PRINCIPIOS Y APLICACIONES MICROSCPICOS

TABLA 16-1. Preparaciones y tinciones microscpicas utilizadas en el laboratorio de microbiologa clnica Mtodo de tincin Examen directo Examen en fresco KOH al 10% Preparacin no teida, examinada con microscopa de campo brillante, de campo oscuro o de contraste de fase Se usa el KOH para disolver el material proteico y facilitar la deteccin de elementos fngicos que no son afectados por soluciones alcalinas fuertes. Se pueden agregar pigmentos, como el azul de algodn de lactofenol, para aumentar el contraste entre los elementos fngicos y el fondo Modificacin del procedimiento de KOH, en el cual se agrega tinta china como material de contraste. El pigmento se utiliza principalmente para detectar especies de Cryptococcus en el lquido cefalorraqudeo y en otros lquidos corporales. La cpsula polisacrida de las especies de Cryptococcus no se tie, creando un halo alrededor de la clula de levadura Se agrega yodo a las preparaciones hmedas de muestras parasitolgicas para reforzar el contraste de las estructuras internas. Facilita la diferenciacin entre amebas y leucocitos del anfitrin Principio y aplicaciones

Tinta china

Yodo de Lugol Tinciones diferenciales Tincin de Gram

Es la tincin usada ms comnmente en los laboratorios de microbiologa. Constituye el criterio bsico para separar los grandes grupos de bacterias (es decir, grampositivas, gramnegativas). Despus de la fijacin de la muestra en un portaobjetos de cristal (por calentamiento o tratamiento con alcohol), esta se expone a cristal violeta y despus se agrega yodo para formar un complejo con el pigmento principal. Durante la decoloracin con alcohol o acetona, las bacterias grampositivas retienen el complejo, mientras que los microorganismos gramnegativos lo pierden; se aade saponina como contracolorante, que es retenido por los microorganismos gramnegativos (de ah su color rojo). El grado en que cada microorganismo retiene la tincin depende del organismo, las condiciones de cultivo y la habilidad para la tincin del microscopista Utilizada para la deteccin e identificacin de protozoos fecales. Los huevos y larvas de helmintos retienen demasiada tincin y se identifican ms fcilmente con una preparacin en fresco Se usa generalmente en laboratorios de histologa ms que en laboratorios de microbiologa, sobre todo para la deteccin de elementos fngicos en tejidos, aunque se pueden detectar otros microorganismos, como bacterias. La tincin con plata requiere habilidad debido a que una tincin no especfica puede hacer que las muestras sean Ininterpretables Se usa principalmente para la deteccin de organismos de Pneumocystis en muestras respiratorias. Los quistes se tien de un color entre azul rojizo y violeta oscuro, sobre un fondo azul claro. La tincin de fondo se elimina por sulfatacin. Las clulas de levadura se tien y son difciles de distinguir de las clulas de Pneumocystis. Los trofozotos no se tien. Muchos laboratorios han sustituido esta tincin por tinciones fluorescentes especficas Es una alternativa a la hematoxilina frrica para la tincin de protozoos. Los protozoos tienen citoplasmas de color entre verde azulado y violeta, y ncleos y cuerpos de inclusin de color entre rojo y rojo purpreo; el fondo de la muestra es verde Se utiliza para detectar parsitos sanguneos, cuerpos de inclusin de virus y clamidias, y especies de Borrelia, Toxoplasma, Pneumocystis y Rickettsia. Es una tincin policromtica que contiene una mezcla de azul de metileno, azur B y eosina Y. La tincin Giemsa combina azul de metileno y eosina. Los iones de eosina estn cargados negativamente y tien los componentes bsicos de las clulas de color entre naranja y rosa, mientras que otros pigmentos tien las estructuras celulares acidas en varios tonos entre azul y violeta. Los trofozotos de los protozoos tienen ncleos rojos y citoplasmas de color azul verdoso; las levaduras intracelulares y los cuerpos de inclusin generalmente se tien de azul; las rickettsias, las clamidias y las especies de Pneumocystis se tien de violeta

