Anda di halaman 1dari 4

Uji aktivitas penghambatan tirosinase dilakukan dengan metode yang mengacu pada metode yang digunakan oleh Chiari,

et al. (2010) dengan beberapa modifikasi. Pembuatan Larutan Dapar Fosfat 50 mM pH 6,5 Untuk membuat larutan dapar sebanyak 200 ml, kalium dihidrogen fosfat (BM 136,09) ditimbang seksama sebanyak 1,36 gram, lalu dilarutkan dengan aquades 100 ml. Sebanyak 11 ml larutan NaOH 0,2N ditambahkan ke dalam larutan tersebut dan ditambahkan aquades hingga hampir mencapai 200 ml. pH larutan diukur dan diteteskan NaOH hingga pH mencapai 6,5.

Pembuatan Larutan L-DOPA 2,5 mM L-DOPA (BM 197,19) ditimbang seksama sebanyak 12,4 mg, kemudian dilarutkan dengan dapar fosfat (pH = 6,5) dalam labu ukur sampai 25,0 ml. Pada saat preparasi hingga uji penghambatan tirosinase dilakukan, larutan ini dihindarkan dari cahaya.

Pembuatan Larutan Tirosinase Tirosinase (1715 U/mg) ditimbang seksama sebanyak 1,40 mg kemudian dilarutkan dengan dapar fosfat pH 6,5 dalam labu ukur sampai 10,0 ml. Tirosinase yang terlarut memiliki aktivitas 240 unit/ml. Setelah preparasi hingga uji penghambatan tirosinase, larutan ini disimpan dalam suhu rendah (2-8C).

Uji Pendahuluan Penghambatan Tirosinase Pengukuran Panjang Gelombang Maksimum Untuk menentukan panjang gelombang maksimum sebanyak 1656 l larutan dapar fosfat 50 mM pH 6,5 dan 480 l larutan L-DOPA (2,5 mM) dipipet ke dalam tabung reaksi. Kemudian ditambahkan 250 l larutan tirosinase ke dalam tiap tabung reaksi. Campuran diinkubasi kembali pada suhu kamar selama 20 menit, kemudian diukur serapannya dengan spektrofotometer UV-Vis. Panjang gelombang yang telah digunakan peneliti sebelumnya adalah 450, 475, dan 490 nm (Arung, et al., 2006; Chiari, et al., 2010; Zheng, Tan, dan Wang, 2012)

Optimasi Konsentrasi Substrat L-DOPA Larutan dapar fosfat 50 mM pH 6,5 sebanyak 1656 l dan 480 l larutan L-DOPA dengan konsentrasi 1; 2; 2,5 dan 3 mM dimasukkan kedalam 4 tabung reaksi. Selanjutnya ditambahkan larutan 250 l larutan tirosinase, dihomogenkan menggunakan vortex mixer dan

diinkubasi kembali pada suhu kamar selama 20 menit. Serapan diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi.

Optimasi Waktu Inkubasi Larutan pereaksi yang terdiri dari 1656 l larutan dapar fosfat (50 mM, pH 6,5), dan 480 l larutan L-DOPA dengan konsentrasi sesuai hasil optimasi dimasukkan ke dalam 3 tabung reaksi. Sebanyak 250 l larutan tirosinase ditambahkan pada tiap tabung lalu dihomogenkan menggunakan vortex mixer. Campuran diinkubasi pada suhu kamar dengan berbagai waktu inkubasi yaitu selama 10, 15 dan 20 menit. Serapannya diukur dengan spektrofotometer UV-Vis pada panjang gelombang maksimum hasil optimasi.

Uji Penghambatan Tirosinase Asam Kojat sebagai Kontrol Positif Pembuatan Larutan Asam Kojat sebagai Kontrol Positif Asam kojat sebanyak 50 mg ditimbang saksama dan dilarutkan dalam 10ml dapar fosfat 50 mM pH 6,5 sehingga diperoleh konsentrasi 5000 g/ml. Larutan tersebut dipipet sebanyak 1 ml, dimasukkan ke dalam labu ukur 50,0 ml, lalu dicukupkan volumenya dengan dapar fosfat hingga didapatkan konsentrasi larutan asam kojat 100 g/ml. Selanjutnya dilakukan pengenceran hingga didapatkan larutan asam kojat dengan konsentrasi 5; 10; 20; 40 dan 50 g/ml sebagai variasi konsentrasi pada pengujian untuk mendapatkan nilai IC50. Pengujian Larutan Asam Kojat sebagai Kontrol Positif Siapkan larutan asam kojat dengan konsentrasi 5; 10; 20; 40 dan 50g/ml, larutan LDOPA dengan konsentrasi hasil optimasi, larutan dapar fosfat 50 mM pH 6,5, larutan tirosinase (240 unit/ml), dan tabung reaksi. Komposisi campuran dapat dilihat dalam Tabel 3.1. Campuran dihomogenkan menggunakan vortex mixer, diinkubasi pada suhu kamar selama waktu inkubasi hasil optimasi lalu diukur serapannya dengan spektrofotometer UVVis pada hasil optimasi. Persen inhibisinya dihitung dengan persamaan 2.4 dan dibuat kurva % inhibisi vs konsentrasi asam kojat. Nilai IC50 dihitung menggunakan rumus persamaan regresi linier y = a + bx. Variabel x merupakan konsentrasi sampel dan variabel y merupakan % inhibisi.

