UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DE MXICO FACULTAD DE QUMICA DEPARTAMENTO DE BIOLOGA

TCNICAS PARA EL ANLISIS MICROBIOLGICO DE ALIMENTOS

Segunda Edicin

QFB. Alejandro CAMACHO CRUZ QFB. Martha GILES GMEZ QFB. Aurora ORTEGN VILA M C. Mercedes PALAO RINCN M C. Beatriz SERRANO LPEZ M E. Olga VELZQUEZ MADRAZO Editora: Mara Mercedes Palao Rincn UNAM-UAM

El presente trabajo se desarroll como parte del proyecto PAPIME EN-211604 Edicin autorizada por el Comit Editorial de la Facultad de Qumica.

Mxico D.F., 2009

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ndice

ndice ___________________________________________________________ 2 Agradecimientos _________________________________________________ 4 Introduccin _____________________________________________________ 5

SECCIN 1. MTODOS DE PRUEBA.

Procedimientos para la toma, transporte y manejo de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico . ___________________________ 6 Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico __________________________________________________ 20 Cuenta en placa de bacterias ______________________________________ 28 Determinacin de coliformes totales por cuenta en placa _______________ 38 Mtodo para la determinacin de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli por la tcnica de diluciones en tubo mltiple (NMP). _________________________________________________________ 44 Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. _____________ 60 Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos.___ 72 Mtodo para la determinacin de Salmonella spp. en alimentos. _________ 84 Mtodo para la determinacin de Vibrio cholerae en alimentos, hielo y agua. _________________________________________________________ 106 Mtodo para la determinacin de Listeria monocytogenes en alimentos. _ 126

SECCIN 2. ANEXOS.
Medios de Cultivo _______________________________________________ 138 Diluyentes, soluciones, reactivos e indicadores ______________________ 186

Tinciones______________________________________________________ 192 Caractersticas de las cepas patgenas de Escherichia coli ____________ 195

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecemos profundamente el apoyo que nos han brindado: QFB Ral Garza Velasco, Secretario Acadmico de Docencia de la Facultad; Dr. Rodolfo Pasteln Palacios, Jefe del Departamento de Biologa; QFB Mara del Pilar Granada Macas, Secretaria de Apoyo del Departamento de Biologa Un agradecimiento especial a las profesoras: Dra. Gloria Daz Ruz QA. Aleida Mina Cetina QFB. Adriana G. Meja Chvez Por la revisin, comentarios y sugerencias que nos permitieron mejorar la presente edicin.

A todos los profesores y colegas que en algn momento nos orientaron e hicieron sugerencias para mejorar este trabajo. Agradecemos tambin a la Direccin General del personal Acadmico de la UNAM quien a travs del Proyecto PAPIME EN -211604 apoy la realizacin de este material didctico.

INTRODUCCIN
Este manual, que dedicamos con todo afecto a nuestros estudiantes, tiene como propsito apoyarlos en su formacin, para adquirir conocimientos, aptitudes y actitudes, en especial en aspectos de control analtico en el campo de la microbiologa de alimentos. Hemos tratado de impulsar el desarrollo de un criterio en el rea, que permita a los profesionales que pronto sern, actuar como individuos crticos, capaces de elaborar y/o cambiar normas de calidad existentes, que ayuden a garantizar la Salud Pblica. El manual est organizado en dos secciones: La primera describe las tcnicas microbiolgicas que ayudan a detectar a ciertos grupos de microorganismos, gneros y en ocasiones especies, que son patgenos para el hombre y que por sus caractersticas metablicas, de pH, temperatura de desarrollo, etc., se pueden encontrar en determinados alimentos. En esta parte, tambin se incluyen diagramas de flujo que facilitan desarrollar la tcnica en el laboratorio, incluyen medios de cultivo, tiempos y temperaturas de incubacin, adems de factores especficos que requieren algunos microorganismos para su desarrollo ptimo. Se incluyen las Normas Oficiales Mexicanas (NOM) y se adicionan otras referencias que dan sustento al control de calidad. Tambin dentro de esta seccin, se hacen explcitos los aspectos cuantitativos para la expresin adecuada de los resultados. En la segunda seccin se localizan los medios de cultivo, se describe su formulacin, adems de la forma de preparacin y condiciones de esterilizacin. Se anexa su principio de accin, el que se refiere a cul o cules son los componentes que inhiben el desarrollo de determinados microorganismos, con lo que el medio de cultivo presenta selectividad para el desarrollo de otro grupo, tambin se describen las fuentes nutricionales para las bacterias. Aqu se encuentran los diluyentes ms comunes utilizados en la preparacin de diluciones de las muestras. En esta parte, se incluyen algunos reactivos necesarios para la lectura de pruebas bioqumicas as como colorantes utilizados en tinciones. Esperamos sinceramente que el manual sea til para nuestros estudiantes, que son quienes dan sentido a nuestro trabajo y esfuerzo diario. Todos los autores estamos abiertos a sus comentarios, especialmente a aquellos que nos permitan mejorar nuestro trabajo docente, a travs de este material didctico, y de las clases. Finalmente, se espera que el presente trabajo sea un apoyo, que impulse la participacin de profesionales en la actualizacin y elaboracin de normas, con especificaciones acordes al tipo de alimentos que consume nuestra poblacin.

