Anda di halaman 1dari 15

Prinsip Detektor fluoresensi mungkin yang paling sensitif di antara yang ada detektor HPLC modern.

Hal ini dimungkinkan untuk mendeteksi bahkan kehadiran molekul analit tunggal dalam aliran sel.Biasanya, sensitivitas fluoresensi adalah 10 -1000 kali lebih tinggi dibandingkan dengan detektor UV untuk bahan menyerap UV yang kuat.Detektor fluoresensi sangat spesifik dan selektif antara lain detektor optik.Hal ini biasanya digunakan sebagai keuntungan dalam pengukuran spesies neon tertentu dalam sampel. Ketika senyawa memiliki gugus fungsional spesifik sangat antusias oleh energi panjang gelombang lebih pendek dan memancarkan radiasi panjang gelombang yang lebih tinggi yang disebut fluoresensi.Biasanya, emisi diukur pada sudut yang tepat untuk eksitasi. Kira-kira sekitar 15% dari semua senyawa memiliki fluoresensi alam.Kehadiran terkonjugasi pielektron terutama di komponen aromatik memberikan aktivitas neon yang paling intens.Juga, alifatik dan senyawa alisiklik dengan gugus karbonil dan senyawa dengan ikatan rangkap terkonjugasi yang sangat berpendar, tetapi biasanya untuk tingkat yang lebih rendah.Kebanyakan hidrokarbon aromatik tersubstitusi berpendar dengan yeld kuantum meningkat dengan jumlah dering, derajat mereka kondensasi dan kekakuan struktural mereka. Intensitas fluoresensi tergantung pada kedua eksitasi dan panjang gelombang emisi, sehingga secara selektif mendeteksi beberapa komponen sementara menekan emisi lain. Deteksi komponen apapun secara signifikan tergantung pada panjang gelombang yang dipilih dan jika salah satu komponen dapat dideteksi pada 280 ex dan 340 em., Yang lain bisa terjawab.Sebagian besar detektor modern memungkinkan cepat beralih dari eksitasi dan emisi panjang gelombang, yang menawarkan kemungkinan untuk mendeteksi semua komponen dalam campuran ..Sebagai contoh, dalam sangat penting kromatogram aromatik polynuclear eksitasi dan emisi panjang gelombang yang 280 dan 340 nm, masing-masing, untuk pertama 6 komponen, dan kemudian berubah menjadi nilai-nilai masing-masing 305 dan 430 nm, nilai-nilai yang terakhir merupakan kompromi terbaik untuk memungkinkan deteksi sensitif senyawa.

Detektor fluoresensi Gambar dibawah menunjukkan skema optik dari detektor fluoresensi khas untuk kromatografi cair.Detektor tersedia di pasar berbeda dalam metode di mana panjang gelombang dikendalikan.Instrumen lebih murah menggunakan filter, unit sedang harga menawarkan kontrol monokromator minimal emisi panjang gelombang, dan instrumen penelitian-grade kemampuan penuh memberikan kontrol monokromator kedua eksitasi dan panjang gelombang emisi.

Skematik optik dari detektor fluoresensi khas untuk kromatografi cair. Prinsip dari detektor ini adalah sampel dikenai sinar UV yang sesuai, maka zat ini akan berfluoresensi. Sinar yang dipancarkannya ditangkap dengan phototube. Intensitas sinar fluoresensi ini akan sebanding dengan kadar sampel yang diamati.

Tipe-tipe Detektor Fluorescence : -Single wavelength excitation fluorescence detector -Multi wavellength fluorescence detector -Laser Induced Fluorescence Detector (LIFD)

Single beam biasanya lebih populer karena dapat meningkatkan efektifitas cahaya dan meningkatkan potensial untuk detection limit yang lebih rendah. Namun, single beam memiliki

kelemahan yaitu rentan mengalami goyangan atau turun naiknya lampu, sehingga menyebabkan ketidakstabilan. Untuk mengatasi ini maka digunakan dual beam detector

2. Detektor ini merupakan pengembangan dari single beam detektor.Cahaya yang berasal dari sumber akan dibelokkan oleh sebuah quartz beam splitter dalam diode atau photomultiplier. Pada detektor ini terdapat dua buah monokromator. Pertama untuk mengukur signal yang keluar dari lampu, dan yang kedua untuk mengukur emisi dari analit. Sama seperti halnya pada single beam detektor, pada dual beam detektor juga memiliki potensi terjadinya goyangan pada lampu.Namun hal ini dapat diatasi dengan ditambahkannya magnet di sekitar lampu.

