Fac. Cs. Qs. Dpto. De MICROBIOLOGA LABORATORIO DE BACTERIOLOGA II Q.F.

BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO

REA ESPECFICA DE:

MICROBIOLOGA

NOMBRE DE LA ASIGNATURA: CDIGO: FECHA DE ELABORACIN: NIVEL EN EL MAPA CURRICULAR: TIPO DE ASIGNATURA:

LABORATORIO DE BACTERIOLOGA II FAR 432L MARZO 2002 FORMATIVO DISCIPLINARIA

PROFESORES QUE PARTICIPARON EN SU ELABORACIN: Q.F.B. Ana Bertha Escobedo Lpez M.S.P. Carlos Cabrera Maldonado M.S.P. Juan Manuel lvarez Lpez M.C. Nidia Gary Pazos Salazar MC Patricia Gpe. Surez Albores M.C. Mara Susana Prez Fernndez HORAS DE TEORA: 3 HORAS PRCTICA: 3 CRDITOS: 9

INDICE
NMERO DE LA PRCTICA PRCTICA No. 1 PRCTICA No. 2 PRCTICA No. 3 PRACTICA NO 4 PRCTICA No. 5 PRCTICA No. 6 PRCTICA No. 7 PRCTICA No. 8 PRCTICA No. 9 PRACTICA No 10 PRCTICA No. 11 PRCTICA No. 12 PRCTICA No. 13 PRCTICA No. 14 PRACTICA No 15 PRACTICA No 16 TTULO DE LA PRCTICA SEGURIDAD EN EL MANEJO Y USO DE SUSTANCIAS QUMICAS Y OTROS MATERIALES. DESECHOS PELIGROSOS. EXUDADO FARNGEO Y NASOFARNGEO INFECCIONES DE VAS RESPIRATORIAS BAJAS (CULTIVO DE ESPUTO) BUSQUEDA E IDENTIFICACION DE M. tuberculosis EN DIFERENTES MUESTRAS BIOLOGICAS INFECCIONES OCULARES INFECCIONES OTICAS INFECCIONES NASALES INFECCIONES GASTROINTESTINALES (COPROCULTIVO) INFECCIONES DE LAS VAS URINARIAS (UROCULTIVO) SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS METODO DE KIRBY-BAUER INFECCIONES DEL APARATO GENITAL (EXUDADO CERVICO VAGINAL, VULVAR Y URETRAL CULTIVO DE HERIDAS DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES MENNGEAS (CULTIVO DE LCR) HEMOCULTIVO Y CULTIVO DE MDULA SEA CULTIVO DE CATETERES, SONDAS, ETC. LECTURA REPORTE DE BAAR PARA SU INTERPRETACION Y PGINA 4 9 11 13 15 15 17 19 21 25 27 31 34 37 40 43

REGLAMENTO DEL LABORATORIO

1.- La asistencia al laboratorio deber de ser del 100%, nicamente en casos de fuerza mayor se aceptar una sola falta justificada al da siguiente de la prctica de lo contrario no se podr seguir cursando el laboratorio. 2.- El llegar 15 minutos despus de la hora de entrada se tomar como retraso, el segundo retraso har una falta, lo que implica no tener el 100% de asistencia. 3.- Se deber usar permanentemente la bata del laboratorio, debidamente abotonada y limpia. 4.- Queda estrictamente prohibido el consumo de alimentos y lquidos, as como fumar o aplicarse cosmticos en el laboratorio. 5.- Antes y despus de la prctica, limpiar y descontaminar la mesa de trabajo. 6.- Traer el material necesario para la elaboracin de la prctica como: asa, guantes, cubre boca, cinta adhesiva, algodn, as como material para limpieza como jabn de manos y benzal 7.- Evitar accidentes y en su defecto avisar de inmediato. 8.- A todo material contaminado de desecho se le deben quitar etiquetas y cintas adhesivas, deben ser depositados en botes o recipientes destinados para este uso, no se debe tirar basura al suelo, ni guardarla en los cajones o de tirarla en los vertederos. 9.- Incubar el material el tiempo que se indica debidamente identificado con su nombre y nmero de equipo. 10.- Se deber tener extremo cuidado en el uso de los microscopios y dems equipo del laboratorio. 11.- Se debern lavarse las manos al finalizar la prctica para poder abandonar el laboratorio. 12.- Se debern anexar hojas blancas al manual, en donde se harn las anotaciones pertinentes de cada prctica y se responder el cuestionario. 13.- Para tener derecho a la calificacin del laboratorio se deber tener el 100% de asistencia, tener el manual al corriente, haber presentado todos los reportes y aprobar el examen tericoprctico, lo cual dar la calificacin final del laboratorio que corresponder al 20% de la calificacin final de la materia. 14.- El examen final constar de una parte terica en donde se investigarn los puntos indicados por el profesor y una parte prctica (dependiendo del profesor), este examen deber entregarse en la fecha indicada.

PRACTICA 1 SEGURIDAD EN EL MANEJO Y USO DE SUSTANCIAS QUIMICAS Y DESECHOS 1. INTRODUCCION El manejo adecuado de los residuos slidos hospitalarios presenta diversos impactos ambientales negativos que se evidencian en diferentes etapas como la segregacin, el almacenamiento, el tratamiento, la recoleccin, el transporte y la disposicin final. Las consecuencias de estos impactos no slo afectan a la salud humana sino tambin a la atmsfera, el suelo y las aguas superficies y subterrneas. A todo esto se suma el deterioro del paisaje natural y de los centros urbanos. Debido a que tradicionalmente la prioridad de la institucin ha sido la atencin al paciente, por mucho tiempo se ha restado importancia a los problemas ambientales, creando en muchos casos un crculo vicioso de enfermedades derivadas del manejo inadecuado de los residuos.La cantidad y las caractersticas de los desechos generados en los establecimientos de atencin de salud varan segn la funcin de los servicios proporcionados. 2. MEDIDAS DE BIOSEGURIDAD. En el desempeo de las actividades asistenciales, es primordial tener en cuenta los siguientes principios bsicos de Bioseguridad. Todo trabajador de salud debe cumplir con las siguientes precauciones: 2.1 ADECUADO USO DE LA BATA: - El personal deber contar con bata acordes con la actividad que realiza, que permita desplazamientos y movimientos de extensin y flexin, mantenerse limpio y ajuste perfecto que favorezca la presentacin persona.La bata de servicio ser de uso exclusivo no se empleara en la calle o transporte pblico, con el objeto de evitar ser portador de grmenes. 2.2 LAVADO DE MANOS. El factor ms importante en la propagacin de muchos patgenos es la contaminacin por las manos de estos se deduce que es fundamental el lavado de manos para prevenir la infeccin cruzada. 2.2.1 Recomendaciones Generales para el Lavado de Manos 2.2.2 Tcnica General del Lavado de Manos 2.3 ACCESORIOS DE PROTECCION. Estn diseados para prevenir la propagacin de infecciones que se puedan transmitir, tanto por contacto o por el aire, los cuales son: a) Guantes, b) Mascarilla, c) Anteojos y d) Bata 2.4 CONTROLES DE SALUD E INMUNIZACIONES DEL TRABAJADOR DE SALUD

a) Examen Preocupacional y b) Inmunizaciones 2.5 AISLAMIENTO 2.6 PRECAUCIONES GENERALES 2.6.1 Precauciones con la sangre y otros lquidos orgnicos - Tratar todos los productos sanguneos y lquidos orgnicos como si fueran infecciosos.- Lavarse las manos antes y despus del contacto con el paciente y en caso de contaminacin con sangre y lquidos orgnicos. 2.6.2 Precauciones con las inyecciones y perforaciones de la piel - Los objetos agudos deben ser considerados como potencialmente infectantes, han de ser manejados con extraordinarias precauciones, siempre con guantes, para prevenir lesiones accidentales y deben de ser situados en envases resistentes a la puncin de uso exclusivo. - Utilizar agujas y jeringas desechables y que no deben de ser cubiertas o encapuchadas con sus fundas una vez utilizadas. 3. MEDIDAS EN CASO DE ACCIDENTES 3.1 ACCIDENTES CON MATERIAL DE PACIENTE CON DIAGNOSTICO DESCONOCIDO - Todo paciente y material en contacto con sangre o fluidos, deben de ser considerables como potencialmente infectados.- En caso de sufrir lesin accidental con elementos punzocortante potencialmente infectados, realizar un lavado minucioso con agua y jabn. Inmediatamente presionar los bordes de la herida para favorecer la salida de sangre por la misma, etc. 3.2 ACCIDENTES CON MATERIALES DE PACIENTES CON SIDA. El Virus de Inmunodeficiencia Humana (VHI) se puede transmitir en los establecimientos de salud a travs de sangre, fluidos o materiales contaminados. Puede ocurrir de: Paciente a paciente, de paciente a trabajador de salud y de trabajador a pacientes. 3.2.1 Medidas a tomar en caso de accidentes con material sospechoso de contener el virus de VIH. - Despus de producido un accidente con material potencialmente contaminado, se debe de lavar la zona afectada con agua y jabn, favoreciendo el sangrado de la lesin si es necesario, se cubrir la herida con un apsito.

