Normalmente, uma destas relaes (a, b ou c) ajusta-se de forma satisfatria. caso contrrio, poder-se-
optar por um mtodo numrico com procedimento matemtico de ajuste alternativo, de acordo com o
previsto na Norma ISO 5725-2.

As duas medidas de disperso referidas representam os extremos da variabilidade de um mtodo de
ensaio, sendo a repetibilidade uma medida de variabilidade mnima e a reprodutibilidade uma medida
de variabilidade mxima dos resultados. Entre estas medidas extremas, existe uma situao intermdia,
que se designa por preciso intermdia (ISO 5725-3).

2.3.3.3 Preciso Intermdia

A preciso intermdia refere-se preciso avaliada, sobre a mesma amostra, amostras idnticas ou
padres, utilizando o mesmo mtodo, no mesmo laboratrio ou em laboratrios diferentes, mas
definindo exactamente quais as condies a variar (uma ou mais), tais como:

diferentes analistas;
diferentes equipamentos;
diferentes pocas;
com/sem verificao da calibrao.

Esta medida de preciso reconhecida como a mais representativa da variabilidade dos resultados num
laboratrio e, como tal, mais aconselhvel de usar, pelo que se desenvolver, neste guia, apenas a
situao intralaboratorial.

Para determinar a preciso intermdia de um mtodo, efectuam-se n medies em replicado, duplicado
ou em ensaio nico, sobre a amostra, nas condies pr-definidas, pois existem vrios mtodos de
estudar este tipo de preciso. Quando aplicvel, este procedimento repetido sobre outras amostras,
abrangendo outras gamas de concentrao.

Na maioria dos casos, o valor da preciso intermdia funo da gama de concentrao do ensaio e o
seu clculo efectuado, preferencialmente, a partir dos resultados obtidos, aps eliminao dos
resultados aberrantes (ISO 5725-2, ASTM E178). A visualizao grfica dos valores tambm pode ser
til para identificar a existncia de valores aberrantes (ISO 5725-3).

Dependendo do ensaio e do tipo de aplicao do estudo da preciso intermdia, existem vrios
mtodos para determinao e controlo desse parmetro de qualidade, nomeadamente :

- Atravs de Cartas de Controlo de Amplitudes, que podero ser aplicadas, entre outras, para
rplicas, para duplicados de amostra e para padres estveis ao longo do tempo (ISO 5725-6 , ISO
8258)
- Atravs da expresso :

( )
( )
( )
2
1 1
1
1

= =

=
n
k
j jk
t
j
y y
n t
Si ( ISO 5725-3)
Sendo:
Si
( )
- desvio padro de preciso intermdia (onde os smbolos relativos s condies intermdias
de preciso podem aparecer entre parntesis, Ex: Si
(T.O.)
significa tempo e Operadores
diferentes)
t - n de amostras ensaiadas (no confundir com t de Student);
n - n ensaios efectuados por amostra,
j n da amostra (que vai de 1 a t amostras);
k n do resultado obtido para a amostra j (que vai de 1 a n);


y jk resultado individual (k) para a amostra j de 1 a t
y j representa a mdia aritmtica dos resultados da amostra j de 1 a t

Neste caso, a determinao da preciso intermdia feita atravs da recolha de t valores de n ensaios
de amostras ou padres. A preciso intermdia, tal como mostra a expresso de clculo, baseada na
disperso entre ensaios. recomendado que o valor de t(n-1) seja, pelo menos, igual a 15.

Quando n = 2, esta ltima equao toma a forma :

( )
( )
2
1
2 1
2
1
=
t
j
j j
y y
t
Si
Sendo:

Yj1 primeiro resultado obtido para a amostra j ;
Yj2 - segundo resultado obtido para a amostra j.

Um mtodo simplificado para estimar a preciso intermdia baseia-se na execuo de n medies
(n 15), em condies pr-definidas, sobre:

uma mesma amostra;
amostras supostamente idnticas;
padres.

