Produção de Bioetanol A Partir de Licor de Cozimento Ao Sulfito Ácido

Universidade de Aveiro
2008
Departamento de Qumica
Mariana Fernandes
Correia

Produo de bioetanol a partir de licor de
cozimento ao sulfito cido

II

Universidade de Aveiro
2008
Departamento de Qumica
Mariana Fernandes
Correia

Produo de bioetanol a partir de licor de cozimento
ao sulfito cido

Dissertao apresentada Universidade de Aveiro para cumprimento dos
requisitos necessrios obteno do grau de Mestre em Materiais Derivados
de Recursos Renovveis, realizada sob a orientao cientfica do Professor
Doutor. Dmitry Victorovich Evtuguin, Professor Associado do Departamento de
Qumica da Universidade de Aveiro e da Professora Doutora Ana Barreto
Xavier, Professora Auxiliar do Departamento de Qumica da Universidade de
Aveiro.

Apoio financeiro do Projecto
Biorrefinaria: Potencialidades do licor
de cozimento de Eucalyptus globulus
ao sulfito cido com a indstria Caima,
S.A. no mbito do Projecto de
Investigao Cientfica e
Desenvolvimento Tecnolgico
CICECO/DQUA

III

o jri
presidente Prof. Doutor Armando Jorge Domingues Silvestre
Professor Associado com Agregao da Universidade de Aveiro

Prof. Doutora Isabel Maria Pires Belo
Professora Auxiliar da Universidade do Minho

Prof. Doutor Dmitry Evtuguin
Professor Associado com Agregao da Universidade de Aveiro

Prof. Doutora Ana Maria Rebelo Barreto Xavier
Professora Auxiliar da Universidade de Aveiro

Eng. Antnio Fernandes dos Santos Prates
Director de Laboratrio e Ambiente, Caima Indstria de Celulose, S.A.

IV

agradecimentos

Professora Doutora Ana Xavier agradeo a orientao de todo o trabalho,
apoio, empenho, carinho e amizade.

Ao Professor Doutor Dmitry Evtuguin agradeo todo o apoio, ensinamento
incansvel e amizade.

Ao Engenheiro Antnio Prates em representao da Caima, S.A., agradeo o
apoio financeiro de toda a investigao que permitiu desenvolver um trabalho
em cooperao com a indstria de grande interesse actual, assim como a
cedncia do licor para todo o projecto. Agradeo tambm o apoio financeiro
para deslocamentos a congressos e a concesso da Bolsa de Investigao.

Professora Doutora Isabel Spencer-Martins agradeo toda a orientao
durante o trabalho experimental, assim como a oferta das leveduras
desacidificantes da Portuguese Yeast Culture Collection da qual directora.

Dra. Mimi agradeo a ajuda incansvel e orientao nas anlises de HPLC.

s colegas de laboratrio Sandra, Sara e Paula agradeo a orientao nas
anlises de GC-FID.

Aos colegas de laboratrio e amigos Raquel, Ana Sofia, Rui, Nuno, Pedro, Ana
Patrcia, Gisela e Catarina agradeo a amizade e ajuda durante a parte
experimental do trabalho.

Universidade de Aveiro agradeo a oportunidade de realizar esta
investigao.

minha famlia, pais, irm e Hugo agradeo o apoio, incentivo, amizade e
carinho que sempre demonstraram durante toda a minha formao acadmica
e especialmente na concretizao deste projecto.

V

palavras-chave

Bioetanol, xilose, fermentao, licor ao sulfito cido, Eucalyptus globulus,
Pichia stipitis, Saccharomyces cerevisiae, desacidificao.

resumo

O Licor de Cozimento ao Sulfito cido (HSSL) utilizado neste trabalho
um subproduto da indstria papeleira originado a partir do processo de
cozimento da madeira de Eucalyptus globulus com cido bissulfito. Este
contm dissolvido lenhosulfonatos e produtos resultantes da hidrlise das
hemiceluloses dos quais 40-45gL
-1
so monossacardeos, e em maioria
xilose.
A fraco de acares presente, pode ser usada como substrato na
produo de vrios compostos, nomeadamente etanol. O objectivo deste
estudo desenvolver um processo biotecnolgico de produo de bioetanol
a partir deste licor usando uma levedura fermentadora de pentoses, a Pichia
stipitis, tendo como finalidade a produo de um biocombustvel em
alternativa s fontes fsseis.
A primeira parte do trabalho foi o estudo do metabolismo da Pichia stipitis
na presena de diferentes concentraes de licor e em diferentes reactores:
Erlenmeyer e Biorreactor com controlo de pH. No entanto, os rendimentos e
produtividades de etanol foram reduzidos devido presena de compostos
inibidores como o cido actico (cerca de 8gL
-1
), o hidroximetilfurfural e os
lenhosulfonatos.
A segunda parte envolveu a remoo desses mesmos inibidores por
diferentes mtodos incluindo a desacidificao biolgica com diferentes
leveduras, das quais a Saccharomyces cerevisiae apresentou melhores
resultados removendo todo o cido actico em menos de 30h. A evaporao
para reduo de compostos volteis e separao da fraco de acares
usando resinas de troca inica foram os outros dois mtodos. Os melhores
resultados foram obtidos usando este ltimo com rendimento de etanol de
0,48g etanol/g acar consumido. Ainda na optimizao do meio fermentativo
foi testada uma enzima comercial para aumento dos acares disponveis
fermentao, o que resultou num aumento de 30% de xilose e a glucose quase
quadriplicou.

VI

keywords

Bioethanol, xylose, fermentation, Hardwood Spent Sulphite Liquor, Eucalyptus
globulus, Pichia stipitis, Saccharomyces cerevisiae, deacidification.

abstract

Hardwood Spent Sulfite Liquor (HSSL) is a waste by-product of pulp mills
formed during wood delignification with bisulfite solution. HSSL contains
dissolved lignosulfonates and hemicellulose hydrolysis products, which
comprises 40-45 gL
-1
sugars, mainly xylose.
The sugar fraction can be used as a substrate for the production of
diverse products including ethanol. The objective of this study is to propose a
biotechnological approach to produce bioethanol, alternative to fossil fuels,
from this liquor using a xylose fermenting yeast: Pichia stipitis.
The first part of this work was to study Pichia stiptis metabolism in the
presence of different HSSL concentrations and in different reactors:
Erlenmeyer and Biorreactor with pH control. However, ethanol yield and
productivities obtained were reduced due to presence of inhibiting
compounds like acetic acid (about 8gL
-1
), hydroxymethylfurfural and
lignosulfonates.
The second part involved different detoxification methods including
biological methods with different deacidificant yeasts, evaporation to reduce
volatile compounds and sugar fraction separation using ion-change resins.
The best results were obtained with this separation device, where the ethanol
yield was maximum (0,48g ethanol/g sugar consumed). The best
deacidification was reached with Saccharomyces cerevisiae allowing the
total acetic acid removal during 30h. In addition to media optimization trials
some enzymatic hydrolysis were also carried out and resulted in 30% xylose
increase and about four times of glucose.

ndice
VII
NDICE

NDICE............................................................................................................VII
NDICE DE FIGURAS............................................................................................ X
NDICE DE TABELAS..........................................................................................XII
LISTA DE ABREVIATURAS................................................................................. XIII
1. INTRODUO ................................................................................................. 1
2. REVISO BIBLIOGRFICA................................................................................. 3
2.1 BIOCOMBUSTVEIS............................................................................... 4
2.1.1 Biocombustveis em Portugal ........................................................... 6
2.1.2 O caso do Bioetanol ....................................................................... 7
2.2 MICRORGANISMOS............................................................................... 9
2.2.1 Microbiologia do Gnero Pichia......................................................... 9
2.2.2 Leveduras Desacidificantes.............................................................10
2.3 PROCESSO FERMENTATIVO...................................................................11
2.3.1 Bioqumica da Fermentao Etanlica ..............................................11
2.3.2 Cintica de Fermentao................................................................14
2.4 FORMAO E ORIGEM DOS LENHOSULFONATOS......................................17
2.4.1 Composio Qumica da Madeira .....................................................17
2.4.2 Processo de Cozimento ao Sulfito cido (Sulfite Pulping) ....................20
2.4.3 Degradao do Material Lenhocelulsico...........................................22
1.5 REMOO DE INIBIDORES....................................................................25
1.5.1 Mtodos Fsico-Qumicos ................................................................25
1.5.2 Mtodos Biolgicos........................................................................26
2. MTODOS EXPERIMENTAIS............................................................................. 27
2.1 MICRORGANISMOS - manuseamento e manuteno.................................28
2.2 MEIOS DE CULTURA.............................................................................28
2.2.1 Meios de Cultura Gerais .................................................................28
2.2.2 Meios de Cultura Selectivos ............................................................29
2.3 ASSPSIA E AMOSTRAGEM ...................................................................32
2.3.1 Asspsia......................................................................................32
2.3.2 Amostragem ................................................................................32
2.4 CONDIES DE INOCULAO E CRESCIMENTO .......................................33
2.4.1 Pr -Tratamento do Licor ...............................................................33
ndice
VIII
2.4.2 Condies de Fermentao Lquida ..................................................33
2.4.2.1 Fermentaes em Erlenmeyer........................................................ 34
2.4.2.2 Fermentaes em Biorreactor ........................................................ 34
2.5 MTODOS ANALTICOS ........................................................................35
2.5.1 Anlise do Licor (Hardwood Spent Sulfite Liquor)...............................35
2.5.1.1 - Teor de lenhosulfonatos ............................................................. 35
2.5.1.2 - Teor de Cinzas e pH................................................................... 35
2.5.1.3 - Teor de Acares Redutores por oxidao do cido 3,5- dinitrosaliclico
(mtodo de DNS) .................................................................................... 35
2.5.1.4. - Anlise de Monossacardeos....................................................... 36
Recta de Calibrao................................................................................. 37
Quantificao de Acares nas Amostras .................................................... 38
2.5.2 Determinao de Biomassa ............................................................38
2.5.2.1 Mtodo Gravimtrico .................................................................... 38
2.5.2.2 Mtodo Turbidimtrico .................................................................. 39
2.5.3 Anlise por HPLC (Consumos e Produo).........................................39
2.5.4 Espectroscopia de FT-IR ................................................................40
2.5.4 Anlise Elementar .........................................................................40
2.6 HIDRLISE ENZIMTICA ......................................................................40
2.7 REMOO DE INIBIDORES....................................................................41
2.7.1 Desacidificao Biolgica................................................................42
2.7.1.1 Meio Slido.................................................................................. 42
2.7.1.2 Meio Lquido ................................................................................ 42
2.7.2 Desacidificao por Evaporao ......................................................43
2.7.3 Remoo de Lenhosulfonatos..........................................................43
3. RESULTADOS E DISCUSSO ........................................................................... 46
3.1.COMPOSIO DO LICOR.......................................................................47
3.2 FERMENTAES EM ERLENMEYER..........................................................48
3.2.1 Meios Sintticos............................................................................48
3.2.2 Fermentaes Sequenciais com Licor Industrial .................................50
3.3 FERMENTAES EM BIORREACTOR........................................................53
3.3.1 Ensaio Abitico.............................................................................54
3.4 HIDRLISE ENZIMTICA ......................................................................55
ndice
IX
3.5 DESACIDIFICAO POR ARRASTAMENTO DE VAPOR.................................57
3.6 DESACIDIFICAO - ABORDAGEM BIOLGICA........................................57
3.6.1 Escolha de Levedura desacidificante em meio slido...........................58
A - Meios com Acares e cido actico..................................................... 58
i)- Meio com 0,6% (p/v) de cido actico: ................................................59
ii) - Meio com 0,8% (p/v) de cido actico: ..............................................59
B - Meios sem Acares com cido actico................................................. 60
i) Meio com 0,6% (p/v) de cido actico: .................................................61
ii) Meio com 0,8% (p/v) de cido actico:.................................................61
3.6.2 Optimizao da etapa de desacidificao ..........................................63
A - Fermentao com Saccharomyces cerevisiae ......................................... 63
B - Fermentao com Candida tropicalis..................................................... 64
C - Fermentao com Candida utilis........................................................... 65
D - Fermentao com Pichia anomala ........................................................ 66
3.7 RESINAS DE TROCA INICA..................................................................68
4. CONCLUSES ............................................................................................... 71
5. BIBLIOGRAFIA .............................................................................................. 74
6. ANEXOS....................................................................................................... 79
ANEXO 1 - Rectas de Calibrao (HPLC).......................................................80
ANEXO 2 - Rectas de Calibrao (GC-FID)....................................................81
ANEXO 3 - Grficos correspondentes s fermentaes em Erlenmeyers ............82
ANEXO 4 - Espectro de FT-IR relativo ao ensaio abitico. ...............................85

ndice
X
NDICE DE FIGURAS

Figura 1 - Representao esquemtica do ciclo de CO
2
na utilizao de biocombustveis
[4]. ................................................................................................................... 5
Figura 2 - Evoluo do Consumo de Biocombustveis em Portugal. [1] ........................ 6
Figura 3 - Evoluo da produo de bioetanol na UE-15 [8]. ..................................... 8
Figura 4 - Clula tpica de levedura: a) esquema representativo b) fotografia ao
microscpio electrnico (Adaptado de Rocha, C.M.R, 1996). .................................... 10
Figura 5 - Esquema representativo do processo de fermentao etanlica a partir de
glucose............................................................................................................ 12
Figura 6 - Vias metablicas de converso de xilose a xilulose e consequente converso
de xilulose a etanol ........................................................................................... 12
Figura 7 - Curva de crescimento microbiano. ........................................................ 15
Figura 8 - Esquema da estrutura da celulose (Adaptado de Moore et al, 1998)........... 17
Figura 9 - Monossacardeos principais das hemiceluloses. ....................................... 18
Figura 10 - Esquema da estrutura da lenhina proposto por Adler, em 1977 ............... 19
(Adaptado de Lee, J., 1997 [34])......................................................................... 19
Figura 11 - Esquema de Produo da pasta de papel e formao do HSSL................. 21
Figura 12 - Esquema da decomposio da madeira originando compostos inibidores
(Adaptado de Mussatto et al,2004) ...................................................................... 23
Figura 13 - Exemplos de alguns compostos fenlicos existentes no HSSL. ................. 24
Figura 14 - Influncia da concentrao de cido actico na produtividade e rendimento
de etanol pela P. stipitis ..................................................................................... 24
Figura 15 - Curva de calibrao obtida entre o peso seco e a densidade ptica a 650nm
de Pichia stipitis. ............................................................................................... 39
Figura 16 - Esquema ilustrativo do trabalho desenvolvido na tese. ........................... 45
Figura 17 - Curvas de crescimento nos meios sintticos em Erlenmeyer.................... 49
Figura 18 - Curvas de consumo de acares e produo de etanol em meios sintticos
(smbolos a cheio correspondem ao meio com cido actico e smbolos a vazio ao meio
sem cido). ...................................................................................................... 49
Figura 19 - Grfico de barras representativo da produtividade volumtrica das
fermentaes em Erlenmeyer.............................................................................. 52
Figura 20 - Exemplo de uma das contaminaes obtidas para alguns ensaios em
Erlenmeyer: ..................................................................................................... 52
A) observao em placa de Petri ; B) observao ao microscpio. ............................ 52
Figura 21 - Fotografia do depsito observado no ensaio abitico com 40% de licor. .... 54
ndice
XI
Figura 22 - Grfico de barras representativo do aumento de glucose por hidrlises
enzimtica ....................................................................................................... 55
Figura 23 - Grfico de barras representativo do aumento de xilose por hidrlises
enzimtica ....................................................................................................... 56
Figura 24 - Esquema do estudo de pH de acordo com as zonas de viragem dos
indicadores....................................................................................................... 58
Figura 25 - Exemplos das fotografias tiradas s placas de meio slido diferencial: a)
mudana de cor no meio prpura por C. utilis, b) crescimento em meio verde por S.
cerevisiae. ....................................................................................................... 61
Figura 26 - Grfico do crescimento e consumos da fermentao com Saccharomyces
cerevisiae ........................................................................................................ 63
Figura 27 - Grfico do crescimento e consumos da fermentao com Candida tropicalis64
Figura 28- Grfico do crescimento e consumos da fermentao com Candida utilis. .... 65
Figura 29 - Grfico do crescimento e consumos da fermentao com Pichia anomala. . 66
Figura 30 - Curvas de consumos do processo de desacidificao em meio lquido: a) com
Saccharomyces cerevisiae seguida de adio de Pichia stipitis b) com Saccharomyces
cerevisiae seguida de filtrao e adio de Pichia stipitis ......................................... 68
Figura 30- Fermentao da soluo de acares a pH 7,0 (linhas a cheio) e pH 5,8
(linhas a tracejado). .......................................................................................... 70
Figura 31- Fermentao em meio suplementar (MS) e 0% de licor. .......................... 82
Figura 32 - Fermentao com 20% de licor........................................................... 82
Figura 35 - Fermentao com 40% de licor em biorreactor ..................................... 84

ndice
XII
NDICE DE TABELAS

Tabela 1 - Propriedades da Gasolina em comparao com o Bioetanol (Adaptado de
European Biomass Industry Association)................................................................. 9
Tabela 2 - Composio qumica da madeira (compostos principais). ......................... 20
Tabela 3 - Composio do meio YM. .................................................................... 29
Tabela 4 - Composio do meio MS. .................................................................... 29
Tabela 5 - Composio das solues base que permitiram preparar os diferentes meios
de cultura selectivos slidos................................................................................ 30
Tabela 6 - Esquema das composies das fermentaes em % (v/v)........................ 34
Tabela 7 - Tabela resumo dos ensaios feitos para a hidrlise enzimtica. .................. 41
Tabela 8 - Tabela resumo dos ensaios feitos com a soluo de acares recolhida das
colunas de permuta inica. ................................................................................. 44
Tabela 9 - Composio do Hardwood Spent Sulfite Liquor (HSSL) de Eucalyptus globulus
ao sulfito cido. ................................................................................................ 47
Tabela 10 - Composio dos meios de fermentao sintticos (concentraes em gL
-1
).48
Tabela 11 - Composio das fermentaes em Erlenmeyer em termos de concentrao
(gL
-1
). ............................................................................................................. 50
Tabela 12 - Composio inicial das fermentaes e dados das curvas de crescimento. 51
Tabela 13 - Tabela resumo dos resultados de consumos e produo das fermentaes
em Erlenmeyers................................................................................................ 51
Tabela 14 - Tabela resumo da fermentao feita em biorreactor com 40% (v/v) de licor.53
Tabela 15 - Resultados obtidos por anlise elementar ............................................ 54
Tabela 16 - Composio do licor no incio e final da destilao por arrastamento de
vapor. ............................................................................................................. 57
Tabela 17 - Resultados do crescimento e mudana de cor no meio slido selectivo com
acares e 6,0gL
-1
de cido actico. ..................................................................... 59
Tabela 18 - Resultados do crescimento e mudana de cor no meio slido selectivo com
acares e 8,0gL
-1
de cido actico. ..................................................................... 60
Tabela 19 - Resultados de crescimento e mudana de cor no meio slido selectivo sem
acares e 6,0gL
-1
de cido actico. ..................................................................... 61
Tabela 20 - Resultados de crescimento e mudana de cor no meio slido selectivo sem
acares e 8,0g/L de cido actico....................................................................... 62
Tabela 21 - Tabela resumo das fermentaes com leveduras desacidificantes. ........... 66
Tabela 22 - Composio da soluo de acares recolhida a partir de separao inica
do licor por resinas catinica e aninica. ............................................................... 69
ndice
XIII
Tabela 23- Resumo das fermentaes com a soluo de acares a diferente pH........ 70

