Radio imunoensaio ( RIA)

Ac-AG Sensvel e especfica Radio uso de um rdio istopo ( autorizao do conselho de energia nuclear CNEN), emite radiao ionizante. Por conta da periculosidade, essa tcnica no muito utilizada. Quando a concentrao da substancia muito baixa, no temos alternativa. O ELISA a tcnica utilizada em substituio ao radio imunoensaio.

ELISA espectrofotometria. Logo, quando comparado ao RIE, no uma tcnica to sensvel.

Rdio istopo por exemplo, uma dosagem hormonal. Ento, so necessrios: 1- Anticorpo contra a substancia 2- Anticorpo marcado com o istopo 3- Analisar o periculosidade 4- Radioproteo 4.1 distancia da fonte 4.2 tempo de exposio 4.3 Blindagem ( Beta acrlico e gama- chumbo) No se usa chumbo para proteger de radiao beta, porque os eltrons vo se chocar, fazendo com que o chumbo perca eltrons/prtons

formando dessa forma radiao X, logo, a pessoa ficar exposta a raios X. 4.4 Resduo de material radioativo. Ele tem que ser segregado, no dever ficar em qualquer local. Quando se trabalha com RIE voc pode descarta o lquido em lixo comum, porque a radiao baixa e ocorre a diluio da radioatividade. Porm, existe tubos que no vo no lixo comum, como por exemplo o tubo utilizado para a diluio do radioistopo marcado. Tem que deixalo lavando, decaindo. 5- Existe tcnica alternativa? 6- A radiao aumenta muito a sensibilidade

Princpios bsicos Alta especificidade e seletividade Reatividade cruzada so capazes de reconhecer outras molculas com alta seletividade Ag + Ac AgAc Velocidade de formao do complexo diretamente proporcional a

concentrao do Ag e do Ac. Velocidade de dissociao da ligao diretamente proporcional a

concentrao do complexo. Equilbrio da reao Vf = Vd

Formao de complexos devido a grande afinidade um pelo outro. Porm, eles podem se dissociar. Para transformar uma proporcionalidade em igualdade necessrio termos uma constante de proporcionalidade. Vf= k . [Ag] . [Ac] constante um numero alto Vd= Kd . [AgAc] constante um valor baixo Com isso, Vf=vd Percebe-se qeue a formao do complexo muito maior, para igualar as constantes. Logo, o RIE facilmente detectvel. Anticorpo o soro, material biolgico, peptidases dentre outras, esto presentes. Logo, voc dever fazer a 4C.

Exemplo fornecido, para demonstrar que o ensaio competitivo entre a Bk radioativa e a Bk da amostra. Grafico ( Bk radioativa x Ac) + [ crescentes da Bk normal] Vai adicionando a normal, o que causa um deslocamento da ligao (Bk radioativa x Ac), diminuindo a sua concentrao. E isso o que dosado, quanto do complexo radioativo vai sendo desfeito. Existe efeito de pr-zona no RIE? B0 = na ausncia de padro, ou seja, quantidade mxima de Bk radioativa x Ac.

Background da amostra fragmentos do peptdeo, porm, sem a ligao do anticorpo. A capacidade de ligao vai diminuindo. Papel bilog, lineariza a curva, para ficar mais fcil de trabalhar e visualizar. Voc empacota os pontos do eixo x e y, o que faz seu resultado parecer uma reta. Papel loguito.

Separao B (ligado) e F ( livre) Reatividade cruzada Suspenso de carvo dextran (polissacardeo) 70 KDa IgG 150 kDa Bk 1 KDa O carvo dextran, tem carvo ativado, e com isso ele apresenta uma superfcie de contato muito maior. A dextran recobre a superfcie do carvo, porque a superfcie dele muito adsortiva. Deixando um espao muito pequeno para ligao de outras substncias pequenas ( BK radioativa livre). Coloca o carvo dextran na amostra e espera um tempo (15 minutos). 2500 rpm / 15 minutos (tudo a 4C, desde o comeo). O carvo ligado a Bk free juntamente com a dextran so depositados no fundo do tubo.

Volume final da reao = 500 microlitros No pipetar volumes menores do que 10 microlitros Soluo padro [ Angio II] = 8,48 x 10 Tubo 1 2 3 4 5 6 7 B0 Linespecfica Total [angio II] 6,0 x 10 6,0 x 10 2,5 x 10 5,0 x 10 1,0 x 10
-11 -10 -9 -9 -8 -4

V AngioII 35 ml 35 ml 15 ml 29 ml 59 ml 12 ml 24 ml -

Vmarcado 100 microli.. 100 microli.. 100 microli... 100 microli.. 100 microli.. 100 microli.. 100 microli.. 100 microli.. 100 microli.. 100 microli..