A estimativa da preciso intermdia Si
( )
, neste caso, dada por :

( )
( )
Si
n
y y
k
k
n
=
1
1
1
2
( ISO 5725-3)

em que Si
( )
o desvio padro de preciso intermdia relativo a essa gama e onde os smbolos
relativos s condies intermdias de preciso podem aparecer entre parntesis (Ex: Si
(T.O.)

significa tempo e Operadores diferentes). Este mtodo revela-se menos eficiente quando
comparado com os anteriores.

Sendo:
n n de amostras / padres;
Yk resultado individual obtido;
y representa a mdia aritmtica dos resultados individuais obtidos.

Recomenda-se a leitura da Norma ISO 5725-3 para aprofundar conhecimentos nesta rea. Na Norma
ISO 5725-6 so expostos vrios exemplos prticos de estimativa e controlo da preciso intermdia,
atravs das cartas de controlo, pelo que se recomenda a consulta desta norma.

2.3.3.4 Comparao da Preciso Entre Mtodos

Quando se pretende avaliar se dois mtodos (A e B) tm diferenas significativas entre si, em termos de
preciso, pode-se recorrer ao teste F

. Este baseia-se no clculo da razo (PG) entre as varincias dos
dois mtodos (PG = SA
2
/SB
2
). Estas varincias devem ser colocadas de modo a que esta razo seja
maior ou igual a um. Em seguida comparado o valor desta razo com o valor de F de Snedecor,
atendendo aos graus de liberdade em questo. Se PG F, os dois mtodos no apresentam diferenas
significativas entre si, relativamente s suas precises.
2.3.4 EXACTIDO

Este parmetro caracterstico determinado atravs de uma avaliao directa (ver 2.4).

2.3.5 ROBUSTEZ

A robustez de um mtodo de ensaio mede a sensibilidade que este apresenta face a pequenas variaes.
Um mtodo diz-se robusto se se revelar praticamente insensvel a pequenas variaes que possam
ocorrer quando este est a ser executado.

Para determinar a robustez de um mtodo de ensaio, pode-se recorrer ao teste de YOUDEN. Trata-se
de um teste simples, que permite no s avaliar a robustez do mtodo, como tambm seriar a influncia
de cada uma das variaes nos resultados finais, indicando qual o tipo de influncia (por excesso ou por
defeito) de cada uma dessas variaes. Convm salientar que quanto maior for a robustez de um
mtodo, maior ser a confiana desse relativamente sua preciso.


Este teste baseia-se na realizao de um determinado nmero de ensaios sobre uma amostra
(normalmente at oito, pois acima deste nmero a anlise da robustez torna-se difcil), realizados
segundo um plano de controlo de factores (at um mximo de sete), susceptveis de influenciarem o
processo. Os ensaios devem ser realizados em replicados, de forma a no causar interpretaes erradas.
Chamam-se factores aos parmetros cujos efeitos de flutuao se pretendem quantificar atravs dos
resultados dos ensaios. Assim, avaliado o efeito de cada factor em estudo, atravs de uma anlise dos
resultados experimentais.

O procedimento para elaborao do teste de YOUDEN o seguinte:

a) Anlise pormenorizada atravs das prescries do mtodo e da experincia pessoal e
histrica, para a seleco de sete factores (A, B, C, D, ..... , G) ou de trs factores de
interesse (A, B, C), independentes entre si e susceptveis de influenciarem os resultados
finais das determinaes.

b) Fixao dos valores nominal e alternativo para quantificao dos desvios dos factores em
relao aos valores prescritos. Representa-se normalmente o valor nominal por 1 e o
valor alternativo por -1.

c) Fixao das condies de realizao da srie de ensaios tais como :
- procedimentos de ensaio
- registos de resultados.

d) Elaborao de um quadro tpico para o plano de ensaios:

Utilizando trs factores,
A B C REi
1 ENSAIO 1 1 1 RE1
2 ENSAIO 1 -1 -1 RE2
3 ENSAIO -1 1 -1 RE3
4 ENSAIO -1 -1 1 RE4
RA RB RC


