DISTRIBUCIN DE LA INFECCIN POR Streptococcus iniae EN DIFERENTES RGANOS DE TILAPIA ROJA (Oreochromis sp) Y TILAPIA NILOTICA (Oreochromis niloticus)

DIAGNOSTICADO POR PCR EN TIEMPO REAL

FRANK BARREIRO SANCHEZ CODIGO: 2005104481

DIRECTOR: HENRY OSTOS ALFONSO, M.D. MSc. Gentica

UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES PROGRAMA DE TECNOLOGIA EN ACUICULTURA CONTINENTAL NEIVA HUILA 2012

DISTRIBUCIN DE LA INFECCIN POR Streptococcus iniae EN DIFERENTES RGANOS DE TILAPIA ROJA (Oreochromis sp) Y TILAPIA NILOTICA (Oreochromis niloticus) DIAGNOSTICADO POR PCR EN TIEMPO REAL

TRABAJO DE GRADO REALIZADO COMO REQUISITO PARA OPTAR POR EL TTULO DE TECNLOGO EN ACUICULTURA CONTINENTAL

FRANK BARREIRO SANCHEZ CODIGO: 2005104481

DIRECTOR: HENRY OSTOS ALFONSO, M.D. M.Sc. Gentica

UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES PROGRAMA DE TECNOLOGIA EN ACUICULTURA CONTINENTAL NEIVA HUILA 2012

NOTA DE ACEPTACIN

_______________________________________ _______________________________________ _______________________________________

________________________________________ JURADO

________________________________________ JURADO ________________________________________ DIRECTOR ________________________________________ COORDINADOR

DEDICATORIA

A: Dios, por darme la oportunidad de vivir y por estar conmigo en cada paso que doy, por fortalecer mi corazn e iluminar mi mente y por haber puesto en mi camino a aquellas personas que han sido mi soporte y compaa durante todo el periodo de estudio . Mi madre Mara Gladys Snchez, por darme la vida, quererme mucho, creer en m y porque siempre me apoyaste. Mam gracias por darme una carrera para mi futuro, todo esto te lo debo a ti . Mi Padre Farith Barreiro, Por los ejemplos de perseverancia y constancia que lo caracterizan y que me ha infundado siempre, por el valor mostrado para salir adelante y por su amor . Mis hermanos, Farith Alfredo y Albeiro, por estar conmigo y apoyarme siempre, los quiero mucho . Mi director de tesis, Henry Ostos Alfonso, por su gran apoyo, motivacin y exigencia para la culminacin de esta etapa de estudios.

AGRADECIMIENTOS

A la Universidad Surcolombiana por haberme admitido como un hijo ms de su alma mater.

Agradecimiento especial:

A James Betancur Lpez, Zootecnista, por sus asesoras, recomendaciones durante el desarrollo del presente trabajo.

A Juan Carlos Quintero, Mdico Veterinario y Zootecnista, por sus recomendaciones

A Dolly Lucia Salgado,por su colaboracin,apoyo administrativo y por su amistad.

A Andrea Garrido, Auxiliar del Laboratorio de Medicina genmica, por su colaboracin y disponibilidad con los materiales del laboratorio.

INDICE DE CONTENIDO Introduccin......9 1. Marco Terico.....13 1.1. La estreptococosis en peces........13 1.2. Caractersticas de cultivo de la bacteria.....16 1.3. Diagnostico..18 1.4. Salud pblica...19 1.5. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR).....20 1.6. PCR en tiempo real.....24 2. Formulacin del Problema y Justificacin.25 3. Objetivos...28 3.1. Objetivos general.....28 3.2. Objetivos especficos ......28 4. Metodologa......29 4.1. Muestras y controles .......29 4.2. Extraccin de DNA, a partir de tejidos.......29 4.3. Protocolo de PCR en tiempo real...30 4.4. Examen de histopatologa.......33 4.5. Anlisis estadstico...33 5. Resultados....34 5.1. Extraccin de DNA a partir de muestras congeladas ....34 5.2. Resultados de la PCR en tiempo real.......36 5.3. Sensibilidad de la PCR en tiempo real.....38 5.4. Especificidad de la PCR en tiempo real...39 5.5. Histopatologa....40 6. Discusin ..42 7. Conclusiones....43

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Tabla 2. Tabla 3 Tabla 4. Tabla 5. Tabla 6. Tabla 8.

Pruebas de identificacin de Streptococcus spp aislados en peces Primers utilizados para el diagnstico de Streptococcus iniae por PCR en tiempo real Reactivos a utilizar y su cantidad de volumen para la PCR en tiempo real Cantidad de DNA obtenido a partir de la las muestras rganos positivos para la infeccin Streptococcus iniae Hallazgos histopatolgicos en diferentes rganos de individuos diagnosticados positivos para Streptococcus iniae por PCR en tiempo real Cronograma

18 31 31 34 36 40 38

INDICE DE FIGURAS

Numeracin Figura 1 Figura 2 Figura 3

Figura 4 Figura 5 Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 Figura 11 Figura 12

Figura 13

Figura 14

Descripcin de la figura Amplificacin exponencial a partir de un fragmento de ADN molde tras una serie de ciclos de PCR (Adaptado de Andy Vierstraete, 2001) Esquema del procedimiento de la PCR Esquema de desarrollo PCR en tiempo real (empleando sistema taqman). Tomado de: AbsoluteQuantificationstarted Guide. AplieddBiosystems. rea de extraccin de DNA rea de PCR NanoDrop 2000 VortexMixer Resultado de la PCR tiempo real para el individuo 130 (izquierda), individuo 628 (derecha) Distribucin de infeccin por rgano Sensibilidad de la PCR Tiempo Real. Especificidad de la PCR Tiempo Real. Moderados a severos focos de epicarditis granulomatosa y leve presencia de bacterias tipo coco en miocardio y endocardio 2X (izquierda). Moderado foco de epicarditis necrtica 10X (derecha). Severa acumulacin de bacterias tipo coco focalizada en encfalo y meningitis extensa multifocal. 40X (izquierda). Moderado a severo foco de meningitis fibrinohemorrgica con leve presencia de bacterias tipo coco en el citoplasma de macrfagos 10X (derecha). Moderado foco de hepatitis con presencia de bacterias tipo coco intracelulares. Moderados focos de activacin de CMM en hepatopncreas 40X (izquierda). Severo foco de necrosis e inflamacin en hepatopncreas con presencia de bacterias tipo coco intra y extracitoplasmticas en clulas tipo macrfagos, leve a moderados focos de infiltrado mononuclear perivascular, leve presencia de vacuolas que desplazan el ncleo de los hepatocitos 10X (derecha)

