Cultura celular por Mrcia Regina Cominetti1 O que uma cultura celular?

? Clulas animais e vegetais, isoladas de tecidos vivos, podem continuar a crescer in vitro se os nutrientes e todos os outros fatores necessrios sua sobrevivncia, crescimento e proliferao forem corretamente fornecidos. Quando este processo realizado em laboratrio, em condies controladas de temperatura, umidade, oxignio e gs carbnico, ele chamado de cultura celular. A cultura de clulas permite que as mesmas funcionem como unidades independentes similares a microorganismos como bactrias e fungos. Estas clulas em cultura so capazes de crescer e se dividir normalmente, de forma similar a quando esto crescendo in vivo, isto se, como dito, os nutrientes necessrios forem fornecidos no que chamamos de meio de cultura. O meio de cultura o lquido aonde as clulas crescem e se multiplicam e pode possuir, dependendo da necessidade de cada linhagem celular, diferentes componentes. Basicamente, um meio de cultura deve possuir em sua composio sais inorgnicos (tais como clcio, ferro, magnsio, potssio, entre outros), aminocidos essenciais e no essenciais, vitaminas, antibiticos, uma fonte de energia, como a glicose e um indicador de pH como o fenol red, por exemplo. Em uma cultura celular, dependendo de seu tecido de origem, as clulas podem crescer tanto suspensas no meio de cultura, quanto aderidas formando monocamadas no fundo da garrafa em que esto sendo cultivadas. As clulas em suspenso derivam de linhagens que originalmente no necessitam de adeso ao substrato para proliferao, tais como clulas hematopoiticas. J as clulas aderidas, necessitam ligar-se ao substrato para se dividir e crescer e esta ligao essencial, uma vez que se estas clulas perdem a ancoragem ao substrato, elas param de proliferar e morrem. Exemplos de clulas aderidas so fibroblastos e clulas epiteliais, entre outras. Breve histrico A histria do desenvolvimento de culturas de clulas iniciou-se por volta de 1950. O objetivo inicial era estudar, sob o microscpio, eventos celulares normais, tais como o desenvolvimento de clulas nervosas. A necessidade do cultivo de clulas animais, especialmente em larga escala, tornou-se evidente com a procura de vacinas contra vrus. As grandes epidemias de plio nos anos entre 1940 e 1950 despertaram o esforo de vrios cientistas para o desenvolvimento de vacinas. Em 1949, quando o vrus da plio pde ser crescido em cultura de clulas humanas, um considervel interesse na rea foi desenvolvido e grandes quantidades de vacinas foram desenvolvidas a partir de clulas em cultura. A vacina da plio produzida a partir de um vrus inativo, tornou-se um dos primeiros produtos comerciais criados a partir de clulas animais cultivadas. Em 1975, a tecnologia da cultura celular foi fundamental para a produo de clulas hbridas (hibridomas) a partir da fuso de duas ou mais clulas capazes de produzir
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Docente do curso de Graduao em Gerontologia e do Programa Interinstitucional de Ps-Graduao em Cincias Fisiolgicas (PIPGCF) Associao Ampla UFSCar/UNESP.