- Se informara inmediatamente al mdico de turno, quien debe de examinar la herida y determinar el tipo y gravedad (puncin, lactancia superficial o profunda, contaminada de la piel o mucosa no intacta) y hasta que punto pudo contaminarse con la sangre. 3.2.2 Medidas a tomar en caso de infeccin por VIH. Para las personas infectadas por VIH o con cuadro de SIDA, no es necesario indicar precauciones como aislamiento en habitaciones privadas, ni normas de admisin especiales. 4. TRATAMIENTO DE MATERIALES E INSUMOS CONTAMINADOS. Las practicas de limpieza, desinfeccin y esterilizacin son esenciales para cualquier programa de control y prevencin de infecciones. 4.1 LIMPIEZA 4.2 DESCONTAMINACION 4.2.1 Procedimientos de lavado de material 4.3 DESINFECCION 4.3.1 Metodos de desinfeccin a) Mtodos Qumicos: Desinfeccin de alto nivel y Desinfeccin de nivel intermedio. b) Mtodos No Qumicos: Pasterurizacin y Hervido. 4.4 ESTERILIZACION 4.4.1 Mtodos a) Esterilizador por medios fsicos: Tipos de Esterilizador a vapor y Esterilizador al calor seco. b) Mtodos Qumicos: Qumicos-Lquidos, Qumico-Gas y QumicosPlasma. 4.4.2 Indicaciones: - Factores que afectan la eficacia de los procesos de esterilizacin - Consideraciones Irradiacin, Radiacin Ultravioleta,

4.4.3 Consideraciones de esterilizacin 4.4.4 Empaque 4.4.5 Almacenamiento del material 5. MANEJO DE SUSTANCIAS QUIMICAS. La asimilacin de sustancias por el cuerpo humano puede ocurrir a travs de los pulmones, el aparato digestivo, la piel y las mucosas. 5.1 CLASIFICACION: a) Reactivos para anlisis, b) Reactivos tcnicamente puros y c) Reactivos industriales o tcnicos 5.2 MEDIDAS GENERALES 5.3 EQUIPOS DE PROTECCION Y SEGURIDAD 5.4 ALMACENAMIENTO DE SUSTANCIAS QUIMICAS 5.5 CONSERVACION DE LAS SUSTANCIAS QUIMICAS 6. MANEJO DE PRODUCTOS

BIOLOGICOS 6.1 CUIDADOS GENERALES - Todas las muestras deben de ser tratadas como altamente infecciosas para evitar posible contagio.- El personal que transporta las muestras, debe de utilizar guantes de plstico y conocer los procedimientos de descontaminacin y desinfeccin. 6.2 DEPOSITO Y TRANSPORTE - Todas las muestras de sangre y fluidos corporales deben ser colocadas en recipientes seguros en buen estado y con tapa de cierre hermtico.- La persona que toma la muestra debe de tener especial cuidado de no contaminar la parte externa del recipiente. 6.3 CUIDADO DEL PERSONAL - Se debe de utilizar proteccin facial (tapa boca, mascarilla plstica) as se prev un contacto posible de la membrana de la mucosa, con sangre o fluidos corporales.- Nunca pipetear muestras, fluidos infecciosos o txicos con la boca, etc. 7

6.4 CUIDADOS Y LIMPIEZA DEL MATERIAL Y AREA - Las zonas de trabajo deben de desinfectarse despus de producirse un derrame de sangre o fluido corporal, y al terminar las labores.- Todo el material empleado en la realizacin de las pruebas donde se trabaje con especimenes clnicos, debe de esterilizarse por autoclave u otro mtodo apropiado antes de ser utilizado, desplazado o eliminado, de acuerdo a las facilidades. 6.5 SANGRE Y HEMODERIVADOS - La sangre colectada, debe ser considerada como potencial infecciosa.Para tomar muestras de sangre se deben de utilizar jeringas y agujas descartables o sistemas de tubos al vaco.- La toma de muestras de sangre, fluidos corporales u otros, debe de realizarse siempre con guantes. 6.9 MEDIDAS EN CASO DE ACCIDENTES a) En derrame de cultivos y b) Emisin de aerosoles 7. SEGURIDAD EN AREAS ESPECIFICAS 7.1 LABORATORIO. A continuacin se sealan importantes sobre seguridad en el trabajo de laboratorio: recomendaciones

- El personal de laboratorio debe de pasar por previa evaluacin mdica completa que debe de comprender una historia clnica detallada al momento de su incorporacin a la institucin.- Colocar a la seal internacional de riesgo biolgico en las puertas de los locales donde se manipulen microorganismos.

PRACTICA 2 EXUDADO FARNGEO El estudio del exudado farngeo y nasofaringeo es importante para el diagnstico de ciertas infecciones consideradas dentro de las principales causas de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Dentro de las principales bacterias patgenas causantes de infeccin estn los estreptococos. Tambin es muy importante conocer la flora normal en las vas respiratorias altas y bajas para un buen reporte, ya que la orofaringe es un sitio expuesto y se debe distinguir a los patgenos de los comensales con ayuda del cultivo. El exudado farngeo y nasofaringeo son las muestras ms empleadas para el estudio bacteriolgico de una infeccin de vas respiratorias superiores y es requisito importante que sean tomadas en forma adecuada para garantizar resultados confiables y correctos TOMA DE MUESTRA EXUDADO FARNGEO Tomar la muestra al inicio del cuadro clnico antes de empezar cualquier tratamiento e indicar al paciente que debe presentarse sin aseo bucal y sin haber ingerido alimento. 1.- Se inclina la cabeza del paciente hacia atrs y se revisa con una lmpara la zona afectada 2.- Se empuja la lengua hacia abajo con un abatelenguas estril que permita mejor visin. 3.- Se introduce un hisopo hacia las amigdalas, sin tocar la lengua y se frota la zona afectada. No tocar nunca la mucosa oral, lengua o vula. 2.- Se investigar rutinariamente la presencia de Streptococcus -hemoltico del grupo A (S. pyogenes). 3.- En las sospechas de difteria debern mandarse porciones de membrana NASOFARNGEO Es la muestra indicada para la investigacin de Bordetella pertussis. La muestra se puede tomar por exudado o aspirado: Exudado: Introducir un hisopo de dacrn con mango flexible y tratado previamente con alginato de calcio por una de las narinas aproximadamente 10 cm cuidando de tocar solamente el extremo posterior del mango, una vez tocado el fondo de la nasofaringe se frota suavemente y con movimiento rpido Aspirado: 1.- Desinfectar el lugar de la puncin con povidona. 2.- Introducir una aguja en el antrum maxilar por debajo del cornete inferior, o en el seno frontal por debajo del marco supraorbital del ojo. 9

3.- Aspirar el lquido del seno. Cuando no se obtenga lquido, iaplicar 1 mL de suero salino estril y aspirarlo nuevamente. 4.-Inyectar una parte de la muestra en un medio de transporte para anaerobios y enviar el resto en un contenedor estril o en la propia jeringa. TRANSPORTE DE LA MUESTRA En caso de que la muestra no se vaya a procesar de inmediato se deber depositar en un medio de transporte y es importante que el mdico indique con base al cuadro clnico el germen de sospecha para facilitar el diagnstico. DIAGRAMA DE TRABAJO

Medio de transporte Stuart Caldo Todd-Hewitt Agar Biggy Agar gelosa sangre de carnero (CGP, BGN) GHBEL (H. influenzae)

Candida albicans

Agar gelosa sangre de carnero

Colonias -hemolticas

Pruebas de identificacin

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PRACTICA 3 INFECCIONES DE VAS RESPIRATORIAS BAJAS (CULTIVO DE EXPECTORACIN) Las infecciones de las vas respiratorias inferiores son causa importante de enfermedad y muerte a nivel nacional. Siendo la tuberculosis en sus diferentes cuadros agudos, una de las ms frecuentes, se presentan tanto en gente joven y anciana, as como en pacientes inmunodeficientes y a consecuencia principalmente del uso del tabaco. De los principales agentes bacterianos asociados a neumonas sobresalen en primer trmino Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniae, Haemophilus influenzae; bacterias del tipo anaerobio tienen un papel importante en algunas muestras, por lo que se recomienda la bsqueda de Chlamydia pneumoniae Mycoplasma pneumoniae que se asocia con neumonas atpicas, Francisella tularensis, E.coli, Ps aeruginosa, levaduras del tipo de Candida albicans. En este tipo de estudios el reporte preliminar de las tinciones para el inicio del manejo antimicrobiano es de suma importancia. En las condiciones habituales de la clnica diaria, no es una muestra representativa de la situacin existente en el tracto respiratorio inferior por su mezcla con secreciones procedentes de todo el rbol traqueo-bronquial y con la flora saprfita de la orofaringe. No obstante es un mtodo fcil y rpido cuya utilidad o relacin entre resultado obtenido y verdadera etiologa depende en gran medida de su correcta obtencin, control de calidad antes de iniciar su procesamiento, tipo de agente que se pretenda detectar y valoracin adecuada del resultado. La tuberculosis en nuestro pas, es actualmente uno de los problemas ms importantes de salud en los ltimos aos y su resurgimiento se da a partir de la epidemia de VIH que ataca a todo el mundo. El diagnstico de las micobacterias se puede realizar en diferentes productos biolgicos como son: expectoracin, orina, lavado gstrico, raspado larngeo, lavado o cepillado bronquial, materia fecal, sangre o heridas. TOMA DE MUESTRA 1.- Enjuagar la boca con agua destilada estril o solucin salina. 2.- Obtener el esputo tras una expectoracin profunda, preferentemente matinal. 3.- De no producirse expectoracin espontnea, puede inducirse el esputo con nebulizaciones de suero fisiolgico estril (15 mL durante 10 minutos), siendo til adems realizar un drenaje postural o fisioterapia respiratoria. VOLUMEN MNIMO De 2 a 10 mL, si es posible.