LISTA DE ABREVIATURAS

GEE - Gases com Efeito de Estufa

PNAC - Plano Nacional de Alteraes Climticas

FT-IR - Espectrsocopia de Infravermelho por Transformadas de Fourier

GC-FID - Cromatografia Gasosa com Detector de Ionizao de Chama

HPLC - Cromatografia Gasosa de Alta Eficincia

YM - Yeast Medium

MS - Meio Suplementar

HSSL - Hardwwod Spent Sulfite Liquor

NRRL -Northern Regional Research Laboratory (Illinois, USA)

PYCC - Portuguese Yeast Culture Collection

UV/Vis - Espectroscopia de Ultravioleta/Vsivel

0
- taxa especfica de crescimento

Yp/s- rendimento (gramas de produto/ g de substrato consumido)

Qp
max
- produtividade mxima (g de produto formado/ L meio fermentado x hora)

Introduo
1

1. INTRODUO

Introduo
2

O recurso a biocombustveis em alternativa aos combustveis fsseis tem sido
cada vez mais uma das grandes prioridades a nvel mundial em termos econmicos e
ambientais. Em pases como os Estados Unidos ou o Brasil, o bioetanol j uma
realidade bastante bem estruturada e com uma produo cada vez maior. No entanto,
este biocombustvel classificado de 1 gerao, ou seja, so cultivadas culturas como
a beterraba e o milho com a finalidade quase exclusiva de produzir bioetanol por
fermentao.
Neste trabalho pretende-se precisamente evitar este processo, que levaria a longo
prazo, distoro de valores de mercado destes bens alimentares. Deste modo,
pretende obter-se etanol a partir de um subproduto da indstria papeleira e assim
desenvolver biocombustvel de 2 gerao, ou seja, de produtos no comestveis. A
grande vantagem deste processo o baixo custo que o substrato apresenta para a
indstria o que se torna vantajoso em casos de rendimentos etanlicos elevados, em
que o custo de produo final ser mais baixo

A Indstria Papeleira envolvida nesta cooperao - Caima, SA., produz pasta
branca para o fabrico de papel de acordo com o mtodo de cozimento ao sulfito cido
de Eucalyptus globulus produzindo, para alm da pasta, um licor denominado Licor de
Cozimento ao Sulfito cido (Hardwood Spent Sulfite Liquor ou HSSL). este licor, rico
em pentoses, que se pretende ser valorizado e, por fermentao com leveduras, obter o
bioetanol.

Na primeira parte do trabalho foi ento escolhida e aplicada em vrios processos
de fermentao, quer em Erlenmeyer quer em biorreactor, a levedura Pichia stiptis Y-
7124 por ser conhecida como uma das melhores leveduras fermentadoras de pentoses.
No entanto, medida que foram sendo avaliados os resultados das fermentaes
concluiu-se que o licor apresentava alguns compostos inibidores que teriam que ser
minimizados ou removidos. A segunda parte do trabalho teve ento como principal
objectivo a remoo precisamente destes compostos, nomeadamente do cido actico,
lenhosulfonatos e compostos fenlicos, optimizando desse modo o rendimento de etanol
produzido.

Reviso Bibliogrfica
3

2. REVISO BIBLIOGRFICA

Reviso Bibliogrfica
4
2.1 BIOCOMBUSTVEIS

A Unio Europeia est longe de ser auto-suficiente em energia e na Europa dos
23, a dependncia de produtos energticos est estimada em cerca de 50%,
essencialmente em petrleo, gs natural e carvo.
No entanto, esta tendncia para a dependncia energtica aumentou com a
entrada dos novos pases da adeso e poder atingir os 70% nos prximos 20 a 30
anos, se no tornarmos mais competitiva a produo interna de energia (nuclear e
renovvel) e se no utilizarmos a energia de uma forma mais racional (conservao e
eficincia).
O sector dos transportes responsvel por mais de 30% do consumo final de
energia na EU e depende 98% de produtos petrolferos, sendo responsvel pela emisso
de quase mil milhes de toneladas de CO
2
(um tero das emisses totais).
Os desafios europeus neste sector vm com a substituio de uma parte dos
combustveis fsseis convencionais (gasleo e gasolina) por combustveis alternativos
eliminando o chumbo e o enxofre nesta rea [1].

O termo biocombustvel engloba todos os combustveis (slido, lquido ou gs)
produzidos a partir de organismos vivos ou de subprodutos metablicos e que tenham
origem em materiais renovveis [2]. Com os biocombustveis esto sempre associados
conceitos de sustentabilidade, reduo do efeito de estufa devido diminuio de
emisses gasosas, desenvolvimento regional, social e agrcola.

Teoricamente um biocombustvel pode ser produzido a partir de qualquer fonte de
carbono, no entanto a mais comum tem sido as plantas fotossintticas que capturam a
energia solar. Esta biomassa tem sido reconhecida como a maior fonte de energia
renovvel para suprimir o declnio das fontes fsseis. de facto uma reserva atractiva
essencialmente por trs razes. Primeiro, por ser renovvel e consequentemente,
sustentvel a um desenvolvimento futuro. Segundo, porque demonstra propriedades
ambientais positivas muito boas tais como baixos nveis de CO
2
e enxofre nas suas
vrias formas. Terceiro, aparentemente o potencial econmico bastante significativo
relativamente ao aumento sucessivo dos preos dos combustveis fsseis no futuro [3].

Os biocombustveis trazem ento vrias vantagens:

- So facilmente conseguidos a partir de diversas fontes de biomassa;
- So biodegradveis e contribuem para a sustentabilidade [3];
Reviso Bibliogrfica
5
- Permitem a mistura, em pequenas percentagens, com os combustveis
actualmente utilizados sem perda das caractersticas destes;
- No implicam alteraes dos motores dos veculos actuais, se misturados em
pequenas percentagens;
- No h alteraes profundas na logstica de distribuio de combustveis, uma
vez que se podem aproveitar as existentes, sem custos adicionais ou muito reduzidos
para os postos de abastecimento;
- A produo de biocombustveis poderia ser completamente feita a partir de
biomassa produzida na prpria EU at cerca de 8%;
- A sua combusto neutra em relao ao CO
2
, pois o carbono contido na
biomassa foi capturado na atmosfera (Figura 1).

Figura 1 - Representao esquemtica do ciclo de CO2 na utilizao de biocombustveis [4].

No entanto, h ainda a salientar alguns inconvenientes:

Energia solar e CO2
biomassa
colheita
pr-processamento
celulose
hidrlise
acares
fermentao
microbiana
BIOCOMBUSTVEIS CO2
CO2
CO2
CO2
CO2
Reviso Bibliogrfica
6
- Neste momento ainda so caros, em relao aos combustveis convencionais que
substituem, sobretudo em cenrios de petrleo barato;
- H uma reduzida disponibilidade de terreno agrcola para o cultivo de matrias-
primas;
- H j uma distoro dos valores de mercado de bens alimentares agrcolas e um
risco dessa mesma distoro aplicada tambm aos produtos com origem na floresta
(indstria papeleira e de aglomerados) face a uma potencial concorrncia [1].

2.1.1 Biocombustveis em Portugal

Em Portugal o Quadro Legal regula-se entre outros, pelo Decreto-Lei n62/2006
que transpe para a Directiva n2003/30/CE e que cria mecanismos para promover a
colocao no mercado de quotas mnimas de biocombustveis. Esta prev a celebrao
de acordos para a utilizao de biocombustveis em frotas de transportes pblicos e
ainda introduz o conceito de pequeno produtor com vocao para o aproveitamento de
matrias residuais ou para a utilizao de processos inovadores para o desenvolvimento
tecnolgico de produtos menos poluentes [1]. Na Figura 2 est representada a previso
da evoluo do consumo de biocombustveis em Portugal at 2010:

Evoluo esperada da introduo no consumo em
Portugal de Biocombustveis
0
100000
200000
300000
400000
500000
600000
700000
Ano
T
o
n
e
l
a
d
a
s
Biodiesel 159 79547 195000 320000 370000 580000
Bioetanol 0 0 0 40000 80000 150000
2005 2006 2007 2008 2009 2010

Figura 2 - Evoluo do Consumo de Biocombustveis em Portugal [1].

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7
O sector dos transportes em Portugal a segunda maior fonte de GEE (Gases com
Efeito de Estufa) e representam cerca de 30% das emisses nacionais. O sector
rodovirio representa 80% [1].

A Resoluo do Conselho de Ministros n. 119/2004, de 31 de Julho, estabeleceu,
mediante a adopo do Programa Nacional para as Alteraes Climticas (PNAC 2004),
as medidas tidas como adequadas para que Portugal viesse a atingir as metas que lhe
esto fixadas no mbito do Protocolo de Quioto (PQ) e do Acordo de partilha de
responsabilidades da Unio Europeia.
Nos termos desse Acordo (Deciso n. 2002/358/CE, de 25 de Abril) esto
definidas metas diferenciadas para cada um dos Estados-Membros da Unio Europeia de
modo a no pr em causa a meta comunitria de 8% de reduo global das emisses
de gases com efeito de estufa (GEE) no primeiro perodo de cumprimento do PQ (2008-
2012) face aos valores de 1990. Atravs desse Acordo, Portugal obrigou-se a limitar,
nesse perodo, o aumento das suas emisses de GEE em 27% sobre o valor verificado
em 1990 [5].

2.1.2 O caso do Bioetanol

O etanol ou lcool etlico (CH
3
CH
2
OH) produzido a partir de materiais celulsicos
uma das solues com vista reduo do consumo excessivo de crude e como
consequncia o aumento da poluio ambiental.
Ao contrrio da gasolina, o etanol um combustvel oxigenado que contm 35%
de oxignio, o que reduz as emisses de NO
x
levando a uma maior eficincia e portanto
resultando numa combusto mais limpa a temperaturas relativamente baixas.

Consideram-se duas categorias principais: o bioetanol de primeira gerao,
fabricado a partir de matrias vegetais produzidas pela agricultura (beterraba, trigo,
milho, colza, girassol, cana-de-acar) e que entram em concorrncia com culturas
alimentcias; e de segunda gerao, produzido a partir da celulose e de outras fibras
vegetais presentes na madeira ou apenas de subprodutos do seu processamento ou
ainda das partes no comestveis dos vegetais [6].

Actualmente este combustvel obtido essencialmente por fermentao de
acares, amidos ou de biomassa celulsica. A produo comercial mais abundante
feita a partir da cana-de-acar (Brasil), da beterraba e do milho (EUA). O processo a
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8
partir de biomassa celulsica normalmente requer pr-tratamentos o que encarece o
produto [7].

Como representado no grfico da Figura 3, a produo europeia de bioetanol
atingiu as 309 500 toneladas em 2003. Com 18 0000 a Espanha o produtor lder
devendo o sucesso tambm ausncia de impostos cobrados pela utilizao deste tipo
de combustvel.

Evoluo da Produo de Bioetanol na UE-15
48
59 58
80
103
118
111
191
216
317
310
0
50
100
150
200
250
300
350
1993 1994 1995 1996 1997 1998 1999 2000 2001 2002 2003
Ano
1
0
0
0

t
o
n
e
l
a
d
a
s

Figura 3 - Evoluo da produo de bioetanol na UE-15 [8].

O bioetanol apresenta ento vrias propriedades como biocombustvel (resumidas
na Tabela 1):

- Contedo energtico mais baixo do que a gasolina, o que significa que para um
dado volume de combustvel o rendimento do veculo maior;
- O nmero de octanas maior, o que aumenta a eficincia do combustvel no
motor;
- O elevado contedo em oxignio resulta numa combusto mais limpa;
- A sua evaporao lenta, logo a concentrao no ar baixa e portanto reduz o
risco de exploso - parmetro indicado pela Presso de Vapor de Reid [8];

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9
Tabela 1 - Propriedades da Gasolina em comparao com o Bioetanol (Adaptado de European Biomass
Industry Association).

Para alm das vantagens de utilizao como biocombustvel pode ser usado
tambm na indstria de cosmticos, farmacuticos e claro, na indstria alimentar.
Aproximadamente 9% do etanol ainda produzido sinteticamente, no entanto, os
outros 91% j so produto de fermentaes [7].

2.2 MICRORGANISMOS

2.2.1 Microbiologia do Gnero Pichia

A Pichia stipitis conhecida pela sua capacidade de fermentar pentoses,
nomeadamente xilose, mais do que qualquer outra levedura, em condies de
microarejamento, pois a sua actividade fermentativa induzida em resposta limitao
de oxignio [9]. assim uma espcie anaerbia facultativa que aumenta o seu
metabolismo de produo de etanol na presena de condies microaeroflicas [10,11].
A sua reproduo assexuada normalmente por gemulao lateral (Figura 4a).
Quanto morfologia, as clulas so esfricas, elpticas ou alongadas com cerca de 2,2 a
6m (Figura 4b). O seu crescimento em meio slido ocorre em apenas 3 dias a 25-
28C, aos pares ou individualmente, apresentando uma cor bege suave e um aspecto
cremoso [12].

Propriedades Gasolina Bioetanol
Peso Molecular (kg/kmol) 111 46
Densidade (kg/L) a 15C 0,75 0,80-0,82
Contedo em Oxignio (wt-%) - 34,8
Nmero de Octanas 97 109
Nmero de Cetanas 8 11
Ar/Combustvel(kg ar/kg combustvel) 14,7 9,0
Temperatura de Ebulio (C) 30-190 78
Presso de Vapor Reid (kPa) a 15C 75 16,5
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10

Figura 4 - Clula tpica de levedura: a) esquema representativo b) fotografia ao microscpio electrnico
(Adaptado de Rocha, C.M.R, 1996).

2.2.2 Leveduras Desacidificantes

As leveduras capazes de sobreviver em ambientes cidos na presena de cidos
orgnicos fracos esto normalmente associadas a problemas de contaminao
alimentar, uma vez que estes compostos so frequentemente utilizados como
conservantes qumicos na indstria alimentar [13].
Este tipo de leveduras so encontradas principalmente em fermentaes malo-
lcticas estando presentes por exemplo nos mostos de vinhos, convertendo o cido
mlico a lctico, e assim reduzindo a acidez do vinho [14].
As espcies gentilmente cedidas pela Portuguese Yeast Culture Collection foram:
Candida tropicalis PYCC 3097, Candida utilis PYCC 2541, Kluyveromyces marxianus
PYCC 3886
T
, Zygosaccharomyces baillii PYCC 5167
T
, Saccharomyces cerevisiae PYCC
4072 e Pichia anomala PYCC 4121
T
.

Para escolha das leveduras desacidificantes so feitos meios de cultura selectivos
planeados de acordo com a diferente capacidade de crescimento que as diferentes
espcies apresentam em meio mineral com substrato simples (cido carboxlico fraco)
ou com substratos misto (acar e cido carboxlico fraco) como nicas fontes de
carbono e energia [13]. A concentrao bem como a manipulao do pH do meio,
associada incorporao de um indicador cido-base, permite seleccionar condies
para aplicao destas espcies nas diferentes situaes prticas.