Utilizando sete factores,

A B C D E F G REi
1 ENSAIO 1 1 1 1 1 1 1 RE1
2 ENSAIO 1 1 -1 1 -1 -1 -1 RE2
3 ENSAIO 1 -1 1 -1 1 -1 -1 RE3
4 ENSAIO 1 -1 -1 -1 -1 1 1 RE4
5 ENSAIO -1 1 1 -1 -1 1 -1 RE5
6 ENSAIO -1 1 -1 -1 1 -1 1 RE6
7 ENSAIO -1 -1 1 1 -1 -1 1 RE7
8 ENSAIO -1 -1 -1 1 1 1 -1 RE8
RA RB RC RD RE RF RG

em que :
- REi - resultado experimental obtido pela combinao do ensaio i;
- A, B, C,......G - factores em anlise (valor nominal/valor alternativo);
- Ri (A ..... G) - efeitos de cada factor (i).

e) Tratamento dos resultados experimentais obtidos, nas condies de aplicao do teste e
clculo dos efeitos atravs das equaes seguintes :

Ri
REi REi
REi
ou
Ri
REi REi
Z
=

=

( ) ( )
( )
( ) ( )
1 1
1
1 1

em que Z corresponde a metade do nmero de ensaios (para o caso de sete factores e oito
ensaios, Z = 4).

Recomenda-se o clculo pela segunda frmula do Ri. No entanto os resultados so comparveis pelas
duas frmulas.


Resolve-se o sistema de equaes lineares para cada factor/nvel, atendendo a que existem
quatro experincias em que o factor foi mais alterado e outras quatro em que este foi menos
alterado:

Por exemplo, para o factor A :

RA
RE RE RE RE RE RE RE RE
=
+ + + + + + 1 2 3 4 5 6 7 8
4
( )

f ) Ordenao dos valores de efeitos obtidos

g ) Crtica dos valores obtidos

h ) Controlo mais rigoroso dos factores de maior influncia.

O teste de YOUDEN assenta nos seguintes pressupostos :

um elevado conhecimento do mtodo em estudo e de todos os factores que potencialmente
o podem influenciar, os quais devem ser os escolhidos nesta anlise;
no entrar em linha de conta com a variabilidade associada ao mtodo de ensaio em estudo;
o laboratrio dever garantir que todos os factores, que no foram objecto de estudo, se
mantm constantes.

Nota : Para aprofundar conhecimentos nesta matria recomenda-se a consulta do Standard Methods
for Water and Wastewater.

Situao alternativa:

Testar o mtodo em condies de preciso intermdia, isto , fazendo variar as condies operatrias
dentro do prprio laboratrio, tal como definido na parte 2.3.3.3, ao longo de um elevado nmero de
dias, obtendo um nmero significativo de resultados. Em seguida, dever ser elaborada uma anlise
detalhada e cuidada dos resultados em termos de preciso do mtodo.


Esta situao alternativa no oferece as vantagens do teste de YOUDEN, sendo no entanto um
processo capaz de fornecer uma informao valiosa acerca do comportamento da metodologia em
condies de trabalho diferentes.

Como obvio, esta fase da validao ser feita numa fase final de todo o processo de validao do
mtodo de ensaio.

2.4 AVALIAO DIRECTA

Este tipo de avaliao visa essencialmente conhecer a exactido dos mtodos de ensaio. Esta
definida como sendo a concordncia entre o resultado de um ensaio e o valor de referncia aceite como
convencionalmente verdadeiro.

O termo exactido, quando aplicado a uma srie de resultados de ensaio, implica uma combinao de
componentes de erros aleatrios e componentes de erros sistemticos.

Os processos normalmente utilizados para avaliar a exactido de uma metodologia so, entre outros, os
seguintes :

Materiais de Referncia Certificados;
Ensaios Interlaboratoriais;
Testes comparativos.

2.4.1 MATERIAIS DE REFERNCIA CERTIFICADOS

Sempre que possvel, os Materiais de Referncia Certificados (MRC) devem ser usados no processo de
validao de um mtodo de ensaio. Alm disso, estes materiais constituem uma excelente ferramenta
no Controlo Externo da Qualidade de uma anlise qumica.