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TRANSPORTE Y CONSERVACION Envo inmediato al laboratorio (no superior a 2 horas). Si no es posible, conservar en refrigeracin 4C. OBSERVACIONES 1.- Es preferible realizar la toma antes de instaurar el tratamiento antibitico. 2.- No es til para anaerobios. 3.- No son inoculables las secreciones de sospechosa procedencia. 4. - La expectoracin debe rechazarse hasta obtener un esputo de calidad suficiente (mas de 25 leucocitos polimorfonucleares por campo 100x, y de 10 clulas epiteliales por campo 100x). DIAGRAMA DE TRABAJO

Muestra

Tincin de Gram

BAAR

Agar Mac Conkey Agar Gelosa Sangre Agar Gelosa Chocolate Agar Sal y Manitol Agar Biggy

Pruebas de identificacin

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PRACTICA 4 BUSQUEDA E IDENTIFICACION DE M. tuberculosis EN DIFERENTES MUESTRAS BIOLOGICAS Mycobacterium tuberculosis es una bacteria responsable de la mayor cantidad de casos de tuberculosis en el mundo. Fue descrito por primera vez el 24 de marzo de 1882 por Robert Koch, quien posteriormente recibira el premio Nobel de Fisiologa o Medicina en 1905. Su genoma est secuenciado, lo que permitir aclarar su relacin con las otras especies del complejo Mycobacterium tuberculosis. Es una bacteria Grampositiva frecuentemente incolora, aerbica estricta. Su crecimiento est subordinado a la presencia de oxgeno y al valor del pH circundante. Es muy resistente al fro, la congelacin y la desecacin y por el contrario muy sensible al calor, la luz solar y la luz ultravioleta. Su multiplicacin es muy lenta (se divide cada 16 a 20 horas) y ante circunstancias adversas puede entrar en estado latente, pudiendo retrasar su multiplicacin desde algunos das hasta varios aos. El reservorio natural del M. tuberculosis es el hombre, tanto el sano infectado como el enfermo. Las infecciones de las vas respiratorias inferiores son causa importante de enfermedad y muerte a nivel nacional. Siendo la tuberculosis en sus diferentes cuadros agudos, una de las ms frecuentes, se presentan tanto en gente joven y anciana, as como en pacientes inmunodeficientes y a consecuencia principalmente del uso del tabaco. En este tipo de estudios el reporte preliminar de las tinciones para el inicio del manejo antimicrobiano es de suma importancia. En las condiciones habituales de la clnica diaria, no es una muestra representativa de la situacin existente en el tracto respiratorio inferior por su mezcla con secreciones procedentes de todo el rbol traqueo-bronquial y con la flora saprfita de la orofaringe. No obstante es un mtodo fcil y rpido cuya utilidad o relacin entre resultado obtenido y verdadera etiologa depende en gran medida de su correcta obtencin, control de calidad antes de iniciar su procesamiento, tipo de agente que se pretenda detectar y valoracin adecuada del resultado. La tuberculosis en nuestro pas, es actualmente uno de los problemas ms importantes de salud en los ltimos aos y su resurgimiento se da a partir de la epidemia de VIH que ataca a todo el mundo. El diagnstico de las micobacterias se puede realizar en diferentes productos biolgicos como son: expectoracin, orina, lavado gstrico, raspado larngeo, lavado o cepillado bronquial, materia fecal, sangre o heridas. TOMA DE MUESTRA 1.- Enjuagar la boca con agua destilada estril o solucin salina. 2.- Obtener el esputo tras una expectoracin profunda, preferentemente matinal. 13

3.- De no producirse expectoracin espontnea, puede inducirse el esputo con nebulizaciones de suero fisiolgico estril (15 mL durante 10 minutos), siendo til adems realizar un drenaje postural o fisioterapia respiratoria. VOLUMEN MNIMO De 2 a 10 mL, si es posible. TRANSPORTE Y CONSERVACION Envo inmediato al laboratorio (no superior a 2 horas). Si no es posible, conservar en refrigeracin 4C. OBSERVACIONES 1.- Es preferible realizar la toma antes de instaurar el tratamiento antibitico. 2.- No es til para anaerobios. 3.- No son inoculables las secreciones de sospechosa procedencia. 4. - La expectoracin debe rechazarse hasta obtener un esputo de calidad suficiente (mas de 25 leucocitos polimorfonucleares por campo 100x, y de 10 clulas epiteliales por campo 100x). DIAGRAMA DE TRABAJO

Muestra

Tincin de Gram

BAAR

Agar Mac Conkey Agar Gelosa Sangre Agar Gelosa Chocolate Agar Sal y Manitol Agar Biggy

Pruebas de identificacin 14

PRACTICA 5 Y PRACTICA 6 EXUDADO TICO Y OCULAR Las infecciones ticas se pueden asociar a infecciones respiratorias mal cuidadas y en nios pequeos son muy comunes por la introduccin de objetos extraos como semillas, juguetes pequeos, etc. Las infecciones oculares se manifiestan comnmente por el constante lagrimeo. Los microorganismos aislados con mayor frecuencia dependen de la edad del paciente y su localidad. Considerndose dentro de los pacientes de mayor riesgo a los recin nacidos por las posibles secuelas irreversibles que pueden originarse en ellos. TOMA DE MUESTRA CULTIVO TICO 1.- Limpiar odo externo con un antisptico suave. 2.- Introducir el hisopo teniendo cuidado de no lastimar, indicando al paciente hasta donde soporta el hisopo en caso de abscesos, aspirar el fluido. 3.- Diferenciar las muestras del odo derecho e izquierdo 4.- Cuando se trata de una perforacin del tmpano la muestra se recomienda sea tomada por el otorrinolaringlogo. 5.- Sembrar la muestra en los medios de cultivo indicados y en forma inmediata. 6.- Si las muestras no pueden procesarse inmediatamente se emplearn medios de transporte para bacterias tipo Stuart-Amies, que se mantendrn a temperatura ambiente. TOMA DE MUESTRA CULTIVO OCULAR 1.- Indicar al paciente que debe abstenerse de aplicar soluciones antispticas en ambos ojos. 2.- Con un hisopo mojado en suero fisiolgico frotar sobre la conjuntiva. 3.- Identificar de que ojo procede la muestra. 4.- El transporte deber ser inmediato. Cuando no sea posible, se colocarn los hisopos en medio de transporte tipo Stuart-Amies, que se mantendr a temperatura ambiente. Para Chlamydia se utilizar un medio de transporte especfico ("2-SP").

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DIAGRAMA DE TRABAJO

Muestra

Tincin de Gram

Inocular medios selectivos y diferenciales

Pruebas de identificacin

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PRACTICA 7

INFECCIONES NASALES
Infeccion nasal Las infecciones nasales pueden reconocerse por los sintomas que producen: estornudos, descarga nasal, respiracion ruidosa y respiracion por la boca. Cuando la congestion nasal interfiere con la habilidad de olfatear, el gato pierde su apetito y se rehusa a comer. La causa mas comun de infecciones nasales en el gato es una enfermedad respiratoria viral. Sospecha de esto cuando ambas fosas nasales estan involucradas y cuando otros gatos dentro de la casa exhiben los mismos sintomas. La descarga nasal al principio acuosa pero despues se vuelve mucosa, amarilla y gruesa. Las infecciones respiratorias virales tambien estan acompaadas de fiebre, lagrimeo y descarga de los ojos, ulceraciones de la lengua; tos y letargo. Estas enfermedades se discuten a detalle en las paginas de Enfermedades Infecciosas. Las infecciones bacteriales se establecen cuando la cubierta de la nariz se ha daado por un cuerpo extrao o un golpe en la nariz o por una enfermedad respiratoria previa. En ocasiones la infeccion se extiende a la cavidad nasal de la sinus frontal (Ver sinusitis). Las seales mas comunes de involucramiento bacterial de la nariz son una descarga nasal mucoide, amarillo cremosa o purulenta. Una descarga con sangre indica una ulceracion de la membrana. NASOFARNGEO Es la muestra indicada para la investigacin de Bordetella pertussis. La muestra se puede tomar por exudado o aspirado: Exudado: Introducir un hisopo de dacrn con mango flexible y tratado previamente con alginato de calcio por una de las narinas aproximadamente 10 cm cuidando de tocar solamente el extremo posterior del mango, una vez tocado el fondo de la nasofaringe se frota suavemente y con movimiento rpido Aspirado: 1.- Desinfectar el lugar de la puncin con povidona. 2.- Introducir una aguja en el antrum maxilar por debajo del cornete inferior, o en el seno frontal por debajo del marco supraorbital del ojo. 3.- Aspirar el lquido del seno. Cuando no se obtenga lquido, iaplicar 1 mL de suero salino estril y aspirarlo nuevamente. 17

4.-Inyectar una parte de la muestra en un medio de transporte para anaerobios y enviar el resto en un contenedor estril o en la propia jeringa. TRANSPORTE DE LA MUESTRA En caso de que la muestra no se vaya a procesar de inmediato se deber depositar en un medio de transporte y es importante que el mdico indique con base al cuadro clnico el germen de sospecha para facilitar el diagnstico.