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25 32 32 35 36 37 37 38 39

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INTRODUCCIN

La acuicultura sigue siendo un sector productivo de alimentos ricos en protenas creciente, vigoroso e importante, segn la informacin proporcionada por la FAO, la produccin acucola mundial de pescado comestible, incluidos los peces de aleta, los crustceos, los moluscos y otros animales acuticos destinados al consumo, alcanz los 52,5 millones de toneladas en el ao 2008. (FAO 2010). La contribucin de la acuicultura a la produccin total de la pesca de captura continu aumentando y pas del 34,5 % en 2006 al 36,9 % en 2008. En el perodo 1970-2008 la produccin acucola de pescado comestible aument a un ritmo anual medio del 8,3 %, mientras que la poblacin mundial aument en promedio un 1,6 % anual. (FAO 2010). El resultado combinado del desarrollo de la acuicultura en todo el mundo y la expansin de la poblacin mundial es que el suministro per cpita medio anual de pescado comestible procedente de la acuicultura para el consumo se multiplic por diez y pas de 0,7 kg en 1970 a 7,8 kg en 2008, lo que supone un incremento medio del 6,6 % anual. (FAO, 2010)

La produccin acucola se destina principalmente al consumo. En 2008 la acuicultura gener el 45,7 % de la produccin mundial de pescado comestible destinado al consumo, cifra superior al 42,6 % correspondiente a 2006. (FAO, 2010). En China, el mayor productor acucola del mundo, el 80,2 % del pescado comestible consumido en 2008 procedi de la acuicultura, cifra superior al 23,6 % correspondiente a 1970. La produccin acucola suministr al resto del mundo el 26,7 % de su pescado comestible, cifra superior al 4,8 % correspondiente a 1970. (FAO, 2010)

La acuicultura Colombiana en mayor parte es la piscicultura; lo primero que hay que resaltar sobre el desarrollo de la piscicultura nacional es que, si bien es cierto que se trabaja con varias especies nativas, la mayor parte de su produccin est concentrada en dos especies exticas que son la tilapia y la trucha, siendo la primera la que muestra una mayor dinmica en produccin y participacin en el mercado. La especie nativa con mayor participacin es la cachama, seguida muy de lejos por el bocachico. (FAO INCODER, 2011).

En primer lugar, a pesar de la gran participacin del sistema productivo de estanques en la superficie total, slo genera el 65.48 % en el volumen total de produccin, mientras que el sistema de jaulas, con menos del 2 % del espejo de agua genera el 34.52 % de la produccin, en segundo lugar, la tilapia representa el 73.72 % del total de la produccin, mientras que la cachama, que es el segundo nivel llega al 11.5 %, la trucha el 2.86 % y las otras especies slo el 3.4 %. La participacin del Huila en el total de la produccin es del 44.47 %, seguido por el Meta con el 15.11 %; todos los dems departamentos tienen producciones muy inferiores al Huila y Meta. (FAO INCODER, 2011).

La estreptococosis es una enfermedad originada por un grupo de cocos Gram (+) que inducen una signologa clnica bastante caracterstica que involucra muchos rganos del pez. Hasta el momento los cocos Gram (+) que se han publicado como agentes patgenos para los peces incluyen: Streptococcus sp., Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus milleri, Streptococcus iniae, Streptococcus ictaluri,

Streptococcus parauberis, Enterococcus sp., Enterococcus seriolicida, Lactococcus sp., Lactococcus garviae, Lactococcus piscium, Vagococcus sp., Vagococcus salmoninarum, Carnobacterium pisccola. (Prieta et al.,
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1993; Eldar et al., 1994; Toranzo et al., 1994; Domenech., 1996; Michel et al., 1997, Mata et al., 2004, Yang and Li, 2009, Jimenez A. P. 2010).

Streptococcus iniae y otras especies de estreptococos se han descrito en numerosos brotes de la enfermedad en varias especies de peces como la tilapia. (Hernndez E, Figueroa J, and Iregui C. 2009.) Streptococcus iniae es el principal agente causal de la estreptococosis en todo el mundo de peces silvestres y de granja. Originalmente aislado de abscesos subcutneos sobre delfines de agua dulce del Amazonas (Pier y Madin, 1976), este patgeno se ha asociado a brotes de enfermedades en diferentes especies de peces de agua dulce y salada comerciales, tales como la trucha arco iris, la tilapia, el bagre rayado, la dorada o la lubina (Zlotkin et al., 1998; Shoemaker et al., 2001; Colorni et al., 2002), con tasas de mortalidad entre el 30 y el 50% de los peces afectados (Eldar et al, 1995b).

Las tcnicas de biologa molecular, tales como la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), son ms precisas y exactas para la identificacin de bacterias a nivel de especie. Estas tcnicas se han utilizado cada vez ms para detectar e identificar muchos patgenos bacterianos. Varias tcnicas moleculares han sido desarrollados para complementar los protocolos de diagnstico y taxonmicos del Streptococcusiniae, hacindolo ms rpido, sensible, exacto y especfico. Los ensayos de PCR se han utilizado con xito para identificar Streptococcus iniae por la amplificacin de los genes 16S rRNA (Zlotkin et al., 1998), la chaperonina HSP60 (Goh et al., 1998), el 16S23S rRNA gen de la regin espaciadora intergnica (Berridge et al., 1998), y el gen de la lactato oxidasa (LCTO) (Mata et al., 2004).