Um MRC possui um valor de concentrao (ou outra grandeza) para cada parmetro e uma incerteza
associada (em alguns casos, nomeadamente quando se est perante um MRC multi-componente, pode
acontecer que nem todos os parmetros tenham incerteza atribuda). A aquisio de um MRC ter de


ser feita a um organismo fornecedor reconhecido e credvel. Divulgam-se em seguida algumas
entidades que comercializam MRCs :

IRMM Institute for Reference Materials and Measurements anteriormente designado por BCR;
NIST - National Institute of Standards and Technology, dos Estados Unidos da Amrica;
US Geological Survey dos Estados Unidos da Amrica;
US Environmental Protection Agency dos Estados Unidos da Amrica;
National Research Council do Canad;
Agncia Internacional de Energia Atmica.

Recomenda-se a consulta dos Guias ISO 30, 31, 33 e 35, da base de dados internacional para materiais
de referncia COMAR (disponvel no Instituto Portugus da Qualidade), assim como navegar nas
pginas da INTERNET, para aprofundar conhecimentos nesta rea.

O uso correcto dos MRC consiste na sua anlise para avaliar o desempenho do Laboratrio. O valor
obtido na anlise de um MRC deve ser comparado com o valor certificado, determinando-se o erro e
exactido da anlise. Quando o valor obtido no se encontrar dentro do intervalo de incerteza indicado
para o valor certificado, o Laboratrio deve procurar as causas desse desvio e tentar elimin-las ou
aceit-las. Conforme o rigor definido para os seus resultados, o Laboratrio pode adoptar critrios
diferentes para aceitao dos resultados dos MRC.

Em seguida, apresentam-se alguns processos para avaliao dos resultados obtidos da anlise de um
MRC :

Erro relativo;
Teste de hipteses (teste t);
Factor de desempenho Z (Z-score);
Erro normalizado.


Erro Relativo

Uma forma de avaliar a exactido de um mtodo de ensaio atravs do clculo do erro relativo (Er),
expresso em percentagem (%). Este calculado pela expresso:

( )
Er
Xlab Xv
Xv
=

100

em que:
Xlab - valor obtido experimentalmente (ou a mdia aritmtica de valores obtidos);
Xv - valor aceite como verdadeiro, ou seja, o valor certificado do MRC.

O erro relativo exprime a componente de erros sistemticos. Cabe ao Laboratrio definir qual o seu
grau de exigncia em termos de exactido do mtodo em estudo, o qual deve assentar sempre que
possvel em dados bibliogrficos referentes ao mtodo em questo ou na ausncia de tais dados, em
critrios de bom senso. Um valor de Er inferior ou igual a 5 % em alguns casos pode ser satisfatrio,
sendo no entanto este valor meramente indicativo.

Teste de hiptese (teste t)

O Laboratrio poder tambm averiguar a existncia de erros sistemticos associados metodologia
praticada, atravs de um teste de hiptese:

teste t

( )
t
Xlab Xv N
Sxlab
=

sendo :
Xlab - mdia dos valores experimentais obtidos pelo laboratrio na anlise do MRC;
N - nmero de amostras ensaiadas;
Sxlab - o desvio padro associado mdia dos valores do laboratrio (Xlab).


Em seguida o valor t (em mdulo) comparado com o valor crtico ttab (tabelado para determinado
grau de confiana e N-1 graus de liberdade) e toma-se como critrio de aceitao :

Se |t| ttab , no ficou estatisticamente evidenciada a existncia de erros sistemticos e
logo o ensaio satisfatrio;
Se |t| > ttab , ficou estatisticamente evidenciada a existncia de erros sistemticos e logo o
ensaio no satisfatrio.

Factor de desempenho Z (Z-score)

Outra forma de avaliar o desempenho do Laboratrio na anlise de um MRC o clculo do factor de
desempenho Z :

( )
Z
Xlab Xv
S
=

sendo :
Xlab - valor obtido pelo Laboratrio;
Xv - valor aceite como verdadeiro, ou seja, o valor certificado do MRC;
S - unidade de desvio, que pode ser a incerteza do MRC ou ainda outra unidade de desvio
interna.