Vol anticorpo 100 microli.. 100 microli.. 100 microli.. 100 microli.. 100 microli.. 100 microli.. 100 microli.. 100 microli..

Vol tampo 265 265 285 271 241 288 276 300 400 400

2,0 x 10-8 4,0 x 10-8 -

O anticorpo estar diludo 4 mil vezes. E deveremos levar ele a 20000 Marcado**: atividade radioativa de 690000 com em 100 microlitros Agitar o tubo os tubos vortex Incubar a 4C/ 18 horas Angiotensina Exerccio: fazer diluies seriadas da soluo padro de Angio. Marcado 10000 cpm O experimento feito em duplicata ( tubos de 1-6) Os trs ltimos em triplicata

Dando um total de 21 tubos, tendo que ser preparado 2,1ml de Angio, logo sempre bom fazer um volume a mais ( 2,5 ml) Anticorpo 100 microlitros Se o ttulo dele for 10000 ( exemplo), este anticorpo me dever ser titulado em um tubo de ensaio com uma concentrao 5x menor do que 10000. Ter cuidado pois ao transferir de um tubo para outro e aps a diluio com o tampo, sero realizadas 5 diluies. 15 tubos vo receber o Anticorpo.

Tampo RIA Tampo fosfato 25mM ph 7,4 Com NaCl 0,15M Inibidor de peptidases EDTA 1mM Gelatina 0,1% ( evitar que os peptdeos analisados sejam aderidos a parede do tubo. Ela se liga a parede no lugar) Azida sdica 0,1% (fungicida)

Carvo dextran, preparo Carvo 0,625g Dextran T-70 0,0652g 100 ml de tampo RIE Becker 250 ml

Colocar um agitador magntico, homogeneizar a soluo por 15 minutos. Colocar o Becker dentro do gelo com um pouco de gua. Com a ponteira da pipeta, auxiliar na diluio da dextran. Colocar 1ml de soluo carvo dextran em cada tubo, menos no ToTal! A soluo dever ficar em contato com a amostra por 15 minutos, no deixar por um tempo maior, para que a adsoro. Por isso, a pipitagem das solues no poder ser superior a 2 minutos. A centrfuga tem que ser ligada antes, porque logo aps 10 minutos da adio da soluo de carvo dextran, eles devero ser equilibrados na posio Centrifugar por 15 minutos. Estamos fazendo somente a curva padro e o controle. Aps os 15 minutos na centrfuga, devemos parar a centrifugao para no desligarmos a dextran do carvo e perdemos complexos. Transferir o sobrenadante para tubos de contagem.

NO TOTAL AO INVS DE COLOCAR A SOLUO DEXTRAN, COLOCAREMOS 1 ML DE TAMPO. Tubo de contagem tubo que o cintilador aceita. Existem dois tipos de cintilao : slida e lquida. Slida: radiao gama, I125 Lquida: beta, por exemplo

Cintilador: Apresenta um cristal de iodeto de sdio, com um orifcio central chamado poo de cintilao. A haste do aparelho segurar os tubos para que ele no encoste no fundo no poo, evitando dessa forma que ocorra contaminao do poo com alguma radiao presente no tubo de leitura. Leitura sem material radioativo: Basal ( BKG) Dentro do tubo de leitura dever ser colocado no mximo 2ml de soluo. CPM: Contagem por minuto. Cristal de iodeto de sdio contaminado com Tlio, que absorve a radiao gama emanada dos tubos de leitura e emite outro fton, que se choca da clula foto eltrica. Com uma sequencia de cascata de eventos ( cascata de placas) ( nmero 1). Todo aparelho tem uma eficincia de contagem, dessa forma, d para saber a eficincia do aparelho. O erro igual a raiz quadrada da contagem. Logo, quanto menor a contagem, maior o erro. Caso acontea de ter contagem muito pequenas, melhor deixar por mais tempo. em que eltrons so chocados uns contra os outros, liberando quantidades de eltrons que gerar uma marcao

Vamos deixar lendo por 1 minuto, mas isso pode variar com a quantidade de radioatividade. Se ela for alta, poderemos deixar por um tempo menor.

Tubos B0 B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 LNE TOTAL

Cpm1

Cpm2

cpmm

B ( cpmm LNE)

B/B0

Anlise dos resultados Quanto mais a gente dilu o anticorpo, aumentar a sensibilidade