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En la realizacin de este trabajo se emple la PCR en tiempo real, para identificar la distribucin de la infeccin por Streptococcus iniae en cerebro, corazn e hgado de tilapia roja (Oreochromissp) y tilapia nilotica (Oreochromisniloticus) adems se observ el dao histopatolgico por rgano.

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1. MARCO TERICO

1.1. LA ESTREPTOCOCOSIS EN PECES

El patgeno Streptococcusi niae en peces (Pier, G.B., Madin, S.H., 1976) es endmica en varias partes del mundo, incluido Israel (Eldar, A., S. Lawhon, P. F. Frelier, L. Assenta, B. R. Simpson, P. W. Varner, and H. Bercovier. 1997.) y Amrica del Norte (Perera, R. P., S. K. Johnson, M. D. Collins, and D. H. Lewis. 1995.) la infeccin por Streptococcus iniae en la trucha arco iris (Oncorhynchusmykiss) produce una enfermedad que afecta sustancialmente el cerebro, con slo pequeas alteraciones patolgicas en otros rganos (Eldar A y Ghittino C. 1999). Recientemente el Streptococcus iniae se ha aislado de los seres humanos enfermos que sufren de celulitis, meningitis o bacteriemia lo que indica una amenaza para la salud pblica. (GiladBachrach, Amir Zlotkin, AvshalomHurvitz, Donald L.Evans and AviEldar. 2001). El Streptococcusiniae fue inicialmente aislado en 1976 en delfines amaznicos de agua dulce (Iniaegeoffrensis) que habitaban en el acuario de San Francisco y Nueva York (Pier y Madin, 1976 y 1978). Estos animales presentaban lesiones cutneas superficiales. En los aos ochenta, se aisl una nueva especie del estreptococo, considerado el agente etiolgico de meningoencefalitis agudas que afectaban a tilapias de cultivo en Israel, Taiwn y los Estados Unidos (Eldaret al, 1994 y 1995a), causando una alta tasa de mortalidad entre los animales. (Romano. LA., Meja J. 2003.).

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En principio a este patgeno se lo denomin Streptococcus shiloi, posteriormente, las caractersticas fenotpicas y genotpicas demostraron que se trataba del Streptococcus iniae (Eldar y et al, 1995b).

La

primera

infeccin

por

Streptococcus

en

el

hbrido

de

tilapia

(Oreochromisniloticus x O. aureus) fue en Arabia Saudita y se reporta en 1994 (Al-Harbi, 1994). Desde entonces, la infeccin se ha propagado rpidamente por todo el pas, causando una mortalidad considerable en las poblaciones de tilapia, con efecto econmico significativo. (Al-Harbi, Ahmed H., 2010). Un estudio demuestra que la prevalencia de Streptococcus iniae en establecimientos productores de tilapias en Estados Unidos de Norteamrica es realmente preocupante. El Streptococcus iniae se aisl en 3,81 % de las tilapias nilticas estudiadas y en el 7,23 % de su hbrido denominado vulgarmente tilapia roja. En cuanto a los establecimientos evaluados entre el 21,6 % y el 27,4 % presentaban algn animal infectado por Streptococcus iniae. Se observaron variaciones entre animales de diferentes edades tanto en tilapia niltica como en tilapia roja. En tilapia niltica se hall una menor prevalencia bacteriana en animales de peso comercial y alevinos con el 1,67 % y 0,88 % respectivamente y la mayor incidencia se observ en peces en fase de engorde (7,96 %). Algo similar sucedi con la tilapia roja, donde se encontr una menor prevalencia bacteriana en animales de peso comercial y alevinos con el 3,12 % y 2,12 % respectivamente y la mayor incidencia se observ tambin en peces en fase de engorde (9,56 %) (Shoemaker y cols, 2001). Clnicamente se evidencia que los animales infectados dejan de alimentarse, se observan letrgicos y adelgazados. Macroscpicamente se encuentran frecuentemente con endoftalmos, aunque ocasionalmente, puede observarse
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exoftalmos cuando la septicemia genera una panoftalmitis aguda. (Romano. LA., Meja J. 2003.). Las hemorragias cutneas difusas o petequiales son frecuentes y si bien se observan en todo el cuerpo, prevalecen en la regin ceflica y caudal. En el abdomen se suele observar una ascitis con lquido que vara entre cetrino y hemorrgico. Con cierta frecuencia se observa una esplenomegalia y el hgado se observa friable. En la cavidad craneal se puede ver la congestin difusa cerebral con lquido cefalorraqudeo hemorrgico (Romano. LA., Meja J. 2003). El anlisis histolgico muestra un caracterstico cuadro septicmico con una marcada infiltracin celular inflamatoria y numerosos cocos en la mayora de los tejidos examinados. Predomina un cuadro menigoenceflico con dilatacin de capilares menngeos, extravasacin de eritrocitos y densos infiltrados inflamatorios con predominio de granulocitos y macrfagos aunque tambin se observan linfocitos. Con tcnicas de impregnacin argntica se pueden ver abundantes cocos en el parnquima enceflico. En el hgado se observa una hepatitis focal intrasptica con focos de necrosis hepatocelular e infiltrados inflamatorios. En algunos casos se puede observar una periarteritis heptica. En el bazo se observa disgregacin de melanomacrfagos y presencia de cocos en los sinusoides esplnicos. La miocarditis y la pericarditis suele ser un hallazgo frecuente. Algunos autores describen oftalmitis, presencia de granulomas menngeos y focos inflamatorios renales (Perera et al, 1998). El en pez oscar (Astronotusocellatus), hemorrgica, con seriola y

