Anda di halaman 1dari 11

LAPORAN PRAKTIKUM

ISOLASI DNA GENOM, PCR, ELEKTROFORESIS

Disusun oleh :

Weda Kusuma G0007025

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS SE ELAS MARET 2007

ISOLASI DNA GENOM, PCR, DAN ELEKTROFORESIS


I! TU"UAN A. Isolasi DNA genom Mahasiswa memahami dan mampu melakukan isolasi DNA genom Mahasiswa memahami dan mampu melakukan PCR Mahasiswa mampu mengamplifikasi intron III dan I pertum!uhan sapi C. "lektroforesis Mahasiswa memahami dan mampu melakukan elektroforesis Mahasiswa menentukan !erat molekul sampel DNA dari hormon B. PCR

II! DASAR TEORI Isolasi DNA #enom adalah $ara untuk mendapatkan strain murni dari suatu sum!u seperti spesimen klinis %ang mungkin telah men&adi !agian dari $ampuran kultur primer ' Dorland()**+ ,. PCR 'Pol%merase Chain Rea$tion, merupakan suatu teknik %ang didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik dimana ter&adi penggandaan &umlah molekul DNA pada setiap siklusn%a dalam waktu %ang relatif singkat. -eknik ini sangat ideal untuk mengidentifikasi patogen dengan $epat dan akurat. Proses ini dapat dikelompokkan dalam . tahap( %aitu denaturasi 'pemisahan rantai,( annealing 'penempelan, primer dan e/tension
(peman&angan atau polimerisasi). '0atson et al( 122)3Retnoningrum 1224,.

"lektroforesis merupakan proses !ergerakn%a molekul !ermuatan pada suatu medan terseparasi listrik. "lektroforesis pada gel dapat dapat digunakan dengan untuk separasi pewarnaan atau makromolekul 'seperti protein dan asam nukleat,. Posisi molekul %ang dideteksi autoradiografi( ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.

"lektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks pen%angga untuk

men$egah ter&adin%a difusi karena tim!uln%a panas dari arus listrik %ang digunakan. #el poliakrilamid dan agarose merupakan matriks pen%angga %ang !an%ak dipakai. Bila !erada dalam suatu medan listrik( molekul !iologi %ang !ermuatan positif akan !ermigrasi ke elektroda negatif dan se!alikn%a. Prinsip inilah %ang dipakai dalam elektroforesis untuk memisahkan molekul-molekul !erdasarkan muatann%a.
(www.unri.a$.id5&urnal5&urnal,

III! METODE ALAT DAN A#AN A. Isolasi DNA genom Alat: 1. Mikropipet dan tip ). 6entrifuge .. Almari pendingin 7. orte/ Bahan: 1. Darah sapi ). Nuklei l%sis solution .. Protein solution 7. DNA reh%dration solution 8. Cell l%sis solution +. Isopropanol 4. "tanol 4*9 B. PCR Alat: 1. 6atu set perangkat PCR ). Mikropipet dan tip Bahan: 1. DNA template 'hasil isolasi DNA genom, 1 :l ). Primer 1 *(8 :l .. Primer ) *(8 :l 7. MgCl) 1(8 :l 8. -a; Buffer )(8 :l +. dN-P mi/ *(8 :l 4. dd<)= 18(. :l >. -a; Polimerase *() :l C. "lektroforesis pre$ipitation

Alat: 1. 6atu set perangkat elektroforesis ). Mikropipet dan tip .. ?ampu @ 7. Power suppl% 8. Parafilm

Bahan: 1. DNA marker ). DNA sampel .. "thidium Bromida 7. dd<)= 8. #el Agarose +. ?oading !uffer 4. Buffer -A" 1* A 1* m? '-ris Base )7() gr( Asam Asetat gla$ial 8(.1 m?( "D-A *(8 mM 1* m?,

CARA KER"A A! Is$%as& DNA 'e($m 1. Men%iapkan .** :l sampel darah( menam!ahkan 2** :l $ell l%sis solution( menghomogenkan dan menginku!asi selama 1* menit pada suhu kamar ). Men%entrifugasi selama )* detik pada ke$epatan maksimum '17.*** rpm, .. Mem!uang supernatan( memBorte/ pellet 7. Menam!ahkan .** :l nu$lei l%sis solution( men$ampur dengan mem!olak-!alikkan ta!ung 8. Menam!ahkan 1** :l protein pre$ipitation solution ( memBorte/ selama )* detik +. Men%entrifugasi selama . menit( 17.*** rpm 4. Memindahkan supernatan ke dalam ta!ung %ang !aru( menam!ahkan .** :l isopropanol. Men$ampur dengan mem!olak-!alikkan ta!ung hingga ter!entuk !enang-!enang putih DNA >. Men%entrifugasi . menit 2. Mem!uang supernatan( menam!ahkan etanol 4*9 1*. Men%entrifugasi . menit