DIAGRAMA DE TRABAJO

Muestra

Tincin de Gram

Inocular medios selectivos y diferenciales

Pruebas de identificacin

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PRACTICA 8 INFECCIONES GASTROINTESTINALES (COPROCULTIVO) El estudio de las bacterias responsables de cuadros clnicos gastrointestinales se realiza fundamentalmente mediante el cultivo de la materia fecal (coprocultivo). Las enfermedades diarreicas agudas representan una de las principales causas de defuncin en nuestro pas. Las vas gastrointestinales son el hbitat natural de una extensa variedad de microorganismos, la mayora de las bacterias de la flora entrica residente corresponden a miembros de la familia Enterobacteriaceae (E. coli, Proteus, etc) aunque tambin son abundantes Enterococcus faecalis, diversas especies de Staphylococcus, Mycobacterium y especies anaerobias. Siendo de mayor relevancia diagnstica las enterobacterias patgenas como Shigella, Salmonella, Yersinia, Escherichia coli, esta ltima aunque se considera parte de la flora, algunos serotipos denominados enteropatgenos son capaces de producir gastroenteritis, principalmente en lactantes en forma de brotes epidmicos. Adems de otros gneros de importancia mdica como Vibrio, Campylobacter y Helicobacter que pertenecen a otras familias. El objetivo principal de realizar el coprocultivo es que ste sirva como apoyo diagnstico clnico en caso de gastroenteritis. TOMA Y TRANSPORTE DE MUESTRA Las muestras se debern obtener al inicio del cuadro clnico antes de iniciar el tratamiento antimicrobiano. 1.- La muestra de heces se puede recolectar en un recipiente de boca, no es necesario que est estril, slo es preciso que est limpio, que no contenga restos de jabn, detergente o desinfectante. Cuando se trata de lactantes la muestra se toma directamente del recto utilizando una sonda conectada a una jeringa estril, e introducindole solucin salina isotnica. 2.- Los medios de transporte para heces se emplean slo si la muestra no es procesada inmediatamente. Existen sistemas comerciales de transporte para bacterias (Cary-Blair o modificaciones o solucin de glicerol tamponado). 3.- Slo en ocasiones extremas se puede refrigerar la muestra. PROCEDIMIENTO 1.- Hacer la observacin directa de las heces, si presenta moco, sangre o si son lquidas, pastosas o de diferente color. 2.- La tincin de Gram en frotes de materia fecal es importante para corroborar la presencia de Campylobacter en sus formas vibrinicas y helicoidales, la presencia de clulas indicativas de inflamacin, eritrocitos, etc.

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3.- La materia fecal se siembra directamente con un asa y la cantidad de muestra depende del tipo de medio de cultivo utilizado. El mtodo usado es por la tcnica de estra cruzada esterilizndola en cada seccin de la placa y separando la estra. 4.- Las placas se incuban a 37 C durante 18 a 24 horas 5.- Al mismo tiempo de sembrar las placas, sembrar un tubo de enriquecimiento con muestra fecal usando una cantidad pesada de inculo, como caldo tetrationato o caldo selenito. Si se sospecha de Vibrio sembrar un tubo con agua peptonada alcalina (APA), incubar a 37C de 12 a 18 horas y posteriormente sembrar en un medio selctivo. 7.- Del tubo de enriquecimiento despus de incubado se siembran medios selectivos y diferenciales y se identifican las colonias de inters DIAGRAMA DE TRABAJO Heces Enriquecimiento SSI al 0.5% Caldo tetrationato Caldo selenito Agar Mac Conkey Agar EMB Azul de metileno Agar ENDO Agar XLD Agar tergitol 7

Agar SS Agar verde Brillante Agar sulfito de bismuto Agar XLD

Identificacin bioqumica Identificacin serolgica

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PRACTICA 9 INFECCIONES DE VAS URINARIAS UROCULTIVO Las infecciones de las vas urinarias son muy frecuentes, y presentan una marcada resistencia al tratamiento y muchas de ellas con tendencia a recidivar especialmente en las personas del sexo femenino, considerndose riesgosas porque pueden evolucionar a enfermedades renales graves, como pielonefritis, presentndose en algunos casos de manera asintomtica, o como enfermedad aguda o crnica. Las infecciones agudas son causadas generalmente por un solo microorganismo, mientras que las crnicas por varios microorganismos. Las bacterias que con mayor frecuencia se aslan de la orina de pacientes son E. coli, Staphylococcus, Proteus, Enterococcus faecalis, Salmonella, Pseudomonas, Mycobacterium, ocasionalmente Neisseria gonorroheae o Candida albicans. TOMA DE MUESTRA La muestra idnea es la primera miccin de la maana, ya que permite la multiplicacin de bacterias durante la noche. Tcnicas para mujeres. 1.- La paciente debe quitarse la ropa interior. 2.- Se lavar las manos cuidadosamente con agua y jabn, las enjuagar con agua y las secar con una toalla limpia. 3.- Se separarn los labios mayores y menores, y los mantendr separados en todo momento hasta que se haya recogido la orina. 4.- Con una gasa enjabonada se lava bien la vulva pasndola de delante hacia atrs, se repetir el proceso un total de 4 veces. 5.- Enjuagar cuidadosamente con agua hervida para eliminar los restos de jabn. 6.- Se indicar a la paciente que orine desechando los 20-25 primeros mililitros, tras lo cual y sin interrumpir la miccin, se recoger el resto de la orina en el recipiente. 7.- El frasco de boca ancha y estril debe sujetarse para que no tome contacto con pierna, vulva o ropa de la paciente. Los dedos no deben tocar el borde del frasco o su superficie interior. Tcnica para hombres. 1.- Lavado de las manos con agua y jabn. 2.- Retraer completamente el prepucio, que se mantendr as en todo momento, hasta que se haya recogido la orina. 3.- Limpiar el glande con jabn neutro. 4.- Eliminar los restos de jabn enjuagndolo con agua hervida. 5.- Se pedir al paciente que orine desechando los primeros 20-25 mililitros y sin interrumpir la miccin, recoger el resto de la orina en el recipiente estril.

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Tcnica para nios. 1.- En nios y nias mayores la orina se recoge de forma similar a los adultos. 2.-En nios y nias ms pequeos, la orina se recoger en colectores o bolsas estriles especialmente diseadas para ellos de la siguiente forma: a) Lavado cuidadoso de los genitales y rea perineal igual que en los adultos. b) Colocar la bolsa de plstico o el colector. c) Vigilar la bolsa cada 30 minutos y tan pronto como el nio haya orinado, deben retirarse y enviarse al laboratorio para su procesamiento. d) Si la miccin no se ha realizado en una hora, se repite la operacin colocando una nueva bolsa. Otros pacientes 1.- En pacientes ingresados con imposibilidad de recoger la muestra por s mismos, se realizar sondaje vesical por personal sanitario experto con las medidas aspticas oportunas. 2.- Orina de pacientes con catter permanente. a) Se limpiar el catter con una gasa humedecida en alcohol o solucin yodada. Dejar secar unos minutos. b) Pinchar directamente con la aguja el catter, por la zona desinfectada, aspirando entre 3-5 ml. c) Para su transporte puede enviarse en la jeringa o pasar la orina a un recipiente estril. Si no puede llevarse al laboratorio, se debe refrigerar a 4C. d) Como regla general se considera que la muestra de sonda vesical no es una muestra adecuada y que est justificado rechazar su procesamiento. ORINA VESICAL Es la orina obtenida por puncin suprapbica. Esta puncin requiere un buen conocimiento de la tcnica y de las precauciones que hay que adoptar, con rigurosa asepsia, descartando problemas de hemostasia y con la vejiga palpable y previa desinfeccin y anestesia local; se punciona sta a 1.5 cm. de la snfisis pubiana, en la lnea media, estando el paciente en decbito supino, con una jeringa de 10 mL y con aguja larga (calibre 19) se aspira el contenido vesical (ver figura). En caso de orina obtenida por puncin suprapbica se enviar al laboratorio lo antes posible en la misma jeringa de la extraccin, tras expulsar el aire de su interior y con la aguja pinchada en un tapn de goma estril, indicando en volante adjunto, procedencia de la muestra o tcnica empleada para su recogida (dato importante a la hora de valorar el recuento de colonias).

