TCNICAS EN PATOLOGA NEUROMUSCULAR

Las enfermedades neuromusculares (ENM) engloban ms de 150 enfermedades que afectan al sistema nervioso o, de forma aislada, al msculo, y en su mayora son de origen gentico. Estas enfermedades son incapacitantes, progresivas y mayoritariamente sin tratamiento eficaz, excepto el sintomtico, lo que conlleva una gran repercusin social, laboral y econmica. Aunque estas enfermedades afectan en conjunto a un nmero considerable de individuos, la gran variedad de entidades nosolgicas descritas hace que cada enfermedad, considerada aisladamente, tenga una baja prevalencia y por lo tanto, estn consideradas como enfermedades raras.

El descubrimiento de la distrofina y el gen que la codifica en 1987 supuso un punto de inflexin a partir del cual se fueron identificando nuevos genes y protenas implicadas en otras enfermedades neuromusculares. Esto permiti conocer en gran medida la estructura molecular de la fibra muscular, as como la relacin entre protenas musculares y de la matriz extracelular. Adems de las ENM que afectan a nervio y unin neuromuscular, se han descrito ms de 40 distrofias musculares individualizadas genticamente, pero a menudo son escasamente conocidas y de difcil diagnstico debido al solapamiento de los cuadros clnicos.

Estudio de protenas musculares por western blot y tcnicas de gnetica aplicadas a las enfermedades neuromusculares: PCR, RFLP y Secuenciacin

Dentro de las distintas metodologas utilizadas para establecer el diagnstico molecular de una enfermedad estn las que se aplican a nivel gentico, a partir de ADN del paciente, generalmente extrado de sangre perifrica o de la misma biopsia muscular. Una de las tcnicas ms habituales es el anlisis directo de mutaciones mediante enzimas de restriccin (PCR-RFLP). Esta tcnica es

muy til en la identificacin de mutaciones frecuentes, como es el caso de la glucogenosis tipo V, en la cual, el estudio por PCR-RFLP de tres mutaciones en el gen responsable de esta enfermedad (PYGM) permite detectar estas mutaciones en el 60% aproximadamente de los pacientes. En cambio, en un elevado nmero de casos, las mutaciones que producen enfermedades neuromusculares son de muy baja frecuencia por lo que es de gran utilidad la secuenciacin de los genes para la bsqueda de las mutaciones responsables de una enfermedad. Adems, la secuenciacin es una herramienta esencial para los estudios de ligamiento o de genes candidatos, ya que permiten identificar aqullos implicados en una determinada enfermedad. Por otra parte, existen metodologas de diagnstico molecular que se aplican a nivel proteico. Entre ellas, la ms empleada es la tcnica de Western blot o inmunoelectroforesis, que permite realizar una cuantificacin proteica, observando la ausencia, sobreexpresin o dficit parcial de una protena muscular, adems de poder determinar si existen alteraciones en el tamao de una protena especfica. En las distrofinopatas, por ejemplo, cobra una gran relevancia esta tcnica ya que permite establecer un diagnstico diferencial entre dos cuadros clnicos producidos ambos por alteraciones en el gen de la distrofina, la distrofia muscular de Duchenne, con ausencia total de distrofina, y la distrofia muscular de Becker, en la que se produce una distrofina anmala, generalmente de menor peso molecular y en menor cantidad. La aplicacin de los estudios moleculares en el campo de la medicina, en particular en el estudio de las enfermedades neuromusculares ha supuesto un cambio drstico en el modo de enfocar el diagnstico, tanto para establecer su etiologa como para aplicar una posible terapia o realizar un consejo gentico.

La biopsia muscular es un instrumento fundamental para el diagnstico de las enfermedades neuromusculares. El manejo adecuado y escrupuloso de la biopsia en el laboratorio de neuropatologa es imprescindible para obtener un diagnstico certero. La muestra debe ser enviada lo antes posible despus de su extraccin, junto con una adecuada informacin de la historia clnica. Tanto la obtencin de la muestra, como la orientacin del tejido, y todo su posterior tratamiento, deben ser realizados con el mximo cuidado posible por personal especializado y unos medios que en no todos los hospitales existen. Tcnicas de histoqumica e inmunohistoqumica en la patologa neuromuscular A diferencia de otros tejidos, la morfologa del tejido muscular esqueltico se preserva mucho mejor en cortes por congelacin, imposible de apreciar en tejido formolado y parafinado. Una vez orientada la muestra, se congela en isopentano enfriado en nitrgeno lquido. El isopentano previene la formacin de cristales de hielo y de esa manera se puede preservar toda la estructura muscular permitindonos realizar, no solo las tcnicas histoqumicas, sino tambin las histoenzimaticas e inmunohistoqumicas. El almacenamiento y conservacin adecuados de la biopsia muscular (en Bancos de Tejidos, si es posible) permitir retomar su estudio para afinar el diagnstico en el caso de descubrimiento de nuevas protenas, obtencin de nuevos anticuerpos o de nuevas tcnicas y ser utilizada en investigacin. La tcnica de HematoxilinaEosina aporta informacin sobre la morfologa y tamao de las fibras musculares, el nmero y aspecto de los ncleos, presencia de infiltrados inflamatorios, acmulos mitocondriales, aumento de glucgeno o de lpidos. Estos detalles se pueden analizar con ms detalle mediante tcnicas especficas como el Tricrmico de Gomori que permite el diagnstico de