continuamente anticorpos monoclonais especficos. Estes anticorpos possuem grande valor teraputico e so produzidos comercialmente a partir de culturas de hibridomas em larga escala. Tipos de culturas celulares As culturas celulares podem ser de trs tipos: 1) Primrias 2) Finitas 3) Contnuas Cultura primrias Culturas de clulas primrias so produzidas a partir de clulas retiradas de um tecido por processos de desagregao por mtodos mecnicos, enzimticos ou qumicos. As culturas primrias so portanto formadas a partir clulas que sobrevivem aos processos de desagregao, aderem-se ao substrato da garrafa de cultura (ou mantm-se em suspenso) e proliferam. As clulas primrias possuem morfologia idntica ao do tecido das quais se originam. A cultura primria permite pouco nmero de divises (ou passagens) celulares, aps as quais entram em estado de senescncia e morrem. Muitos cientistas preferem utilizar culturas primrias em seus experimentos uma vez que estas clulas mantm as caractersticas fisiolgicas do tecido de origem, podendo ser consideradas portanto como representativas das condies naturais de um organismo. Culturas finitas As culturas finitas so formadas aps a primeira passagem de uma cultura primria. Estas culturas iro proliferar por um nmero finito de divises celulares, aps as quais iro morrer. O potencial proliferativo de algumas culturas finitas pode ser prolongado atravs da introduo de genes virais transformantes (tais como os genes transformantes SV40). Culturas contnuas Culturas finitas de clulas iro fatalmente morrer ou eventualmente adquirir uma mutao estvel capaz de produzir uma cultura contnua. Esta mutao sofrida pelas clulas conhecida como transformao ou imortalizao e est freqentemente associada com tumorigenicidade. Clulas primrias de roedores em cultura formam facilmente linhagens de clulas contnuas espontaneamente ou aps o tratamento com algum agente mutagnico. Clulas de culturas primrias humanas ao contrrio, raramente tornam-se imortais desta forma e necessitam de modificaes genticas adicionais para formar uma linhagem contnua. Clulas derivadas de tumores humanos, contudo, freqentemente suportam uma grande quantidade de passagens, sendo consideradas contnuas. Linhagens de clulas contnuas so relativamente fceis de

trabalhar, comparado com linhagens clulas primrias, contudo, deve-se lembrar de as primeiras podem sofrer alteraes genticas (mesmo que no existam alteraes morfolgicas visveis) aps vrias passagens e que portanto, podem no representar a situao fisiolgica real do organismo in vivo. Aplicaes da cultura de clulas animais Existe um grande nmero de aplicaes para clulas animais ou vegetais cultivadas, dentre eles: 1) Estudos fisiolgicos e bioqumicos de clulas normais e tumorais; 2) Estudos dos efeitos de compostos qumicos ou drogas variadas sobre tipos especficos de clulas (epiteliais, sanguneas, etc.); 3) Estudos para a gerao de tecidos artificiais (como pele artificial, por exemplo); 4) Sntese de produtos biolgicos a partir de culturas celulares em larga escala, etc. 5) Produo de protenas recombinantes glicosiladas, as quais no podem ser produzidas por bactrias, uma vez que estas no possuem o metabolismo necessrio. Cuidados e esterilidade Uma cultura celular precisa, acima de tudo, ser livre de contaminaes. A taxa de multiplicao de clulas animais relativamente baixa, comparada com clulas bacterianas. Enquanto bactrias podem se duplicar a cada 30 minutos, as clulas animais requerem de 18 a 24 horas. Isto torna as culturas de clulas animais mais vulnerveis contaminao, uma vez que um pequeno nmero de bactrias introduzido na garrafa de cultura pode crescer rapidamente em uma populao de clulas normais. Para evitar a introduo de microorganismos na cultura, vrios cuidados bsicos de manipulao e preveno devem ser tomados. Todo o trabalho da cultura de clulas deve ser realizado em um fluxo laminar inspecionado e em bom estado de funcionamento. Antes do incio dos procedimentos, a luz ultravioleta que fica dentro do fluxo laminar deve ser ligada e mantida por, no mnimo, 30 minutos e de preferncia, com os materiais a serem utilizados expostos a ela. O pesquisador deve utilizar boas tcnicas de assepsia e evitar a formao de aerossis durante a manipulao dos materiais. Todo o material utilizado deve ser desinfetado com agentes prprios e autoclavados antes do uso. Todos os equipamentos e materiais utilizados na cultura celular devem ser esterilizados. Jalecos e luvas devem ser obrigatoriamente vestidos e a cada retirada das mos do espao interno do fluxo, deve-se lavar as luvas com lcool 70%. O uso do fogo dentro do fluxo tambm pode minimizar as chances de contaminao. Com estes procedimentos bsicos, a chance de contaminao com microorganismos nocivos como bactrias, fungos e micoplasmas, pode ser evitado. Bibliografia The Quiagen Transfection Resource Book, Second Edition.