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Puncin suprapbica VOLUMEN MINIMO DE LA MUESTRA. Es suficiente un volumen de orina de 5-10 mL, ver tabla Recomendaciones sobre el volumen de orina DETERMINACION Bacteria Hongos Mycobacterias Anaerobios Virus Parsitos. TRANSPORTE DE LA MUESTRA La orina debe llegar al laboratorio en el plazo de una hora. Cuando esto no sea posible debe refrigerarse a 4C durante un tiempo mximo de 24 horas. El laboratorio debe controlar el transporte, garantizndose el que las muestras han sido refrigeradas desde el momento de su toma, siendo admisible, si no puede garantizarse el transporte correcto, la utilizacin de algn conservante (cido brico al 2% o el sistema comercial con brico-formiato). VOLUMEN (mL) 0,5-1 >20 >20 1 10-15 COMENTARIOS Primera orina de la maana. Primera orina de la maana. Primera orina de la maana tres das consecutivos. Aspirado suprapbico, enviar en un sistema de transporte para anaerobios Primera orina de la maana, enviar con hielo y transportar al laboratorio inmediatamente. Orina de 24 horas.

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DIAGRAMA DE TRABAJO Primera miccin matutina chorro medio Agar Mac Conkey Agar sangre de carnero asa calibrada 10-3 Cent. 2000g/10 min Sedimento Cuantificacin No. de colonias X 1000 No. de UFC/mL Identificacin bioqumica

Thayer Martin (N. gonorrhoeae) Agar biggy (Candida albicans)

INTERPRETACIN: Actualmente se utiliza el criterio de Kass para detectar una bacteriuria verdadera. La bacteriuria verdadera se caracteriza usualmente por cuentas bacterianas que exceden 1,000,000 UFC/mL y menos de 10,000 UFC/mL se considera negativo. Sin embargo es muy importante el criterio del mdico de acuerdo al estado clnico del paciente.

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PRACTICA 10 SENSIBILIDAD A LOS ANTIMICROBIANOS METODO DE KIRBY-BAUER En los ltimos aos, las bacterias resistentes a los antimicrobianos, han causado varios brotes de infecciones que produjeron muchas muertes. Por ello es necesario establecer programas nacionales e internacionales de vigilancia de la resistencia de las bacterias a los antibiticos, utilizando pruebas de sensibilidad fidedignas que proporcionen datos comparables. La informacin microbiolgica y epidemiolgica disponible ayudar a los clnicos a seleccionar el agente microbiano ms apropiado para tratar cada infeccin. Las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos evalan la capacidad de un antibitico u otro frmaco antimicrobiano para inhibir in vitro el desarrollo bacteriano. Esta capacidad puede determinarse por el mtodo de dilucin o por el mtodo de difusin. Prueba de dilucin: Se utiliza para evaluar cuantitativamente la actividad de un antimicrobiano, agregando diluciones de ste a caldos de cultivo o en un medio de agar en el que luego se siembra el microorganismo a estudiar. La concentracin del antimicrobiano ms baja que inhiba el crecimiento microbiano despus de una noche de incubacin se considera concentracin mnima inhibitoria (CIM) del frmaco. Prueba de difusin: El microorganismo problema se siembra uniformemente sobre un agar y se colocan en la superficie de ste varios discos de papel impregnados con el antibitico. El frmaco se difunde a partir del disco siguiendo un gradiente de concentracin, de manera que el crecimiento microbiano resulta inhibido a una distancia del disco relacionada, entre otras cosas, por la sensibilidad del germen. El mtodo de difusin por discos, descrito por primera vez en 1966 por Kirby-Bauer y normalizado por la OMS en 1976 se recomienda para fines clnicos por la sencillez de la tcnica y su reproducibilidad. Principalmente es recomendado para la familia Enterobacteriaceae, pero tambin es til para patgenos de crecimiento rpido a excepcin de los anaerobios estrictos. MUESTRA 1.- Cultivos puros y cepas control como Staphylococcus aureus (ATCC 25923) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) 2.- Para probar la susceptibilidad de Haemophilus y Streptococcus se recomienda utilizar un suplemento en el medio.

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DIAGRAMA DE TRABAJO Inculo de la colonia problema

Ajuste de turbidez en S.S.I. al 0.5 del Nefelmetro de Mc Farland

Inocular el agar Muller-Hinton barriendo el hisopo en tres direcciones diferentes

Esperar 5 min

Colocar los sensidiscos seleccionados sobre el agar y presionarlos ligeramente

Medir los dimetros de los halos de inhibicin de acuerdo a tablas de sensibilidad

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PRACTICA 11 INFECCIONES DEL APARATO GENITAL (EXUDADO CERVICO VAGINAL, VULVAR Y URETRAL) Las enfermedades de transmisin sexual (ETS) son un problema importante en Salud Pblica. Los principales agentes asociados a las ETS incluyen virus, bacterias, hongos, protozoarios y ectoparsitos, los cuales estn involucrados en varios sndromes, por lo que la participacin del laboratorio en el diagnstico es relevante. En general, la identificacin de las bacterias productoras de ETS no siempre es a travs de cultivos, en algunos casos se requiere de tcnicas inmunolgicas. Como el caso de Treponema pallidum ya que no existe ningn medio sinttico para su aislamiento; o Chlamydia trachomatis que por ser una bacteria intracelular obligada requiere de clulas vivas para su multiplicacin, de tinciones especiales o bien tcnicas de hibridacin para su identificacin. Las infecciones agudas pueden extenderse por continuidad en el aparato genital y originar secuelas graves en tanto que la infeccin puede tener caractersticas metastsicas y transmitirse por va sangunea a otros rganos y tejidos. EXUDADO CRVICO VAGINAL TOMA DE MUESTRA 1.- Con la paciente en posicin ginecolgica se introducir un espculo "sin lubricante" (si es necesario para lubricar utilizar agua templada). 2.- Recoger la muestra bajo visin directa, con un hisopo, de la zona con mayor exudado, o en su defecto, del fondo del saco vaginal posterior. (Vase figura) 3.- Repetir la operacin con un segundo hisopo.

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NMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Se obtendrn dos hisopos, una destinado al tubo con SSI y el otro al medio de transporte. TRANSPORTE Y CONSERVACIN El envo de la muestra debe ser inmediato siempre que sea posible. Cuando la muestra pueda procesarse antes de 15 minutos debern emplearse hisopos con medio de transporte tipo Stuart-Amies, que se mantendrn a temperatura ambiente, o preferentemente, en estufa 35-37C hasta su procesamiento, que deber ser antes de 3-6 horas. OBSERVACIONES. Cuando se sospeche la infeccin por Neisseria gonorrhoeae, Chlamydia trachomatis Mycoplasma hominis o Ureaplasma urealtycum, deber enviarse muestra endocervical. Para completar el diagnstico de vaginosis si la toma no se realiza en el servicio de Micro biologa, es imprescindible realizar en el momento de la misma, la determinacin pH vaginal, la produccin de aminas voltiles por la adicin de KOH al 10% y observar caractersticas del flujo, todos estos datos consignarn en un cuestionario. No deben utilizarse en los das previos a la recogida de la muestra, soluciones antispticas vaginales, vulos ni pomadas.

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EXUDADO URETRAL TOMA DE MUESTRA 1.- Limpiar cuidadosamente la mucosa circundante con gasas estriles. 2.- Introducir un hisopo uretral fino suavemente con un movimiento de rotacin hasta penetrar unos 2 cm dentro de la uretra (3-5 cm para la investigacin de Chlamydia trachomatis). (Vase figura) Repetir operacin con un segundo hisopo.

3.- Cuando no haya suficiente exudado, puede estimularse mediante un masaje suave prosttico-vesicular. . NMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN. Debern enviarse dos hisopos, uno destinado al examen microscpico y otro al cultivo. TRANSPORTE Y CONSERVACIN. Debe ser inmediato. Cuando no puedan procesarse las muestras antes de 15 minutos, se utilizarn hisopos con un medio de transporte Stuart-Amies que se mantendrn a temperatura ambiente o, preferentemente, en estufa a 35-37C. Las muestras se procesarn siempre que se pueda antes de 3 horas, y como mximo en un plazo de 6-12 horas. OBSERVACIONES. La muestra ha de recogerse preferentemente antes de la primera miccin de la maana, si no es posible, se deber esperar al menos una hora tras la ltima miccin.