A avaliao poder ser feita (Guia ISO/CEI 43) de acordo com seguinte escala de pontuao:

| Z| 2 : Satisfatrio

2 < Z 3 : Questionvel

Z > 3 : Incorrecto

O factor de desempenho Z funo da unidade de desvio adoptada, isto , poder-se- utilizar outra
escala de pontuao que no a citada anteriormente.

Erro Normalizado

Caso o laboratrio calcule a incerteza do seu resultado (Ulab), o valor verdadeiro (Xv) deve estar dentro
do intervalo de incerteza de Xlab. Quando tal no acontece, este intervalo poder estar subestimado.
Nestes casos, geralmente empregue o conceito de erro normalizado (En) para efectuar a avaliao do
desempenho (Guia ISO/CEI 43):

( )
En
Xlab Xv
U U
lab ref
=

+
2 2

Em que :
Uref - incerteza associada ao valor verdadeiro.

Se(En( 1, ento Ulab est bem estimada.

Sempre que nos processos de avaliao utilizados no se verifiquem as condies satisfatrias, dever
ser elaborado um plano de aces correctivas de forma a procurar as causas do sucedido, corrigi-las e
reavaliar-se o ensaio.

A periodicidade da anlise dos MRCs deve ser estipulada em funo da frequncia de anlises
efectuadas, de estas serem de rotina ou de carcter pontual, do grau de conhecimento das amostras, da
complexidade das tcnicas e do grau de confiana exigido para o resultado.

2.4.2 ENSAIOS INTERLABORATORIAIS

Existem diversos tipos de ensaios interlaboratoriais, consoante os objectivos a que se destinam. Refira-
se, entre outros :

- Ensaio Interlaboratorial de Aptido : destina-se a avaliar o desempenho dos laboratrios participantes
(Guia ISO 43), funcionando nalguns pases como uma condio para a acreditao do laboratrio. Se
possvel, deve estar rastreado a um MRC, podendo geralmente os participantes usar os mtodos que
entenderem;


- Ensaio Interlaboratorial de Normalizao : destina-se a estudar as caractersticas de um mtodo de
anlise, nomeadamente a sua reprodutibilidade e repetibilidade. Neste caso, condio de acesso a
utilizao exclusiva do mtodo em causa.

Quando o Laboratrio pretenda avaliar a repetibilidade e a reprodutibilidade (parmetros
caractersticos) de um mtodo, demonstrando em simultneo que tem uma preciso compatvel com a
de outros laboratrios, pode recorrer a um ensaio do tipo de normalizao. Quando tem por objectivo
evidenciar a exactido dos seus resultados, ento pode participar em ensaios do tipo de aptido.

Os resultados obtidos pelo laboratrio nos ensaios interlaboratoriais em que participa devem ser
objecto de uma anlise cuidada, de que resulta um plano de aces correctivas.

Avaliao do Desempenho

A avaliao do desempenho do Laboratrio participante feita pela entidade organizadora. Em geral
usada a seguinte frmula (Z-score):

( )
S
Xv Xlab
Z

=

em que:
Xlab - valor obtido pelo Laboratrio;
Xv - valor aceite como verdadeiro, isto , o estabelecido no ensaio interlaboratorial;
S - unidade de desvio, que pode ser o desvio padro da mdia dos laboratrios no ensaio
interlaboratorial, a incerteza de Xv, ou outro desvio que assente em critrios de exigncia da entidade
organizadora.

A avaliao pode ser feita segundo a seguinte escala de pontuao:

| Z| 2 : Satisfatrio
2 < Z 3 : Questionvel
Z > 3 : Incorrecto

Nesta escala o laboratrio dever ter Z-scores inferiores a 2, embora na prtica nem sempre tal
suceda. Nestes casos, semelhana do que foi dito para a anlise de um MRC, o que se deve fazer
elaborar um plano de aces correctivas.

O factor de desempenho Z funo da unidade de desvio adoptada, isto , poder-se- utilizar outra
escala de pontuao que no a citada anteriormente.