Procedimientos para la toma, transporte y manejo de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico.
OBJETIVOS Explicar la importancia del muestreo y sus etapas en la obtencin de resultados fidedignos durante el anlisis microbiolgico de alimentos. Realizar correctamente la toma, transporte y manejo de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico.

GENERALIDADES Para obtener resultados significativos y confiables en el anlisis microbiolgico de alimentos, son fundamentales: la seleccin y toma de la muestra, las formas de conservacin y transporte al laboratorio. Los alimentos se muestrean principalmente por tres razones: Realizar el control de la calidad y determinar la vida de anaquel. Verificar las tcnicas de manipulacin y produccin higinica. Determinar la presencia de microorganismos causantes de intoxicaciones o infecciones a travs de alimentos. El control sanitario de los alimentos auxilia en el establecimiento de una fecha de caducidad que garantice el periodo til o de seguridad para consumir dichos alimentos, esta fecha se establece con base en la vida de anaquel del producto. En algunos casos, el control de calidad se realiza por inters del productor para demostrar la calidad del producto que elabora y si es posible demostrar la superioridad frente a sus competidores. El incremento en la demanda de los consumidores por productos de buena calidad, ha marcado la pauta sobre la produccin higinica de los alimentos, as como el anlisis para establecer si las condiciones de almacenamiento o manipulacin han sido adecuadas. El muestreo debe disearse de tal forma que permita tomar una muestra representativa del alimento por analizar, as como la recoleccin de cualquier dato til. Otro aspecto importante que se debe tomar en cuenta es la estandarizacin de los mtodos de prueba para asegurar reproducibilidad, precisin y exactitud en los resultados. Las cuentas numricas de microorganismos pueden variar considerablemente de acuerdo con la tcnica analtica desarrollada, as como con los medios de cultivo utilizados en la misma, entre otros factores; esta variabilidad se elimina utilizando el mismo mtodo de dilucin, medios de cultivo, tiempos y temperaturas de incubacin, etc., de aqu la importancia de la aplicacin de las Normas Oficiales. Finalmente la evaluacin de la