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DIAGRAMA DE TRABAJO Medio de transporte Stuart V Agar Sangre de Carnero Biggy Tincin de Gram

Tayer-Martin

Agar Mac Conkey

Neisseria gonorrhoeae

Gelosa Sangre Humana

Enterobacterias Candida albicans

Gardnerella vaginalis

Streptococcus Staphylococcus

Identificacin bioqumica

Solucin salina isotnica

Observacin en fresco Trichomonas vaginalis

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PRACTICA 12 CULTIVO DE HERIDAS Uno de los fenmenos que se observan con ms frecuencia en las enfermedades infecciosas es la formacin de un exudado purulento a raz de la invasin bacteriana de una cavidad, tejido u rgano del cuerpo. Clnicamente puede ir desde un sencillo o inocuo grano hasta uno o varios abscesos con mltiples bolsas de pus. El exudado est constituido por microorganismos invasores, leucocitos, principalmente polimorfonucleares y una mezcla de humores orgnicos y fibrina. En algunos casos, el exudado puede recubrir la superficie del rgano, en otros, el exudado puede estar tabicado por capas de fibrina y una red de clulas tisulares (ntrax). Incluso hay casos en que el exudado proviene de una herida abierta, que por ello suelta lquido espeso o pus. Uno de los principales problemas de pacientes fracturados, quemados u operados que se encuentran en unidades hospitalarias son las infecciones que pueden adquirir en estos nosocomios. El principal problema de stas TOMA DE MUESTRA 1.- Lavar cuidadosamente la superficie de la herida. 2.- Recoger el pus mediante jeringa y aguja, aspirando preferentemente de zonas profundas. 3.- Cuando la muestra sea insuficiente, instilar suero o solucin de Ringer lactato y aspirarlo nuevamente en la jeringa. 4.- Cuando los procedimientos anteriores no sean factibles podr efectuarse un frotis de las partes profundas de la herida con un hisopo. NUMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN Para muestras lquidas se intentara obtener 1-10 cm. En el resto de las ocasiones se enviar la mxima cantidad posible. TRANSPORTE Y CONSERVACIN El envo al laboratorio debe ser inmediato. Se utilizar para el envo la misma jeringa de la extraccin 2, debidamente identificada si puede procesarse antes de 2 horas y si no usar medio de transporte. OBSERVACIONES Las muestras recibidas en hisopo son de escasa rentabilidad y deben obtenerse slo en circunstancias muy excepcionales, cuando no se pueda recoger la muestra por otros mtodos.

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EXANTEMAS TOMA DE MUESTRA 1.- Aspirar directamente con jeringa y aguja el contenido de las lesiones. Cuando no sea suficiente, colocar una pequea cantidad de suero salino estril y aspirarlo. NUMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN Se obtendr el mximo volumen de muestra. TRANSPORTE Y CONSERVACIN Igual que para lceras y abscesos. ABSCESOS CERRADOS TOMA DE MUESTRA 1.- Desinfectar la piel. Limpiar la zona con alcohol, de forma concntrica comenzando por el centro. Abarcar una zona de unos 10 cm. 2.- Repetir la operacin con povidona. En pacientes con hipersensibilidad al iodo, en lugar de povidona se utilizar alcohol dos veces consecutivas. 3.- Dejar secar al menos 1 minuto para que la povidona ejerza su accin antisptica. 4.- Realizar una puncin-aspiracin del absceso con jeringa y aguja. 5.- Introducir una pequea parte de la muestra en el medio de transporte para anaerobios. 6.- Desinfectar la superficie de goma del tapn con povidona e inyectar con la misma jeringa, parte de la muestra. No debern utilizarse nunca los medios que hayan adquirido una coloracin azul. 7.- Dejar el resto de la muestra en la jeringa y remitirla as, o bien, traspasarla a un contenedor estril. NUMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN Deber enviarse un volumen de muestra entre 1-5 mL. TRANSPORTE Y CONSERVACION Las muestras deben enviarse al laboratorio tan pronto como sea posible. Hasta que esto suceda, mantener las muestras y el medio de transporte a temperatura ambiente. OBSERVACIONES Es muy importante especificar en el volante de peticin la localizacin del absceso con vistas a la interpretacin de los resultados.

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FISTULAS TOMA DE MUESTRA 1.- Limpiar cuidadosamente la superficie cutnea con alcohol y luego con Povidona. Aspirar el exudado de la parte profunda de la fstula con jeringa y aguja. NUMERO DE MUESTRAS Y/O VOLUMEN El volumen ptimo para el cultivo es de 1-5 mL. TRANSPORTE Y CONSERVACION Enviar las muestras al laboratorio antes de 2 horas. OBSERVACIONES Este tipo de muestras son inadecuadas para la investigacin de anaerobios. Los trayectos fistulosos y sinusales suelen estar colonizados habitualmente por distintos microorganismos que no estn implicados en la patogenia de proceso, por lo que estas muestras habitualmente son poco rentables y hay que evaluar los resultados con precaucin. DIAGRAMA DE TRABAJO

Muestra

Tincin de Gram Agar Mac Conkey Agar Gelosa Sangre Agar Gelosa Chocolate Agar Sal y Manitol Agar Biggy

Pruebas de identificacin

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PRACTICA 13 DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES MENNGEAS (CULTIVO DE LCR) LQUIDO CEFALORRAQUIDEO Auque desde hace mucho tiempo daba por hecho que la funcin primordial del liquido cefalorraquideo (LCR) era la de proteccin del sistema nervioso central (SNC) y la regulacin de su volumen, en 1926 Cushing propuso la idea de que el LCR representaba la tercera circulacin. Desde entonces se ha confirmado y ampliado su proposicin. Cushing plantea que el LCR constituye por si mismo el medio interno del SNC, ya que lo provee de la matriz acuosa de los componentes exactamente necesarios para su adecuado funcionamiento, por otro lado, acta como linfa cerebral ya que su continua circulacin permite la remocin permanente de materiales nocivos y de desecho. An mas recientemente, se ha comprobado el papel que juega el LCR en el transporte a travs del encfalo a travs de diversas molculas activas como hormonas y aminas de accin neutral. Dentro de las patologas que mas comnmente se presentan a este nivel esta la meningitis, que es la inflamacin de las membranas que recubren el SNC, es decir, las delgadas membranas que cubren totalmente al cerebro y la mdula espinal y una de sus causas puede ser por infeccin, bsicamente debido a que los microorganismos responsables de esta forma clnica pueden alcanzar al SNC a travs de la va hematgena (bacteriemia o septicemia) o invadir directamente el cerebro (otitis, fracturas de crneo, etc.). El diagnstico del SNC se apoya en el examen integral del LCR en esta tarea, tanto el mdico como el qumico son responsables de la utilidad del examen. El mdico desde la toma de la muestra, la medicin de la presin intracerebral, entre otras y el qumico como realizador directo de los anlisis citoqumicos y microbiolgicos del LCR TOMA DE MUESTRA Se obtendr antes de instaurar cualquier teraputica antibitica. LCR obtenido por puncin lumbar: 1.- Se localiza la zona elegida para la puncin lumbar mediante palpacin de los espacios intervertebrales una vez colocado el paciente en la posicin adecuada. 2.- Se desinfecta con alcohol al 70% una zona de 10 cm de dimetro en el rea elegida, la aplicacin del desinfectante se hace de forma concntrica del centro a la periferia. Se repite la operacin con povidona yodada que se deja secar durante un minuto. 3.- Realizar la puncin entre los espacios intervertebrales L3-L4, LA-L5 o L5-S1, siguiendo las normas de la ms estricta asepsia. 4.- Al llegar al espacio subaracnoideo retirar el estilete y dejar salir libremente el lquido cefalorraqudeo que se recoger en tres tubos sin conservantes con tapn de rosca.

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Generalmente el primer tubo para el estudio bioqumico, el segundo para el estudio microbiolgico y el tercero para investigacin de clulas (este suele ser el ms transparente aunque la puncin haya sido traumtica). No obstante, el tubo ms turbio se enviar a Microbiologa. VOLUMEN MNIMO 1.- Para el estudio bacteriolgico rutinario es suficiente 1 mL, aunque es preferible disponer de volmenes superiores. 2.- Para hongos o micobacterias se necesitan al menos 2 mL adicionales ms por cada uno de los estudios, siendo deseable llegar a los 10 mL 3.- Para estudio de virus se necesita al menos 1 2 mL ms. TRANSPORTE El producto debe enviarse inmediatamente al laboratorio, pues alguno de los agentes etiolgicos como S. pneumoniae, pueden lisarse rpidamente a partir de una hora tras su recogida. Si no es posible se mantendr en estufa a 35-37C y una parte se incubar en un frasco de hemocultivo que se mantendr en idnticas condiciones hasta su procesamiento en el laboratorio. Si no se dispone de estufas se mantendr a temperatura ambiente. Nunca deber refrigerarse pues se puede afectar la viabilidad de N. meningitidis y H. influenzae. En el LCR no se estudian rutinariamente anaerobios. En caso de solicitar una investigacin se enviar en un medio de transporte de lquidos para estudio de anaerobios o en hemocultivo de anaerobios. Las muestras para el estudio de virus se enviarn en hielo, si el envo se retrasa ms de 24 horas, se deber de conservar a -70C. OBSERVACIONES Como la meningitis suele surgir por un proceso bactermico se solicitarn simultneamente hemocultivos, pudiendo ser as mismo estudiadas las posibles lesiones metastsicas cutneas. Es necesario que el mdico seale claramente las investigaciones solicitadas (bacterias habituales, micobacterias, anaerobios, hongos o virus).