3. Mendeteksi Emisi optical dari molekul yang mengalami eksitasi menuju tingkat energi yang lebih tinggi akibat penyerapan radiasi elektromagnetik.LIFD merupakan teknik deteksi optical yang paling sensitif. LIFD biasanya digunakan untuk analisis capillary electrophoresis. LIFD dipakai sebagai alat terpisah untuk analisis produk reaksi berantai polimer, penentuan larutan seperti protein, asam nuleat, siklik hidrokarbon aromatik, dan senyawa yang beracun seperti sianida .

sumber : Deuterium Lamps : lampu ini merupakan pilihan yang baik jika eksitasi ultraviolet serta stabilitas yang panjang diperlukan. Lampu ini minim gangguan dan memiliki hasil yang terbatas. Ini akan menghambat background mencapai photomultiplier.

1. Single Wavelength Eksitasi Fluorescence Detector Panjang gelombang detektor eksitasi fluoresensi tunggal mungkin adalah detektor LC paling sensitif yang tersedia, tetapi dicapai dengan mengorbankan fleksibilitas. Adiagram o fa bentuk sederhana dari detektor fluoresensi ditunjukkan pada Gambar 36.

Lampu eksitasi biasanya disediakan oleh tekanan rendahlampu merkuri yang relatif murah dan menyediakan relative tinggi intensitas UV cahaya di 253,7nm. Banyak zat yang berpendar akan senang dengan cahaya dari panjang gelombang ini.

Gambar 36.Single Wavelength Eksitasi Fluorescent Detector

Lampu eksitasi difokuskan oleh lensa kuarsa melalui sel.Sebuah lensa kedua, set normal terhadap insiden ringan, memfokuskan cahaya fluorescent ke sel foto.Sebuah panjang gelombang detektor fluoresensi tetap akan memiliki kepekaan (konsentrasi minimum terdeteksi pada panjang gelombang eksitasi 254 nm) dari sekitar 1 x 10 sekitar 500 dengan indeks respon dari 0,96 <r <1,04. Sebuah contoh dari pemisahan dimonitor oleh detektor fluoresensi sederhana adalah pemisahan campuran polutan prioritas yang ditunjukkan pada gambar 37.Lampu eksitasi adalah sekitar monokromatik pada 254 nm dan semua panjang gelombang cahaya neon dirasakan oleh sel foto.
-9

g / ml dan dynamic range linier dari

Kolom: 2 Pecosphere -5C C18 (150 mm x 4,6 mm) dalam seri.Ponsel Phase: 90% acetonitrile/10% air.Laju alir: 2,0 ml / menit.Detector Fluorescence (Eksitasi 254 Total emisi nm

1.Naftalin 4.Phenanthrene 7.Pyrene

2.Fluorene 5.Antrasena 8.Benzo (a) antrasena

3.Acenaphthene 6.Fluoranthracene 9.Chrysene

10.Benzo (b) fluoranthen 11.Benzo (k) fluoranthen 12.Benzo (k) fluoranthen 13.Dibenz (a, h) antrasena 14.Indeno (1,2,3, cd) pyrene 15.Benzo (ghi) perylene Courtesy dari Perkin Elmer Korporasi Gambar 37.Pemisahan Polutan Prioritas Dimonitor oleh Fluorescence Detector Sederhana

Ada beberapa kompromi antara mahal detektor spektrometer fluoresensi dan panjang gelombang eksitasi detektor fluoresensi tunggal.Beberapa memiliki monochromators tunggal yang memilih panjang gelombang cahaya eksitasi, lain mempekerjakan monokromator tunggal untuk memilih panjang gelombang emisi atau memberikan spektrum emisi. 2. Multi Panjang Gelombang Fluoresensi Detector Detektor multi-panjang gelombang fluoresensi berisi dua monochromators, satu untuk memilih panjang gelombang eksitasi dan yang kedua untuk memilih panjang gelombang fluoresensi atau menghasilkan spektrum fluoresensi Diagram panjang gelombang detektor multifluoresensi ditunjukkan pada Gambar 38.

Gambar 38.The Fluorescence Spectrometer Detector Detektor ini terdiri dari spektrometer neon dilengkapi dengan sel penyerapan cocok yang cukup kecil sehingga tidak menurunkan resolusi kolom LC.Ada dua jalur cahaya jelas berbeda satu untuk cahaya eksitasi dan satu untuk cahaya yang dipancarkan.Jalan cahaya yang berbeda