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11
2.3 PROCESSO FERMENTATIVO

2.3.1 Bioqumica da Fermentao Etanlica

As fermentaes mediadas por leveduras ou bactrias como microrganismos
fermentativos usam normalmente cinco monossacardeos dos mais abundantes:
glucose, xilose, manose, galactose e arabinose, convertendo-os directa ou
indirectamente a etanol [7].
Este processo com aplicaes industriais envolve sempre: a) obteno de
acares fermentveis, b) fermentao desses acares a bioetanol e c) separao e
purificao do etanol, normalmente por destilao [15].
sabido que as hexoses so os monossacardeos mais facilmente fermentveis,
no entanto, h estirpes especficas para a fermentao de pentoses, como o caso da
Pichia stipitis, da Pachysolen tannophilus, da Candida shehatea ou das bactrias
Zymomonas mobilis. Sob condies de microarejamento a C. shehatea e a Pichia stipitis
so as mais rpidas no consumo da xilose e as que levam a maiores converses em
etanol [16]. A Zymomonas mobilis uma bactria que tem sido descrita como
alternativa utilizao de leveduras, apresentando como vantagens principais uma taxa
especfica de consumo de acares muito elevada, baixa produo de biomassa,
tolerncia a elevadas concentraes de etanol [17,18] e no necessita de controlo de
oxignio para manuteno da viabilidade celular [19].
H ainda referncia a fungos como o Rhizopus oryzae que alm de crescerem em
meios como o licor ao sulfito cido, assimilam a glucose, a manose, a xilose e o cido
actico para produo de etanol. No entanto, alm de ser necessrio um bom
suplemento do meio com vrios sais de amnia, clcio e magnsio, quando as fontes de
carbono se esgotam do meio, o fungo assimila todos os metabolitos produzidos como o
etanol, o glicerol ou o cido lctico [20].

De um modo geral, a fermentao um processo de obteno de energia que a
clula procaritica realiza em ambiente anaerbico. No caso das leveduras, o processo
de converso de glucose a piruvato d-se via glicoltica, que mais tarde ento
convertido a etanol por reduo do acetaldedo (Figura 5). Esta combinao de gliclise
e produo de etanol ento chamada de fermentao etanlica e tem um rendimento
energtico final de 2 ATP [21].
De um modo geral a fermentao da glucose traduz-se em [7]:

C
6
H
12
O
6
2C
2
H
5
OH + 2CO
2
+ 2 ATP (energia libertada=118 kJ/mol)

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12

Figura 5 - Esquema representativo do processo de fermentao etanlica a partir de glucose

Mas a utilizao de pentoses de facto a mais valia deste tipo de leveduras, o que
vai ao encontro da composio do meio a fermentar.
A assimilao de pentoses foi referida pela primeira vez em 1959 por Karczewska,
mas o metabolismo de converso de xilose a xilulose apenas foi comprovado em 1960
por Chiang and Knhigt e por sua vez, a fermentao a etanol apenas nos anos 80 por
vrios autores [11].
A xilose inicialmente transportada atravs da membrana plasmtica onde a
transformada em xilulose 5-P. Vrios sistemas de transporte deste monossacardeo tm
sido propostos, mas a Pichia stipitis assimila-a por simporte de protes, ou seja, um
mecanismo altamente dependente do pH e que pode ser inibido pela assimilao de
outros acares, precisamente pela competio por protes [22].
As duas vias pelas quais a xilose convertida em xilulose esto esquematizadas
na figura 6:
Para a converso de xilose a xilulose as
leveduras usam dois passos que envolvem
reaces de oxidao-reduo. A primeira
enzima a interferir a xilose reductase que
converte a xilose a xilitol. Este pode ser
excretado da clula ou ainda oxidado a xilulose
pela xilulose desidrogenase. Na Pichia stipitis,
sob condies anaerbicas, a primeira reaco
pode ocorrer quer na presena de NADPH ou
NADH [23]. Assim, o NAD
+
regenerado e a
acumulao de xilitol muito baixa, seguindo-
se a converso para etanol.
A via que segue por aco da xilose
isomerase mais utilizada no caso das
bactrias e necessita da presena de Mn
2+
,
Co
2+
ou Mg
2+
.

Figura 6 - Vias metablicas de converso de xilose a xilulose e consequente converso de xilulose a
etanol
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13

Uma vez convertida em xilulose, o metabolismo continua com uma reaco de
fosforilao. A reaco catalisada por uma xilulocinase que converte a xilulose a
xilulose 5-P. O pH ptimo desta enzima na P. stipitis referido como 7,0 e geralmente
requer Mn
2+
. A xilulose 5-P depois metabolizada a intermedirios glicolticos como o
gliceraldedo 3-P e a frutose 6-P pela via das pentoses fosfatadas. Estes intermedirios
so ento convertidos a piruvato pela via Embden Meyerhof Parnas (EMP) ou Entner
Doudoroff (ED), que por sua vez sofre a aco da piruvato descarboxilase e convertido
a acetaldedo e posteriormente reduzido a etanol.

Em resumo, e com base no esquema explicado acima vem a equao geral:

3 C
5
H
10
O
5
5C
2
H
5
OH + 5CO
2
1,0 g 0,51 g 0,49 g

Esta equao assume que a xilose convertida em xilulose, sem acumulao de
xilitol, que a xilulose 5-P convertida a frutose 6-P e gliceraldedo 3-P sem reciclagem
oxidativa ou desequilbrios de cofactores, que a glucose 6-P e o gliceraldedo 3-P so
convertidos a etanol via EMP, sem perda de acetato para o ciclo de Krebs e ainda que a
biossntese negligvel. O rendimento terico ento de 1,67 mol de etanol por mol de
xilose, ou em termos de massa 0,51 g de etanol/g xilose [11].

De modo a optimizar este rendimento em etanol, vrios microrganismos tm
sido geneticamente manipulados e seleccionados ao longo das duas ltimas dcadas. Os
maiores sucessos em bactrias tm-se verificado em E.coli, K. oxytoca e Z. mobilis [24,
25] e em leveduras em S. cerevisiae, que naturalmente fermenta apenas hexoses e em
C. utilis [26]. No entanto, a nvel industrial este um processo pouco vivel, uma vez
que as alteraes genticas introduzidas se vo perdendo ao longo das geraes, o que
interrompe processos contnuos no sendo de todo aconselhvel.

O desempenho das leveduras quanto ao maior ou menor rendimento de etanol
est dependente de um determinado nmero de factores incluindo o arejamento. No
caso da Pichia stipitis a produo de etanol ocorre apenas sob condies microaeroflicas
[27]. Segundo Skoog and Hanh-Hgerdal, 1990 a produtividade especfica de etanol
mxima nestas condies 0,20 g de etanol por g de peso seco e por hora e o
rendimento 0,48 g etanol/g acar fermentvel a uma taxa de transferncia de oxignio
de 1 mmol/L. h. Com a diminuio do oxignio do meio verificou a acumulao de
vrios intermedirios como a glucose 6-P, com a consequente reduo da concentrao
de piruvato assim como a reduo da velocidade de consumo da xilose. Com excessivo
arejamento h oxidao do etanol e das clulas microbianas [28].
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14

Outros factores que influenciam a produo de etanol pela Pichia stipitis so a
composio do meio, o pH e a temperatura. O meio deve ser muito bem formulado e
suplementado com minerais e fontes de azoto [29]. O pH deve ser moderado (6,5-7,0)
assim como a temperatura para permitir a acumulao de etanol [28]. Quanto ao
crescimento, sabe-se que a Pichia cresce em apenas 3 dias em meio slido e que a sua
fase exponencial em meio lquido tem cerca de 20h. No entanto, as referncias a meios
de fermentao com este licor de cozimento ao sulfito cido ou outro tipo de
hidrolisados de origem lenhocelulsica indicam a presena de inibidores e at a
acumulao de metabolitos que possam diminuir a sua taxa especfica de crescimento
[30-35].

A inibio do crescimento celular pela produo de etanol varia com a sua
concentrao e com a temperatura. A P. stipitis sabe-se que inibida a concentraes
relativamente baixas (34 g/L) quando comparada com a sua produo mxima (45-48
g/L). Uma descida de temperatura pode levar a um aumento de tolerncia de etanol. O
mximo j obtido para esta espcie antes da sua completa inibio foram 65 g/L a
25C.

As razes para a inibio por etanol prendem-se essencialmente com a
acumulao de acetaldedo e acetato por oxidao do etanol e com alteraes nas
membranas celulares que podem ser minimizadas com a adio de Tween 80,
ergosterol ou cido linolico para aumentar a sua fluidez.

2.3.2 Cintica de Fermentao

O objectivo de qualquer processo biotecnolgico usar sistemas biolgicos que
maximizem a eficincia da utilizao de substrato, aumentando os lucros da indstria
onde est implementado. Assim, o processo fermentativo deve procurar um
compromisso entre a produtividade volumtrica e a concentrao final de produto,
mantendo o rendimento de converso de substrato em nveis aceitveis.

Para atingir estes objectivos, os sistemas de culturas celulares devem ser
descritos quantitativamente, ou seja, a cintica do processo deve ser conhecida. S
assim, se podem prever o rendimento e o tempo de fermentao, assim como a
dimenso correcta do processo a nvel industrial. Na prtica, todos estes estudos so
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15
primeiro efectuados em reactores de pequena escala passando depois para escala piloto
e, se realmente promissor, para um "scale-up industrial.

Para determinar a evoluo ao longo do tempo da concentrao de um
componente celular, da concentrao de clulas ou da biomassa em suspenso em meio
de crescimento lquido, necessrio obter a curva experimental de crescimento da
populao microbiana e calcular a taxa especfica de crescimento do microrganismo em
questo nas condies de crescimento testadas num processo descontnuo.

Na Figura 7 podem distinguir-se 4 fases do crescimento microbiano, que se
aplicam ao crescimento de leveduras.

Figura 7 - Curva de crescimento microbiano.

A fase lag ou de latncia ocorre logo a seguir inoculao do meio de cultura,
onde as clulas do microrganismo tm normalmente que se adaptar ao novo meio.
Durante este perodo inicial, pode no ocorrer multiplicao celular, no entanto verifica-
se, por exemplo, a sntese de novas enzimas. Estas podem ser necessrias sntese de
compostos essenciais ao crescimento ou hidrlise ou metabolizao dos compostos
presentes como fontes de carbono, azoto, etc. Esta fase dita de latncia pode ter uma
durao mais ou menos extensa consoante o estado fisiolgico da cultura usada como
inculo e as condies de crescimento. Por exemplo, a presena de uma percentagem
elevada de clulas no-viveis no inculo, um meio de cultura contendo um nutriente
essencial difcil de metabolizar ou a incubao em condies ambientais de stress a que
o organismo no se encontra adaptado, conduzem normalmente a fases de latncia
extensas.

A fase exponencial a fase que se segue e onde aps um perodo de acelerao,
a taxa de crescimento da populao microbiana se torna constante, isto , as clulas
L
O
G
1
0

(
n
l
u
l
a
s

v
i
v
e
i
s
)

D
e
n
s
i
d
a
d
e

p
t
i
c
a

LAG EXPONENCIAL ESTACIONRIA MORTE
Fases de Crescimento
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16
sofrem diviso e o seu nmero duplica aps um determinado intervalo de tempo.
Durante esta fase, em que todos os nutrientes esto presentes em excesso, os
microrganismos dividem-se e a populao cresce com uma taxa especfica de
crescimento mxima (
0
) que depende do potencial gentico do microrganismo, da
composio do meio de cultura e das condies de crescimento (temperatura, pH,
disponibilidade de gua, etc.). No perodo de desacelerao ocorre um declnio da taxa
especfica mxima de crescimento, em resultado da diminuio para valores limitantes
do crescimento da concentrao de um (ou mais) nutrientes essenciais ao metabolismo
celular e/ou do aumento da concentrao de produtos do metabolismo txicos para as
clulas.

Na fase estacionria o esgotamento de um nutriente e/ou a acumulao de
produtos inibidores do metabolismo leva a que a diviso da populao pare. No entanto,
em carncia de nutrientes, as clulas podem manter-se viveis durante perodos de
tempo mais ou menos longos, custa das reservas endgenas, que usam em processos
de manuteno. Contudo, mais cedo ou mais tarde, verifica-se um declnio da
concentrao de clulas viveis durante a fase de morte celular.

Por fim, h a fase de morte onde ocorre a perda irreversvel da capacidade de
diviso celular, o que origina um decrscimo da concentrao de clulas viveis na
populao microbiana ao longo do tempo [36].

O acompanhamento deste crescimento feito pela avaliao quantitativa da
evoluo da concentrao celular ao longo do tempo, por meios mais ou menos
directos. um mtodo bastante eficaz no que diz respeito fase exponencial onde
calculada a taxa especfica de crescimento de acordo com: X
dt
dX
= .
Estas medies pressupem um processo descontnuo, em que o inculo
adicionado ao processo e s no fim recuperado o produto. O reactor, depois de
esterilizado, fica pronto para nova utilizao.

Assim, a cintica de fermentao essencialmente determinada pela
disponibilidade de nutrientes, ou seja de substrato essencial ao metabolismo. No
entanto o pH do meio e presena/ ausncia de oxignio so outros factores
fundamentais. No caso da Pichia stipitis o pH ideal 6,0-7,0 e o meio deve ser apenas
microarejado.

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17
2.4 FORMAO E ORIGEM DOS LENHOSULFONATOS

2.4.1 Composio Qumica da Madeira

A madeira constituda principalmente por celulose, hemiceluloses, lenhina,
extractveis e cinzas. A celulose forma o esqueleto principal das clulas, rodeado por
outras matrizes (as hemiceluloses) e material aglutinante (a lenhina).

Apesar da composio qumica da celulose ser conhecida em pormenor, a sua
organizao estrutural no est ainda bem esclarecida. Sabe-se que um
homopolissacardeo linear constitudo por unidades de glucopiranose unidas por ligaes
glicosdicas (14), possuindo uma estrutura amorfo-cristalina. Grupos destas
molculas agregam-se uns aos outros e formam microfibrilas (10 a 20nm) constitudas
por regies cristalinas altamente organizadas, alternadas de regies mais amorfas
desordenadas. As microfibrilas, por sua vez, organizam-se em fibrilas que se juntam em
camadas uniformes (lamelas), as quais constituem os elementos morfolgicos bsicos
da parede celular (Figura 8). Globalmente, a proporo de celulose cristalina nas
paredes celulares das fibras na madeira situa-se entre 60-70%.
Este o maior constituinte da madeira, sendo cerca de 40 a 50% da sua matria
seca [37].

Figura 8 - Esquema da estrutura da celulose (Adaptado de Moore et al, 1998)

As hemiceluloses pertencem a um grupo de polmeros heterogneos com
funes de suporte nas paredes celulares possuindo estrutura geralmente ramificada e
amorfa. Os seus monmeros so essencialmente D-glucose, D-manose, D-galactose, D-
xilose, L-arabinose e pequenas quantidades de L-ramnose, cido D-glucurnico, cido
4-O-metil-D-glucurnico e cido D-galacturnico (Figura 9). A quantidade de
parede celular
clula
fibrila
microfibrila
celulose
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18
hemiceluloses ronda os 20 a 35% do peso seco da madeira e a sua composio e
organizao difere com o tipo de madeira.

Figura 9 - Monossacardeos principais das hemiceluloses.

A composio qumica da madeira das folhosas, a chamada madeira dura
diferente da madeira das resinosas, madeira mole. No caso de folhosas como o
Eucalyptus globulus as hemiceluloses dividem-se essencialmente em:

- glucuronoxilanas (15-25%): cujo componente principal a O-acetil-4-O-
metilglucurono--D-xilana tambm chamada de glucuronoxilana ou apenas xilanas se o
constituinte principal for a xilose. A sua estrutura principal consiste ento em unidades
de -D-xilopiranoses ligadas em (14). Estas unidades podem conter grupos O-acetil
em C2 e C3 e resduos de cido 4-O-metil-d-D-glucurnico, MeGlcpA ligados em O-2.
No E. globulus, cerca de 1/3 das unidades deste cido so substitudas em O-2 (2)-
MeGlcpA-(12)-Xylp). A galactose (Gal) aparece apenas na forma de unidades
terminais [Galp-(1 ].

O-acetil-(4-O-metil--D-glucurono)-D-xilana:
[-D-Xilp]-(14)-[-D-Xylp]7-(14)-[-D-Xilp]42-(14)-[-D-Xilp]2-(14)-[-D-Xilp]24-(14)-[-D-Xilp]-(14)-
3 2 3 2 3 3 2
Ac Ac Ac Ac
1 1 1
4-O-Me--D-Glc!A 4-O-Me--D-Glc!A 4-O-Me--D-Glc!A
2 2

1 1
ramnoarabinogalactana--D-Gal! glucana-D-Gluc!

-[-D-Xil!]6-(14)-[-D-Xil!]15-(13)-[-L-Ram!]-(12)-[-D-Gal! A]-(14)-[-D-Xil!]
3 2 2

Ac Ac Ac
Reviso Bibliogrfica
19

- glucomananas (1-4%): constitudas por unidades de D-glucopiranose e D-
manopiranose ligadas em (14).

--D-Glcp-(14)--D-Manp-(14)--D-Glcp-(14)--D-Manp-(14)--D-Glcp-(14)--D-Glcp-
2(3)
|
acetil (alguns)

- outros polissacardeos: podem ser pectinas (ramnogalaturonanas, entre
outras), glucanas (xiloglucanas, amido) e galactanas (arabinogalactanas,
ramnoarabinogalactanas).

