Artigo: Specificity efficiency and fidelity of PCR 1 Porque razo, num par de primers, o parmetro Tm deve ser aproximado

o para ambos os primers? 2 Se os primers apresentarem Tm diferentes o que poder acontecer se: a) A temperatura de emparelhamento (annealing) for adequada ao primer de Tm mais baixo? b) A temperatura de emparelhamento (annealing) for adequada ao primer de Tm mais elevado? 3 A razo entra a quantidade de primers/DNA molde na reaco influencia a especificidade e a eficincia. Faa corresponder as duas condies a) e b) aos efeitos previsveis a) Elevada razo entra a quantidade de primers/DNA. b) Reduzida razo entra a quantidade de primers/DNA Efeitos previsveis (preencher o espao com a) ou b) _____ maior probabilidade de originar produtos inespecficos _____ primers tornam-se limitantes e a eficincia baixa _____ maior probabilidade de formao de primer-dimers

Diferentes DNA polimerases utilizadas na reaco de PCR possuem caractersticas diferentes que afectam a eficincia e a fidelidade 4 As enzimas T7 e Klenow apresentam elevadas eficincias por ciclo. Porque no so correntemente utilizadas em reaces de PCR? 5 Que enzima mais adequada para reaco de PCR com elevada fidelidade? Que dados da tabela apoiam a escolha? Que caracterstica da enzima justifica os resultados observados?

11- A que fase 1 ou 2, corresponde a acumulao de produto de forma exponencial de acordo com a expresso Nf = N0 (1 + Y)n? 12 Tipicamente, a partir de que nmero de cpias obtidas se entra na fase de sobreamplificao? 13 Quais so os efeitos indesejveis da sobre-amplificao? 14 Quais as suas possveis causas?

http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/ Lecture12/Lecture12.html

17 Faa a legenda da figura. A legenda deve explicar a experincia que est a ser realizada, quais os parmetros que so a ser testados. 18 Caracterize os 3 pares de primers e justifique relativamente a a) eficincia b) especificidade

20 A figura reflecte o efeito da concentrao de primers em que parmetros? Justifique

Primer concentrations lower than 0.6 M resulted in reduced yield. However, higher primer concentrations reduced primer specificity due to mispriming and primer dimer formation.

Exemplo de descrio de uma polimerase comercial: GoTaq Hot Start Polymerase contains the high performance GoTaq DNA polymerase bound to a proprietary antibody that blocks polymerase activity. The polymerase activity is restored during the initial denaturation step. GoTaq Hot Start Polymerase exhibits 5'3' exonuclease activity. 21 - Quais so as vantagens apresentadas para esta polimerase? 22 Em que consiste hot-start? Poder ter um efeito mais pronunciado em que parmetro (especificidade, fidelidade)? Justifique, com recurso figura abaixo:

To demonstrate the performance of PfuTurbo Hotstart DNA polymerase (Quiagen) , we used a series of model systems designed to mimic the most challenging PCR applications facing customers. In the low-copy-number hot-start systems, an HIV or lambda DNA target is amplified from serially diluted DNA template in the presence of high concentrations of denatured genomic DNA (Figures 2 and 3). Exogenous single-stranded DNA provides numerous sites for nonspecific primer annealing and extension in the absence of hot start.

23 - Analise a tabela abaixo e para cada alterao nos parmetros, indique o efeito na reaco pedido na coluna 3.
Adaptada de http://www.biochem.arizona.edu/classes/bioc471/pages/Lecture12/Lecture12.html A critical step in developing a new PCR assay is to optimize the reaction conditions to obtain maximum specificity and sensitivity. The primary reason for these optimization steps is determine what deviations from the "standard" reaction conditions are necessary to promote functional primer annealing and extension. Parameter primer annealing temperature Alteration increase the temperature decrease the temperature DNA polymerase enzyme concentration Effect on the reaction how does higher Temp effect specificity? how does lower Temp effect sensitivity ?

what effect does low enzyme concen. have on yield? what effect does high enzyme concen. have on specificity?

type of DNA polymerase Magnesium concentration varying the [MgCl2]

which thermostable polymerase is best regarding 1- most efficient enzyme 2- decreased error rate what effect does MgCl2 concentration have 1- low [MgCl2] on specificity? 2 - high [MgCl2] on stabilizing primer annealing? why raise the denaturation temperature ?? why increase primer extension time ?? when would altering the cycle number help ??

Cycle parameters

denaturation temperature duration time of primer extension cycle number

Quality of PCR products Please note that even a good PCR product needs PCR-purification. Your PCR product should be purified, whether your interested band is good or not. That means:

Here are some examples of the bands need PCR purification (Only have PrimerDimer as contaminator) or Gel Purification (have smear with other contaminators):

24- A presence de primer-dimer no gel (V/F) ___ pode dever-se a mau desenho dos primers (escolha de primers com sequencias que conduzem ao emparelhamento entre primers) ___ pode dever-se a um excesso de primers na reaco ___ pode revelar uma fraca incorporao dos primers no produto desejado e consequentemente uma baixa eficincia

PCR Troubleshooting: http://www.bio-rad.com/en-pt/applications-technologies/pcr-troubleshooting#gel1