Tincin de hematoxilina frrica Tincin de metenamina argntica

Tincin de azul O de toluidina

Tincin tricrmica

Tincin de Wright-Giemsa

Tinciones acidorresistentes Tincin de Ziehl-Neelsen Se utiliza para teir micobacterias, as como otros microorganismos acidorresistentes. Los microorganismos se tien con carbolfucsina bsica y resisten la decoloracin con soluciones cido-base. El fondo se tie para contrastar con azul de metileno. Los microorganismos se ven rojos sobre un fondo azul claro. La captacin de la carbolfucsina requiere el calentamiento de la muestra (tincin acidorresistente en caliente) Tincin acidorresistente en fro (no requiere calentamiento). Basada en el mismo principio que la tincin de Ziehl-Neelsen Basada en el mismo principio que otras tinciones acidorresistentes, excepto que se usan pigmentos fluorescentes (auramina y rodamina) para la tincin principal, y el permanganato de potasio (agente fuertemente oxidante) es la tincin de contraste e inactiva los pigmentos de fluorocromo no fijados. Los microorganismos tienen una fluorescencia verde amarillenta sobre un fondo negro

Tincin de Kinyoun Tincin auraminarodamina

Mtodo de tincin Tincin acidorresistente modificada

Principio y aplicaciones Se usa un agente decolorante dbil con cualquiera de las tres tinciones acidorresistentes enumeradas. Mientras que las micobacterias son fuertemente acidorresistentes, otros microorganismos se tien ms dbilmente (p. ej., Nocardia, Rhodococcus, Tsukamurella, Gordonia, Cryptospordium, Isospora, Sarcocystis y Cyclospora). Estos microorganismos se pueden teir ms fcilmente utilizando un agente decolorante dbil. Los microorganismos que requieren esta tincin se denominan parcialmente acidorresistentes

Tinciones fluorescentes Tincin naranja de acridina Se utiliza para la deteccin de bacterias y hongos en muestras clnicas. El pigmento se intercala en el cido nucleico (nativo y desnaturalizado). Con pH neutro, las bacterias, los hongos y el material celular se tien de naranja rojizo. Con pH cido (4), las bacterias y los hongos se mantienen de color naranja rojizo, pero el material de fondo se tie de amarillo verdoso Igual que las tinciones acidorresistentes Se utiliza para detectar elementos fngicos y especies de Pneumocystis. La tincin se une a la celulosa y a la quitina de las paredes celulares. El microscopista puede mezclar el pigmento con KOH. (Muchos laboratorios han sustituido la tincin tradicional de KOH por esta tincin) Se acoplan anticuerpos (monoclonales o policlonales) con molculas fluorescentes. La unin especfica a un microorganismo es detectada por la presencia de fluorescencia microbiana. Esta tcnica ha demostrado ser til para detectar o identificar muchos microorganismos (p. ej., Streptococcus pyogenes, Bordetella, Francisella, Legionella, Chlamydia, Cryptospordium y Giardia, virus de la gripe, virus herpes simple). La sensibilidad y la especificidad de la prueba estn determinadas por el nmero de microorganismos presentes en la muestra y la calidad de los anticuerpos utilizados en los reactivos

Tincin auramina-rodamina Tincin blanca de calcofiuor

Tincin directa con anticuerpos fluorescentes

KOH, hidrxido de potasio.

TIPOS Y MEDIOS DE CULTIVO No selectivos Agar sangre Agar chocolate Agar de Mueller-Hinton Tioglicato Agar dextrosa de Sabouraud Selectivos, diferenciales Agar MacConkey Agar de sal manitol Agar xilosa-lisina-desoxicolato Medio de Lowenstein-Jensen Agar Middlebrook CHROMagar Agar de levaduras inhibidor Especializada Agar de extracto de levadura con carbn tamponado (BCYE) Agar cistina-telurita Medio de cultivo LIM (lisina-indol-movilidad) Agar sorbitol MacConkey Agar Regan Lowe Agar sacarosa sales biliares tiosulfato citrato (TCBS)

recuperacin de bacterias y hogos recuperacin de bacterias, incluidas Haemophilus y Neisseria gonorrhoeae susceptibilidad bacteriana enriquecimiento para bacterias anaerobias recuperacin de hongos selectivo para gram negativas; diferencia para fermentadores de lactosa selectiva para estafilococos; diferencial para S. aureus selectiva Salmonella y Shigella en cultivos entricos selectivo de micobacterias selectivo de micobacterias selectivo, diferencial para levaduras selectivo para hongos recuperacin de Legionella y Nocardia recuperacin de Corynebacterium diphteriae recuperacin de Streptococcus agalactiae recuperacin de Escherichia coli O157 recuperacin de Bordetella pertussis recuperacin de especies de Vibrio