determinadas miopatas, como las mitocondriales, en las que se visualizan fibras ragged-red, que presentan acmulos de mitocondrias, algunas miopatas congnitas como la nemalnica, o la miopata por cuerpos citoplsmicos. Tambin se tien de rojo los agregados tubulares y las vacuolas ribeteadas (rimmed vacuoles). El PAS (Periodic Acid Schiff) es fundamental para observar depsitos de glucgeno o los cuerpos de poliglucosano y constituye una tcnica de gran importancia en el diagnstico de enfermedades metablicas como las glucogenosis. El patrn intermiofibrilar y la distribucin de los diferentes tipos de fibras se observan con las tcnicas histoenzimticas, como la Succino-Deshidrogenasa (SDH), especfica de las mitocondrias, que las tie de coloracin azul intensa y junto a la Citocromo-Oxidasa (COX-SDH) resulta de gran ayuda en el diagnstico de las citopatas mitocondriales. Con NADH (Nicotinamide Adenine Dinucleotide Dehydrogenase-Tetrazolium Reductase), se tie de azul intenso las mitocondrias y el retculo sarcoplsmico que constituyen la red intermiofibrilar del sarcoplasma. Las alteraciones estructurales, tales como cores, fibras target, anulares, lobuladas o apolilladas (moth eaten") frecuentemente encontradas en algunas miopatas, se ponen de manifiesto mediante NADH y SDH. Las ATPasas permiten visualizar los diferentes tipos de fibras musculares, que en condiciones normales se distribuyen adoptando una distribucin en tablero de ajedrez, alternando fibras de tipo1 y 2, mientras en determinadas circunstancias patolgicas, como la atrofia neurgena de larga evolucin se produce una agrupacin por tipos de fibras como resultado de la reinervacin. Otras tcnicas enzimticas como la Miofosforilasa permiten el diagnstico de Glucogenosis V (Enfermedad de McArdle), cuando no se observa tincin. El dficit de Mioadenilato Desaminasa (MAD) tambin puede ser diagnosticado mediante la ausencia de tincin histoqumica, aunque el grado de tincin puede ser variable y se pueden producir dficits secundarios a otras patologas. El descubrimiento de diferentes protenas del sarcolema, sarcoplasma o del ncleo de las fibras musculares y su estudio inmunohistoqumico ha modificado de forma notable la clasificacin de las Distrofias Musculares y ha hecho posible llegar a un diagnstico exacto de stas. Dada la complejidad y la estrecha relacin entre las diferentes protenas, el nmero de anticuerpos a analizar debe ser numeroso y dirigido. No todas las enfermedades debidas al dficit de una protena presentan una ausencia total de la misma siendo difcil su valoracin, por lo que requiere especialistas en este campo. En la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD) se observa una ausencia total de inmunomarcaje para la protena distrofina, exceptuando la fibras revertans, con marcaje positivo en un porcentaje generalmente inferior al 5% de las fibras musculares y secundariamente disminuye o desaparece el inmunomarcaje del complejo de protenas asociadas a la distrofina, DAP (Dystrophin-Associated Proteins complex) debido a la desestabilizacin del complejo proteico. Paralelamente se produce una sobreexpresin de DRP2 (Dystrophin-Related Protein) en un intento de suplir la ausencia de distrofina. Otras distrofias muculares presentan mayor dificultad interpretativa del estudio inmunohistoqumico, como la Distrofia Muscular de Becker (DMB) en la que el inmunomarcaje de distrofina suele ser irregular y tenue, a veces con fibras negativas en alguno de los dominios de la protena. Las portadoras sintomticas presentan un patrn de expresin de distrofina en mosaico, con grupos de fibras positivas y otros grupos negativos, sobreexpresin de DRP2 en las fibras distrofina-negativas y ausencia de sobreexpresin en las fibras normales.