higiene del producto y la aceptabilidad por parte del consumidor, pueden seguirse apropiadamente slo si se tiene el historial del mismo. En caso de riesgo sanitario o brotes de enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs), el muestreo se dirige primordialmente al producto sospechoso, sin embargo, cualquier esfuerzo deber realizarse para colectar tanto los remanentes del alimento sospechoso, platillo de la comida ingerida, as como otros lotes obtenidos durante la misma recoleccin obtenida del establecimiento, incluso si no se trata del alimento sospechoso ser de gran valor, su anlisis. Por otra parte si se conoce el microorganismo responsable, la evaluacin puede limitarse a su bsqueda. En el diseo del plan de muestreo es muy importante que toda persona implicada en la recoleccin y envo de las muestras, as como el personal del laboratorio y los analistas que realizan la interpretacin de los resultados sean consultados en las primeras etapas del muestreo y anlisis microbiolgico de las muestras, por lo tanto debern definirse claramente los objetivos del anlisis para evitar prdida de tiempo y esfuerzo. Todos los anlisis microbiolgicos tienen sus limitaciones y stas se debern tener presentes antes de tomar cualquier accin. El acondicionamiento de la muestra que se va a analizar es de importancia fundamental, por ejemplo si las muestras se colectan inadecuadamente o no se evalan muestras representativas del lote, los resultados de laboratorio sern poco significativos, ya que las interpretaciones analticas de un lote grande se basan en una muestra relativamente pequea, es por esto que los procedimientos de muestreo deben aplicarse rigurosamente. Una muestra representativa es esencial cuando estn distribuidos en el alimento microorganismos patgenos o toxinas y la comercializacin del mismo depende del contenido bacteriano demostrado en relacin a los estndares legales. El nmero de unidades que comprende una muestra de un lote de alimento determinado deber ser estadsticamente representativa, de acuerdo con la norma NMX-Z-12-1987, partes 1, 2 y 3 basada en Military Standard (Mil Std 105-D), Norma Militar Americana. La composicin y naturaleza de cada lote afecta la homogeneidad y uniformidad del total de la muestra. Un procedimiento estadstico de muestreo correcto, dependiendo si el alimento es slido, semislido, viscoso o lquido, deber determinarse por el muestreador apoyado en la norma NOM-109-SSA-1-1994 la cual determina los Procedimientos para la toma manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico. Para asegurar la representatividad del producto por analizar, otro aspecto importante durante el muestreo es que la toma de muestras se realice aleatoriamente en cada lote. Es indispensable tener un control microbiolgico de los contenedores usados en la toma de muestras lo cual se logra manteniendo uno de ellos vaco, pero expuesto a las mismas condiciones de recoleccin de la muestra; tambin se debe considerar que de acuerdo a la capacidad de estos recipientes y la cantidad de muestra tomada de cada envase correspondiente a un lote, ser el nmero que de ellos se necesite; en el aspecto cuantitativo una muestra unitaria consiste de un mnimo de 100 g de alimento.
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Las condiciones de conservacin, transporte, tiempo comprendido entre la recoleccin de la muestra, su entrega en el laboratorio, as como la realizacin del anlisis influyen notoriamente en los resultados obtenidos, ya que la poblacin microbiana puede sufrir cambios cualitativos y cuantitativos, esto es apreciablemente cierto en los productos perecederos. Adems se deben tomar en consideracin los siguientes puntos para obtener resultados confiables: La recoleccin de las muestra se debe de efectuar evitando toda contaminacin externa, tanto ambiental, como humana para asegurar la integridad de la misma. Si es posible, enviar las muestras al laboratorio en el empaque original sin abrir. Si el producto es, o se encuentra en empaques de gran tamao para enviarlos al laboratorio, transferir la porcin representativa a un contenedor estril bajo condiciones aspticas, para lo cual es necesario esterilizar por separado utensilios de acero inoxidable como: cucharas, cuchillos, tenedores, esptulas y tijeras en autoclave o en horno, para que puedan ser utilizados en la toma de muestra. El uso de alcohol y el flamear son insuficientes para esterilizarlos. Utilizar recipientes limpios, secos, libres de fugas, de boca ancha, estriles y de un tamao apropiado para la toma de las muestras del producto. En lo posible, evitar los recipientes de vidrio que pueden romperse y contaminar el producto alimenticio. Los contenedores como jarras de plstico o latas de metal, debern estar hermticamente cerrados y a prueba de fugas. Para materiales secos, utilizar cajas de metal estriles, latas, bolsas, o empaques con sellos o cierres adecuados. Las bolsas de plstico estriles (solamente para materiales secos, no congelados) o botellas de plstico, son empaques tiles para lneas de muestras. Se deber tener cuidado de no sobrellenar las bolsas o fracturar la bolsa por puncin. Identificar cada muestra unitaria (definida posteriormente en este apartado) con una etiqueta o cinta adhesiva (maskintape). No etiquetar con una pluma sobre el plstico porque la tinta puede penetrar en el contenedor. De ser posible obtener al menos 100,0 g de cada unidad de muestra. Enviar as mismo controles abiertos o cerrados, dentro de contenedores estriles junto con la muestra. Entregar las muestras al laboratorio rpidamente, manteniendo en lo posible las condiciones de almacenamiento originales. Tomar una muestra adicional para llevar el control de la temperatura, que debe controlarse durante todo el proceso y al llegar al laboratorio. Elaborar una historia de todas las muestras para los tiempos, fechas de recoleccin y llegada al laboratorio. Los alimentos enlatados o secos que no sean perecederos y sean colectados a temperatura ambiente, no necesitan ser refrigerados. Transportar los alimentos refrigerados o congelados en contenedores seguros y apropiados de construccin rgida, de tal manera que puedan llegar al laboratorio sin cambio alguno. Colectar las muestras congeladas en contenedores pre-enfriados. Colocar los contenedores en un congelador lo suficientemente grande para mantenerlos fros y espaciados; mantener en congelacin las muestras slidas congeladas todo el
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tiempo. No se debern congelar los productos refrigerados. Enfriar en hielo entre 0-4 C las muestras refrigeradas, excepto las de mariscos y moluscos bivalvos y colectarlas en un contenedor con refrigerante capaz de mantener la temperatura de la muestra entre 0-4 C hasta su llegada al laboratorio. A menos que se especifique de otra manera, las muestras refrigeradas en general no debern ser analizadas en un lapso mayor a 36 h despus del tiempo de recoleccin. Empacar las muestras de moluscos bivalvos desconchadas en hielo frap hasta su anlisis. Mantener los mariscos en un intervalo de temperatura entre 0 y 10C. Examinar los mariscos o moluscos bivalvos en un perodo de 6 h y no ms de 24 h despus de que se hayan recolectado. Cabe destacar la importancia del muestreo y la conservacin para los alimentos perecederos ya que para fines oficiales la Ley General de Salud seala claramente que despus de la notificacin de los resultados del anlisis practicado, si existe alguna duda sobre la veracidad de stos, el particular puede impugnar dentro del plazo contemplado en la misma Ley, lo que da como consecuencia que la Secretara de Salud analice la muestra testigo en un laboratorio de tercera que sta seale en presencia de las partes interesadas y el resultado obtenido sea el que en forma definitiva acredite si el producto en cuestin rene o no los requisitos y especificaciones sanitarias. Sin embargo, los alimentos an en condiciones apropiadas de conservacin, pueden sufrir cambios significativos en sus caractersticas biolgicas y/o fisicoqumicas, provocando que los resultados de las muestras testigo sean improcedentes. Cualquier informacin relevante, como la que a continuacin se seala, debe acompaar a la muestra del alimento para asegurar que estar sujeta al anlisis ms adecuado y para permitir que el analista evale adecuadamente los resultados: Nombre y autoridad del oficial muestreador. Nmero de identificacin de la muestra. Fecha, hora y lugar del muestreo. Descripcin de la muestra incluyendo nmero de lote, cdigo de enlatado, etc. y datos de caducidad (sese por tanto tiempo, mejor antes de tanto tiempo, etc.). Razn del muestreo. Nombre del propietario, fabricante, manufacturador, importador, vendedor, comprador, etc. El proceso y fecha de coccin (si se conoce) de alimentos cocidos. Pas de origen, condiciones de almacenamiento en ese pas, condiciones y tiempo de transporte (si se conocen). Condiciones de almacenamiento del lugar del muestreo. Otros factores importantes, por ejemplo condicin del empaque, humedad, sanitizacin Mtodo de muestreo (aleatorio a travs del lote, aleatorio a travs de unidades accesibles, etc.). Condiciones de almacenamiento y transporte desde que la muestra fue tomada. Detalles clnicos y epidemiolgicos (en caso de sospecha de envenenamiento alimentario, as tambin en caso de que se considere como fuente de contaminacin con patgenos).
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Si fuera necesario transferir las muestras al recibirlas en el laboratorio, debern colocarse en contenedores adecuados y emplearse las tcnicas de asepsia al abrirse. El contenedor deber estar desinfectado con alcohol al 70%, si es necesario, para evitar la contaminacin de la muestra. Otros lotes de un producto similar pueden proporcionar un historial til y debern evaluarse junto con cualquier muestra sospechosa. Los siguientes detalles debern acompaar al formato: Apariencia- describir la muestra en trminos generales, por ejemplo: 100,0 g de jamn color rosado, cocido y rebanado, envuelto en papel. Debern registrarse los signos de deterioro, color anormal y presencia de hongos. Textura- El deterioro microbiano puede causar que los productos se tornen suaves o semi-lquidos, esto aplica particularmente a los productos crnicos, por ejemplo el jamn presenta capa acuosa, viscosa, enverdecimiento, etc.). Olor- Este es un indicador de descomposicin o contaminacin. Un anlisis organolptico incluye el sabor, pero STE NO DEBER REALIZARSE EN EL LABORATORIO. A. Manejo de Muestras en el Laboratorio y Preparacin del Homogeneizado de Muestra Tan pronto como la muestra de alimento llega al laboratorio, el analista deber anotar las condiciones fsicas generales de la misma. Si la muestra no puede ser analizada inmediatamente, deber ser almacenada como se describe posteriormente. Si la muestra va a ser analizada para fines regulatorios, para investigacin de un brote por consumo de un alimento, o para una inspeccin bacteriolgica, es esencial el seguimiento estricto a las recomendaciones descritas a continuacin. B. Recibo de muestras. 1. Estado del contenedor de muestras. Examinar los contenedores de muestras con el objetivo de localizar posibles defectos fsicos graves. Inspeccionar cuidadosamente bolsas y botellas para comprobar que no presentan hoyos, fracturas, etc., adems corroborar que no exista contaminacin cruzada proveniente de los defectos descritos anteriormente y que invalidara el anlisis. 2. Etiquetado e Historial. Cada muestra debe estar sellada con tapa y acompaada de un reporte de recoleccin completo (como el que se indic anteriormente) y registrarse el nmero de muestra y la fecha. Asignar a cada muestra unitaria un nmero individual y analizarla separadamente a menos de que se trate de una muestra compuesta descrita en el captulo anterior. 3. Seguimiento de un plan de muestreo. La mayora de los alimentos se recolectan de acuerdo a un plan de muestreo. Dependiendo del alimento y el tipo de anlisis diseado, determinar el plan ms adecuado.