A lenhina o segundo maior componente celular da madeira. Estabelece uma
associao estrutural com componentes das paredes celulares de origem
hemicelulsica, conferindo-lhes firmeza e rigidez. uma macromolcula altamente
irregular cuja estrutura no ainda precisa mas sabe-se que um polmero complexo,
altamente ramificado e insolvel em gua. Como se pode observar na Figura 10 um
heteropolmero constitudo por dmeros de fenilpropano (C9) com ligaes C-O-C (ter)
(> 65%) e C-C (<35%) entre si, formando uma estrutura tridimensional amorfa de
elevado peso molecular (600-10 000 kDa) [36].

Figura 10 - Esquema da estrutura da lenhina proposto por Adler, em 1977
(Adaptado de Lee, J., 1997 [35])

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20
Os extractveis so compostos de diversa natureza com peso molecular
relativamente baixo que, por definio, so solveis em solventes orgnicos ou gua.
Destes compostos podem fazer parte terpenos (em pequena quantidade em
folhosas), terpenides, cidos gordos, triglicridos e compostos fenlicos [38].

As cinzas consistem em sais de sdio, potssio, clcio com os correspondentes
anies de carbonato, fosfato, silicato, sulfato, cloreto, etc. que permanecem aps a
combusto da madeira [38].

Na Tabela 2 podem comparar-se as composies relativas dos diferentes tipos
de constituintes nas resinosas e folhosas.

Tabela 2 - Composio qumica da madeira (compostos principais).

2.4.2 Processo de Cozimento ao Sulfito cido (Sulfite Pulping)

O objectivo principal do processo de cozimento libertar as fibras da madeira
por deslenhificao com tratamentos fsicos e/ou qumicos. Neste processo, a lenhina
removida, de modo a que as fibras de celulose sejam facilmente separadas com
tratamentos mecnicos suaves. Hoje em dia, estes tratamentos qumicos mais usuais
dividem-se em 2 tipos principais: sulfato (ou Kraft) e sulfito [39].

No processo ao sulfato a madeira deslenhificada com hidrxido de sdio e
sulfureto de sdio preservando a resistncia das fibras e originando pastas fortes [40].

Componente

Resinosas
(%)
Folhosas
(%)
Celulose 35-45 40-50
Hemicelulose
(Galacto)glucomanana
Xilanas
20-25
5-10
2-5
15-30
Lenhina 25-35 18-25
Extractveis 3-8 1-5
Cinzas 0,2-0,5 0,3-0,6
Reviso Bibliogrfica
21
No processo sulfito (esquematizado na Figura 11) o cozimento da madeira faz-se
usando uma mistura de cido sulfuroso (H
2
SO
3
) e io bissulfito (HSO
3
-
) na forma de
amnia, magnsio, clcio ou sdio com os seguintes equilbrios qumicos:

SO
2
+ H
2
O H
2
SO
3
(SO
2
.H
2
O)
H
2
SO
3
H
+
+ HSO
3
-

HSO
3
-
H
+
+ SO
3
2-

Este cozimento dissolve a maioria da lenhina e algumas hemiceluloses mas
deixando as fibras de celulose ainda unidas. Como o pH do processo bastante baixo
(pH=1,5-2), as reaces levam condensao da lenhina e decomposio do cido do
cozimento, resultando num licor com cores extremamente escuras, onde predomina
tambm o SO
2
em soluo [41].
Simultaneamente com a dissoluo da lenhina, durante o processo so
removidos da madeira alguns polissacardeos. A selectividade da deslenhificao traduz
precisamente a razo entre a lenhina e os polissacardeos removidos. Uma selectividade
elevada implica a perda de poucos hidratos de carbono. No incio do cozimento tem-se
uma perda elevada mas depois, com a contnua deslenhificao, ocorre uma abrupta
subida na selectividade.
Basicamente, as reaces responsveis pelo processo de deslenhificao so as
de sulfonao (que originam grupos hidroflicos sulfnicos na cadeia hidrofbica da
lenhina) e as de hidrlise (que quebram as ligaes entre as unidades de fenilpropano,
criando grupos hidroxilfenlicos livres).
Os lenhosulfonatos so os produtos resultantes das quebras das ligaes -O-4 da
estrutura de lenhina e posterior sulfonao das posies e/ou das cadeias laterais
das unidades C9. A molcula de lenhosulfonato forma um polielectrlito altamente e
aleatoriamente ramificado. Em soluo a molcula tem tendncia a enrolar e ganhar
forma redonda com os grupos sulfnicos superfcie [42].
HSO3
-
/SO2
135C, 10h H2O2

Madeira Cozimento Pasta Crua Branqueamento Pasta Branca
(20% lenhina) (2-4% lenhina) (<1% lenhina)
Licor fino
condensado

Licor grosso
evaporao

Licor fino do efeito 7 (HSSL)

Figura 11 - Esquema de Produo da pasta de papel e formao do HSSL.
7 6 5 4 3 2 1
Reviso Bibliogrfica
22
2.4.3 Degradao do Material Lenhocelulsico

O tipo de compostos txicos e a sua concentrao no licor resultante do
processo de cozimento pode influenciar as variveis da fermentao, nomeadamente a
eficincia da utilizao dos acares fermentveis por parte do microrganismo e levar
diminuio de produto formado.
De acordo com alguns estudos os efeitos txicos podem ser divididos em 4
grupos principais [30]:

- Produtos da Degradao de Acares (Figura 12):

Durante a hidrlise, as pentoses presentes na madeira podem degradar-se a
furfural - um composto txico que dependendo da sua concentrao no meio de
fermentao, pode levar inibio do crescimento celular e afectar a taxa especfica de
crescimento do microrganismo [30]. Em estudos relacionados com a produo de etanol
com Pichia stipitis, concentraes de furfural de 0,5 1,0 e 2,0g/L reduziram o
crescimento celular em 25%, 47% e 99% respectivamente. O rendimento e a
produtividade decresceram tambm 90% e 85% [28].
Ainda da degradao das hexoses, se bem que em menor quantidade, pode
formar-se hidroximetilfurfural (HMF), um composto txico que leva ao aumento da fase
lag durante o crescimento microbiano. O crescimento da Pichia stipitis foi tambm
reduzido quando estudado na presena de 0.5, 0.75 e 1.5g/L de HMF para 43, 70 e
100% respectivamente [30].
H ainda a salientar o efeito sinergtico destes dois compostos quando
combinados com outros, nomeadamente com compostos fenlicos e aromticos
derivados da degradao da lenhina e vrios cidos (actico, frmico e levulnico).
Tambm este efeito j foi relatado para a P. stipitis, e o furfural com o HMF inibem o
seu crescimento celular, bem como a fermentao da xilose [30].
Pensa-se que a pH baixos, os cidos fracos como o cido actico so
lipossolveis e portanto, permeveis membrana plasmtica. Aquando da sua entrada
para o citosol este dissocia-se devido ao pH neutro intracelular, diminuindo assim o pH
citoslico. A manuteno de um pH neutro no interior da clula fundamental para a
manuteno da viabilidade. Est demonstrado que a actividade replicativa da clula
decresce linearmente com a diminuio do pH intracelular [43].
Ainda da degradao do material lenhocelulsico pode resultar outro tipo de
compostos como o cido levulnico e o cido frmico. A sua diferente toxicidade em
relao ao cido actico, deve-se essencialmente diferena na permeabilidade das
membranas e diferente forma aninica que formam no interior da clula, no entanto,
so tambm considerados como potenciais inibidores microbianos [44].
Reviso Bibliogrfica
23

Figura 12 - Esquema da decomposio da madeira originando compostos inibidores (Adaptado de
[30])

Durante a fermentao a reduo do furfural a lcool furfurlico ocorre com
elevada probabilidade; produto este que j foi relatado como inibidor do crescimento
aerbico da P. stipitis por provocar a morte celular.

- Produtos da Degradao da Lenhina:

Durante a hidrlise da lenhina so formados vrios compostos aromticos,
poliaromticos, fenlicos e aldedicos. Os fenlicos de baixo peso molecular so os mais
txicos uma vez que causam a perda da integridade das membranas biolgicas,
afectando assim a sua capacidade de servirem de barreiras e de matrizes enzimticas.
Em consequncia, tanto o crescimento celular como a assimilao de acares so
reduzidos [30] Paraj et al (1998) relatou ainda que, este tipo de produtos pode ser
mais txico que o furfural ou o HMF mesmo a baixas concentraes [45]. Associado ao
licor ao sulfito cido de Eucalyptus globulus esto presentes 4 fenlicos principais: o
cido glico, o pirogalol, o cido sirngico e o cido vanlico (representados na Figura
13). De todos, o cido glico de longe o mais abundante, cerca de 68mg/ 100g
matria seca [46]. Os lenhosulfonatos so outros dos compostos produzidos durante a
Reviso Bibliogrfica
24
deslenhificao da madeira no processo sulfito e que pensa-se estarem mesmo
associados a um efeito inibitrio do crescimento microbiano [47].

HO
OH
OH

HO
OH
OH
HO O

O
OH
O
O
HO

O
OH
O
OH

pirogalol cido glico cido sirngico cido vanlico

Figura 13 - Exemplos de alguns compostos fenlicos existentes no HSSL.

- Compostos Derivados da Estrutura Lenhocelulsica

Dentro da estrutura lenhocelulsica h ainda os compostos extractveis (resinas
acdicas, os terpenides e os taninos) e o cido actico derivado dos grupos acetil
presentes nas hemiceluloses e que saem durante o processo hidroltico.
Quando o pH do meio fermentativo baixo, o cido actico existe sob a forma
no dissociada (porque o seu pKa 4,75), ou seja, lipossolvel, e por isso difunde-se
pelas membranas plasmticas. J no interior da clula, onde o pH aproximadamente
7, o cido dissocia-se e vai acumulando protes no citoplasma. Como consequncia, o
pH interno das clulas comea a descer, inibindo a actividade celular e causando at a
morte [30].
Para a P. stipitis, o efeito do cido
actico dos factores mais importantes a
controlar, pois para concentraes superiores a
2g/L de cido actico, a produtividade e o
rendimento comeam a diminuir drasticamente,
sendo que concentraes acima dos 8g/L j
apresentam valores quase nulos destes
parmetros (Figura 14) [28].

Figura 14 - Influncia da concentrao de cido actico na produtividade e rendimento de etanol pela
P. stipitis [28].

Reviso Bibliogrfica
25
- Ies de Metais Pesados:

Os ies dos metais pesados (ferro, crmio, nquel e cobre) podem ser originados
por corroso do equipamento e a sua toxicidade est associada inibio enzimtica
das vias metablicas de degradao dos acares por parte dos microrganismos [30].

A concentrao mxima de cada inibidor que cada microrganismo pode suportar
relativa, pois tudo depende do tipo de microrganismo e seu metabolismo, a sua
adaptao ao meio, o tipo de processo fermentativo, o tipo de inibidores presente, o seu
efeito conjunto, etc.

1.5 REMOO DE INIBIDORES

Diversos mtodos biolgicos, fsicos e qumicos tm sido utilizados numa fase
anterior ao processo fermentativo para remoo especfica de inibidores fazendo parte
do pr-tratamento essencial viabilidade celular com elevados rendimento etanlicos
[48].

1.5.1 Mtodos Fsico-Qumicos

Os mtodos qumicos incluem tratamentos alcalinos, com aumento de pH para 9-
10 com Ca(OH)
2
seguido de um reajustamento para pH 5,5 com H
2
SO
4
(overliming).
Este mtodo permite a precipitao de compostos txicos e o aumento do pH aumenta
a instabilidade dos mesmos em soluo. A utilizao de sulfito de sdio em conjunto
com este tratamento tem sido tambm referida como uma vantagem na fermentao
alcolica deste tipo de substrato, aumentando a produtividade [49].
Os compostos txicos podem tambm ser adsorvidos em carvo activado [50],
uma vez que um material de baixo custo, ou em resinas de troca inica [51]. No
entanto, estes processos tm que ser economicamente viveis no custo final do
produto.

Os mtodos fsicos incluem essencialmente evaporao dos compostos volteis,
nomeadamente cido actico e furfural, mas tambm aumentam consideravelmente a
Reviso Bibliogrfica
26
concentrao de compostos txicos no volteis como os extractveis ou os derivados
da lenhina [33].

1.5.2 Mtodos Biolgicos

A nvel biolgico tm-se usado enzimas como a lacase e a peroxidase que levam a
uma remoo selectiva de compostos fenlicos monomricos por polimerizao
oxidativa destes compostos de baixo peso molecular [33]. Para remoo do cido
actico, cido benzico ou furfural de hidrolisados de hemiceluloses tem-se usado o
fungo Trichoderma reesei [33] ou ainda outros microrganismos como o caso de
espcies geneticamente modificadas de Saccharomyces cerevisiae [30,36]. A
degradao de diferentes tipos de lenhosulfonatos considerados inibidores tambm j
foi citada para o fungo Streptomyces viridosporus, com remoo da ordem dos 35%
[47].
A adaptao do microrganismo fermentativo ao meio outra estratgia de
fermentao importante do ponto de vista biolgico, baseando-se em sucessivas
fermentaes que utilizam o microrganismo de cada experincia como inculo
fermentao seguinte [30].

Mtodos Experimentais
27

2. MTODOS EXPERIMENTAIS

28
2.1 MICRORGANISMOS - manuseamento e manuteno

Os microrganismos utilizados neste trabalho foram apenas leveduras.
Para o processo fermentativo - a Pichia stipitis NRRLY 7124 foi fornecida pelo
Laboratrio NRRL liofilizada em porta-amostras. Foi transferida para um meio lquido
inicial (Yeast Medium) apenas para ser mais facilmente homogeneizada e depois
transferida para placas de Petri com meio YM slido com agar onde ficou a crescer 3
dias a 28C. Estas placas foram guardadas a 4C (em frigorfico) e assim foi conservada
durante todo o trabalho experimental com repicagens de 5 em 5 semanas para
renovao celular.
Para o processo de desacidificao biolgica foram solicitadas as seguintes
leveduras PYCC (Portuguese Yeast Culture Collection):

- Candida tropicalis PYCC 3097
- Candida utilis PYCC 2541
- Kluyveromyces marxianus PYCC 3886
T

- Zygosaccharomyces baillii PYCC 5167
T

- Saccharomyces cerevisiae PYCC 4072
- Pichia anomala PYCC 4121
T

As diferentes espcies chegaram em tubos com cunhas de agar, as quais foram
depois transferidas para placas de Petri, mantendo-se o mesmo mtodo de conservao
acima referido.

2.2 MEIOS DE CULTURA

2.2.1 Meios de Cultura Gerais

Para alm do prprio licor, foram usados dois meios de fermentao no processo
geral de manuteno e fermentao com as leveduras j mencionadas:

Yeast Medium [1]

Meio preparado em gua destilada levada a quente e esterilizado em frascos
SCHOTT
em autoclave a 120C durante 22 minutos.

29

Tabela 3 - Composio do meio YM.

Meio Suplementar lquido (MS)

Meio esterilizado em frascos Erlenmeyer de 500 mL preparados com gua
destilada. Os sais de amnia so separados dos restantes componentes antes da
esterilizao a fim de evitar a precipitao dos sais. Assim, o meio dividido em duas
partes.

Tabela 4 - Composio do meio MS.

2.2.2 Meios de Cultura Selectivos

Uma vez que as fermentaes em meio lquido so processos demorados e
trabalhosos, optou-se por um mtodo de seleco para as leveduras desacidificantes
mais eficaz, em meio slido, com indicadores incorporados. Assim, ao ser consumido o
cido actico, o pH do meio aumentava e mudava de cor. O crescimento e respectiva
mudana ou ausncia de mudana de cor nas placas foram monitorizados todos os dias,
por fotografias e registados os resultados. S as leveduras que realmente provocaram

Componente

Quantidade (gL
-1
)
Agar (para meio slido) 20,0
Glucose 10,0
Extracto de levedura 3,0
Extracto de malte 3,0
Componente Quantidade (gL
-1
)
Extracto de levedura 2,5
(NH
4
)
2
HPO
4
2,0
(NH
4
)
2
SO
4
1,0
MgSO
4
.7H
2
O 0,5
30
mudana de cor no meio slido, foram posteriormente usadas em fermentaes lquidas
com licor incorporado.
O meio de cultura utilizado para crescimento em meio slido, foi o meio mineral
com vitaminas e oligoelementos A e B (van Uden, 1967) ao qual se adicionou um
indicador cido-base e a fonte de carbono e energia, de acordo com o pH pretendido,
conforme descrito na tabela 5.
Na preparao do meio escolhido a pH inicial de 4,0 ou 4,5 utilizou-se o verde de
bromocresol como indicador e no caso do meio a pH inicial de 5,5 ou 6,0, o prpura de
bromocresol.
Para a preparao de meios slidos adicionou-se agar na concentrao de 2,0 %
(p/v). Procedeu-se esterilizao no autoclave durante 20 minutos, a 120C.
Os compostos utilizados como fonte de carbono e energia (glucose, xilose e cido
actico) foram preparados separadamente, na concentrao adequada, ajustados ao pH
desejado e esterilizados por filtrao em membrana (filtros de 0,20 m). O mesmo foi
feito para as solues de oligoelementos A e B e para a soluo de vitaminas.
A mistura de todos os componentes foi feita a 50-60C e aps ajuste do pH com
NaOH (10 M) ou HCl (1 M) ao valor desejado, foram adicionados os indicadores [13].