Erro Normalizado

Caso o laboratrio calcule a incerteza do seu resultado (Ulab), o valor de Xv deve estar dentro do
intervalo de incerteza de Xlab. Quando tal no acontece, este intervalo poder estar subestimado.
Nestes casos, e tal como acontece na anlise de um MRC, geralmente empregue o conceito de erro
normalizado (En) para efectuar a avaliao do desempenho (Ver Erro normalizado 2.4.1).

Para um conhecimento mais alargado sobre ensaios interlaboratoriais, recomenda-se a consulta do Guia
RELACRE n 7.

2.4.3 TESTES COMPARATIVOS

Um outro contributo importante na validao de um mtodo interno de ensaio consiste na comparao
dos resultados obtidos a partir desse mtodo com os resultados conseguidos atravs de um mtodo
tomado como referncia. O objectivo principal deste tipo de ensaio comparativo o de estudar a
proximidade dos resultados obtidos pelos dois mtodos de ensaio, isto , de avaliar a exactido do
mtodo interno relativamente ao de referncia. Na prtica, efectuam-se anlises em replicado,
utilizando os dois mtodos de ensaio em separado sobre as mesmas amostras. Este estudo poder ser
realizado numa gama restrita de concentraes ou em toda a gama de concentraes em que se
pretende validar o mtodo.


Existem vrias tcnicas para comparar os resultados obtidos por dois mtodos de ensaio,
nomeadamente :
Teste de hiptese : teste t das mdias
Teste de hiptese : teste t das diferenas (amostras emparelhadas);
;
Teste da regresso linear entre dois mtodos de ensaio.

Nota prtica : a utilizao de software, como a folha de clculo Microsoft Excel, atravs de algumas
ferramentas disponveis (Ferramentas - Analisar Dados procurar testes respectivos), permite aceder
facilmente aos testes estatsticos aqui citados.

Testes de hiptese:

Erros do Tipo I e Tipo II
Se rejeitarmos uma hiptese quando ela deveria ser aceite, dizemos que foi cometido um erro do tipo I.
Se aceitarmos uma hiptese quando ela deveria ser rejeitada, cometemos um erro do tipo II.

A validade dos testes de hiptese exige que estes sejam delineados, de modo a minimizar estes dois
tipos de erros. Uma tentativa de reduzir o erro de um tipo geralmente acompanhada por um erro de
outro tipo. Um dos nicos meios de reduzir ambos os erros aumentar o tamanho da amostra (dos
ensaios efectuados), o que nem sempre possvel.

Teste t das mdias
Este teste aplica-se quando se pretende comparar dois mtodos sobre a mesma amostra. No exigido
que o nmero de amostras ensaiadas seja igual para ambos os mtodos, dado que o estudo da
proximidade dos resultados obtidos pelas duas metodologias feito em torno da mdia de valores.

Este teste pressupe a comparao entre dois valores de t, o t experimental designado por texp (em
valor absoluto), e o t tabelado designado por ttab , sendo tomado como critrio de aceitao :
| texp | ttab


isto , conclui-se, estatisticamente, que os resultados provenientes dos dois mtodos no apresentam
desvios significativos se o texp (em valor absoluto) for inferior ou igual ao ttab.

Na prtica procede-se do seguinte modo:

a) Recolhem-se n1 resultados utilizando o mtodo 1 e n2 resultados aplicando o mtodo 2 sobre uma
mesma amostra (situao recomendada);

b) Calcula-se a mdia dos resultados das rplicas (Xm1 e Xm2)e respectivos desvios padro associados (S1
e S2) para cada mtodo;

c) Calcula-se o texp do seguinte modo:

c.1) Faz-se uma anlise de varincias afim de verificar se existem ou no diferenas significativas entre
as varincias obtidas pelos dois mtodos (S
2
1 e S
2
2 )

2
1
2
2
2
2
2
1
exp ) 2 . 1 .
exp ) 1 . 1 .
S
S
F C
S
S
F C
=
=

optando pela situao C.1.1) quando S
2
1 > S
2
2
optando pela situao C.1.2) quando S
2
2 > S
2
1

Comparam-se os valores de Fexp com os valores tabelados da distribuio F de Snedecor / Fisher,
para (n-1) graus de liberdade.

c.2) Quando Fexp < F de Snedecor/Fisher, calcula-se o texp do seguinte modo :



{ }
( ) ( )
{ }
{ }
t
X X
S
n n
sendo
S
n S n S
n n
m m
exp
,
=

+
|
\
|
.
|
=
+
+
1 2
1 1
1 1
2
1 2
2
1
1
2
2
2
2
1 2

Compara-se o texp (em valor absoluto) com o ttab (para um determinado grau de confiana e n1+n2-2
graus de liberdade).