digambarkan secara terpisah, cahaya eksitasi dalam gelap biru dan cahaya yang dipancarkan dalam biru muda. Sumber eksitasi band yang luas (biasanya lampu deuterium) ditempatkan pada titik fokus dari cermin ellipsoid (ditampilkan di bagian atas pojok kiri dari diagram).Yang dihasilkan sinar paralel jatuh pada cermin toroidal yang berfokus itu ke kisi-kisi pada sisi kiri diagram.Kisi-kisi ini memilih panjang gelombang cahaya eksitasi.Cahaya dengan panjang gelombang yang dipilih lolos ke cermin bulat dan kemudian ke cermin ellipsoid (ditunjukkan di dasar diagram) yang berfokus itu ke sampel.Jalan cahaya eksitasi dalam gelap biru dan terletak di sisi kiri dari diagram. Sebuah beam splitter terletak antara cermin bulat dan cermin ellipsoid (di pusat diagram) yang mencerminkan sebagian dari cahaya insiden ke cermin toroidal lain yang berfokus itu ke sel foto referensi. Jalur dari lampu neon adalah warna biru muda dan sebagian besar di sisi kanan diagram. Fluorescent cahaya dari sel difokuskan oleh cermin ellipsoid pada sebuah cermin bulat yang kemudian memfokuskan cahaya ke kisi-kisi terletak (terlihat di sekitar pusatkanan dari gambar).Kisi-kisi memilih panjang gelombang tertentu dari cahaya neon yang akan dimonitor. Cahaya dari panjang gelombang yang dipilih lolos ke sel fotolistrik yang memonitor intensitasnya. Instrumen ini cukup kompleks tapi sangat serbaguna.Penggunaan detektor untuk

mengoptimalkan kedua cahaya eksitasi dan lampu fluoresensi untuk memberikan selektivitas tinggi untuk Fluoropa turunan dari neomycin ditunjukkan pada Gambar 39. Ini adalah contoh yang sangat baik dari pemilihan panjang gelombang cahaya eksitasi spesifik dan komplementer cahaya emisi panjang gelombang untuk memberikan sensitivitas maksimum.

Kolom: Supercosil LCnatrium asetat sulfate/0.007M acid/0.01M pentana sulfonat, 3:97.Laju alir: 1,75 ml / menit.Posting Kolom reagen: 1L 0,4 M borat acid/0.38M kalium hidroksida yang mengandung 6 ml 40% Brij-35, 4 ml mercaptoethanol, 0.8g o-phthalaldehyde.Laju alir 0,4 ml / menit.Mixer 5 cmx4,6 mm kolom dikemas dengan manik-manik kaca.10 reaktor ft x 0,5 mm rajutan Teflon kapiler tabung.Reaksi Suhu 40
o

C.20 ml sampel dari ekstrak fase gerak dari sampel

komersial.Eksitasi panjang gelombang 365 nm, emisi panjang gelombang 418 nm. Courtesy of Supelco Inc Gambar 39.Deteksi Neomycin OPA Derivatif pada Eksitasi Panjang gelombang 365 nm dan emisi Panjang gelombang dari 418 nm Mengoptimalkan eksitasi dan emisi panjang gelombang cahaya untuk mendapatkan sensitivitas maksimum untuk campuran kompleks dapat menjadi sangat terlibat seperti yang ditunjukkan oleh pemisahan beberapa polutan prioritas digambarkan dalam gambar 40.Pemisahan ini

dilakukan pada kolom panjang 25 cm, 4,6 mm dan dikemas dengan C18 fase terbalik.Fase gerak diprogram dari asetonitril 93%, 7% air sampai 99% asetonitril, 1% air selama 30 menit.Gradien linier dan laju alir 1,3 ml / menit.

Courtesy dari Perkin Elmer Korporasi 1 naftalena 2 acenaphthene 3 Fluorene 4 Phenanthrene 5 Anthracene 6 fluoranthen 7 Pyrene 8Benz(a) antrasena Waktu (detik) Panjang gelombang dari Eksitasi Panjang Cahaya gelombang cahaya yang 9 Chrysene 10 Benzo (b) fluoranthen 11 Benzo (k) fluoranthen 12 Benzo (a) pyrene 13 Dibenz (a, h) antrasena 14 Benzo (ghi) perylene 15 Indeno (123-cd) pyrene