Tabela 5 - Composio das solues base que permitiram preparar os diferentes meios de cultura
selectivos slidos.

Meio base

Composio (%p/v)

(NH
4
)
2
SO
4
0,5
KH
2
PO
4
0,5
MgSO
4
.7H
2
O 0,05
CaCl
2
.2H
2
O 0,013

Soluo de vitaminas

Composio (%p/v)

Biotina 0,001
Pantotenato de clcio 0,08
Mio-inositol 4,0
Niacina 0,16
Hidrocloreto de piridoxina 0,16
Hidrocloreto de tiamina 0,16

31

Solues de oligoelementos

Composio (%p/v)

H
3
BO
3
1,0
KI A 0,2
Na
2
MoO
4
.2H
2
O 0,4

CuSO
4
.5H
2
O 0,08
FeCl
3
. 6H
2
O 0,4
MnSO
4
. 4H
2
O B 0,8
ZnSO
4
.7H
2
O 0,8
HCl (10
-3
N) 0,8 (v/v)

Indicadores

Composio (%p/v)

Verde de bromocresol (pK=4,7) 0,005
ou Prpura de bromocresol (pk=6,3) 0,005

Fontes de Carbono e Energia

Composio (%p/v)

cido actico 0,6 ou 0,8
Glucose 0,15 ou 0,0
Xilose 2,0 ou 0,0

Os meios de cultura foram preparados 2 a 4 dias antes da sua utilizao. Durante
este perodo, os meios slidos foram conservados a 4C j espalhados em placas de
Petri estreis.

Esquematicamente preparam-se ento os seguintes meios:

Meios com Acares e cido actico

0,6% 0,8%

verde prpura verde prpura

e e
32

Meios sem Acar e Com cido Actico

0,6% 0,8%

verde prpura verde prpura

2.3 ASSPSIA E AMOSTRAGEM

2.3.1 Asspsia

Todos os meios de fermentao so esterilizados em autoclave a 120C durante
22 minutos, assim como todo o material a usar.
A manipulao do microrganismo feita em cmara de fluxo laminar com ligao
prvia de radiao ultravioleta, chama e com todos os cuidados de assepsia
necessrios.

2.3.2 Amostragem

O licor foi recolhido directamente na indstria (Caima) do evaporador n7, em
frascos de 10L previamente esterilizados e rolhados com filtro de ar e tubagens para
sada do vapor. Depois de chegados ao laboratrio foram mantidos em cmara fria a
4C e sempre que necessrio para as fermentaes fez-se uma transferncia com
bomba peristltica B. Braun FE 411.

Nas fermentaes as amostras foram recolhidas assepticamente com seringas
estreis na cmara de fluxo laminar. Estas amostras so para: determinao de
biomassa por medio de absorvncia e anlise de substratos e produtos por HPLC,
sendo necessria a remoo de biomassa, a fim de evitar danos no enchimento da
coluna cromatogrfica. Assim, foram recolhidos cerca de 1,50mL para um eppendorff e
centrifugados a 5000 rpm durante 5 minutos em centrfuga Eppendorf MiniSpin. O
sobrenadante foi ento retirado e ainda filtrado por um sistema discal com filtros de
acetato de celulose de 0,2 m para depois ser devidamente injectado.
33
2.4 CONDIES DE INOCULAO E CRESCIMENTO

2.4.1 Pr -Tratamento do Licor

Ao iniciar a primeira fermentao directamente no licor verificou-se que a Pichia
stipitis no cresceu, pois a turbidez do meio manteve-se constante durante as primeiras
horas de fermentao. Assim, foi feito um pr-tratamento para diminuio ou remoo
de compostos que estavam de facto a limitar a viabilidade celular da cultura, assim
como para acertar o pH, para valores mais adequados ao crescimento da levedura.
Este pr-tratamento foi feito por precipitao seguida de oxidao. Usaram-se
ento hidrxido de clcio (Ca(OH)
2
) e hidrxido de amnia (NH
4
OH) para comparar qual
o mais eficiente e foi borbulhado oxignio para ambas as misturas (licor + Ca(OH)
2
e
licor + NH
4
OH) . O uso de hidrxido de amnia revelou-se mais eficaz, uma vez que
permitiu o crescimento celular e a produo de etanol, contrariamente ao que se passou
quando se usou o hidrxido de clcio. O facto de estar presente o io NH
4
+
deve ter
contribudo como fonte de azoto para a nutrio da levedura. O Ca(OH)
2
para alm de
no ter permitido o crescimento certamente iria causar problemas nas tubagens e
fermentadores industriais por acumulao de depsitos indesejveis.

O passo de adio de um hidrxido foi essencial para aumentar o pH do licor para
valores entre 6,0-7,0 e para obter resultados mais eficientes. Esta precipitao decorreu
durante 15h a 4C. O arejamento foi feito depois de filtrado o licor, com borbulhamento
de O
2
durante cerca de 45minutos (por cada litro de licor).
Estes dois passos de precipitao e oxidao foram feitos para todas as tomas de
licor usado em todas as fermentaes.

2.4.2 Condies de Fermentao Lquida

Para as fermentaes lquidas seguiu-se sempre o seguinte esquema de
composio:
- 20% de inculo;
- 10% de suplemento de acares (para manter sempre a mesma
concentrao independente da quantidade de licor adicionada);
- 0% a 60% de HSSL;
- 10% a 70% de Meio Suplementar;

34
Para os casos em que o volume de licor aumentava, o volume de MS diminua na
mesma proporo:

Tabela 6 - Esquema das composies das fermentaes em % (v/v).

Os inculos foram preparados em Meio Suplementar com 10 gL
-1
de glucose que
ficavam a crescer a 28C e 180rpm durante 15h.
Para cada ensaio foram feitas duas fermentaes, das quais foram recolhidas
amostras peridicas para medio de pH, biomassa e anlise de substrato e produto
obtido, tudo em duplicado, para obter valores mdios das medies.

A meio das fermentaes eram feitas placas de Petri e observaes ao
microscpio para verificar se haviam contaminaes.

2.4.2.1 Fermentaes em Erlenmeyer

As fermentaes lquidas foram inicialmente conduzidas em Erlenmeyers de
250mL sem controlo de pH nem de oxignio, apenas com agitao controlada de
180rpm e temperatura constante de 28C em incubadora orbital B. Braun Certomat S.

2.4.2.2 Fermentaes em Biorreactor

Aps os ensaios preliminares em Erlenmeyers passou-se ao sistema de
biorreactor equipado com controlo de temperatura, agitao e de pH com bombas
peristlticas para adio automtica de cido fosfrico e hidrxido de sdio, com um
volume til de 500 mL, a operar em descontnuo. O reactor possui ainda dois filtros de
ar estreis para o exterior. O aquecimento feito por um banho de gua quente que
atravessa toda a camisa do reactor, logo um aquecimento por contacto. Ainda assim,
tem a desvantagem de ter mais volume de fermentao e ter uma preparao e

Batch I

Batch II Batch III Batch IV
20% inculo 20% inculo 20% inculo 20% inculo
10% acares 10% acares 10% acares 10% acares
0 0% % d de e l li ic co or r 2 20 0% % d de e l li ic co or r 4 40 0% % d de e l li ic co or r 6 60 0% % d de e l li ic co or r
7 70 0% % M MS S 5 50 0% % M MS S 3 30 0% % M MS S 1 10 0% % M MS S
35
montagem algo complexas, o que torna difcil a possibilidade de fazer rplicas, uma vez
que s h um biorreactor disponvel.

2.5 MTODOS ANALTICOS

2.5.1 Anlise do Licor (Hardwood Spent Sulfite Liquor)

Foi feita uma anlise prvia do licor para determinao de alguns parmetros
qumicos importantes a ter em conta para o processo de fermentao de acordo com o
metabolismo da levedura.

2.5.1.1 - Teor de lenhosulfonatos

O teor de lenhosulfonatos foi calculado por espectrofotometria (UV) a 273nm
para uma amostra diluda 750 vezes:

A

=
273
x C x l
Com l = 1cm
C (gL
-1
) =
g.cm
L
4 5
273
273
, =
A

2.5.1.2 - Teor de Cinzas e pH

As cinzas correspondem a toda a matria de origem mineral existente na
amostra, eliminando toda a matria orgnica. Foram determinadas por calcinao de
amostras de 20,0 mL na mufla a 750C durante 6h.
O pH foi determinado directamente nas amostras chegadas da indstria,
homogeneizadas e a temperatura ambiente, usando um elctrodo com sonda de
temperatura e calibrado com solues tampo a pH 4,0 e 7,0.

2.5.1.3 - Teor de Acares Redutores por oxidao do cido 3,5-
dinitrosaliclico (mtodo de DNS)

36
Os acares redutores foram determinados por reaco redox com o cido 3,5-
dinitrosaliclico (DNS) que reduzido e passa de amarelo a cor de tijolo:

OH
NO
2
O
2
N
C
O
-
O

OH
NH
2
O
2
N
C
O
-
O

cido 3,5 - dinitrosaliclico (amarelo) 3-amino-5-nitrosalicilato (laranja escuro)

- a cada 1,0 mL de amostra adiciona-se 1,0 mL de DNS seguido de agitao;
- coloca-se em banho fervente 5 minutos e de em gelo para parar a reaco;
- adiciona-se 10,0mL de gua destilada , agita-se e mede-se a absorvncia a
540nm;

Recta de Calibrao

O teor de acares redutores calculado a partir de uma recta de calibrao
feita com padres de glucose de concentrao rigorosa. O procedimento o mesmo
quer para as amostras quer para os padres.

Quantificao de Acares na amostra

Quanto s amostras foram diludas 100 vezes para a absorvncia ficar entre os
valores obtidos para a recta padro.

2.5.1.4. - Anlise de Monossacardeos

A quantificao dos monossacardeos presentes no licor foi feita por GC - FID de
acordo com a seguinte sequncia de procedimentos [53]:

Hidrlise:

- adicionaram-se 1500L de gua destilada a 250 L de licor fino;
- colocou-se num tubo de soviril e adicionaram-se 190L de H
2
SO
4
72%;
- incubou-se a 100C durante 2h e arrefeceu em gelo;

+ Acar redutor + Acar oxidado
37
Reduo:

- adicionaram-se 100L de 2-desoxiglucose como padro interno com
concentrao 15,90mg/mL);
- a 1,0 mL de hidrolisado adicionou-se:
- 0,2mL de NH
3
25%
- 0,1mL de NH
3
3M com 150mg/mL de NaBH
4

- incubou-se uma hora a 30C e arrefecer de seguida em gelo;
- adicionou-se 2 vezes 50L de cido actico glacial e arrefeceu em gelo;
- a 0,3mL de soluo adicionaou-se:
- 0,45mL de 1-metilimidazole
- 3,0mL de anidrido actico
- foi misturado e incubado a 30C durante 30 minutos;
- arrefeceu-se em gelo e adicionaram-se 3,75mL de gua destilada e 2,50mL de
diclorometano;
- agitou-se no vrtex e centrifugou-se a baixa rotao durante 30 segundos;
- retirou-se a fase aquosa;
- adicionaram-se 3,0mL de gua destilada e 2,0mL de diclorometano;
- voltou a agitar-se e centrifugar e aspirar a fase aquosa;
- adicionaram-se 3,0mL de gua destilada, agitou-se no vrtex, centrifugou-se e
a fase aquosa foi aspirada;
- repetiu-se a ltima operao mais duas vezes;
- evaporou-se o diclorometano em corrente de azoto;
- adicionou-se 1,0mL de acetona e voltou a evaporar-se;
- repetiu-se a adio de acetona e a evaporao;

Injeco:

- cromatgrafo Varian 3600
- coluna DB 225 (J&W, 30mx0,25mm d. i. e 0,15 m de espessura)
- temperatura do detector: 250C
- temperatura do injector: 225C
- temperatura da coluna: 220C

Recta de Calibrao

Para a recta de calibrao (Anexo 2) foram feitos 5 padres em bales de
10,0mL:
38
- o padro I com 10,0mg de manose, ramnose e fucose e 20,0mg de xilose,
glucose, galactose e arabinose;
- o padro II com 1,0mL do padro I e 9,0mL de gua destilada;
- o padro III com 2,0mL do padro I e 8,0mL de gua destilada;
- o padro IV com 3,0mL do padro I e 7,0mL de gua destilada;
- o padro V com 5,0mL do padro I e 5,0mL de gua destilada;

Os padres no precisam de sofrer hidrlise por j serem monossacardeos, da
o procedimento para a sua quantificao comear s a partir da adio de 0,1mL de NH
3

3M com 150mg/mL de NaBH
4
a 1,94mL de padro.

Quantificao de Acares nas Amostras

Foram analisadas amostras do licor do evaporador 7 tal como chegou da
indstria e depois de precipitado com NH
4
OH e arejado (pr-tratamento feito ao licor
em todas as fermentaes, essencialmente para acerto de pH). Das amostras foram
feitas duas rplicas, cada uma injectada duas vezes.

2.5.2 Determinao de Biomassa

2.5.2.1 Mtodo Gravimtrico

A determinao da concentrao celular da biomassa presente no meio de
fermentao fez-se por filtrao de um determinado volume de cada amostra por um
filtro de acetato de celulose de 0,20m de poro. Este papel foi seco na estufa a 105C
durante 72h a 105C para eliminar toda a humidade. O peso seco foi ento determinado
aps o arrefecimento em exsicador at estabilizao da massa, por subtraco do peso
da membrana vazia seca ao peso do conjunto obtido. Este valor permite assim calcular
facilmente a concentrao celular a partir do volume rigoroso de amostra filtrada.
Este um mtodo preciso, mas que necessita de considerveis volumes de
amostra quando a concentrao celular baixa. Alm disso, tambm no imediato
aps a recolha de amostras.

39
2.5.2.2 Mtodo Turbidimtrico

A determinao de concentrao celular das fermentaes em Erlenmeyer e em
biorreactor fez-se por turbidimetria, uma vez que para monitorizar o crescimento ao
longo de toda a fermentao tinham que ser retiradas amostras de pequenos volumes.
Este mtodo permite obter uma relao entre a concentrao celular obtida por
gravimetria e a densidade ptica a 650nm, obtendo-se uma curva de calibrao.
Atravs da relao linear estabelecida (Figura 15), calcularam-se as concentraes
celulares a partir da densidade ptica das amostras. Usou-se um espectrofotmetro de
duplo feixe Shimadzu UVmini-1240.

Relao Absorvncia - Densidade Celular
y = 0,544x - 0,0023
R
2
= 0,997
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20
Densidade ptica (a 650nm)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

C
e
l
u
l
a
r

(
g
L
-
1
)

Figura 15 - Curva de calibrao obtida entre o peso seco e a densidade ptica a 650nm de Pichia
stipitis.

2.5.3 Anlise por HPLC (Consumos e Produo)

As amostras recolhidas e filtradas so injectadas num sistema de cromatografia
lquida equipada com uma coluna de troca inica com enchimento Eurokat
de 10m,
bomba Gilson 307, detector de ndice de refraco Gilson modelo 131 e integrador
40
Spectra-Physics 4290. O eluente usado foi uma soluo de 0,01N de H
2
SO
4
que passa
na coluna com um fluxo de 0,4mL/min. temperatura ambiente.

As rectas de calibrao para os quatro compostos analisados (glucose, xilose,
cido actico e etanol) encontram-se no Anexo 1.

2.5.4 Espectroscopia de FT-IR

A anlise de infravermelho com transformada de Fourier fez-se num aparelho
MATTSON 7000 e realizou-se apenas uma vez, para perceber a formao de um
depsito que ocorreu numa das fermentaes. O espectro foi ento obtido a partir de
2mg deste depsito previamente liofilizado em 200mg de KBr. Foram acumulados 64
scans com uma resoluo de 4cm
-1
. A espectroscopia de infravermelho utilizada foi na
regio do infravermelho mdio de 4000-400cm
-1
.

2.5.4 Anlise Elementar

A percentagem relativa de C, N, H e S foi analisada atravs de um analisador
elementar Leco CHNS-932. Uma amostra slida de 2mg do slido liofilizado que se
formou na fermentao abitica em biorreactor foi encapsulada e levada combusto.
Os ajustes para o branco e calibrao so aplicados ao sinal integrado final e as
respostas so obtidas como percentagem de peso de carbono, azoto, hidrognio e
enxofre.

2.6 HIDRLISE ENZIMTICA

De modo a optimizar o meio de fermentao, nomeadamente no que se refere
quantidade de acares fermentveis, foram feitos 3 ensaios com enzimas comerciais
do produto ECONASE
Wheat P Plus com vista degradao dos acares polimricos

existentes, nomeadamente xilanas e glucanas.

41
Neste tipo de hidrlises preciso ter em conta a inibio pelo substrato, pois se
houver muita acumulao de monossacardeos, necessrio recorrer reposio das
enzimas durante o processo [54].

Caractersticas da Enzima comercial:

Actividade de xilanase: 800 000 BXU/g (Birch Xilane Unit)
Actividade de -glucanase: 200 000 BU/g
pH: 5,0 - 5,8
Densidade: 0,8 Kg/dm
3

Matria Seca = mnimo de 90%

Unidades de actividade:

- uma unidade de xilanase (BXU) definida como a quantidade de enzima que
produz uma quantidade de acares redutores correspondente a 1mol de xilose de
uma xilana por minuto a pH 5,3 e 50C [55,56].
- uma unidade de -glucanase (BU) definida como a quantidade de enzima que
produz uma quantidade de acares redutores correspondente a 1mol de glucose de
uma glucana por minuto a pH 5,5 e 50C.