Concluso : os resultados provenientes dos dois mtodos, estatisticamente no apresentam desvios
significativos se o texp (em valor absoluto) for inferior ou igual ao ttab.

c.3) Quando Fexp > F de Snedecor/Fisher, calcula-se o texp do seguinte modo :

{ }
t
X X
S
n
S
n
m m
exp=

+
|
\
|
.
|
1 2
1
2
1
2
2
2

Compara-se texp (em valor absoluto) com o ttab , para um determinado grau de confiana e um nmero
de graus de liberdade (GL), dado por :

GL
S
n
S
n
S
n
n
S
n
n
=
|
\
|
.
| +
|
\
|
.
|
(
|
\
|
.
|
+
+
|
\
|
.
|
+
|
\
|
.
|
|
|
|
(
(
(
(
1
2
1
2
2
2
2
1
2
1
2
1
2
2
2
2
2 1 1
2.


Concluso : os resultados provenientes dos dois mtodos, estatisticamente no apresentam desvios

Na folha de clculo Microsoft Excel, escolher t Test : two sample assuming equal variances ou t
Test : two sample assuming unequal variances, dependendo da situao atrs descrita.

Teste t das diferenas (amostras emparelhadas)
Na folha de clculo Microsoft Excel, escolher t Test : paired two sample for means.
Este teste aplica-se quando se pretende comparar dois mtodos sobre amostras iguais ou similares, na
mesma gama de concentrao, pois assenta no pressuposto que quaisquer erros aleatrios e/ou
sistemticos so independentes da concentrao.

Este teste exige que o nmero de ensaios seja igual para ambos os mtodos, pois no presente caso o
estudo feito em torno das diferenas entre os resultados obtidos pelos dois mtodos para cada
amostra analisada. Tal como no teste anteriormente referido, este pressupe tambm a comparao
entre dois valores de t, o t experimental designado por texp , e o t tabelado designado por ttab , sendo
tomado como critrio de aceitao:

texp ttab

isto , conclui-se que os resultados provenientes dos dois mtodos no apresentam desvios

Na prtica o texp obtido do seguinte modo:

a) Recolhem-se os resultados dos ensaios obtidos pelos dois mtodos (1 e 2) para cada amostra
ensaiada;

b) Calcula-se as diferenas (D
i
) entre os resultados emparelhados obtidos pelos dois mtodos para cada
amostra. Calcula-se em seguida a mdia aritmtica (D
m
) destas diferenas;

c) Calcula-se o t
exp
pela equao seguinte :


t
D
S
N
m
m
exp =

em que :

N = o n de amostras ensaiadas pelos dois mtodos;
D
m
= Mdia aritmtica das diferenas (D
i
);

D
i
= Diferena entre os valores obtidos pelos dois mtodos para a mesma amostra;
S
m
= Desvio padro associado mdia das diferenas (Di).

d) Compara-se texp (em valor absoluto) com o ttab, para um determinado grau de confiana e (N-1)
graus de liberdade).

Concluso: os resultados provenientes dos dois mtodos, estatisticamente, no apresentam desvios

Na prtica grande parte dos mtodos tm de ser aplicados em gamas alargadas de concentraes, e
neste caso, o pressuposto atrs referido nem sempre vlido, pelo que se recomenda a utilizao do
mtodo da regresso linear quando se esto a comparar dois mtodos numa gama alargada de
concentraes.