Streptococcus

iniae

(Seriolaquinqueradiata), anguila (Anguilla japonica) y corvinn ocelado (Sciaenopsocellatus) provoca septicemia ascitis trombosis difusa en vasos sanguneos (Kusuda y cols., 1993; Eldar y cols., 1999; Tukmechi y cols., 2009). En tilapia provoca un cuadro septicmico con una marcada infiltracin celular
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inflamatoria,

de

predominio

meningoenceflico con dilatacin de capilares menngeos, extravasacin de

eritrocitos y densos infiltrados inflamatorios con predominio de granulocitos, macrfagos y linfocitos (Romano y Meja, 2003). En la trucha arcoris (Oncorhynchusmykiss), el Streptococcus iniae provoca formacin de abscesos en el interior de los msculos abdominales con necrosis por coagulacin, as como proliferacin de clulas mucosas y espongiosis en piel, tejido ocular con hiperemia, hemorragias retinianas, inflamacin en el vtreo y hemorragias en la cmara posterior del ojo, as como glomerulonefritis, edema y descamacin de la mucosa intestinal, y necrosis focal heptica con hiperemia e infiltracin linfocitaria (Akhlaghil y Mahjor, 2004). En otro estudio con trucha arcoris, Eldar y Ghittino (1999) describen meningitis aguda, panoftalmitis con destruccin de la cmara anterior del globo ocular y afectacin del nervio ptico, pero en cambio, describen un tejido renal sin lesiones, que s se describe en el estudio de Akhlaghil y Mahjor (2004) tambin con trucha arcoris. (Aamri F. 2010.)

1.2. CARACTERSTICAS DE CULTIVO DE LA BACTERIA

Los medios de cultivo usualmente empleados para el aislamiento de estas bacterias deben ser suplementados con sangre ovina desfibrinada al 5%; dentro de estos se pueden mencionar: agar tripticasa soya (TSA) (Perera et al., 1995; Baya et al., 1996; Cheng and Chen, 1998), agar triptona sangre (BTA) (Bragg and Broere, 1986; Ceschia et al., 1992), y agar infusin cerebro corazn (BHI) (Prieta et al., 1993; Nieto et al., 1995; Yuasa et al., 1999).

En general, se obtiene el crecimiento de colonias pequeas (0.5-1.5 mm), blancas opacas, viscosas, redondeadas y con un borde liso (Plumb et al.,
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1974; Boomker et al., 1979; Bragg and Broere, 1986; Ceschia et al., 1992; Prieta et al., 1993; Perera et al., 1995; Yuasa et al., 1999). La alta viscosidad comnmente observada de estas colonias ha sido asociada a la presencia de una cpsula muy prominente (Yoshida et al., 1996).

Adicionalmente, se han desarrollado medios de cultivo selectivos para estas bacterias. (Kitao et al., 1993) usaron caldo tioglicolato suplementado con azida de sodio (0.025%) para el aislamiento de Enterococcus seriolicida de agua marina y fangos alrededor de las explotaciones de yellowtail. (Jimenez A. P. 2010).

Por medio de la coloracin de Gram suelen observarse como cocos de 0.60.8 m solos o en cadenas cortas como en el caso de los Streptococcus iniae y Streptococcus agalactiae (Kitao, 1993; Perera et al., 1994), como cocobacilos, especialmente el L. garviae y S. parauberis (Boomker et al., 1979; Bragg and Breore, 1986; Prieta et al., 1993; Domnech et al., 1996) o como clulas ovoides (1.4 x 0.7m) en el caso de los Enterococcus sp. Y Vagococcus sp. (Carson et al., 1993; Michel et al., 1997).

En general no son motiles, no esporulados, anaerobios facultativos, no producen catalasa, cido sulfhdrico, indol, ornitina ni oxidasa, producen cido lctico a partir de carbohidratos y no suelen reaccionar con los grupos de antgenos Lancefield (Austin and Austin, 1985; Hardie, 1986).

La tabla 1 muestra las principales caractersticas de identificacin de algunas de las especies de estreptococos aislados de peces.
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1.3. DIAGNOSTICO

El

diagnstico

presuntivo

de

la

estreptococosis

se

basa

fundamentalmente en la presencia de los signos clnicos y el aislamiento de cocos Gram(+) de rganos internos. Una vez se obtiene el crecimiento de colonias puras en los diferentes medios de cultivo, es necesaria una confirmacin ms precisa mediante pruebas fisiolgicas y bioqumicas (Kitao, 1993; Shoemaker and Klesius, 1997).

Tcnicas de inmunohistoqumica han sido utilizadas exitosamente para la identificacin de Streptococcus sp. en trucha arco iris, Tilapia y Yellowtail es una especie de pez de agua salada, la inmunohistoqumica como la inmunoperoxidasa indirecta ha mostrado una mayor sensibilidad en
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comparacin con el aislamiento microbiolgico (Bragg, 1988; Hernndez, 2009). Recientemente, se ha empleado inmunofluorescencia para la deteccin de Streptococcus iniae en tilapia (Klesius et al., 2006).

En Colombia, el diagnstico de la estreptococcosis se viene realizando mediante el uso simultneo de la histopatologa, inmunoperoxidasa indirecta (IPI), microbiologa y PCR (a partir de colonias bacterianas); bien sea en casos de mortalidad o en programas de monitoreo sanitario que se han realizado peridicamente con propsitos preventivos (Iregui et al., 2004).

1.4. SALUD PBLICA

El primer caso de enfermedad humana fue reportado en Texas en 1991, un segundo caso apareci en Ottawa en 1994, y nueve casos ms entre 1995 y 1996 (Weinstein et al., 1997). Todos los pacientes tuvieron historia de manipulacin de tilapias vivas o sus filetes y desarrollaron celulitis aguda, osteomielitis o endocarditis. Por el momento solo se ha implicado el Streptococcus iniae, pero se sospecha que otras bacterias relacionadas con la entidad en peces, puedan como esta, causar infeccin y enfermedad en humanos (Weinstein et al., 1997; Lau et al., 2003).

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1.5. REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

Es una tcnica para la sntesis in vitro de secuencias especficas de ADN. Las siglas PCR significan Polimerase Chain Reaction: reaccin en cadena de la polimerasa. Desarrollada originalmente por Kary Mullis en la dcada de los 80, por lo cual se le adjudic el Premio Nobel de Qumica en 1993, ha sido ampliamente utilizada en el campo de la biologa molecular como PCR simple y en sus diferentes variedades (PCR multiplex, PCR anidado, RT-PCR, PCR-RFLP, etc.) (Hoorfar et al., 2004, Hoffmann et al., 2009).