Para estudar o tempo de hidrlise enzimtica assim como a quantidade de enzima
a usar foram feitos vrios ensaios com 50,0mL de licor precipitado com NH
4
OH at pH
5,5-5,6 e oxigenado, a 50C com 180rpm:

Tabela 7 - Tabela resumo dos ensaios feitos para a hidrlise enzimtica.

Ensaio
Massa de Enzima
(mg)
Glucose
Inicial (gL
-1
)
Xilose
Inicial (gL
-1
)
1 500 1,5 17,8
2 1000 1,5 17,1
3 3000 1,5 17,1

2.7 REMOO DE INIBIDORES

Um dos principais inibidores de crescimento e metabolismo da levedura associado
ao licor sem dvida o cido actico. Na tentativa de remoo deste composto, foram
actividade
mnima
declarada
42
tidas em conta duas abordagens: uma biolgica com leveduras desacidificantes, outra
fsica com evaporao.

2.7.1 Desacidificao Biolgica

2.7.1.1 Meio Slido

A desacidificao em meio slido foi iniciada com seis leveduras gentilmente
cedidas pela PYCC (Portuguese Yeast Culture Collection):
-Candida tropicalis
-Candida utilis
-Kluyveromyces marxianus
-Zygosaccharomyces baillii
-Saccharomyces cerevisiae
-Pichia anomala

Foram inoculadas em placas de Petri com o meio selectivo anteriormente descrito
(Tabela 5) e o seu crescimento e consequente mudana ou no da cor do indicador
presente no meio, foram monitorizados todos os dias ao longo de 8 dias com uma
cmara digital Olympus 4MP, modelo C4040ZOOM. O ensaio foi feito a 28C em
incubadora Braun.
Para cada espcie foram estudados dois parmetros: a variao de pH (de 4,0 a
6,5) e a variao da concentrao de fontes de carbono (cido actico e acares).
A partir das placas de Petri com melhores resultados (bom crescimento e aumento
de pH por consumo de cido actico) passou-se ento aplicao directa destes
microrganismos nos meios fermentativos com licor.

2.7.1.2 Meio Lquido

A aplicao das leveduras desacidificantes nos meios de fermentao foi feita
apenas com quatro espcies por eliminao prvia de outras duas consoante os
resultados obtidos. Assim, foram feitos ensaios em duplicado, com: Saccharomyces
cerevisiae, Candida tropicalis, Pichia anomala e Candida utilis com 60% (v/v) de licor.
As condies de fermentao so as mesmas j descritas.
43
Aps analisados os resultados obtidos no meio fermentativo em termos de
concentrao de cido actico, escolheu-se a melhor levedura para co-inocular com a
Pichia stipitis

2.7.2 Desacidificao por Evaporao

A tentativa de remoo do cido actico foi ainda feita por destilao por
arrastamento de vapor.
No balo de destilao foi colocado o licor tal como recolhido na fbrica. O balo
com gua destilada e reguladores de ebulio serviu de gerador de vapor e a sua
presso foi controlada com um tubo de vidro comprido colocado no topo (manmetro).
No Erlenmeyer foi recolhido o destilado constitudo essencialmente por gua, SO
2
, cido
actico e outros compostos volteis em menor quantidade.
Colocaram-se 500mL de licor no balo de fundo redondo e certificou-se que o pH
era cerca de 4,0 (inferior ao pKa
cido actico
=4,75) para este poder ser arrastado na forma
dissociada. Foram feitos dois ensaios, com 90 e 180 minutos de aquecimento.
No fim do tratamento, verificou-se o volume final do licor e, de seguida procede-
se do mesmo modo que nos anteriores tratamentos. Fez-se precipitao com NH
4
OH at
pH 5,5 - 6,0 seguida de arejamento e filtrao. O licor obtido foi mais uma vez testado
em fermentaes com 60% de licor nas mesmas condies de fermentao j descritas.

2.7.3 Remoo de Lenhosulfonatos

Como os resultados obtidos com a remoo de cido actico no foram os
esperados, escolheram-se resinas de troca inica para remoo de outros compostos
que estivessem a limitar o metabolismo da levedura, nomeadamente os
lenhosulfonatos.
A permuta inica consiste numa troca estequiomtrica de um io por outro,
obedecendo a uma relao de equilbrio. Estas reaces ocorrem nas Resinas de
Permuta Inica, cujo principal componente o poliestireno. Esta substncia forma uma
estrutura reticulada com o divinilbenzeno (DVB), tornando as resinas insolveis. Esta
matriz polimrica permite tambm a fixao dos grupos funcionais cido ou base, fortes
ou fracos, que conferem resina o seu carcter de permutadora de ies.

44
As resinas usadas neste trabalho foram seleccionadas com base em patentes
industriais (European Patent EP1354068 e US Patent 5637225 3 5730877): Dowex 50W
x 2, mesh 100-200, forma Na
+
(resina catinica); Amberlite IRA - 93, mesh 20 - 50,
base livre (resina aninica). As colunas tm aproximadamente 3,5cm de dimetro
interno e 50cm de altura.
Fizeram-se passar pela resina de permuta catinica 100 mL de licor previamente
filtrado com filtros de microfibra de vidro e dimetro de poro de 1 m. Recolheram-se
200 ml (um volume superior ao inicial devido diluio do licor com a gua de
hidratao presente na resina) a pH ~ 1, prova de que a permuta inica foi completa.
Os 200 mL recolhidos anteriormente passaram de seguida para a resina de permuta
aninica e a soluo recolhida (300 - 400 mL divididos em fraces de 100 mL) que
apresenta pH neutro, foi posteriormente analisada em HPLC para determinar a
concentrao de acares presentes.
O processo de lavagem e regenerao das resinas feito com NaOH 1M e HCl
1M intercalado com a neutralizao com gua destilada. Ambos os processos so
controlados a nvel de pH com o papel indicador.
A soluo recolhida foi ainda concentrada cerca de cinco vezes em evaporador
rotativo a 60C para simular a quantidade de acares presente no licor e
posteriormente usada para duas fermentao: a pH 5,8 e pH 7,0 nas seguintes
propores:

Tabela 8 - Tabela resumo dos ensaios feitos com a soluo de acares recolhida das colunas de
permuta inica.

Componente Concentrao (%v/v)
Inculo 10
Meio Suplementar 15
Fraco de Licor recolhida 75

Em resumo, o desenvolvimento do trabalho apresentado nesta tese pode ser
esquematizado da seguinte forma:

H Ha ar rd dw wo oo od d S Sp pe en nt t S Su ul lf fi it te e L Li iq qu uo or r
45

3.2 Erlenmeyer 3.3 Biorreactor 3.4 Hidrlise 3.5, 3.6 e 37
Enzimtica Remoo de Inibidores

Figura 16 - Esquema ilustrativo do trabalho desenvolvido na tese.

Pr-Tratamento
Fermentaes Optimizao do Meio
Resultados e Discusso
46

3. RESULTADOS E DISCUSSO

47

3.1.COMPOSIO DO LICOR

Foi feita uma anlise prvia do licor para determinao de alguns parmetros
importantes a ter em conta para o processo de fermentao de acordo com o
metabolismo da levedura. A sua composio encontra-se na Tabela 9.

Tabela 9 - Composio do Hardwood Spent Sulfite Liquor (HSSL) de Eucalyptus globulus ao sulfito
cido.

Componente

Concentrao (gL
-1
)
Lenhosulfonatos 78,2 0,6
cido actico 8,2 0,3
Furfural Vestgios
Cinzas 15,1 0,2
pH 3,40 0,05
Acares Redutores 42,8 0,4
D-xilose 24,6 0,5
D-manose 8,5 0,9
L-arabinose 7,8 0,3
D-galactose 4,5 0,1
D-glucose 2,3 0,1
L-ramnose 1,6 0,3
L-fucose 0,4 0,3

Estes parmetros so importantes a ter em conta para o processo de fermentao
de acordo com o metabolismo da levedura.
De notar que os monossacardeos foram determinados por GC-FID sofrendo uma
hidrlise cida prvia, o que significa que nos grficos das fermentaes que
monitorizam o consumo de substrato s sejam identificados os que existem em maiores
quantidades na forma monomrica - a xilose e a glucose, quantificados por HPLC.

48
3.2 FERMENTAES EM ERLENMEYER

3.2.1 Meios Sintticos

As fermentaes em meios sintticos tiveram como objectivo principal testar a
Pichia stipitis quanto sua viabilidade celular e quanto produo de etanol
relativamente converso dos monossacardeos existentes no licor.
O meio sinttico foi formulado juntando ao Meio Suplementar (MS) os
monossacardeos existentes no licor e ainda testada a presena de cido actico.
Foram ento feitos dois ensaios: um na presena e outro na ausncia de cido
actico, uma vez que este ser um dos factores limitantes do metabolismo, por ser
considerado inibidor.

Tabela 10 - Composio dos meios de fermentao sintticos (concentraes em gL
-1
).

Composto

Meio com cido actico
(gL
-1
)
Meio sem cido actico
(gL
-1
)
Glucose 5,0 5,0
Xilose 27,0 27,0
Manose 5,0 5,0
Arabinose 6,0 6,0
cido actico 9,5 0,0
Meio Suplementar
40% (v/v) 40% (v/v)

As curvas de crescimento apresentam taxas especficas de crescimento bastante
diferentes: enquanto que no meio com cido apenas de 0,20h
-1
, no meio sem cido o
crescimento ocorreu com uma taxa de 0,51h
-1
.
49

CRESCIMENTO EM MEIOS SINTTICOS A 60% (v/v)
EM ERLENMEYER COM E SEM CIDO ACTICO
-3,5
-2,0
-0,5
1,0
2,5
0 50 100 150
tempo (h)
l
n

A
b
s
o
r
v
n
c
i
a

a

6
5
0
n
m
com cido actico sem cido actico

Figura 17 - Curvas de crescimento nos meios sintticos em Erlenmeyer.

Pela Figura 17 verifica-se que o crescimento microbiano muito maior na
fermentao sem cido actico. No entanto, no meio com cido de notar que a taxa
especfica de crescimento significativa, o que se deve essencialmente glucose
presente no inculo inicial e que permitiu um arranque no meio fermentativo com cido,
uma vez que os acares no so consumidos (Figura 18).
0,0
10,0
20,0
30,0
0 50 100 150
Tempo (h)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

(
g
L
-
1
)
xilose glucose etanol xilose glucose etanol

Figura 18 - Curvas de consumo de acares e produo de etanol em meios sintticos (smbolos a
cheio correspondem ao meio com cido actico e smbolos a vazio ao meio sem cido).
=0,20h
-1

=0,51h
-1

50
Por anlise das amostras retiradas dos meios de fermentao verificou-se que
para a fermentao sem cido actico h consumo rpido de todos os acares (cerca
de 80h) com um rendimento em etanol (Y
p/s
)de 0,40 g etanol/g acar consumido
(glucose+xilose), sendo o rendimento mximo de 0,51 como j foi referido por Hgerdal
et al., 1996. Assim obteve-se uma concentrao mxima de 15,0 g/L de etanol a partir
das 40 g/L de acares iniciais.

3.2.2 Fermentaes Sequenciais com Licor Industrial

As fermentaes feitas em Erlenmayer tiveram todas a mesma composio em
termos de acares, sais e inculo, no entanto, ao fazer-se variar a concentrao de
licor no meio de fermentao, teve que se adaptar as concentraes dos acares e sais
adicionados. Assim, a composio fixa foi sempre planeada como apresentada na Tabela
11.

Tabela 11 - Composio das fermentaes em Erlenmeyer em termos de concentrao (gL
-1
).

Componente

Concentrao (gL
-1
)

Acares glucose
xilose
2,0
20,0
extracto de levedura 2,5
MS (NH
4
)
2
HPO
4,
2,0
(NH
4
)
2
SO
4
1,0

MgSO
4
.7H
2
O) 0,5

inculo
---

Assim, concludas as fermentaes pode analisar-se apenas o efeito da adio de
licor no comportamento da levedura.
Na Tabela 12 encontra-se a composio do meio inicial quanto concentrao de
glucose, xilose, cido actico e pH, assim como o resumo das curvas de crescimento em
termos de tempo de fase exponencial e taxa especfica de crescimento (
0
).

Os grficos correspondentes a cada batch encontram-se no Anexo 3

51
Tabela 12 - Composio inicial das fermentaes e dados das curvas de crescimento.

Acares fermentveis
(gL
-1
)
Batch pH
Glucose
inicial
Xilose
inicial
cido
actico
(gL
-1
)
Tempo
de fase
Exponencial
(h)
Taxa Especfica
de Crescimento
(h
-1
)
I (0% HSSL) 6,2 2,1 16,2 0,0 10 0,37
II (20% HSSL) 6,2 2,1 21,0 2,6 10 0,32
III (40% HSSL) 5,9 3,0 22,3 4,6 7 0,12
IV (60% HSSL) 5,9 3,1 23,0 6,6 - 0,0

Como se pode verificar, medida que o volume de licor aumenta na
fermentao, a taxa especfica de crescimento diminui, o que significa que alm da
biomassa diminuir, o arranque do crescimento vai sendo mais fraco.

Tabela 13 - Tabela resumo dos resultados de consumos e produo das fermentaes em Erlenmeyers.

*considerando rendimento mximo 0,51g de etanol/g de acar consumido (glucose+xilose).

Na Tabela 13 verifica-se que medida que o volume de licor aumenta na
fermentao h uma diminuio directa no consumo de acares e consequentemente,
na converso para etanol. Pelos valores de Y
p/s
pode afirmar-se que o licor de algum
modo inibidor quer do crescimento, quer do metabolismo de produo de etanol, uma
vez que para os 60% (v/v) os acares nem chegam a ser assimilados.
Em termos de produtividade volumtrica a mesma diminuio observada para
cada fermentao (Figura 19):

Acares
residuais (g/L)
Etanol
Batch
Tempo de
fermentao
(h)
Glucose Xilose
Y
P/S
*
(g.g
-1
)
Concent
. mx.
(g/L)
I (0% HSSL) 50 0,0 0,7 0,37 4,1
II (20% HSSL) 50 0,0 1,3 0,30 5,5
III (40% HSSL) 100 0,0 3,0 0,23 6,5
IV (60% HSSL) 100 2,6 22,5 0,00 0,0
52
0,3
0,2
0,1
0,0
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
Q
p
m
x

(
g
L
-
1
h
-
1
)
0% 20% 40% 60%
% de licor na fermentao
Produtividade Volumtrica

Figura 19 - Grfico de barras representativo da produtividade volumtrica das fermentaes em
Erlenmeyer

de salientar ainda que todas as fermentaes foram seguidas ao microscpio e
com placas de Petri (com meio YM slido) a meio do tempo total de fermentao para
detectar contaminaes possveis. Foram encontradas vrias destas contaminaes por
exemplo com Propioniumbacterium, uma vez que foi detectado cido propinico nas
anlises por cromatografia, assim como foram observados diferentes microrganismos
nas placas e no microscpio:

A) Placa de petri com espalhamento feito a meio de uma das fermentaes.

B) - Contaminao bacteriana observada ao microscpio (com ampliao de 500x)

Figura 20 - Exemplo de uma das contaminaes obtidas para alguns ensaios em Erlenmeyer:
A) observao em placa de Petri ; B) observao ao microscpio.
Pichia stipitis
(amarelada e de aspecto leitoso)

Propioniumbacterium
(branca e de aspecto esponjoso)

observao ao microscpio ptico que
confirmou a contaminao bacteriana
(forma caracterstica de bacilo das
bactrias e a parede bacteriana) assim
como tamanho muito menor

53
3.3 FERMENTAES EM BIORREACTOR

Relativamente s fermentaes em Erlenmeyer com agitao orbital e controlo de
temperatura, o biorreactor tem a vantagem de se poder controlar o pH ao longo de todo
o processo com a adio de hidrxido de sdio e de cido fosfrico.

Inicialmente foi pensado o estudo comparativo com as fermentaes sequenciais
em Erlenmeyer, no entanto, decidiu-se comear apenas na fermentao com 40% de
licor e deixar de lado as de 0% e 20%, uma vez que j seriam de esperar resultados
positivos. O objectivo ento, passou a ser apenas comparar pelo menos uma
fermentao e decidir qual o reactor mais adequado para fermentaes futuras, ou seja,
se realmente o biorreactor compensaria relativamente ao Erlenmeyer.

Tabela 14 - Tabela resumo da fermentao feita em biorreactor com 40% (v/v) de licor.

Acares fermentveis (gL
-1
)
Glucose Xilose
Batch pH
inicial final Inicial final
Etanol max.
(gL
-1
)
V 6,0 2,8 0,0 18,9 15,0 0,4

Como se pode observar pela Tabela 14 e ainda pela Figura 36 do Anexo 3, o
resultado no foi melhor do que o da fermentao em Erlenmeyer, pelo contrrio,
praticamente no houve consumo da xilose, e o etanol foi produzido apenas custa da
glucose.
J no ensaio feito em Erlenmeyer com os mesmos 40% de licor (v/v) houve
consumo de praticamente toda a xilose, para alm da glucose e o rendimento foi de
0,23 g de etanol/ g acar consumido.