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4. Almacenamiento. Si es posible, examinar las muestras inmediatamente despus de recibirlas. Sin embargo, si el anlisis debe ser pospuesto, almacenar las muestras congeladas a -20 C hasta su realizacin. Refrigerar las muestras perecederas no congeladas de 0-4 C por un periodo mximo de 36 h. Los alimentos no perecederos, enlatados o de baja humedad se almacenarn a temperatura ambiente hasta el anlisis. C. Descongelado. Utilizar una tcnica asptica para el manejo del producto congelado. Antes de manipular o analizar la muestra de alimento, limpiar las reas de trabajo y reas circundantes. Aunado a lo anterior humedecer el rea de trabajo y las reas circundantes con un agente germicida comercial. De preferencia no descongelar las muestras antes del anlisis. Si es necesario atemperar la muestra congelada para tomar una porcin analtica, descongelar en el empaque original o en el contenedor en el que se recibi en el laboratorio. Cuando sea posible, evitar la transferencia de la muestra a un segundo contenedor para descongelar. Normalmente la muestra puede ser descongelada de 2 a 5 C en 18 h. Si se desea un descongelado rpido, someta la muestra a un bao regulado a 45 C por un tiempo no mayor a 15 min. D. Mezclado. En las muestras alimenticias puede presentarse una distribucin no homognea de los microorganismos. Para asegurar una distribucin ms uniforme, homogenizar circularmente las muestras unitarias lquidas y las muestras secas con una cuchara estril u otro utensilio antes de tomar la muestra analtica para la determinacin de microorganismos mesoflicos aerobios por el mtodo de cuenta en placa y el nmero ms probable para microorganismos coliformes. Utilizar el tamao de la muestra analtica recomendado en cada prctica. Si el contenido del empaque es obviamente no homogneo (por ejemplo, una comida congelada), examinar la muestra analtica del alimento macerado, o preferiblemente analizar cada porcin por separado, dependiendo del objetivo del anlisis. E. Pesado. Tarar el vaso de licuadora o la bolsa de Stomacher ; pesar aspticamente dentro del vaso de licuadora, el tamao de muestra analtica recomendado (si es congelado, pese antes de descongelar). F. Homogenizacin y dilucin. Adicionar la cantidad de diluyente (solucin amortiguadora de fosfatos 0,1M pH 7,2 o agua peptonada al 0,1% estril), necesario para tener una dilucin decimal (10-1). El volumen total de muestra ms diluyente deber cubrir completamente las aspas del vaso de licuadora. Mezclar por 2 min. Este mezclado ser la dilucin 10 -1. Realizar rpidamente diluciones decimales del homogenizado original, usando pipetas que descarguen el volumen requerido con precisin. No medir menos del 10% del volumen