Teste de regresso linear entre dois mtodos de ensaio

Recomenda-se a utilizao deste teste quando se pretende comparar dois mtodos em gamas mais
alargadas de concentrao do que no caso anterior, ou quando se deseja validar um mtodo em toda a
sua gama de trabalho. Isto , neste caso analisam-se pelos dois mtodos uma srie de amostras (no
mnimo dez), de modo a cobrir toda a gama de trabalho que se pretende validar

A concordncia entre resultados obtidos por dois mtodos diferentes avaliada atravs da equao do
tipo y = b.x + a. Designando y por Mtodo 1 e x por Mtodo 2, teremos a equao:


Mtodo 1 = b . Mtodo 2 + a

Sendo:
b declive;
a ordenada na origem.

que representa a equao de regresso linear entre os dois mtodos de ensaio.

Pode-se considerar que os dois mtodos no apresentam desvios sistemticos se a equao anterior no
for significativamente diferente da equao:

Mtodo 1 = Mtodo 2

isto :

O intervalo de confiana associado ordenada na origem, a Sa . t , deve conter o valor zero.

Sa representa o desvio padro da ordenada na origem, t o valor de t tabelado para um determinado grau
de confiana e (N-2) graus de liberdade (sendo N o nmero de amostras ensaiadas).

O intervalo de confiana associado ao declive, b Sb . t , deve conter o valor 1 (um).

Sb representa o desvio padro do declive, t o valor de t tabelado para um determinado grau de
confiana, e (N-2) graus de liberdade (sendo N o nmero de amostras ensaiadas).
Caso no se verifiquem estas duas condies simultaneamente, pode-se concluir que os mtodos no
so estatisticamente concordantes na gama de trabalho em estudo, para um determinado nvel de
confiana.

Quando se utilizar o mtodo da regresso linear para avaliar a concordncia dos resultados obtidos por
dois mtodos de ensaio, e caso se utilize o mtodo dos mnimos quadrados, o mtodo de maior
preciso dever ser colocado no eixo das abcissas (eixo x), sendo o outro colocado no eixo das


ordenadas (eixo y), pelo facto de se considerar que os erros relativos ao eixo das abcissas so
desprezveis face aos associados ao eixo das ordenadas. Assim, ter que ser conhecida a preciso de
cada um dos mtodos, antes de iniciar o estudo comparativo. A comparao das precises pode ser
realizada utilizando o teste F (anlise de varincias F - test).


3. BIBLIOGRAFIA

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testing of (chemical) analytical laboratories, ISO/REMCO N.263, Genve.
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ASTM E 178 (94) Standard Practice for Dealing with Outlying Observations
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ISO 2854 (1976). Interprtation statistique des donnes Techniques dèstimation et tests portant
sur des moyennes et des variances.
ISO 35341 (1993). Statistique Vocabulaire et symboles Partie 1: Probabilit et termes
statistiques gnraux.
ISO 35342 (1993). Statistique Vocabulaire et symboles Partie 2: Matrise statistique de la
qualit.
ISO 35343 (1985). Statistique Vocabulaire et symboles Partie 3: Plans dèxprience
ISO 57251 (1994). Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et mthodes de mesure Partie 1:
Principes gnraux et dfinitions.
ISO 57252 (1994) Exactitude (justesse et fidlit) des rsultats et mthodes de mesure Partie 2:
Mthode de base pour la dtermination de la rptabilit et de la reproductibilit dune mthode de
mesure normalise.
Mesures intermdiaires de la fidlit dune mthode de mesure normalise
Mthodes de base pour la dtermination de la justesse dùne mthode de mesure normalise.
Utilisation dans la pratique des valeurs dèxactique.
ISO 7870 (1993). Cartes de contrle Principes gnraux et introduction lèmploi.
ISO 7873 (1993). Cartes de contrle de la moyenne arithmtique limites de surveillance
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Youden, W. J. , and Steiner, E. H. Statistical Manual of the AOAC Association of Official
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WELAC & EURACHEM (1993). Accreditation for Chemical Laboratories: Guidance on the
interpretation of the EN 45000 series of standards and ISO Guide 25, WELAC Guidance
Document n. 2 & EURACHEM Guidance Document n. 1, Teddington.

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