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DIAGRAMA DE TRABAJO

LCR

Centrifugar 10-20 min. 1000-1500 r.p.m.

Sedimento

Tinciones

Agar Mac Conkey Agar Gelosa Sangre Agar Gelosa Chocolate Agar Sal y Manitol Agar Biggy Agar Lowestein-Jensen

Pruebas de identificacin

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PRACTICA 14 HEMOCULTIVO Y CULTIVO DE MDULA SEA El cultivo de sangre es uno de los estudios ms solicitados en el laboratorio clnico ya que de alguna manera apoya el diagnstico de las infecciones sistmicas que presentan en su evolucin una etapa de bacteriemia o septicemia. La presencia de microorganismos en la sangre refleja una infeccin activa y diseminada en los tejidos. Esta situacin puede originarse por: BACTERIEMIA: Es un trmino que denota la presencia de bacterias en sangre, este puede ser transitorio como un resultado de un fenmeno comn como por ejemplo el cepillarse los dientes, en la evolucin de algunas enfermedades, en infecciones de vas urinarias o en infecciones de heridas. La bacteriemia persistente o recurrente es la presencia continua de un microorganismo en la sangre e implica un fenmeno, que en algunas enfermedades da manifestaciones clnicas. SEPTICEMIA: Se caracteriza por la presencia de bacterias en sangre y tejidos acompaado por ataque al estado general, las bacterias se estn multiplicando en forma activa y liberando toxinas, originando manifestaciones clnicas de diversa magnitud (local o sistmica). PIEMIA: Formacin de diversos abscesos de tipo purulento de origen bacteriano. En pacientes comprometidos como son recin nacidos, personas de la tercera edad, as como inmunosuprimidos se pueden presentar focos spticos y poner en peligro su vida. Una de las caractersticas de este tipo de infecciones es la aparicin de un cuadro febril en el husped acompaado como consecuencia de la liberacin del pirgeno endgeno por los fagocitos, posterior a la ingestin de material txico, endotoxinas, productos de degradacin tisular, pirgeno exgeno. TOMA DE MUESTRA 1.-Retirar los tapones externos de los frascos. 2.-Desinfectar los tapones de goma con alcohol iodado o con iodforo, dejndolo secar al menos un minuto. 3.-Localizar por palpacin la vena que se va a puncionar. Debe utilizarse una vena distinta para cada extraccin. 4.-Desinfectar con alcohol una zona de piel de unos 10 cm de dimetro. Se comenzar por el centro y se irn haciendo crculos concntricos hacia el exterior. 5.- Repetir el paso anterior pero con el alcohol iodado, dejndolo secar durante un minuto.

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6.- Extraer la sangre sin tocar en ningn momento el campo desinfectado. Si fuera necesario palpar nuevamente la vena se utilizarn guantes de goma estriles o se desinfectarn los dedos de la misma manera que la piel del paciente. 7.- Introducir la sangre en los frascos evitando que entre aire en el frasco para cultivo en anaerobiosis. La ventilacin se realizar en el laboratorio de Microbiologa. Mover los frascos para que la sangre y el medio de cultivo se mezclen. Introducir los frascos a 37C. VOLUMEN DE LA MUESTRA La cantidad de sangre a introducir en cada frasco viene determinada por el modelo utilizado en cada hospital, entre 15-20 mL por toma en adultos y 1-3 mL en nios. Como norma general es adecuado que la sangre mantenga una proporcin 1:10 con el medio de cultivo. Es decir, para un frasco de 100 mL, introducir 10 mL de sangre. En caso de neonatos y nios pequeos en que no se pueden obtener volmenes grandes de sangre es suficiente una cantidad de 1-5 mL, que se introduce en un solo frasco. NMERO DE MUESTRAS Tres hemocultivos por paciente, previos al tratamiento antimicrobiano. El intervalo entre las extracciones debe ser superior a una hora cuando sea posible, pero cuando exista una gran urgencia en iniciar el tratamiento, este intervalo puede acortarse hasta 15 minutos. En caso de sepsis y endocarditis subaguda las extracciones se reparten en 24 horas y en caso de que sean los hemocultivos negativos, obtener tres muestras ms al da siguiente. TRANSPORTE Deben enviarse al laboratorio. Hasta su envo mantener a 35-37C; cuando esto no sea posible, mantener a temperatura ambiente. Nunca debe refrigerarse ni congelarse. OBSERVACIONES Cuando no haya venas accesibles puede realizarse la extraccin de sangre arterial. No son adecuadas las muestras procedentes de catter, solamente en caso de que se sospeche infeccin del propio catter y se complica su retirada; se recomienda tomas del brazo opuesto y otras del brazo del catter, para saber si es intra o extraluminal.

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DIAGRAMA DE TRABAJO

Sangre

Medio Bifsico Ruiz Castaeda

Tincin de Gram

Agar Mac Conkey Agar Gelosa Sangre Agar Gelosa Chocolate Agar Sal y Manitol Agar Biggy Agar Lowestein-Jensen

Pruebas de identificacin

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PRACTICA 15 CULTIVO DE CATETERES, SONDAS, ETC.

En las infecciones sistmicas relacionadas con el catter de origen cierto una de las siguientes debe estar presente: Crecimiento del mismo microorganismo por mtodo semicuantitativo (>15 UFC) o cuantitativo (>1000 UFC) del cultivo de la punta de catter, y en sangre perifrica. El crecimiento del microorganismo por metodo cuantitativo ha de tener un cociente mayor de 5:1 entre cultivo de catter y sangre perifrica. La positivdad del cultivo entre cultico de catter y sangre perifrica es mayor de 2 horas. El cultivo del material purulento del trayecto de entrada del catter aisla el mismo microorganismo que el encontrado en sangre. Para el diagnstico de infeccin sistmica probable relacionada con el catter debe cumplirse al menos uno de los siguientes: Signos de sepsis clnica que se resuelve tras 48 h. de retirada de catter sin otros cambios en la antibioterapia. Signos clnicos de sepsis con 2 hemocultivos positivos a flora comensal de la piel. Para el diagnstico de infeccin sistmica posible relacionada con el catter debe cumplirse al menos uno de los siguientes: Signos de sepsis clnica que se resuelve tras retirada de catter y modificar la antibioterapia. Signos clnicos de sepsis con 1 hemocultivos positivos a flora comensal de la piel. Las infecciones relacionadas con catter en las Unidades de Cuidados Intensivos Peditricos tienen una incidencia doble de la comunicada en las UCI de adultos, que tienen una incidencia prxima al 3 por mil das de catter. Los criterios utilizados para definir la infeccin de catter en nios son una aplicacin de los criterios que se utilizan para adultos; sin embargo, existen diferencias en el mantenimiento de una va central en nios o adultos. En primer lugar, el acceso a una va central en nios es mas difcil que en adultos, razn por la que ante sospecha de infeccin de catter en nios no esta indicado de entrada retirar el catter con fines diagnsticos si prevemos que vamos a seguir necesitando una va central, los intentos de cambio de catter se asocian con alta morbilidad. Adems la sensibilidad de los hemocultivos en edad peditrica es menor que la encontrada en adultos, en concreto pasa de un 92 a 69%, la razn estriba en el menor volumen de sangre con que se realizan. Todas estas razones han llevado a redefinir los criterios diagnsticos de infeccin por catter en edad peditrica: Infeccin local: o Colonizacin del catter (criterio microbiolgico).

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o Crecimiento de un microorganismo por mtodo semicuantitativo (>15 UFC) o cuantitativo (>1000 UFC) del cultivo de la punta de catter, segmento subcutneo del trayecto del catter. Infeccin del punto de inoculacin: o Eritema o induracin dentro de los 2 cm del punto de inoculacin, en ausencia de infeccin sangunea y abscesos concomitantes. Infeccin del trayecto de entrada: o Eritema e induracin mayor de 2 cm, absceso concomitante en ausencia de infeccin sangunea. Infeccin de los puntos de fijaccin de catter. Infeccin sistmica: o Relacionada con la infusin. o Relacionada con el catter.

TOMA DE MUESTRA Infeccin local: o Colonizacin del catter (criterio microbiolgico). o Crecimiento de un microorganismo por mtodo semicuantitativo (>15 UFC) o cuantitativo (>1000 UFC) del cultivo de la punta de catter, segmento subcutneo del trayecto del catter. Infeccin del punto de inoculacin: o Eritema o induracin dentro de los 2 cm del punto de inoculacin, en ausencia de infeccin sangunea y abscesos concomitantes. Infeccin del trayecto de entrada: o Eritema e induracin mayor de 2 cm, absceso concomitante en ausencia de infeccin sangunea. Infeccin de los puntos de fijaccin de catter. Infeccin sistmica: o Relacionada con la infusin. o Relacionada con el catter.

TRANSPORTE Y CONSERVACIN El envo al laboratorio debe ser inmediato. Se utilizar para el envo la misma jeringa de la extraccin 2, debidamente identificada si puede procesarse antes de 2 horas y si no usar medio de transporte.

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OBSERVACIONES Las muestras recibidas en hisopo son de escasa rentabilidad y deben obtenerse slo en circunstancias muy excepcionales, cuando no se pueda recoger la muestra por otros mtodos.