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total de la pipeta, por ejemplo, no use pipetas con un capacidad mayor a 10 mL para medir volmenes menores a 1 mL; para medir volmenes de 0.1 mL, no utilizar pipetas con una capacidad mayor a 1 mL. Preparar todas las diluciones decimales con 90 mL de diluyente estril y 10 mL de la dilucin previa a menos que se especifique de otra manera. Mezclar todas la diluciones vigorosamente 25 veces en un arco de 30 cm. en 7 s. No deben excederse ms de 15 min. Desde el licuado de la muestra hasta que las diluciones correspondientes sean vertidas en el medio de cultivo adecuado. G. Homogeneizacin con Stomacher . La molienda con Stomacher como un medio para la preparacin de muestras fue introducida por Sharpe y Jackson en 1972. Fue sugerida como una alternativa muy til para la molienda en la preparacin de alimentos para anlisis microbiolgico. Los Stomachers (Tekmar Co., Cincinnati, OH) estn disponibles comercialmente en 3 tamaos, Stomachers 80, 400 y 3500, para el manejo de volmenes de 8-80, 40-400 y 300-3000 mL, respectivamente. El principio de operacin es muy sencillo. La muestra de alimento con el diluyente se coloca en una bolsa de plstico estril y se introduce en el Stomacher , una caja de metal rectangular con paletas de metal dentro, de tal manera que las paletas golpeen sobre la bolsa. Estas paletas, accionadas por un motor a velocidad constante, se movern hacia adelante y atrs golpeando literalmente la muestra. Este golpeteo liberar a las bacterias de las partculas de alimento, debido en parte a la agitacin violenta del lquido y en parte por la compresin que sufre la muestra por las paletas. No se necesita una homogenizacin completa de la muestra. Como las muestras de alimento se colocan en bolsas de plstico, los fabricantes recomiendan que muestras con huesos u otros objetos punzantes no se preparen con este mtodo.

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Anlisis Microscpico de Alimentos.

Si se sospecha que un alimento ha sido el causante de una infeccin o toxiinfeccin o se ha deteriorado, se debe usar el producto original o una dilucin baja del mismo. Preparar un frotis para un examen microscpico directo. La tincin de Gram y la morfologa celular de la bacteria en el frotis puede indicar la necesidad de otro tipo de evaluaciones. Realizar un examen microscpico incluso si el alimento sufri tratamiento trmico y los microorganismos podran estar inactivados. Un gran nmero de cocos Gram-positivos en el frotis podra indicar la presencia de enterotoxina estafilocccica, la cual no se destruye por los tratamiento trmicos que eliminan las cepas de Staphylococcus aureus enterotoxignico. Un gran nmero de bacilos Gram-positivos esporulados en un alimento congelado podra indicar la presencia de Clostridium perfringens, un organismo que es sensible a bajas temperaturas. Otros bacilos Grampositivos esporulados como Clostridium botulinum o Bacillus cereus podra tambin estar presente en el alimento. Cuando el examen microscpico del alimento en cuestin revela la presencia de muchos bacilos Gram-negativos, considerar los sntomas y perodos de incubacin reportados para la enfermedad bajo investigacin y seleccionar el mtodo de examen especfico para el aislamiento de uno o ms de los siguientes gneros: Salmonella, Shigella, Escherichia, Yersinia, Vibrio o Campylobacter.

Examen microscpico directo de alimentos

SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES Colorantes para tincin de Gram. Aceite de inmersin. Metanol. Xileno.

MATERIAL Y EQUIPO. Portaobjetos, con un extremo etiquetado. Un portaobjeto para cada muestra molida (dilucin 10-1). Asa microbiolgica. Microscopio ptico, con objetivo de inmersin (100X) y ocular 10X.

PROCEDIMIENTO Preparar un frotis de la muestra molida del alimento (dilucin 10-1). Permitir que el frotis seque con el aire y fjar con calor moderado pasando los frotis rpidamente 3 4 veces sobre un mechero Bunsen o Fisher. Opcionalmente, secar los frotis al aire y fijarlos con metanol 1-2 min., eliminar el exceso de metanol y flamear o secar al aire.

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Enfrar a temperatura ambiente antes de teir. Desengrasar los frotis de alimentos con alto contenido en grasas sumergindolos en xileno 1-2 min., eliminar ste, lavar con metanol, eliminar y secar. Teir el frotis con el mtodo de Gram. Usar un microscopio equipado con objetivo para aceite de inmersin (95-100X) y ocular 10X; ajustar la iluminacin al ptimo. Examinar al menos 10 campos de cada frotis, anotando los tipos de microorganismos predominantes, especialmente las formas de tipo Clostridia (bacilos Gram-positivos), cocos Gram-positivos y bacilos Gram-negativos.