11. Mem!uang supernatan( menarik sisa etanol dengan pipet. Mengeringudarakan pelet selama 1*-18 menit( sampai pelet !erwarna putih 12. Menam!ahkan 1** :l DNA reh%dration solution( mem!iarkan semalam pada suhu 7C hingga DNA mengalami rehidrasi se$ara sempurna 1.. Men%impan hasil isolasi DNA untuk praktikum selan&utn%a ! PCR 1. Ran$ang primer sesuai ke!utuhan. -entukan -m dari masing-masing primer untuk menentukan suhu annealing ). Ran$ang siklus %ang akan digunakan( program alat sesuai ran$angan terse!ut. Ran$angan program untuk praktikum ini adalah <ot 6tart Denaturasi Annealing "/tension Cumlah siklus Post PCR ta!ung PCR 4. Meletakkan ta!ung dalam mesin PCR( &alankan mesin. 6etelah proses amplifikasi selesai hasiln%a disimpan dalam suhu 7 C( diperiksa dengan elektroforesis C! E%e)*+$,$+es&s 1. Prosedur pem!uatan gel a. Melarutkan *(8 gr agarose ke dalam -A" 1* A 8* m? %ang terdiri dari -ris Base )7() gr( asam asetat gla$ial 8(.1 m?( "D-A *(8 mM 1* m? b. Memanaskan sampai mendidih5larut sempurna lalu mendiamkan sampai suhun%a turun sekitar 8*C. 6ementara itu men%iapkan $etakan gel dan $om!-n%a $. Menam!ah larutan agarose dengan ) :l ethidum !romida : 27C selama 8 menit : 27C selama 78 detik : +*C selama 78 detik : 4)C selama 1 menit : .* siklus : 4)C selama 8 menit

.. Masukkan $ampuran PCR %ang tertera pada alat dan !ahan dalam

d. Menuangkan ke dalam $etakan lalu mem!iarkan pada suhu kamar sampai mengeras. #el %ang telah &adi dapat disimpan dalam !uffer -A" sampai digunakan ). Prosedur elektroforesis a. Men%iapkan tanki elektroforesis( mengisi dengan !uffer -A" %ang telah mengandung "tBr !. Memasukkan gel ke dalam larutan terse!ut( menarik $om! dari sumur gel $. Men$ampur sampel DNA %ang akan dielektroforesis dengan loading !uffer dan DNA ladder lalu dimasukkan ke sumur-sumur gel d. Menutup tanki dan men%am!ungkan dengan power suppl%( pastikan arah gel tidak ter!alik. Menentukan arus %ang digunakan sekitar 1)* e. Melakukan proses elektroforesis sampai penanda la&u migrasi samapi di !agian !awah gel. f. Mematikan arus listrik( mengangkat gel lalu meletakkan pada wadah plastik g. Melihat hasil elektroforesis di !awah paparan sinar @ dokumentasin%a h. Menentukan ukuran DNA sampel dan &umlahn%a IV! #ASIL DAN PEM A#ASAN A! #as&% lalu di!uat

! Pem-a.asa( Proses pertama %ang dilakukan adalah mengisolasi DNA genom dari sapi. Pada mamalia( DNA !erada pada sel darah putih sehingga untuk mengisolasin%a dapat dilakukan dengan sentrifugasi ke$epatan rendah( tanpa harus melakukan penghan$uran fisik. ?angkah selan&utn%a ialah melisiskan sel darah merah dengan penghan$uran dinding sel dan lapisan pem!ungkus DNA %aitu dengan pem!erian cell lysis solution ke dalamn%a. Demudian dilakukan sentrifugasi untuk memisahkan DNA dengan de!ris sel. Prosedur sentrifugasi harus dilakukan dalam keadaan seim!ang( &arak lu!ang antara tempat menaruh eppendorf satu dengan lainn%a harus sama. 6etelah didapatkan pellet sel darah putih dari sentrifugasi( langkah selan&utn%a ialah menam!ahkan nuclei lysis solution untuk melisis inti sel darah putih. 6etelah itu ditam!ahkan protein precipitation solution untuk mengendapkan protein serta sisa-sisa sel %ang tidak terpakai. 6entrifugasi kem!ali dan tam!ahkan isopropanol hingga ter!entuk !enang-!enang putih DNA dan tam!ahkan &uga etanol 4*9. Isopropanol dan etanol 4*9 ini !erfungsi untuk menarik molekul air dari DNA sehingga DNA dapat mengendap. ?angkah terakhir %aitu menam!ahkan DNA rehydration solution pada ta!ung untuk proses rehidrasi pada DNA dan inku!asikan semalam pada suhu 7C agar proses terse!ut !er&alan sempurna. 6elan&utn%a dilakukan PCR untuk mengamplifikasi DNA. Pada praktikum ini( %ang diamplifikasi ialah intron III dan I ekstensi. -eknik PCR ini diawali dengan penam!ahkan sepasang primer %ang !erfungsi untuk memper!an%ak sekuens pada DNA template. Dedua primer terse!ut ialah #<8 se!agai primer forward dan #<+ se!agai primer reBerse. #<8 : 8E F A#AA-CA##CCCA#CA#AAA-C F .E #<+ : 8E F #-C#-CAC-#C#CA-#---# F .E @ntuk meningkatkan spesifikasi DNA ditam!ahkan MgCl). -a!ung %ang !erisi !er!agai larutan terse!ut kemudian dimasukkan ke dalam mesin PCR. <asil pelipatgandaan DNA dari proses PCR kemudian dari hormon pertum!uhan sapi. -eknik PCR ini melalui tiga tahap %aitu denaturasi( annealing primer( dan