La tcnica de PCR permite amplificar de manera selectiva fragmentos del ADN, situados entre dos regiones cuyas secuencias son conocidas. Estas dos regiones se utilizan como iniciadores en la reaccin de sntesis del ADN, que est catalizada por la enzima ADN polimerasa (Gibello et al., 2001).

Brevemente, la reaccin se basa en la repeticin sucesiva de 30 a 40 ciclos, conformado cada uno por tres etapas o fases principales: Una primera fase de desnaturalizacin, donde la doble hlice de ADN se separa en sus dos hebras, una segunda etapa de hibridacin, donde los iniciadores especficos se unen a las zonas 3 complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar, y un paso final de elongacin, donde se produce la sntesis de una cadena sencilla complementaria a la original mediante la enzima ADN polimerasa, la cual incorpora los desoxinucletidos fosfato presentes en el medio, complementarios a la cadena molde. Este ciclo se repite de tal manera que se da una amplificacin exponencial de la secuencia de inters,
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generando al final del proceso billones de copias de ella (Figuras. 1 y 2). Todo el proceso se lleva a cabo en un equipo, denominado termociclador, que realiza los ciclos en los tiempos y temperaturas programadas de forma exacta. Los productos obtenidos se visualizan normalmente por medio de electroforesis en gel de agarosa. La amplificacin de un gen especfico del patgeno puede de este modo aumentar significativamente la sensibilidad de la deteccin (Gibello et al., 2001, Cunningham, 2002, Yang and Rothman, 2004).

Figura 1. Amplificacin exponencial a partir de un fragmento de ADN molde tras una serie de ciclos de PCR (Adaptado de Andy Vierstraete, 2001).

Las ventajas de la PCR sobre otros mtodos de diagnstico gentico radican en su simplicidad y rapidez, especificidad y sensibilidad (Johnson, 2000; Gibello et al., 2001).

Las diferentes clases de PCR han sido empleadas ampliamente para el diagnstico e investigacin de infecciones causadas por microorganismos (bacterias, hongos, protozooarios) as como para el estudio de
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enfermedades de tipo gentico, anlisis forenses, relaciones filogenticas entre especies, deteccin de cepas resistentes a antibiticos etc. a partir de diferentes muestras como sangre, semen, cultivos bacterianos, cultivos celulares, tejidos frescos, congelados o embebidos en parafina, tanto en medicina humana como Veterinaria (Figura 2.) (Yang and Rothman, 2004).

Figura 2. Esquema del procedimiento de la PCR

En las ltimas dos dcadas la PCR ha sido extensivamente modificada para expandir su utilidad y versatilidad. Por ejemplo, el PCR mltiple permite la deteccin simultnea de diferentes secuencias de ADN, por la incorporacin de diferentes grupos de iniciadores. El PCR anidado, incrementa la sensibilidad y especificidad por medio de dos amplificaciones sucesivas, el PCR-RFLP (Poliformismos en el tamao de los fragmentos de restriccin) permite la amplificacin de genes de inters
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y la posterior digestin con enzimas de restriccin permitiendo generar fragmentos de ADN de distintos pesos moleculares, esta tcnica es de gran utilidad para la genotipificacin de microorganismos y el RT-PCR, permite la deteccin de RNA por la conversin de RNA en una copia complementaria de ADNc por medio de la enzima transcriptasa reversa, muy til en la identificacin de virus RNA como VIH y hepatitis C (Hoorfar et al., 2004, Hoffmann et al., 2009)

Un avance significativo, fue el desarrollo de la PCR en tiempo real, la cual permite la amplificacin y deteccin de los productos en una nica reaccin, eliminando la necesidad de electroforesis para la visualizacin de los amplificados. El PCR en tiempo real permite la amplificacin simultnea y la cuantificacin en tiempo real (al final de cada ciclo) de secuencias especficas de cidos nuclicos, adems de aumentar la sensibilidad, permite reducir el riesgo de contaminacin cruzada (Houghton and Cockerill, 1996; Hoffmann et al., 2009).

El diagnstico de infecciones basado en PCR ha sido desarrollado efectivamente para un gran rango de microorganismos, debido a la alta sensibilidad y especificidad y el bajo consumo de tiempo. En el mundo ha sido aplicada a la identificacin por gnero y especie de microorganismos que no crecen in vitro o que requieren un largo tiempo para crecer (Yang and Rothman, 2004). Sin embargo, un limitado nmero de ensayos ha sido aprobado por la FDA (Food and Drug Administration) y aceptados en la prctica clnica (Yang and Rothman, 2004).

En medicina humana es un mtodo de rutina para el diagnstico y clasificacin

de

enfermedades
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hematolinfoides,

bacterianas

(Mycobacterium fngicas

tuberculosis, spp,

Streptococcus, Aspergillus,

Neisseriagonorrhoeae), Candida), parasitarias

(Chlamydia

(Plasmodium, Trypanosoma, Leishmania, Giardia, Entamoeba histolytica etc), virales (Herpes, cytomegalovirus, Poxvirus, adenovirus, influenza etc) y de enfermedades neoplsicas (Weiss, 1995,Espy et al., 2006; Hutchins and Grabsch; 2009, Mengoli et al., 2009; Olson et al., 2010).

En Medicina Veterinaria, se emplea en el diagnstico de infecciones virales, bacterianas y parasitarias, principalmente en aves (New castle, Influenza aviar) Bovinos (Diarrea viral Bovina, Leucosis bovina) y Cerdos (Sndrome Respiratorio Porcino-PRRS, Haemophilus parasuis, Streptococcus suis, Influenza porcina, Circovirus porcino, Peste porcina clsica, Neumona enzotica porcina) (Pulido et al., 2006; Hoffmann et al., 2009).