Tabel Error! No text of specified style in document..1 Komposisi campuran pada uji penghambatan tirosinase asam kojat

Bahan A Larutan dapar fosfat L-DOPA Larutan asam kojat Larutan tirosinase 1656 480 250 B

Tabung (l) C 1416 480 240 250 D 1666 480 240 -

1906 480 -

A: blanko, B: kontrol blanko, C: sampel, D: kontrol sampel

Uji Penghambatan Tirosinase Ekstrak Daun dan Kulit Batang Matoa Pembuatan Larutan Uji Ekstrak Daun dan Kulit Batang Matoa Ekstrak etanol daun dan kulit batang matoa masing-masing ditimbang seksama sebanyak 50 mg lalu dilarutkan dalam 1 ml DMSO dan dicukupkan volumenya dengan larutan dapar fosfat 50 mM pH 6,5 hingga volume 10,0 ml hingga diperoleh konsentrasi 5000 g/ml. Selanjutnya dilakukan pengenceran hingga didapatkan larutan ekstrak dengan konsentrasi 250; 500 dan 1000 g/ml sebagai variasi konsentrasi pada pengujian untuk mendapatkan nilai IC50. Pengujian Larutan Sampel Ekstrak Etanol Daun dan Kulit Batang Matoa Siapkan larutan uji ekstrak daun dan kulit batang matoa konsentrasi 250; 500 dan 1000 g/ml, larutan L-DOPA dengan konsentrasi hasil optimasi, larutan dapar fosfat 50 mM pH 6,5, larutan tirosinase (240 unit/ml), dan tabung reaksi. Komposisi campuran dapat dilihat dalam Tabel 3.2. Campuran dihomogenkan menggunakan vortex mixer, diinkubasi pada suhu kamar selama waktu inkubasi hasil optimasi lalu diukur serapannya dengan spektrofotometer UV-Vis pada hasil optimasi. Persen inhibisinya dihitung dengan persamaan 2.4 dan dibuat kurva % inhibisi vs konsentrasi ekstrak. Nilai IC50 dihitung menggunakan rumus persamaan regresi linier y = a + bx. Variabel x merupakan konsentrasi sampel dan variabel y merupakan % inhibisi. Tabel Error! No text of specified style in document..2 Prosedur uji penghambatan tirosinase dari ekstrak matoa Bahan A Larutan dapar fosfat L-DOPA 1656 480 B 1906 480 Tabung (l) C 1416 480 D 1666 480

Larutan uji ekstrak Larutan tirosinase

250

240 250

240 -

A: blanko, B: kontrol blanko, C: sampel, D: kontrol sampel

Uji Kinetika Penghambatan Enzim Tirosinase Penentuan kinetika penghambatan enzim dilakukan untuk mengetahui tipe inhibisi dapat diperoleh dengan menggunakan kurva Lineweaver-Burk. Larutan substrat dibuat 5 macam konsentrasi yaitu 20; 10; 5; 2,5 dan 1,25 mM. Pengujian kinetika penghambatan tirosinase dilakukan pada larutan blanko (tanpa penghambat) dan larutan sampel (dengan penghambat). Komposisi campuran dapat dilihat dalam Tabel 3.3. Campuran dihomogenkan menggunakan vortex mixer, diinkubasi pada suhu kamar selama waktu inkubasi hasil optimasi lalu diukur serapannya dengan spektrofotometer UV-Vis pada hasil optimasi. Tabel Error! No text of specified style in document..3 Prosedur pengujian kinetika penghambatan enzim tirosinase Volume (l) Bahan B1 (tanpa penghambat) Larutan dapar fosfat L-DOPA (20; 10; 5; 2,5 dan 1,25) Larutan sampel Enzim Tirosinase 1615 480 250 B0 1906 480 S1 (dengan penghambat) 1416 480 240 250 S0 1666 480 240 -

Dari data yang didapatkan diplot kurva Lineweaver-Burk dengan sumbu x adalah 1/[S] dan y adalah 1/v membentuk persamaan regresi y = a + bx. Hasil plot digunakan untuk menentukan tipe inhibisi sampel uji terhadap enzim tirosinase.