dapat dilihat dengan proses elektroforesis. Pada praktikum kali ini( &enis elektroforesis %ang digunakan ialah elektroforesis Gona %aitu menggunakan media penun&ang %aitu agrose. "lektroforesis %ang dilakukan ialah sistem horiGontal. Proses elektroforesis diawali dengan pem!uatan gel se!agai median%a %aitu agarose dilarutkan ke dalam %ang telah di!uat se!elumn%a %ang terdiri dari -ris Base( asam asetat gla$ial( dan "D-A. "D-A merupakan salah satu komposisi pem!entukan gel dan !uffer %ang !erfungsi se!agai salah satu alat !antu untuk mengalirkan DNA sampel pada !uffer. Pem!erian ethidium !romida '"tBr, %aitu pewarna %ang dapat men%isip atau interkalasi diantara !asa DNA pada dua utas DNA %ang !erlainan sehingga pada saat di!awah paparan sinar @ dapat !erpendar. 6ampel DNA %ang akan dielektroforesis di$ampur dengan loading !uffer( %ang terdiri dari sukrosa se!agai pem!erat agar sampel dapat tenggelam ke dasar gel dan tidak mela%ang ke luar dan pewarna %ang menandai kema&uan proses elektroforesis dan menentukan kapan saatn%a harus menghentikan proses %aitu Bromophenol !lue '7 k!p,( A%lene $%anol '1** !p,( dan =range # '8* !p,( dan kemudian diletakkan pada parafilm se!elum ditaruh di sumursumur gel. Proses ini &uga menggunakan DNA ladder se!agai marker DNA. <asil elektroforesis %ang dilihat di !awah paparan sinar @ menun&ukkan !ahwa ter!entuk !and pada keempat sumuran. Namun masing-masing fragmen mempun%ai ukuran sama dan !er!eda. Pada sumuran 1( )( dan 7 ukuran fragmen %ang ditun&ukkan adalah sama %aitu )). !p. 6edangkan pada sumuran ke-. ukuran fragmen !er!eda dengan lainn%a %aitu 141 !p. V! KESIMPULAN a. Isolasi DNA genom merupakan suatu teknik %ang digunakan untuk mendapat DNA total dari suatu sampel sel organisme dengan $ara purifikasi sampel terse!ut. !. PCR merupakan suatu metode pelipatgandaan DNA se$ara in Bitro %ang dapat menghasilkan fragmen DNA spesifik sesuai dengan %ang kita

inginkan dalam &umlah !an%ak meskipun !erasal dari DNA %ang &umlahn%a sedikit sekali $. "lektroforesis merupakan teknik pemisahan sen%awa %ang !ermuatan dengan meletakkan pada suatu medan listrik sehingga ter&adi separasi material %ang di!edakan !erdasarkan muatan dan ukuran molekul.

DAFTAR PUSTAKA
DaBis( ?eonard # et al. 1227. Basic method in Molecular Biology 2nd edition. Conne$ti$ut: Appleton H ?ange Al!erts( Bru$e et al. 1227. Biologi molecular Sel edisi ke-2. Cakarta: #ramedia =ld( R.0. et al. )**.. Prinsip-prinsip Manipulasi Gen. Cakarta: @I Press <arwood( Adrian C. 1227. Protocols for Gene Analysis. New Cerse%: <umana Press Dneale( #. #eoff. 1227. DNA-Protein nteractions. New Cerse%: <umana Press Pai( Anna C. 122). Dasar-dasar Genetika. Cakarta: "rlangga #riffin( <ugh #. 122.. DNA Se!uencing Protocols. New Cerse%: <umana Press

LAMPIRAN
Perhitungan % I a/ J ! log 1** I 7(1a J ! log +** I 1(>a J ! ------------------------------- log 15+ I )(.a - *(44> I )(.a a I - *(..>

log 1** I 7(1a J ! ) ) ) ! I 7(1 . F *(..> J ! I 7(1 . F *(..> J ! I F 1(.>8> J ! I .(.>8>

% I a/ J ! % I .()a J !

% I .() . F *(..> J .(.>8> % I F 1(*>1+ J .(.>8> % I )(.*7) Antilog )(.*7) I )*1(7 !p % I a/ J ! % I .(88a J ! % I .(88 . F *(..> J .(.>8> % I F 1(1222 J .(.>8> % I )(1>82 Antilog )(1>82 I 18.(7 !p