1.6. PCR EN TIEMPO REAL

La PCR cuantitativa detecta en tiempo real la amplificacin del genoma de inters. Para llevar a cabo esta deteccin existen varios mtodos, pero casi todos basados en la utilizacin de otro fragmento de ADN (sonda) complementario a una parte intermedia del ADN que queremos amplificar. Esta sonda lleva adherida una molcula fluorescente y otra molcula que inhibe esta fluorescencia ("quencher"), de tal forma que slo cuando la sonda es desplazada de su sitio por accin de la ADN polimerasa la molcula fluorescente se libera de la accin del "quencher" y emite fluorescencia al ser iluminada con un lser (figura 3). La cuantificacin de la fluorescencia emitida durante cada ciclo de la PCR ser proporcional a la cantidad de ADN que se est amplificando. En
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general para que sea s vlida esta e tcnica a requiere realizar en paralelo una c s para cono ocer la cantidad total de curva patrn en las mismas condiciones ADN qu ue se est amplificand a o.(M. TevfikDorak (Ed d.) 2007).

Figura 3. Esquema de d desarrollo o PCR en tie empo real (empleando sis stema taqma an). Tomado de: d AbsoluteQ Quantification nstarted Guide e. AplieddBio osystems.

2. 2 FORMU ULACIN DEL D PROBLEMA Y JU USTIFICAC CIN

La acuicult tura de pec ces es uno de los sec ctores de p produccin de aliment tos que q tiene un u crecimie ento anual de d casi el 1 10% desde e 1984, en comparacin con c la produccin ga anadera (3 3%) y la pe esca extra activa (1,6% %). El rpido desarrollo d de d la acuic cultura ha llevado a la a aparicin de un gran nmero de
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enfermedades infectocontagiosas de muy diverso origen, ya que el rgimen intensivo del cultivo, unido en muchas ocasiones a unas condiciones higinico-sanitarias deficitarias, junto al estrs de los animales, favorece la penetracin y desarrollo de agentes patgenos, y como secuencia, la aparicin de enfermedades infectocontagiosas, que son un freno muy significativo en la produccin acucola, afectando en muchos pases al desarrollo econmico del sector.(Aamri F. 2010).

Streptococcus iniae es un importante patgeno de peces en muchas regiones del mundo. Esta bacteria es tambin zoontica con infecciones en humanos asociados con la manipulacin y preparacin de los peces infectados. El Streptococcus iniae se fue sealado como una enfermedad emergente zoontica transmitida por animales destinados al consumo en la Conferencia Internacional sobre Enfermedades Infecciosas Emergentes en 2000 (Hansen et al 2001, Justice et al 2009)

En cuanto a la clnica producida en la infeccin por Streptococcus iniae, los peces afectados pueden presentar uno o ms de los siguientes signos clnicos, dependiendo de la especie afectada: natacin errtica, prdida de orientacin, letargia, prdida de control de la flotabilidad, melanosis, exoftalmia unilateral o bilateral, opacidad de la crnea, hemorragias en o alrededor de los ojos, base de las aletas, ano, o en cualquier otro lugar en el cuerpo, fluido asctico en la cavidad abdominal y ulceraciones (Eldaret al., 1994 y 1995-a). Esta sintomatologa es muy similar a la producida por las bacterias Streptococcus parauberis, Streptococcus agalactiae o Lactococcus garvieae (Domnechet al., 1993 y 1996; Eldaret al., 1994 y 1995-a y b; Bercovieret al., 1997; Eldar y Ghittino, 1999). En algunos casos, los peces no muestran signos evidentes antes de la muerte. La necropsia puede evidenciar la presencia de lquido hemorrgico en cavidad abdominal,
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esplenomegalia, palidez heptica, as como la inflamacin alrededor del corazn y el rin. Muchos estreptococos infectan el sistema nervioso de los peces, lo que explica la natacin errtica frecuentemente observada en peces infectados (Yanong y Francis-Floyd, 2006).

Su diagnstico se basa en los signos clnicos, las lesiones histopatolgicas y el aislamiento microbiolgico; sin embargo, se requiere de tcnicas ms sensibles que confirmen o descarten la presencia de la bacteria en animales. La tcnica de Reaccin en Cadena de la Polimerasa (PCR) en tiempo real permite identificar con una alta sensibilidad y especificidad un gen de inters de un microorganismo que posiblemente se encuentre en bajas concentraciones en una muestra. (Jimnez A. P. 2010).

Adems de su importancia en la acuicultura, Streptococcus iniae ha surgido recientemente como una amenaza para la salud pblica debido a su agente zoontico, al haber sido aislado de humanos infectados como consecuencia de lesiones accidentales durante la manipulacin de pescado fresco infectado (Weinstein et al, 1997;.Lau .et al, 2003;. Facklam et al, 2005).

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3. OBJETIVOS

3.1. OBJETIVOS GENERAL

Identificar la distribucin de la infeccin por Streptococcus iniae en diferentes rganos de tilapia roja (Oreochromis sp) y tilapia nilotica (Oreochromis niloticus) diagnosticado por PCR en tiempo real.

3.2. OBJETIVO ESPECFICOS

Determinar e identificar la distribucin de la infeccin en Cerebro, Hgado y Corazn.

Describir hallazgos histopatolgicos en cerebro, hgado y corazn de individuos infectados con Streptococcus iniae

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4. METODOLOGA

4.1. MUESTRAS Y CONTROLES

El grupo de investigacin del Laboratorio de Medicina Genmica en un estudio realizado en el 2011, identific 10 individuos positivos a la enfermedad Streptococcus iniae, el anlisis se realiz en una mezcla de cerebro, corazn e hgado con la tcnica de PCR en tiempo real, las muestras estn congeladas a -20 C y se emplearon en el presente estudio.

Para los controles se realiz la extraccin de ADN de los cultivos puros de la cepa de Streptococcus iniae, la cual fue adquirida de ATTC (No. 29178) con el Kit comercial QIAamp ADN Mini Kit, QIAGEN, siguiendo las recomendaciones del fabricante.