En las Sarcoglicanopatas, adems del dficit de la protena mutada (alfa, beta, gamma o delta sarcoglicano), se produce una alteracin en la expresin del resto de las protenas del complejo DAP Utilidad de la Microscopa Electrnica en el diagnstico de las enfermedades neuromusculares La microscopa electrnica (ME) ocupa un lugar estratgico en el diagnstico de algunas enfermedades neuromusculares no diagnosticables mediante microscopa ptica. Permite en muchos casos entender el mecanismo fisiopatolgico e incluso orientar el estudio molecular. La biopsia de msculo esqueltico o del nervio perifrico se obtiene tras un estudio detallado clnico, analtico y electrofisiolgico de los pacientes con sospecha de enfermedad neuromuscular. Las muestras se procesan para estudio histolgico, histoqumica e inmunohistoqumico. Tras realizar estos exmenes, el neuropatlogo decide la necesidad de efectuar un estudio ultraestructural, ya que se trata de un procedimiento que requiere formacin y dedicacin especficas. Las muestras, sin embargo, se deben incluir en resina de forma rutinaria en todos los casos, realizndose cortes semifinos y ultralfinos para su posterior examen. La introduccin de la microscopa electrnica en el estudio de las enfermedades neuromusculares constituy una aportacin fundamental en el conocimiento de la morfologa normal y patolgica del msculo esqueltico y del nervio perifrico. Con ello aument de manera sustancial el rendimiento de estas biopsias, herramienta diagnstica fundamental a pesar de la creciente importancia de la inmunohistoqumica y de la biologa molecular en las enfermedades neuromusculares. Adems de revelar nuevos datos sobre las estructuras observables mediante microscopa ptica como el sarcoplasma o el ncleo, la ME identific estructuras hasta entonces poco conocidas, como las mitocondrias, el aparato de Golgi, los lisosomas, la estructura sarcomrica o el sistema sarcotubular. El estudio ultraestructural sistemtico permiti conocer alteraciones patognomnicas de determinadas enfermedades neuromusculares, cuya relevancia diagnstica contina vigente en la actualidad, como las observables en muchas miopatas congnitas, metablicas, txicas o inflamatorias. Tambin permite confirmar el diagnstico sugerido por el estudio inmunohistoqumico en las miopatas con dficit de protenas del sarcolema, la matriz extracelular o la membrana nuclear y es particularmente relevante en las enfermedades con alteraciones del sarcoplasma, tales como las miopatas vacuolares, la miositis por cuerpos de inclusin, la miopata por agregados tubulares, las enfermedades mitocondriales o las miopatas miofibrilares, siendo una herramienta clave en su diagnstico diferencial. Entre las miopatas vacuolares, el estudio ultraestructural permite caracterizar la presencia o no de membrana delimitando la estructura vacuolar, el contenido de las mismas, su carcter autofgico o lisosomal e incluso identificar un subgrupo en el que la membrana vacuolar contiene una lmina basal interna, similar a la que rodea al sarcolema, que constituyen las miopatas vacuolares de caractersticas sarcolmicas, como la enfermedad de Danon o la miopata vacuolar autofgica hereditaria ligada a X (X-MEA). La ME es un mtodo accesible y fiable para la caracterizacin del material de depsito en las distintas enfermedades metablicas, permitiendo un diagnstico certero de determinadas glucogenosis, lipidosis, ceroidolipofuscinosis y otras; identificando depsitos de amiloide o estructuras caractersticas como los cuerpos de Lafora o el material granular osmioflico (GOM)

del CADASIL. Existen adems estructuras no identificables mediante microscopa ptica como las espirales cilndricas, las inclusiones en huella digital, las inclusiones tipo cap, las inclusiones filamentosas intranucleares de la distrofia culo-farngea o de la miositis por cuerpos de inclusin o las inclusiones tbulo-reticulares de las clulas endoteliales caractersticas de la dermatomiositis. En la biopsia de msculo esqueltico o de nervio perifrico, es importante el estudio minucioso no slo de las fibras musculares o nerviosas, sino de las estructuras vasculares y los fibroblastos del peri y endomisio, que en muchas enfermedades pueden reflejar la patologa subyacente, como en la Enfermedad de Pompe o en la de Fabry.

En las imgenes podemos observar el trabajo en laboratorio para realizar en anlisis de una biopsia muscular con histoqumica e inmunohistoqumica y microscopia electrnica.

Conclusin

En conclusin, la microscopa electrnica es una herramienta de gran inters y utilidad en el estudio de la patologa neuromuscular, cuyas principales indicaciones con fines diagnsticos, son las enfermedades metablicas, las miopatas miofibrilares y las miopatas vacuolares, adems del extenso grupo de las miopatas congnitas. Potencialmente, el estudio ultraestructural puede

ayudar a entender el mecanismo fisiopatolgico de las enfermedades neuromusculares, en su mayora poco conocido, e incluso orientar el estudio molecular y gentico. Bibliografa https://www.seap.es/documents/228448/526861/01_Barrera.pdf http://screeninglab.net/index.html http://www.asem-esp.org/index.php/las-enfermedades-neuromusculares