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Norma Oficial Mexicana NOM-109-SSA1-1994 Procedimiento para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico
OBJETIVOS: Realizar correctamente el muestreo de alimentos para el anlisis microbiolgico Disear las etiquetas y hoja de toma de muestras para anlisis microbiolgico de alimentos.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES Solucin amortiguadora fosfatos 0.1 M pH 7.2, esterilizado en botellas con 90 mL del solucin amortiguadora.

SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES Frasco con etanol o isopropanol al 70% (V/V). MATERIAL Y EQUIPO Frascos de boca ancha con tapa de rosca o tapn esmerilado de material esterilizable, no txico de tamao acorde a la cantidad de muestra deseada. Bolsas de polietileno estriles de varias medidas. Hieleras de poliestireno o de otro material aislante. Papel aluminio. Papel estraza. Etiquetas autoadheribles. Cinta testigo. Marcadores indelebles. Algodn. Cerillos. Licuadora. Jarra de vidrio o metal para la licuadora de 1000 mL, con tapa, esterilizada en autoclave por 15 min. a 121 C. Balanza, con pesas; 2000,0 g de capacidad, sensibilidad de 0.1 g. Matraces estriles 250 mL, cubiertos con papel de aluminio. Pipetas graduadas estriles de 1 y 10 mL. Utensilios para el manejo de muestras estriles: muestreadotes, cucharones, esptulas, cuchillos, pinzas, etc. (de acero inoxidable o de cualquier otro material que no provoque cambios que puedan afectar los resultados). Lmparas de alcohol.

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Hielo o bolsas refrigerantes. Bata, cofia, cubreboca y guantes estriles. Autoclave equipada con termmetro de mercurio calibrada a 121 1C. Horno que alcance una temperatura de 170 5C. Termmetros metlicos (dos si es necesario) para toma de temperaturas de alimentos con rangos de -40 a 100C, con intervalos no superiores a 1C.

PROCEDIMIENTO 1. Preparacin del material 1. Todo el material e instrumentos de muestreo que se utilicen para la toma, manejo y transporte de muestras, que van a estar en contacto directo con el alimento, debe estar limpio, estril y libre de substancias que pudieran afectar la viabilidad de los microorganismos. 2. El material para la toma de muestra que requiera esterilizacin, se envolver en forma individual, debidamente identificado, con papel de estraza antes de esterilizarlo. 3. La tapa de los frascos se proteger con papel de estraza o aluminio fijndolos adecuadamente. 4. Colocar cinta testigo en el material a esterilizar. 5. El material que se utilice para la toma de muestra debe ser esterilizado en autoclave a 121C durante 15 minutos o en horno a 170C por dos h., de acuerdo a su naturaleza. 6. Una vez esterilizado el material debe ser protegido para evitar contaminacin posterior.

2. Toma de muestra El procedimiento para la toma de muestra, depender del tipo de producto y de la finalidad del examen. A. Obtencin 1. Es necesario que el personal que lleve a cabo el muestreo antes de realizarlo, se lave las manos y los brazos hasta los codos, adems de cepillarse las uas con jabn. Para muestreo asptico debe utilizar: bata, cofia y cubreboca. De ser necesario el contacto directo de las manos con el producto debern usarse guantes estriles. 2. La toma de muestra de productos envasados con presentacin comercial para venta al menudeo se llevar a cabo en forma aleatoria y no asptica, tomndose del mismo lote y en cantidad suficiente para sus anlisis, envindose al laboratorio tal como se presentan al consumidor.

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3. Tratndose de productos envasados en recipientes grandes, es preciso abrir stos y extraer la muestra en condiciones aspticas para evitar la contaminacin microbiana. 4. Los alimentos expuestos al aire libre y a otras contaminaciones, no requieren precauciones estrictamente aspticas. 5. Cuando se requiera tomar muestras aspticamente, stas no deben tomarse en reas donde las condiciones sanitarias puedan dar lugar a la contaminacin de las mismas. 6. La toma de muestra debe hacerse con rapidez, pero cuidadosamente. Los recipientes para la toma de muestra deben abrirse nicamente al momento de introducir sta y cerrarlos de inmediato. No tocar el interior de los envases y evitar que la tapa se contamine colocndola sobre un trapo estril desechable. 7. Cuando sea necesario tomar la temperatura, la muestra que se utilice para tal fin deber ser diferente de la que se enva para su anlisis. 8. Para alimentos preparados sin envasar de consumo inmediato, se recomienda que la persona que elabora los alimentos, sea la que introduzca la muestra a los recipientes o bolsas estriles con los utensilios que emplea normalmente. Los alimentos que se muestrean en caliente se deben conservar y trasladar a la temperatura en que se muestrearon, esto nicamente si el traslado es menor a una hora, de lo contrario deben enfriarse a temperatura ambiente y trasladarse en condiciones de refrigeracin. 9. En el caso de alimentos lquidos o semilquidos se deber agitar o mezclar hasta conseguir homogeneizar y despus efectuar la toma de la muestra en diferentes niveles. 10. En alimentos slidos cuando sea necesario cortar el producto, debe muestrearse con ayuda de utensilios estriles como sacabocados, cucharas, cuchillos, etc. 11. En productos a granel, tomar la muestra de varios puntos del contenedor para obtener una muestra representativa. 12. Cuando la toma de muestra se realice en un conducto de salida o una compuerta de una partida a granel, antes de obtener la muestra se deben dejar pasar las primeras fracciones del producto para limpiar dicha salida con el flujo. B. Productos perecederos 1. Los alimentos preparados de consumo inmediato que se venden sin envasar o a granel se consideran como alimentos perecederos y los productos no envasados en los cuales no est definida su vida til o de anaquel, se determinar la fecha de caducidad, con base en productos de caractersticas similares. 2. Para productos envasados que no contengan fecha de caducidad, se consideran para fines de esta Norma, como no perecederos. 3. Para productos perecederos la toma de muestra para efecto de vigilancia sanitaria ser nicamente por duplicado, la primera se enviar al laboratorio oficial para su anlisis y la segunda se quedar en poder del interesado para su anlisis particular si es necesario.