4.2. EXTRACCIN DE ADN A PARTIR DE TEJIDOS

La extraccin de ADN se realiz con el kit comercial de Quigen segn el protocolo para bacterias de la misma marca comercial, las muestras de cerebro, hgado, corazn que estaban a -20 C se descongelaron. Estas muestras de tejido se pesaron (10-20mg), se suspendieron en 180 l de una solucin de enzimas (20 mg/ml lysozyme; 20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 2 mM EDTA; 1,2% Triton) este paso es para bacterias Gram-positivas y se maceraron utilizando el mortero con Biovortex marca VortexMixer, (figura 7)
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siempre dentro del tubo vial (eppendorf). Se incubaron por 30 minutos a 37C. despus se aadi 20l de proteinasa K y 200 l del Buffer AL. y se mezclaron con VortexMixer e incubaron a 56C por 30 minutos. Luego se centrifugaron brevemente el tubo para precipitar las gotas que puedan estar adheridas a la tapa del vial (eppendorf), despus se aadieron 200l de etanol (96-100%) se centrifugo brevemente el tubo para precipitar las gotas que puedan estar adheridas a la tapa del vial (eppendorf), luego se adiciono el lisado en una columna purelink spin column y se centrifug a 10000 rpm por un minuto a temperatura ambiente. Se descart todo lo que quedo en el tubo colector, luego se adiciono 500l del Buffer AW1, se centrifug a 10000 rpm por un minuto, se descart todo lo que quedo en el tubo colector, se adiciono 500l del buffer AW2 se centrifugo a 14000 rpm por tres minutos, se descart todo lo que quedo en el tubo colector, luego se introdujo el tubo en un vial nuevo de 1,5 ml en la columna, a continuacin se adiciono 200 l del Buffer AE y se incubo por 1 minuto temperatura ambiente y luego se centrifugo a 14000 rpm por un minuto y se descart la columna y se guard lo que queda en el vial de 1,5 ml.

4.3. PROTOCOLO DE PCR EN TIEMPO REAL

La estandarizacin de la prueba diagnstica molecular por PCR en tiempo real para las especies Streptococcus iniae, la realiz el grupo Laboratorio de Medicina Genmica de la Universidad Surcolombiana, Se disearon los primers para generar las secuencias de la accesin No. Y07622.1 protena Lactato oxigenasa (lctO) (S. iniae). En esta regin se disearon los primers especficos de especie, utilizando el Software Primer Express 3.0 Applied Byosistems, para el equipo utilizado Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System.
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Tabla 2. Primers utilizados para el diagnstico de Streptococcusiniae por PCR en tiempo real Forward Reversed Sonda GTT TTC TTG AAG CTA TTG CAG GTT T CGC GCA AGG GTT TCA TG VIC-CTGCGGTTGCCATACCAGCAAGTATTCTA- TAMRA

Tabla 3. Reactivos a utilizar y su cantidad de volumen para la PCR en tiempo real. Reactivo Taqman Universal PCR master mix (2X) Taqman (sonda) Primer F (10 uM) Primer R (10 um) DNA Agua TOTAL Cantidad 12.5 ul 0.5 ul 1.25 ul 1.25 ul 1 ul 8.5 ul 25 ul

Protocolo de perfiles de temperatura para PCR en tiempo real. 50 C por 2 minutos 95 C por 10 minutos 40 ciclos 95C por 15 segundos 60 C por 1 minutos

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Figura 4. rea de extr raccin de DNA

Figura 5. rea de PCR

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4.4. EXAMEN DE HISTOPATOLOGA

Se tomaron muestras de 10 animales del cerebro, hgado y corazn, estos fueron retirados del animal durante la necropsia y una parte esta conservada en formol tamponado al 4% en PBS (phosphate buffer saline) como mtodo de rutina para fijar y conservar los tejidos sin afectar la citoarquitectura.

Luego en el laboratorio de Histopatologa animal de la Universidad Nacional de Colombia, se tom una pequea porcin representativa de la muestra y se llev al procesador automtico de tejidos, en esta fase se dio la inclusin del tejido con parafina que consiste en: deshidratacin, aclaracin, infiltracin y colado de bloques donde el tejido queda incluido, se seccionaron los bloques con ayuda de un micrtomo (6 - 8 espesor) y se colocaron en bao de flotacin para la seleccin de las muestras, se montaron en placas de vidrio para coloracin general de rutina con hematoxilina- eosina (H&E) o tincin de gram, para el anlisis de las secciones histolgicas. Posteriormente, se llevaron las muestras para observacin en microscopa (10x y 40x).

4.5. ANLISIS ESTADSTICO

Los resultados se analizaron con estadstica descriptiva y anlisis de frecuencias con el paquete estadstico INFOSTAT

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5. RESULTADOS

5.1. EXTRACCIN DE DNA A PARTIR DE MUESTRAS CONGELADAS

La cantidad de DNA obtenido con el kit comercial de Quigen segn el protocolo para bacterias de la misma marca comercial se encuentra en la tabla 4, la medicin se realiz con el equipo NanoDrop 2000 (figura 6.)

Tabla 4. Cantidad de DNA obtenido a partir de la las muestras Muestra Identificacin Individuo Corazn 1 Hgado Cerebro Corazn 2 Hgado Cerebro Corazn 3 Hgado Cerebro Corazn 4 Hgado Cerebro Corazn 5 Hgado Cerebro Corazn 6 7 Hgado Cerebro Corazn 46,3 402 54,8 32,4 23,6 133,8 36,2 10,7 25 29,8 13,1 3,7 37,5 43,2 28,6 34,6 79,2 39,8 22,3 del rgano Cantidad (ng/l)

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Hga ado Cere ebro Cora azn 8 Hga ado Cere ebro Cora azn 9 Hga ado Cere ebro Cora azn 10 Hga ado Cere ebro Control positivo de Str reptococcusin niae

33 10,4 16,7 21,5 20,2 24,6 34 14,2 23 11,7 12,5 8,7

Figura 6. NanoD Drop 2000.

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Figura F 7.Vorte exMixer

5.2. RES SULTADOS S DE LA PCR EN TIE EMPO REA AL

Los resulta ados positiv vos para inf feccin Str reptococcus s iniae se r relacionan en la l tabla 5.