dipancarkan

0 220 340 510 720 1050 1620

280 nm 290 nm 250 nm 260 nm 265 nm 290 nm 300 nm

340 nm 320 nm 385 nm 420 nm 380 nm 430 nm 500 nm

Gambar 40. Pemisahan Seri Polutan Prioritas dengan Programmed Fluorescence Detection Pemisahan menggambarkan pandai menggunakan pemrograman panjang gelombang untuk mendapatkan sensitivitas maksimum.Selama pembangunan kedua panjang gelombang cahaya eksitasi dan cahaya emisi diubah untuk memberikan sensitivitas maksimum untuk zat terlarut tertentu. Detektor dapat memberikan fluoresensi atau spektrum eksitasi dengan menangkap aliran fase gerak ketika zat terlarut berada dalam sel mendeteksi dan pemindaian baik eksitasi atau lampu neon.(Ini adalah teknik yang sama seperti yang digunakan untuk menyediakan spektrum UV dengan panjang gelombang variabel detektor UV).Akibatnya, adalah mungkin untuk mendapatkan spektrum eksitasi pada setiap panjang gelombang neon dipilih atau spektrum neon pada setiap panjang gelombang eksitasi yang dipilih. Jadi, bahkan dengan resolusi spektroskopi relatif miskin ratusan spektrum dapat diproduksi, salah satu atau semua yang (meskipun banyak spektrum yang sangat mirip) dapat digunakan untuk mengkonfirmasi mengidentifikasi senyawa. 3. The Multiwave Fluorescence Detector Instrumen baru yang digunakan gangguan filter dalam upaya untuk memberikan Multiwave Fluoresensi deteksi tanpa menggunakan monokromator.

Logam

Optimum Perangsangan(Nm)

optimum emisi (nm)

Seng (135 pmol) Kadmium (33 pmol) Magnesium (135 pmol) Kalsium (20 nmol)

393 387 393 393

506 522 506 506

Gambar 13.Pemisahan Beberapa Logam Chelate Mempekerjakan Fluorescence Deteksi pada Optimum Eksitasi dan Emisi Panjang gelombang

Perangkat dioperasikan pada empat panjang gelombang yang berbeda dan diagram peralatan mereka ditunjukkan pada Gambar 14. Cahaya eksitasi dari 200 w Xenon lampu busur pertama kali tercermin oleh cermin UV (90% reflektansi rata-rata untuk cahaya antara 325 dan 475 nm) untuk meminimalkan panas dan menghapus sebagian besar Terlihat cahaya.Lampu eksitasi kemudian dilewatkan melalui filter interferensi, yang dapat mengirimkan cahaya pada 320 2 nm, 360 2 nm dan 400 2 nm, dan kemudian fokus ke ujung bulat berbentuk bundel serat optik kuarsa.Bundel serat ini diarahkan cahaya ke modul detektor, yang terdiri dari tabung kuarsa persegi dipasang pada dudukan sel Teflon hitam.

Gambar 14.Diagram Skema Modul Detector

Fluoresensi sinyal diamati melalui jendela samping dalam sel. Dua detektor, masing-masing terdiri dari sensor cahaya dan filter gangguan, yang dipasang di pemegang kuningan di kedua sisi sel.Akibatnya cahaya emisi di empat panjang gelombang yang berbeda dapat diukur secara bersamaan.Filter yang berbeda digunakan untuk frekuensi cahaya eksitasi yang berbeda, misalnya, dengan cahaya eksitasi panjang gelombang dari 400 nm, filter dalam empat unit sensor, dipilih untuk mengirimkan cahaya pada 420 2 nm, 440 2 nm, 460 2 nm dan 500 2 nm masing-masing.Output dari sensor diakuisisi oleh komputer dan data yang

disimpan.Pemisahan, dipantau oleh salah satu dari Fluoresensi saluran, kemudian bisa direkonstruksi. Sebuah contoh dari penggunaan peralatan untuk menyelesaikan puncak berbelit-belit yang mengandung dua zat terlarut ditunjukkan pada Gambar 15.

Gambar 15.Resolusi Convoluted kromatografi Peaks Panjang gelombang cahaya eksitasi adalah 400 nm dan cahaya emisi dimonitor pada 420 nm, 440 nm, 460 nm dan 500 nm. Kromatogram direkonstruksi dari output sama sekali empat panjang gelombang, dan kromatogram gabungan termasuk dalam angka 15.Hal ini terlihat bahwa dua komponen yang jelas dibedakan oleh multi-channel Fluoresensi deteksi, sedangkan

sifat ganda dari puncak berbelit-belit adalah tak dpt dibedakan dengan deteksi nonselektif.Meskipun alat ini lebih sederhana, dan mungkin lebih murah daripada membuat Fluoresensi spektrometer, kinerjanya juga sangat terbatas dibandingkan.

DAFTAR PUSTAKA

1. http://www.analyticalspectroscopy.net/ap2-15.htm 2. http://www.chromatography-online.org/5/contents.html 3. http://www.chromatography-online.org/HPLC-Detectors/Transport/rs63.html 4. http://hplc.chem.shu.edu/NEW/HPLC_Book/Detectors/det_flur.html 5. http://id.wikipedia.org/wiki/Fluoresens

Anda mungkin juga menyukai