TRANSPORTE Y CONSERVACION Las muestras deben enviarse al laboratorio tan pronto como sea posible. Hasta que esto suceda, mantener las muestras y el medio de transporte a temperatura ambiente. OBSERVACIONES Es muy importante especificar en el volante de peticin la localizacin del absceso con vistas a la interpretacin de los resultados.

DIAGRAMA DE TRABAJO

Muestra

Tincin de Gram Agar Mac Conkey Agar Gelosa Sangre Agar Gelosa Chocolate Agar Sal y Manitol Agar Biggy

Pruebas de identificacin 42

PRACTICA 16 LECTURA DE BAAR PARA SU INTERPRETACION Y REPORTE OBJETIVOS 1. El alumno conocer el procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras a partir de un paciente con sospecha clnica de tuberculosis. 2. Realizar la tcnica de Ziehl-Neelsen a un frotis con micobacterias que se le proporcione. 3. Identificar los bacilos alcohol cido resistentes (BAAR) e interpretar los resultados de la baciloscopa. INTRODUCCION La tuberculosis es un serio problema de Salud Pblica Mundial, la OMS ha estimado que un tercio de la poblacin mundial esta infectada por Mycobacterium tuberculosis y ha calculado que 5 a 10% de los individuos infectados podran desarrollar la enfermedad. El gnero Mycobacterium incluye mas de 54 especies de micobacterias que se caracterizan por ser bacilos ligeramente curvos o rectos de 0.2-0.6 X 1.0 -10 m, aerobios, alcohol cido resistentes (BARR), no mviles, que presentan un alto contenido de lpidos y cidos grasos en su envoltura celular. El gnero incluye especies patgenas primarias como el complejo M. tuberculosis (M. tuberculosis, M. bovis, M. africanum) y M. leprae, as como patgenos oportunistas como el complejo M. avium (M. avium, M. intracellulare), M. fortuitum, M. kansasii, M. escrofulaceum, marinum, M. ulcerans, y especies que raramente se asocian con dao en el humano como M. triviale, M. gordonae, M. chelonae entre otras micobacterias. La tuberculosis es una enfermedad infecto-contagiosa causada principalmente por M. tuberculosis, bacilo caracterizado por ser un parsito obligado del hombre, intracelular facultativo; que se trasmite con mayor frecuencia de persona a persona a travs de la inhalacin de aerosoles que contienen al patgeno. La patognesis de la tuberculosis es compleja, en general del resultado final de la interaccin hospedero-parsito que se establezca resultar en el dao al hospedero, la destruccin del bacilo, o su estado de latencia. El diagnstico definitivo de la tuberculosis pulmonar o extrapulmonar (Renal, meningea, pleural etc.) se establece a travs del aislamiento en cultivo e identificacin bioqumica de M. tuberculosis a partir de muestras clnicas representativas del sitio afectado por la enfermedad. La tincin de Zielh-Neelsen o Kinyoun para la bsqueda de bacilos alcohol cido resistentes (BAAR) es un mtodo rpido, simple y econmico, sin embargo tiene una baja sensibilidad, adems de que establece un diagnstico presuntivo de la tuberculosis, debido a que solo permite observar una caracterstica de las micobacterias de ser bacilos alcohol cido resistentes, caracterstica que no es exclusiva del gnero Mycobacterium. 43

OBTENCION DE MUESTRAS La tuberculosis pulmonar es la presentacin clnica ms frecuente de tuberculosis y la muestra representativa es la expectoracin, la cual deber obtenerse por las maanas, en un nmero de 3 a 5 muestras y volumen de 5 a 10 ml. Debido a que esta muestra proviene de un sitio no estril deber ser descontaminada y mucolizada para su procesamiento, el mtodo mas utilizado para llevar a cabo este proceso se realiza mediante NaOH al 4% y N-Acetil-L-Cisteina. Despus de la concentracin de la muestra a 3000 rpm X 30 minutos y su neutralizacin con amortiguador de fosfatos pH 6.8 o albmina al 0.05%. Se inocular 0.1 ml del sedimento al cultivo de Lowenstein-Jensen y se realizar el frotis para su tincin por Ziehl-Neelsen, Kinyoun o auramina fluorocromo. La tincin directa a partir de la muestra de expectoracin es posible sobre todo en pacientes clnicamente sospechosos con tuberculosis pulmonar. Los mtodos ms frecuentes para la obtencin de la muestra de expectoracin (esputo) se sealan a continuacin: 1.- Expectoracin espontnea 2.-Lavado bronquial 3.-Lavado gstrico La tuberculosis genitourinaria es una forma clnica tarda de la tuberculosis, generalmente asintomtica, el diagnstico bacteriolgico se realiza mediante la tincin y cultivo de M. tuberculosis en orina, sin embargo esto representa serias dificultades debido al escaso nmero de bacilos presentes. La muestra de orina deber obtenerse previa asepsia, por el mtodo de medio chorro de toda la orina de la maana, con un mnimo de 40 ml de volumen, el nmero de muestras estudiadas ser de 3 a 6 y su procesamiento deber hacerse de inmediato a travs de la concentracin de la orina a 3000 rpm X 30 minutos, su descontaminacin con NaOH al 4% y neutralizacin con amortiguador de fosfatos pH 6.8 o bien albmina al 0.05%, para finalmente inocular 0.1 ml del sedimento al cultivo de Lowenstein-Jensen y elaborar un frotis para la tincin. MATERIAL PARA LA PRCTICA Frotis con BAAR y Escherichia coli Colorantes para tincin de Ziehl-Neelsen Mechero de alcohol Microscopio Papel seda Aceite de inmersin Cultivos de Lowentein-Jensen con cepa de M. tuberculosis y otras especies.

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ACTIVIDAD PRCTICA A. El profesor explicar el procedimiento para la toma de muestras, considerando expectoracin y orina, as mismo su manejo, transporte y el proceso de la muestra para la baciloscopa y cultivo. PARA OBTENER LA MUESTRA 1. Use un envase estril de plstico y boca ancha con tapa de rosca, transparente, fcilmente rotulable y desechable 2. Etiquetar el envase con el nombre del paciente, tipo de muestra, fecha y hora de coleccin, adems del nmero de registro del paciente. 3. Obtener la muestra de preferencia antes de iniciar el tratamiento antfimico. 4. Obtener una muestra representativa y suficiente. 5. No usar fijadores o sustancias preservativas y transportar de inmediato la muestra para su procesamiento (Refrigerar la muestra s es necesario a 4 OC) NOTA: La orina deber ser procesada inmediatamente, debido a su rpida contaminacin. B. A partir del frotis proporcionado realice la tincin de Zielh-Neelsen: 1. Coloque el frotis sobre las varillas. 2. Cbralo con fuscina fenicada por 5 a 10 minutos, con el mechero de alcohol flamee por abajo de la laminilla hasta la emisin de vapor, evite que la fuscina hierva y agregue ms colorante si se consume por la vaporizacin. 3. Lavar la superficie del frotis con agua. 4. Decolorar el frotis con alcohol cido por 1 minuto. 5. Lavar la superficie del frotis con agua. 6. Cubra el frotis con azul de metileno por 1 minuto. 7. Lavar con agua y secar. 8. Observar al microscopio con objetivo 100 x (inmersin). 9. Identificar los bacilos alcohol cido resistentes (BAAR) que se observan de color tinto.

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METODO PARA REPORTAR EL NUMERO DE BACILOS ALCOHOL ACIDO RESISTENTES (BAAR) OBSERVADOS EN LA TINCION No. DE BACILOS OBSERVADOS: REPORTE No se observaron BAAR en 300 campos Negativo (-) De 1 a 2 bacilos en 300 campos dudoso (repetir) De 1 a 9 bacilos por campo en promedio en 100 campos observados Positivo (+) De 1 a 9 bacilos por campo en promedio de 10 campos observados Positivo (2 +) De 1 a 9 bacilos en promedio por campo Positivo (3+) Mas de 9 bacilos en promedio por campo Positivo (4 +)
Am Rev Respir Dis 1981;123:343-358.

C. A partir del cultivo de Lowenstein-Jensen con crecimiento de colonias de M. tuberculosis, observar las caractersticas de las colonias. IDENTIFICACION DE ALGUNAS ESPECIES DEL GENERO Mycobacterium DE IMPORTANCIA MEDICA Crecimi Te Morfol Pigmenta Niaci Reduc Catal Urea Especie ento mp oga cin na cin asa sa erat colonia Nitrato 68C ura l s optima Lento 37C Rugosa + + M. tuberculosi s Lento 37C Rugosa V Fina M. bovis Lento 37C Lisa + + + + M. Kansasii Lento 37C Lisa V M. avium fina Rugosa

RESULTADOS DE LA PRCTICA 1.- Seale el nmero de muestras necesarias de expectoracin para el diagnstico de tuberculosis pulmonar.

3.-Explique el fundamento de la tincin de Zielh-Neelsen y las caractersticas de los BAAR observados en la laminilla analizada. 46