Tabla T 5. r rganos pos sitivos para la infeccin n por Strep ptococcus in niae. Individuo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 rgan nos infectados Coraz zn - Hgad do Cereb bro Coraz zn Coraz zn Coraz zn Hgad do Coraz zn - Cereb bro Hgad do - Cerebr ro Hgad do Hgad do - Cerebr ro
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Ningn individuo presento infeccin en los tres rganos al mismo tiempo, el 40% presento infeccin en dos rganos, el 30% de la infeccin se present en corazn, el 20% se present en Hgado y cerebro al mismo tiempo, 20% en hgado, el 10% se present en cerebro igualmente en corazn - hgado y corazn cerebro

Figura 8. Resultado de la PCR tiempo real para el individuo 1 (izquierda), individuo 8 (derecha)

Figura 9. Distribucin de infeccin por rgano.

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5.3. SEN NSIBILIDA AD DE LA PCR P TIEMP PO REAL

Figura F 10. Se ensibilidad de e la PCR Tiem mpo Real.

El limite m s bajo de deteccin del d Streptoc ae se prob diluyendo el coccus inia ADN A en agua destilad da estril en n concentra aciones de 1:1, 1:10, 1 1:100, 1:1000 y 1:10000. En la figura a 10 se mu uestra la alt ta sensibilid dad del diag gnstico, con una u diluci n tan alta se evidencia claram mente la pe endiente qu ue permite el diagnstico d o positivo de e la infecci n.

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5.4. ESPECIFICIDAD DE LA PCR TIEMPO REAL

Figura 11. Especificidad de la PCR Tiempo Real.

La especificidad del ensayo de PCR Tiempo Real se prob utilizando ADN extrado de las cepas de tres especies de Streptococcus; S. pyogenes, S. pneumoniae y S. agalactiae, en la figura 10 se muestra la alta especificidad que tiene la prueba para la familias S. iniae.

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5.5. HISTOPATOLOGA

A nivel microscpico se hallaron diferentes daos o injurias en los tejidos colectados (corazn, hgado, cerebro), en la Tabla 7 se muestran las principales lesiones histopatolgicas halladas en los diferentes rganos analizados y que se relacionan con infecciones por streptococcocis.

Tabla 6. Hallazgos histopatolgicos en diferentes rganos de individuos diagnosticados positivos para Streptococcus iniae por PCR en tiempo real Corazn Cerebro Hgado Epicarditis multifocal con formacin de granulomas o granulomatoso con presencia de bacterias tipo cocos. Moderada miocarditis generalizada. Bacterias tipo coco en miocardio y endocardio. Granuloma en miocardio. Miocarditis generalizada. Meningitis multifocal Hemorragias e inflamacin granulomatosa en meninges. Leve a moderado foco de meningoencefalitis necrtica con presencia de bacterias tipo cocos Congestin en encfalo y meninges generalizada Granuloma de meninges Meningitis Fibrinohemorrgica con presencia de bacterias tipo cocos en el citoplasma de macrfagos Focos de congestin heptica. Hepatopncreas con presencia de bacterias tipo coco intra extracitoplasmaticas en celulas tipo macrfagos. Focos de hepatitis con presencia de bacterias tipo coco intracelulares. Activacin de centros melanomacrfagos en hepatopncreas. Granuloma en hgado. Vacuolizacin heptica.

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Figura 12.Moderados a severos focos de epicarditis granulomatosa y leve presencia de bacterias tipo coco en miocardio y endocardio 2X (izquierda). Moderado foco de epicarditis necrtica 10X (derecha).

Figura 13.Severa acumulacin de bacterias tipo coco focalizada en encfalo y meningitis extensa multifocal. 40X (izquierda). Moderado a severo foco de meningitis fibrinohemorrgica con leve presencia de bacterias tipo coco en el citoplasma de macrfagos 10X (derecha).

Figura 14. Moderado foco de hepatitis con presencia de bacterias tipo coco intracelulares. Moderados focos de activacin de CMM en hepatopncreas 40X (izquierda). Severo foco de necrosis e inflamacin en hepatopncreas con presencia de bacterias tipo coco intra y extracitoplasmticas en clulas tipo macrfagos, leve a moderados focos de infiltrado mononuclear perivascular, leve presencia de vacuolas que desplazan el ncleo de los hepatocitos 10X(derecha).

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6. DISCUSIN

Este trabajo corrobora los estudios previos de nuestro grupo de investigacin respecto que todos los casos positivos obtuvieron por los menos un rgano infectado, el 40% reporto coinfeccin. La tcnica de PCR Tiempo Real, como una herramienta de diagnstico molecular, ha facilitado la deteccin y la identificacin de un nmero creciente de bacterias de importancia clnica en medicina veterinaria y humana. A veces, entre los microorganismos filogenticamente relacionadas, es difcil disear un conjunto especfico de cebadores para la identificacin de especies bacterianas.

El examen histopatolgico revel agudo a subagudo meningoencefalitis que consiste de un exudado que cubre la superficie del cerebro que contiene colonias de bacterias y la infiltracin multifocal de clulas de macrfagos en el hgado y corazn como las lesiones principales, Estos resultados se pueden correlacionar con los hallazgos clnicos de letargo y prdida de la orientacin, (Eldar&Ghittino 1999) que pueden ser confundidos con otras clases de infeccin.

La infeccin por Streptococcus iniae se presenta con morbilidades agudas y crnicas en muchas especies de peces, tanto de pesca extractiva como de acuicultura, y as, al menos, 27 especies de peces han sido descritas como sensibles a la infeccin (Agnew y cols., 2007). Sin embargo, es la primera vez que se realizan estudios sobre este tipo de patologa en Colombia, las investigaciones se han realizado en el laboratorio de medicina genmica de la Universidad Surcolombia desde el ao 2011.

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7. CONCLUSIONES

La PCR en tiempo real es un mtodo rpido, sensible y especfico para la deteccin de Streptococcus iniae en peces comerciales, til en investigacin, estudios epidemiolgicos y diagnstico.

El Streptococcus iniae causa una infeccin muy grave y puede generar graves problemas sobre la actividad acucola del Huila y sobre los recursos icticos nativos.

La importancia de seguir con monitoreos continuos, por las implicaciones que tiene el Streptococcus iniae en la salud de los peces y como agente zoontico.

Se necesita ms investigacin para entender completamente este patgeno, en particular, su diversidad serolgica y epidemiolgica, antes de que los programas de vacunacin puedan tener xito a escala mundial.

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