54
3.3.1 Ensaio Abitico

Observou-se tambm, que com o decorrer das duas
fermentaes se formava um depsito amarelado (Figura 21)
que no era apenas biomassa. Para confirmar que esse mesmo
depsito no era formado por aco da levedura, mas sim por
eventual precipitao do meio fermentativo, foi feito um ensaio
abitico (sem levedura) com 40% de licor.

Figura 21 - Fotografia do depsito observado no ensaio abitico com 40% de licor.

Ao longo das 100h de ensaio foram retiradas amostras para quantificao dos
acares e dos lenhosulfonatos e verificou-se que estes se mantiveram constantes o
que no conclusivo para indicar de facto a degradao destes compostos do licor
como inicialmente se pensava. Posteriormente, este depsito foi liofilizado e efectuada
uma anlise elementar cujos resultados se encontram na Tabela 15 e uma anlise de
FT-IR (Anexo 4).

Tabela 15 - Resultados obtidos por anlise elementar.

Carbono
(%)
Azoto
(%)
Hidrognio
(%)
Enxofre
(%)
2,6420,053 4,6040,066 3,2190,065 0,5480,049

At ao momento no foi possvel descobrir a composio completa deste
depsito. Sabe-se apenas que tem na sua maioria carbono, hidrognio e azoto
provavelmente dos sais. No entanto, a percentagem de enxofre dos grupos sulfnicos
(0,5%) foi muito baixa, o que significa que realmente no houve degradao dos
lenhosulfonatos como confirmado pela sua medio (por UV) ao longo do ensaio.
Pelo espectro de FT-IR consegue ver-se a banda dos grupos sulfnicos aos 3741
cm
-1
, assim como a do enxofre livre aos 561cm
-1
. De resto, ficam ainda por identificar
os grupos funcionais das bandas 1401cm
-1
e 1081cm
-1
.
Certamente, este precipitado foi provocado pela adio do cido e da base
durante a manuteno do pH com as bombas peristlticas, associado tambm ao tipo
de agitao - ambos parmetros que diferem dos Erlenmeyers.

Assim, a hiptese de continuar fermentaes em biorreactor foi posta de parte,
da que todos os ensaios seguintes continuaram a ser em Erlenmeyer.
55
3.4 HIDRLISE ENZIMTICA

O objectivo deste passo, includo na optimizao do meio de fermentao, foi
aumentar a disponibilidade de acares fermentveis de modo a aumentar a produo
de etanol.
Muitos so os artigos que citam a hidrlise enzimtica de material
lenhocelulsico [7, 11, 35, 37, 57-59], nomeadamente com endoglucanases,
exoglucanases e celobiases, muitas vezes produzidas in situ a partir de inmeros
microrganismos como fungos e bactrias. No entanto, aqui no se trata da biomassa
lenhocelulsica propriamente dita, logo no seria necessrio usar celulases, uma vez
que a celulose retida ao mximo para a produo de pasta de papel.
Neste caso, como o objectivo o aproveitamento do licor que resulta do
cozimento cido do eucalipto, h que seleccionar as enzimas mais adequadas aos
acares polimerizados que fazem parte deste licor.
No caso de folhosas como o eucalipto, de esperar que os monmeros mais
abundantes sejam a xilose e a glucose derivadas precisamente das hemiceluloses mais
abundantes - as glucanas e as glucoronoxilanas e ainda de oligmeros de celulose
semi-degradada.
Assim, e como j foi referido na seco de Mtodos Experimentais foram usadas
trs quantidades diferentes de uma enzima comercial Econase Wheat P Plus com
actividade de xilanase e glucanase. Os resultados da hidrlise foram analisados por
HPLC em vrios intervalos de tempo.

0
2
4
6
8
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

(
g
L
-
1
)
0 30 60 90 120 180
Tempo de Hidrlise (min.)
Aumento de Glucose
500mg 1000mg 3000mg

Figura 22 - Grfico de barras representativo do aumento de glucose por hidrlises enzimtica.
56
15
17
19
21
23
25
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

(
g
L
-
1
)
0 30 60 90 120 180
Tempo de Hidrlise (min.)
Aumento de Xilose
500mg 1000mg 3000mg

Figura 23 - Grfico de barras representativo do aumento de xilose por hidrlises enzimtica.

Como se pode observar nos grficos de barras representados nas Figuras 22 e
23, a hidrlise quer de glucose quer de xilose foi mais eficiente no ensaio 3 com
3000mg de enzima, ou seja, 6,0% (m/v) do volume de licor. Neste ensaio, a
concentrao de glucose quase quadriplicou e a de xilose aumentou 30%. J os outros
dois ensaios (1 e 2) foram muito semelhantes, com aumentos de glucose na ordem dos
60-70% e de xilose na ordem dos 10-13%.
De notar que no se usaram concentraes maiores de enzima por limitaes de
manuteno de um meio de fermentao vivel, uma vez que se comeavam a formar
depsitos que poderiam ser adversos sobrevivncia das leveduras.

Apesar de se revelar um processo eficaz em termos de aumento da fonte de
carbono disponvel, no foi possvel converter estes acares em etanol, uma vez que a
levedura no cresceu nas duas fermentaes realizadas com 60% (v/v) de licor. O que
significa que antes de qualquer hidrlise neste sentido, devero ser removidos todos e
quaisquer inibidores do licor. No entanto, ser um processo de optimizao do meio de
fermentao a ter em conta para fermentaes futuras.

57
3.5 DESACIDIFICAO POR ARRASTAMENTO DE VAPOR

A destilao por arrastamento de vapor teve como objectivo a remoo do cido
actico, por estar referido como um dos principais inibidores da fermentao etanlica
[14, 43, 51, 52]. ainda um mtodo de fcil integrao no processo de produo de
pasta, com aproveitamento de vapor dos evaporadores onde o licor queimado.
Foram feitos dois ensaios com 90 (I) e 180 (II) minutos de destilao e verificou-
se que de facto foi removido cerca de 50% do cido actico do licor quer por anlise do
destilado quer por anlise ao licor final obtido.

Tabela 16 - Composio do licor no incio e final da destilao por arrastamento de vapor.

Quer para o licor resultante do tratamento I quer do tratamento II obteve-se um
aumento da glucose monomrica e da xilose, cujos resultados foram determinados por
HPLC. Assim, tentou fazer-se uma fermentao com 60% deste licor resultante em
Erlenmeyer com 250mL de volume total.
Tanto para um tratamento como para outro, nas fermentaes no houve
produo de etanol e o crescimento foi muito baixo, pois para alm da remoo do
cido no ter sido completa, o aquecimento excessivo poder ter levado formao de
compostos de caramelizao [60]. De qualquer modo, a extenso do tempo de
destilao no se justifica na remoo de cido, uma vez que a remoo foi muito
idntica dos 90 para os 180minutos.

3.6 DESACIDIFICAO - ABORDAGEM BIOLGICA

Depois da tentativa de remoo de cido actico por arrastamento de vapor no
apresentar os melhores resultados, tentou fazer-se uma abordagem biolgica da
Glucose
(gL
-1
)
Xilose
(gL
-1
)
cido actico
(gL
-1
) Tratamento
Tempo
(min.)
Inicial Final Inicial Final Inicial Final
I 90 0,8 1,4 18,0 17,9 8,2 4,5
II 180 0,8 4,6 18,0 27,4 8,2 4,3
58
desacidificao por serem vrias as referncias em artigos sobre desacidificao com
leveduras, fungos ou mesmo bactrias geneticamente modificadas [14, 52, 61].

3.6.1 Escolha de Levedura desacidificante em meio slido

Inicialmente foi estudado o comportamento de seis espcies diferentes de
leveduras desacidificantes: Z. bailli, C. tropicalis, C. utilis, P. anomala, S. cerevisiae e K.
marxianus em diferentes pHs e diferentes concentraes de acares, portanto em
diferentes meios. Paralelamente foi feito sempre um ensaio com a Pichia stipitis para
testar realmente a incapacidade de remoo de cido actico.

A - Meios com Acares e cido actico

O meio com acares o meio inicial representado na Tab. 5, ou seja, com:

- 0,15% de glucose
- 2,0% de xilose
- 0,6% e 0,8% de cido actico

Para mudanas de pH entre 4,0 e 5,0 foi usado o verde de bromocresol que vira
para azul, e para mudanas entre 5,5 e 6,5 foi usado o prpura de bromocresol que vira
para roxo. Esquematicamente temos:

Figura 24 - Esquema do estudo de pH de acordo com as zonas de viragem dos indicadores.

pH de crescimento de leveduras
4,0
Verde de
bromocresol
Prpura de
bromocresol
4,5 5,0 5,5 6,0 6,5
azul roxo
59
Para cada zona de viragem de cada indicador foram ento feitos dois meios:
com 6,0g/L de cido actico como estudado por Schler D., 1998 [13] e 8,0g/L (como
representao do licor).

i)- Meio com 0,6% (p/v) de cido actico:

Os resultados so indicados em:
Mudana de cor (+ positiva ou - negativa) / Grau de crescimento (de 1 a 5
consoante a cobertura da placa e densidade de biomassa)

Tabela 17 - Resultados do crescimento e mudana de cor no meio slido selectivo com acares e
6,0gL
-1
de cido actico.

Verde de bromocresol (pH 4,0-5,0) Prpura de bromocresol (pH 5,5-6,5)
Levedura Dia 1 Dia 2 Dia 3 Dia 1 Dia 2 Dia 3
P. anomala -/- -/+(1) -/+(1) +(2)/+(4) +(5)/+(5) +(5)/+(5)
K. marxianus -/- -/- -/+(1) -/+(2) +(4)/+(4) +(4)/+(4)
C. tropicalis -/- -/- -/- -/- -/+(5) -/+(5)
C. utilis -/- -/- -/- + (2)/+(4) +(4)/+(4) +(4)/+(4)
P. stipitis -/- -/+(1) -/+(1) -/+(1) -/+(5) -/+(5)
S. cerevisiae -/- -/+(2) -/+(2) -/+(1) +(3)/+(4) +(4)/+(4)
Z. baillii -/- -/+(2) -/+(3) -/- -/+(1) -/+(3)

Pelos resultados obtidos na Tabela 17 verifica-se que nas placas com o verde de
bromocresol, ou seja, com o pH mais baixo, no houve mudana de cor, e portanto no
houve consumo de cido actico. O crescimento em geral, foi fraco. Quanto ao meio
prpura, verificou-se uma mudana de cor mais rpida para a C. utilis e para a P.
anomala, confirmando o consumo de cido com aumento de pH, assim como um
crescimento elevado para as mesmas e ainda para a S. cerevisiae e K. marxianus.

ii) - Meio com 0,8% (p/v) de cido actico:

60

Tabela 18 - Resultados do crescimento e mudana de cor no meio slido selectivo com acares e
8,0gL
-1
de cido actico.

P. anomala
-/- -/- -/- +(2)/+(4) +(4)/+(5) +(4)/+(5)
K. marxianus
-/- -/+(1) -/+(1) -/+(2) +(2)/+(2) +(4)/+(4)
C. tropicalis
-/- -/- -/- -/+(3) -/+(5) -/+(5)
C. utilis
-/+(1) -/+(1) -/+(1) + (2)/+(3) +(4)/+(4) +(5)/+(5)
P. stipitis
-/+(1) -/+(1) -/+(1) -/+(1) -/+(3) -/+(4)
S. cerevisiae
-/+(1) -/- -/- +(1)/+(1) +(3)/+(3) +(4)/+(3)
Z. baillii
-/- -/- -/+(2) -/- +(1)/+(1) +(2)/+(2)

Com 8,0gL
-1
de cido actico os resultados foram muito semelhantes. Na tabela
18 pode verificar-se que para pH baixos a mudana de cor no ocorreu e que o
crescimento apenas se evidenciou na Z. bailli. Quanto ao meio prpura, mais uma vez a
mudana de cor mais rpida foi nas leveduras P. anomala e C. utilis e o crescimento foi
maior nas mesmas e na K. marxianus ao fim do 3 dia.

De referir ainda que foram sempre feitas placas sem inculo, ensaios abiticos,
para verificar se poderia eventualmente ocorrer mudana de cor ao longo do tempo
apenas por factores externos s leveduras ou se poderia haver algum crescimento por
contaminao. Nesses casos, essa mudana nunca se verificou.

B - Meios sem Acares com cido actico

Apesar dos resultados positivos de mudana de cor no meio prpura, era
necessrio obter crescimento microbiano apenas custa do cido actico presente como
fonte de carbono, de modo a deixar os acares livres para a fermentao etanlica.
Assim, foi feito um segundo meio com cido actico mas sem acares.

61
i) Meio com 0,6% (p/v) de cido actico:

Tabela 19 - Resultados de crescimento e mudana de cor no meio slido selectivo sem acares e
6,0gL
-1
de cido actico.

P. anomala
-/- -/- -/- +(1)/+(2) +(4)/+(2) +(5)/+(5)
K. marxianus
-/- -/- -/- -/- +(1)/+(1) +(3)/+(4)
C. tropicalis
-/- -/- -/- -/- +(4)/+(3) +(5)/+(5)
C. utilis
-/- -/- -/- +(3)/+(3) +(4)/+(3) +(5)/+(5)
P. stipitis
-/- -/- -/- +(2)/+(2) +(1)/+(1) +(4)/+(5)
S. cerevisiae
-/- -/+(1) +(1)/+(2) +(1)/+(1) +(2)/+(1) +(5)/+(4)
Z. baillii
-/- -/- -/- -/- -/- +(1)/+(1)

Nestes meios sem acares, os resultados foram ligeiramente diferentes,
principalmente no meio de pH mais baixo. A nica levedura que apresentou crescimento
e mudana de cor foi a S. cerevisiae, chegando mesmo a cobrir a placa toda ao 8 dia
de crescimento (Fig. 25b). J nas placas de meio prpura, com pH mais elevado, a C.
utilis foi a que apresentou mudana de cor mais rpida, logo no 1 dia (Fig. 25a). O
crescimento maior associado a mudana de cor por mudana de pH observou-se para P.
anomala, C. tropicalis e C. utilis.

a) b)

Figura 25 - Exemplos das fotografias tiradas s placas de meio slido diferencial: a) mudana de cor
no meio prpura por C. utilis, b) crescimento em meio verde por S. cerevisiae.

ii) Meio com 0,8% (p/v) de cido actico:

62
Este meio foi talvez o mais importante a nvel de seleco de leveduras
desacidificantes, pois alm de ter uma concentrao de cido actico semelhante do
licor, no possui acares e portanto as leveduras iro usar o cido como fonte de
carbono.

Tabela 20 - Resultados de crescimento e mudana de cor no meio slido selectivo sem acares e
8,0g/L de cido actico.

P. anomala
-/- -/- -/- +(1)/+(1) +(3)/+(4) +(3)/+(5)
K. marxianus
-/- -/+(1) -/+(1) -/- -/+(1) +(1)/+(1)
C. tropicalis
-/- -/+(1) -/+(1) +(3)/+(2) +(4)/+(5) +(4)/+(5)
C. utilis
-/- -/- -/- + (2)/+(1) +(4)/+(5) +(5)/+(5)
P. stipitis
-/- -/+(1) -/+(1) -/- -/+(1) +(2)/+(2)
S. cerevisiae
-/- -/- -/- -/- +(2)/+(2) +(3)/+(2)
Z. baillii
-/- -/- -/- -/- -/- -/-

Observando a Tabela 20 pode concluir-se que no geral, o crescimento diminui
em ambos os meios. No verde de bromocresol no foi registada nenhuma mudana de
cor e o crescimento de biomassa foi mesmo muito pouco. No meio prpura, a mudana
de cor s foi mxima na C. utilis. J o crescimento abundante foi observado na P.
anomala, na C. tropicalis e na C. utilis.

Com os resultados obtidos, e a partir das seis leveduras iniciais, foi ento feita
uma pr-seleco das espcies que possam talvez ser as mais eficazes para o fim
destinado - a remoo de cido actico no meio fermentativo com licor. Passou-se
ento aos testes em meio lquido, mas agora apenas com as 4 melhores leveduras:
Saccharomyces cerevisiae, Candida tropicalis, Candida utilis e Pichia anomala.
Este mtodo permitiu diminuir o tempo e morosidade do processo envolvido nas
fermentaes, quer na preparao e anlise dos meios por HPLC, tornando o processo
de escolha muito mais rpido e fcil.

63
3.6.2 Optimizao da etapa de desacidificao

A - Fermentao com Saccharomyces cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae
0,0
3,0
6,0
9,0
12,0
15,0
0 40 80 120 160 200 240
tempo (h)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

(
g
/
L
)
1,0
3,0
5,0
7,0
9,0
11,0
13,0
p
H
biomassa cido actico xilose glucose pH
.

Figura 26 - Grfico do crescimento e consumos da fermentao com Saccharomyces cerevisiae.

Na figura 26 pode observar-se que o consumo de cido actico foi de facto
muito rpido e eficaz logo s 20h, acompanhado como era de esperar, de um
ligeiro aumento de pH. No entanto, valores to elevados de pH (maiores que 6,0)
talvez possam ser prejudiciais ao metabolismo, o que pode ser facilmente
controlado em biorreactor com adio de cido fosfrico, por exemplo. Depois d-se
o consumo da fonte de carbono mais disponvel, a xilose, que consumida
lentamente a partir das 40h at ao final da fermentao. De notar que a glucose
presente no licor muito baixa (1,5- 2,0g/L) e portanto na fermentao est
diluda a 60% logo, no quantificada no HPLC, foi por isso considerada nula em
toda a fermentao. A taxa especfica de crescimento (
0
) foi de 0,150,02 h
-1
.