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C. Impugnacin En caso de impugnacin presentada en los trminos que seala la Ley General de Salud, en productos perecederos, la toma de muestra subsecuente la llevar a cabo personal autorizado tomando cinco muestras en forma aleatoria del lote existente o la cantidad, o nmero estipulado en la norma correspondiente del producto, la cual ser analizada por el laboratorio acreditado para realizar terceras y el resultado obtenido ser el que definitivamente acredite que el producto cumple con los requisitos y especificaciones sanitarias exigidas. El nmero de submuestras del total que determinen el cumplimiento sern tres de cinco, o lo que estipule la norma correspondiente. D. Identificacin de la muestra 1. En la toma de muestra es indispensable identificar el recipiente claramente, inmediatamente antes o despus de colocar en l la muestra, mediante rtulo o etiqueta (indelebles), con los siguientes datos: 2. Fecha, lugar, hora del muestreo, nmero de lote y temperatura de la toma de muestra si es que procede. 3. La etiqueta deber colocarse entre la tapa y el cuerpo del frasco, la caja, en el nudo o cierre de la bolsa en forma tal que se evite que la muestra sea alterada o violada. E. Conservacin y transporte 1. El manejo y transporte de las muestras deber efectuarse de tal manera que se impida su ruptura, alteracin o contaminacin, evitando su exposicin a la luz solar directa. 2. Las muestras deben entregarse al laboratorio lo ms rpidamente posible. Los alimentos perecederos se transportarn bajo condiciones de temperatura de 2 a 8C; y deben mantenerse a esa temperatura hasta el momento de realizar las pruebas, las cuales deben iniciarse dentro de las 24 h. siguientes a su recoleccin. En caso de alimentos congelados, la temperatura no debe ser mayor de 0C, empleando para conservarla hielo seco. Para la refrigeracin es recomendable el empleo de recipientes con lquido refrigerante o hielo potable contenido en bolsas de plstico impermeables para evitar que el agua de deshielo alcance la tapa de los envases o que de alguna manera contamine a los alimentos muestreados. 3. En el caso de muestras individuales blandas, evitar que la presin que puedan ejercer otros recipientes, o una cantidad excesiva de las mismas, las deformen u originen derrames y provoquen que el contenido se ponga en contacto con el exterior de la envoltura. 4. En el caso de muestras no perecederas, evitar que se daen, humedezcan o contaminen con otras. 5. Los productos con presentacin comercial deben ser transportados en sus envases originales a temperatura ambiente, siempre y cuando sta no exceda de 45C 6. Para la conservacin, durante el transporte de las muestras no est permitido el empleo de sustancias qumicas.

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7. Las muestras que se entreguen al laboratorio debern acompaarse de un informe que adems de contener la identificacin de la muestra, incluya los siguientes datos: F. Nmero de unidades y/o cantidad. 1. Clave nica que permita la identificacin del domicilio del fabricante, representante y/o distribuidor. 2. Indicar nombre genrico y especfico del producto, as como la marca comercial y cualquier otra informacin que se considere importante. 3. Observaciones, en donde se seale las condiciones sanitarias en el que se encontraban los productos antes de efectuar la toma de muestra, o algn otro dato que sea significativo para determinar los anlisis microbiolgicos que sean necesarios. 4. La muestra testigo podr eliminarse una vez que se obtengan resultados oficiales que indiquen el cumplimento de las especificaciones sanitarias y el particular no decida llevar a cabo su impugnacin.

RESULTADOS Disear las etiquetas y hoja de toma de muestras para anlisis microbiolgico de alimentos, utilizar en todos los ejercicios experimentales las etiquetas y hojas de muestreo diseadas. Tomar las precauciones necesarias para el correcto llenado de estas formas Recolectar, transportar y conservar los alimentos, de acuerdo a todo lo indicado en este protocolo.

BIBLIOGRAFA NOM-109-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Procedimientos para la toma, manejo y transporte de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. International Commission on Microbial Specifications Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL of Foods (2005)

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Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlisis microbiolgico

OBJETIVOS Preparar adecuadamente las muestras de los alimentos bajo estudio, as como las diluciones que les permitan investigar su contenido microbiolgico. Determinar el nmero de diluciones adecuado, con base en las caractersticas y datos de la muestra y de los microorganismos que sern investigados.