64

B - Fermentao com Candida tropicalis

Candida tropicalis
0,0
3,0
6,0
9,0
12,0
15,0
0 50 100 150 200 250
tempo (h)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

(
g
/
L
)
1,0
3,0
5,0
7,0
9,0
11,0
13,0
p
H
biomassa cido actico glucose xilose pH

Figura 27 - Grfico do crescimento e consumos da fermentao com Candida tropicalis.

Na fermentao representada na figura 27 o consumo de cido actico j
demorou mais tempo, desaparecendo por completo por volta das 70h de
fermentao. O pH e a biomassa aumentaram gradualmente e a taxa especfica de
crescimento (
0
) foi 0,140,03 h
-1
. Neste caso, o consumo da xilose mais evidente
acompanhou o consumo do cido actico o que no conveniente. O que se
pretende que a levedura consuma em primeiro lugar o cido actico que o
inibidor da fermentao etanlica.

65

C - Fermentao com Candida utilis

Candida utilis
0,0
3,0
6,0
9,0
12,0
15,0
0 50 100 150 200 250
tempo (h)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

(
g
/
L
)
1,0
3,0
5,0
7,0
9,0
11,0
13,0
p
H

Figura 28- Grfico do crescimento e consumos da fermentao com Candida utilis.

Na figura 28 o cido actico consumido muito lentamente durante toda a
fermentao, s mesmo s 220h que desaparece por completo, sendo o seu consumo
acompanhado pelo da xilose. Mais uma vez o pH acompanha a diminuio de cido
actico aumentando para valores de 6,6. A taxa especfica de crescimento foi
ligeiramente mais alta (0,160,05 h
-1
).

66
D - Fermentao com Pichia anomala

Pichia anomala
0,0
3,0
6,0
9,0
12,0
15,0
0 50 100 150 200
tempo (h)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

(
g
/
L
)
1,0
3,0
5,0
7,0
9,0
11,0
13,0
p
H

Figura 29 - Grfico do crescimento e consumos da fermentao com Pichia anomala.

Finalmente no grfico da figura 29 pode ver-se que o cido tambm s foi
consumido aps 70h acompanhado de consumo de xilose. A taxa especfica de
crescimento no entanto, foi a maior de todas as outras fermentaes: 0,220,03h
-
1
, talvez por ser a espcie mais resistente ao licor.

Os resultados obtidos nestas fermentaes podem ento comparar-se na
Tabela 21:

Tabela 21 - Tabela resumo das fermentaes com leveduras desacidificantes.

Levedura 0 (h
-1
)
Consumo completo do
cido actico aps (h)
Consumo de
xilose*(gL
-1
)

Saccharomyces cerevisiae 0,15 0,02 20 12,0 0,6
Candida tropicalis 0,14 0,03 70 9,6 0,4
Candida utilis 0,16 0,05 220 7,6 0,9
Pichia anomala 0,22 0,03 72 7,1 0,3
* xilose consumida at ao ltimo ponto (das 0h s 240h de fermentao)
67

Como se pode observar os melhores resultados foram sem dvida obtidos com a
Saccharomyces cerevisiae, com um consumo de todo o cido actico em apenas 20h.
Assim, decidiu-se inocular esta levedura antes da Pichia stipitis com vista remoo
prvia do cido. Foram ento adoptados dois mtodos:

a) Inoculao da Saccharomyces cerevisiae e aps 24h inoculao da Pichia
stipitis;
b) Inoculao da Saccharomyces cerevisiae, e aps 24h filtrao da biomassa e
inoculao da Pichia stipitis;

Cada ensaio foi realizado em duplicado e os resultados podem comparar-se nas
figuras 30 a) e b) que mostram as mdias das duas fermentaes.

a)
S. cerevisiae + P. stipitis
0,0
3,0
6,0
9,0
12,0
15,0
0 30 60 90 120 150 180
tempo (h)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

(
g
/
L
)
1,0
3,0
5,0
7,0
9,0
11,0
13,0
p
H
glucose xilose cido actico etanol biomassa pH

68
b)
S. cerevisiae filtrada + P. stipitis
0,0
3,0
6,0
9,0
12,0
15,0
0 30 60 90 120 150 180
tempo (h)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

(
g
/
L
)
1,0
3,0
5,0
7,0
9,0
11,0
13,0
p
H
glucose xilose cido actico etanol biomassa pH

Figura 30 - Curvas de consumos do processo de desacidificao em meio lquido: a) com
Saccharomyces cerevisiae seguida de adio de Pichia stipitis b) com Saccharomyces cerevisiae seguida
de filtrao e adio de Pichia stipitis.

Nos grficos acima representados verifica-se que de facto h consumo da xilose
praticamente toda aps 8 dias de fermentao, no entanto a converso para etanol no
conseguida em nenhum dos processos, da que a filtrao da biomassa no trouxe
vantagens ao mtodo. De facto evidencia-se um maior consumo da xilose a partir do
momento que no h cido actico, mas ainda assim h inibidores no licor que tm que
ser previamente removidos, uma vez que a fermentao etanlica no conseguida,
apesar de ocorrer crescimento microbiano.

3.7 RESINAS DE TROCA INICA

De facto, quer a desacidificao por arrastamento de vapor, quer a desacidificao
biolgica conseguida com grande sucesso, no promoveram a fermentao dos
acares a etanol, o que leva a concluir que h outros inibidores no licor, certamente os
lenhosulfonatos que esto presentes em grande concentrao. Para ultrapassar esta
69
limitao fez-se uma separao em coluna de permuta inica e utilizou-se apenas a
fraco dos acares que da se obteve para promover a fermentao etanlica.
Este tipo de permuta inica est j descrito em vrias patentes internacionais com
o objectivo de separar a xilose do licor ao sulfito cido para ser posteriormente usada
em rao animal [56] ou produtos aromticos utilizados na indstria alimentar [35].

As solues obtidas directamente das colunas de troca inica apresentavam-se
praticamente incolores e a sua composio foi determinada por HPLC (Tabela 22). No
FT-IR verificou-se apenas vestgios dos lenhosulfonatos.

Tabela 22 - Composio da soluo de acares recolhida a partir de separao inica do licor por
resinas catinica e aninica.

Componente

Concentrao (gL
-1
)
Lenhosulfonatos Vestgios
cido actico 0,0 0,0
pH 5,40 0,05
Xilose 5,7 0,3
Glucose 0,5 0,2

Esta soluo foi concentrada quatro vezes em evaporador rotativo, suplementada
com Meio Suplementar (MS) e dividida para duas fermentaes a pH diferentes
(acertado com NH
4
OH): uma a 5,8 e outra a 7,0.

70
FERMENTAO DA SOLUO DE ACARES
0,0
4,0
8,0
12,0
16,0
20,0
0 10 20 30 40 50
tempo (h)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

(
g
/
L
)
1,0
4,0
7,0
10,0
13,0
p
H
glucose xilose etanol biomassa pH

Figura 31- Fermentao da soluo de acares a pH 7,0 (linhas a cheio) e pH 5,8 (linhas a tracejado).

Tabela 23- Resumo das fermentaes com a soluo de acares a diferente pH.

Parmetros pH 5,8 pH 7,0
Etanol (gL
-1
) 8,1 8,8
Yp/s (g etanol/g acar consumido) 0,49 0,48
Qp
max
(g etanol/L meio fermentado e por h) 1,22 1,04
Eficincia da Converso (%) 96 94
Consumo Total de acares aps (h) 30 24

Como se pode observar pelo grfico da Figura 31 e pela Tabela 23, a Pichia stipitis
conseguiu consumir todos os acares e ferment-los a etanol. Estas foram de facto as
fermentaes mais eficientes com uma converso acima dos 94% e em apenas 24h e
30h a pH 7,0 e 5,8 respectivamente. Apesar de se obter mais etanol a pH 7,0 (cerca de
8,8gL
-1
), a eficincia da converso foi maior a pH 5,8 assim como a produtividade
volumtrica.
Este foi de facto o mtodo mais eficaz na remoo de todos e quaisquer
inibidores, no entanto, a recolha da prpria soluo de acares das resinas foi um
processo muito demorado e trabalhoso.

Concluses
71

4. CONCLUSES

Concluses
72

O presente trabalho teve como obejctivo principal o aproveitamento de
monossacrdeos presentes no licor ao sulfito cido, nomeadamente de xilose, para
produo de bioetanol. No entanto, logo de incio, pde verificar-se que este licor tem
um efeito inibitrio na fermentao alcolica. Com as fermentaes em Erlenmeyers
verificou-se a variao de metabolismo da Pichia stipitis medida que o volume de licor
aumentava no meio de fermentao. O valor mximo assimilado foi 40% (v/v) de licor,
uma vez que com 60% (v/v) a levedura j no conseguiu consumir nenhum acar e
consequentemente produzir etanol. O rendimento mximo obtido foi de 73% com
apenas 20% (v/v) de licor e decresceu para 45% com o dobro de licor. Os ensaios
prvios em meio sinttico provaram que de facto o cido actico presente no licor
(8,2gL
-1
) um dos fortes inibidores a eliminar pois, o meio sinttico com cido actico
no evidenciou actividade fermantativa. Neste caso, diz-se que a levedura est sob
stress cido. Torna-se portanto necessrio atenuar o efeito de inibio do cido actico
permitindo prolongar a fermentao e obter concentraes finais de etanol mais
elevadas.

As fermentaes em biorreactor tinham como objectivo controlar essencialmente
o pH, visto que este um dos factores importantes para o correcto metabolismo
fermentativo, no entanto, no tiveram sucesso. Foi observado um depsito elevado que
confirmou-se no ser apenas biomassa, pelo ensaio abitico. Este depsito, que
provavelmente ter origem em precipitaes do cido e da base adicionados ao reactor,
influenciou as medies de absorvncia que monitorizavam o crescimento e pode ter
impedido de algum modo o processo da fermentao. O tipo de geometria e agitao
diferentes relativamente ao Erlenmeyer tambm podero estar na origem de diferenas
ao nvel de transferncias de oxignio e de massa no processo fermentativo.

A hidrlise enzimtica s se revelou realmente eficaz para elevadas concentraes
de enzima. Com 6,0% (m/v) de Econase Wheat P Plus conseguiu-se aumentar a
concentrao de glucose cerca de quatro vezes mais e a de xilose para 30%, no entanto
necessrio verificar a viabilidade deste processo a nvel industrial. Mesmo aumentando
a fonte de carbono disponvel, as fermentaes realizadas no foram bem sucedidas
pois continuou-se a tentar os 60% de licor, o que revela que realmente o factor
toxicidade presente se sobrepe capacidade fermentativa da levedura.

Na remoo de inibidores tentou-se retirar o cido actico do licor por destilaes
por arrastamento de vapor e por desacidificao biolgica. Nas destilaes s se
conseguiu remover cerca de 50% do cido actico. Na desacidificao biolgica foram
usadas seis leveduras diferentes das quais a Saccharomyces cerevisiae se revelou a
mais eficiente, consumindo todo o cido actico em apenas 20h. Ainda assim, a adio
Concluses
73
de um inculo de Pichia stipitis aps este passo no revelou qualquer produo de
etanol aps todo o consumo de xilose. A P. stipitis usou a xilose apenas para
crescimento e manuteno.
Conclui-se ento que outros compostos inibidores como os lenhosulfonatos e os
compostos fenlicos, estejam a bloquear o processo fermentativo e a sua remoo
praticamente completa fez-se usando colunas de resinas de troca inica. Deste processo
resultou uma soluo rica em xilose praticamente incolor que depois de concentrada foi
usada em duas fermentaes a diferentes valores de pH. A pH 5,8 obteve-se uma
eficincia mais elevada (96%), no entanto o consumo de xilose demorou mais 6h do
que a pH7,0 onde a eficincia foi ligeiramente menor (94%). Conclui-se portanto que
um pH intermdio, talvez 6,5 fosse o ideal. De facto, este foi o mtodo mais eficaz na
remoo conjunta de todos os inibidores (cido actico, lenhosulfonatos, furfural,
fenlicos, etc.), tornando consequentemente as fermentaes com a Pichia stipitis
extremamente rpidas e eficientes. Este estudo permitiu verificar que a fermentao
directa do licor no permite a produo de bioetanol, mas que esta pode ser conseguida
depois de uma separao e concentrao dos monossacardeos fermentveis com
elevados rendimentos e produtividades. No entanto, h que associar sempre ao produto
final, o custo total deste processo de separao quanto viabilidade de produo
escala industrial.
Bibliografia
74

5. BIBLIOGRAFIA

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73.

Anexos
79

6. ANEXOS

Anexos
80

ANEXO 1 - Rectas de Calibrao (HPLC)

Recta de Calibrao da Glucose
y = 1173,9x - 496,54
R
2
= 0,9996
0
10000
20000
30000
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0
Concentrao (g/L)
r
e
a
Recta de Calibrao da Xilose
y = 1094,2x - 365,75
R
2
= 0,9995
0
10000
20000
30000
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0
Concentrao (g/L)
r
e
a

Recta de Calibrao do cido Actico
y = 552,62x - 479,92
R
2
= 0,9989
0
5000
10000
15000
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0
Concentrao (g/L)
r
e
a
Recta de Calibrao do Etanol
y = 468,17x - 836,25
R
2
= 0,9998
0
5000
10000
15000
0,0 5,0 10,0 15,0 20,0
Concentrao (g/L)
r
e
a

Anexos
81

ANEXO 2 - Rectas de Calibrao (GC-FID)
Ramnose
y = 1,2734x - 0,0170
R
2
= 0,9999
0,0
0,5
1,0
1,5
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
m(ram)/m(P.I.)
A
(
r
a
m
)
/
A
(
P
.
I
)
Fucose
y = 1,0528x - 0,0046
R
2
= 0,9999
0,0
0,5
1,0
1,5
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
m(fuc)/m(P.I)
A
(
f
u
c
)
/
A
(
P
.
I
)

Arabinose
y = 1,0368x - 0,0051
R
2
= 0,9998
0,0
1,0
2,0
3,0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
m(ara)/m(P.I.)
A
(
a
r
a
)
/
A
(
P
.
I
)
Xilose
y = 1,0405x - 0,0093
R
2
= 0,9999
0,0
1,0
2,0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
m(Xil)/m(P.I)
A
(
x
i
l
)
/
A
(
P
.
I
.
)

Manose
y = 1,1008x - 0,0009
R
2
= 0,9997
0,0
0,5
1,0
1,5
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
m(man)/m(P.I)
A
(
m
a
n
)
/
A
(
P
.
I
)
Galactose
y = 1,0408x + 0,0118
R
2
= 0,9999
0,0
1,0
2,0
3,0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
m(gal)/m(P.I)
A
(
g
a
l
)
/
A
(
P
.
I
)

Glucose
y = 1,0721x - 0,0013
R
2
= 0,9998
0,0
1,0
2,0
3,0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
m(glu)/m(P.I)
A
(
g
l
u
)
/
A
(
P
.
I
)

Anexos
82

ANEXO 3 - Grficos correspondentes s fermentaes em
Erlenmeyers

BATCH I - ERLENMEYER COM 0% HSSL
0,0
4,0
8,0
12,0
16,0
20,0
0 10 20 30 40 50
tempo (h)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

(
g
/
L
)
0,0
3,0
6,0
9,0
12,0
p
H

Figura 32- Fermentao em meio suplementar (MS) e 0% de licor.

BATCH II - ERLENMEYER COM 20% HSSL
0,0
4,0
8,0
12,0
16,0
20,0
0 10 20 30 40 50
tempo (h)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

(
g
/
L
)
0,0
3,0
6,0
9,0
12,0
p
H
glucose xilose etanol biomassa cido actico pH

Figura 33 - Fermentao com 20% de licor.
Anexos
83
BATCH III - ERLENMEYER COM 40% HSSL
0,0
4,0
8,0
12,0
16,0
20,0
24,0
0 20 40 60 80 100
tempo (h)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

(
g
/
L
)
0,0
3,0
6,0
9,0
12,0
p
H

Figura 34 - Fermentao com 40% de licor

BATCH IV - ERLENMEYER COM 60% HSSL
0,0
5,0
10,0
15,0
20,0
25,0
0 20 40 60 80 100
tempo (h)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

(
g
/
L
)
0,0
3,0
6,0
9,0
12,0
p
H

Figura 35 - Fermentao com 60% de licor.

Anexos
84

BATCH V - BIORREACTOR COM 40% HSSL
0,0
4,0
8,0
12,0
16,0
20,0
24,0
0 20 40 60 80 100
tempo (h)
C
o
n
c
e
n
t
r
a
o

(
g
/
L
)
0,0
3,0
6,0
9,0
12,0
p
H

Figura 36 - Fermentao com 40% de licor em biorreactor.

Anexos
85
ANEXO 4 - Espectro de FT-IR relativo ao ensaio abitico.

Produção de Bioetanol A Partir de Licor de Cozimento Ao Sulfito Ácido

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Produção de Bioetanol A Partir de Licor de Cozimento Ao Sulfito Ácido

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Universidade de Aveiro

em autoclave a 120C durante 22 minutos.

Wheat P Plus com vista degradao dos acares polimricos

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