GENERALIDADES Los microorganismos estn ampliamente distribuidos en la naturaleza, por lo que siempre se encuentran presentes en diversos productos, especialmente en aquellos que favorecen de algn modo su sobrevivencia o desarrollo. Los alimentos por su produccin primaria, generalmente tienen una importante microbiota normal, segn la regin y condiciones en que se producen; adems, su composicin tiende a conservar dicha flora y, por supuesto, le proporciona nutrientes de manera que, si las condiciones lo permiten, los microorganismos pueden multiplicarse en los alimentos. Como consecuencia de este desarrollo microbiano, los alimentos pueden deteriorarse y perder sus atributos. Adems de la microbiota normal, los alimentos son susceptibles de contaminacin durante su manejo, ya sea por operadores, equipo, fauna nociva, o por contaminacin cruzada; algunos de los microorganismos contaminantes pueden ser patgenos y en tal caso, su desarrollo e incluso su mera sobrevivencia, pueden ocasionar desde el incumplimiento de normas de higiene y seguridad, hasta la aparicin de ETAs. Dado el tamao de las poblaciones microbianas que pueden estar presentes en un alimento, que van desde algunos miles hasta varios millones de clulas por gramo, su determinacin cuantitativa requiere la preparacin de diluciones conocidas de la muestra; y es costumbre utilizar cifras decimales para facilitar los clculos. En esta prctica se establece la forma general de preparar dichas diluciones. En vista de la gran cantidad de productos alimenticios y de la diversidad de sus caractersticas, algunos pueden requerir modificaciones o mtodos especficos pero, en todos los casos donde sea posible, se recomienda apegarse a estas guas y modificarlas nicamente cuando sea necesario. Lo ms adecuado es preparar una dilucin primaria y, a partir de ella, todas las necesarias para poder contar los microorganismos presentes; pueden ser dos diluciones decimales consecutivas, es decir, 1:10 y 1:100 o superiores, segn la carga microbiana esperada en el alimento. Un analista experimentado puede estimar el

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nmero de diluciones necesarias a partir del conocimiento que tenga del proveedor y del proceso, e incluso a partir de los datos de muestreo y desde luego, a partir de la experiencia con cada tipo de muestra. El buen resultado del mtodo requiere que las fuentes de variacin sean eliminadas en lo posible, por lo que es muy importante apegarse a la tcnica y controlar cuidadosamente las condiciones.

FUNDAMENTO Posterior a la toma de muestra y como parte del anlisis, se hace una dilucin primaria cuya finalidad es lograr obtener una muestra representativa del alimento, esto es, tanto en el aspecto cualitativo (diferentes tipos de bacterias) como en el cuantitativo, y as lograr una distribucin lo ms uniforme posible, de los microorganismos contenidos en la muestra destinada al anlisis. Con este fin, se utiliza un diluyente que favorezca la recuperacin de los microorganismos presentes, para ponerlos de manifiesto cuando se cultiven; para lograrlo, el diluyente debe tener la osmolaridad y el pH favorables para iniciar la recuperacin y actividad de las clulas microbianas presentes, as como para favorecer aquellas que se buscan entre una poblacin mixta. Se pretende encontrar el nmero de microorganismos por unidad de volumen, hasta asegurar que despus de la incubacin se obtenga un resultado cuantificable, esto se logra despus de realizar tantas diluciones decimales seriadas como sea necesario, en el mismo diluyente. Este resultado puede ser la cuenta de colonias en placas o la observacin de resultados proporcionales al tamao de la poblacin, en el caso de tubos o matraces.

NOTAS Esta tcnica es la primera etapa en el anlisis de la mayora de las prcticas en las que se determina cuantitativamente algn microorganismo o grupo microbiano; por lo tanto, contina con la determinacin especfica. Cuando se trabaja con alimentos lquidos, fcilmente homogenizables, que pueden distribuirse con pipetas de 1 mL, y con bajo contenido microbiano, puede omitirse la preparacin de diluciones, pero este caso es una excepcin, no la regla. Los diluyentes ms utilizados son la solucin amortiguadora de fosfatos, el agua peptonada y la solucin salina isotnica, pero pueden utilizarse otros diluyentes que cumplan con las funciones de dispersar y homogenizar la carga microbiana y de facilitar la recuperacin de los microorganismos en estudio, mediante condiciones de osmolaridad, pH, etc., adecuadas para ellos; por ejemplo, para la determinacin de Vibrio cholerae, que es alcalfilo, se utiliza agua peptonada a pH 8.5.

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El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se inoculan las diluciones en los medios de cultivo, no debe exceder de 20 minutos.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 1 matraz erlenmeyer de 250 mL de capacidad, con 90,0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos o agua peptonada al 0,1%, o con solucin salina isotnica (SSI), al 0,85 %a. 4 a 6 tubos de ensayo de 16 x 150 mm con tapn de rosca, conteniendo 9,0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos o agua peptonada al 0,1 % o con solucin salina isotnica (SSI), al 0,85 % a. MATERIAL Y EQUIPO Utensilios estriles (cuchillo, tenedor, cuchara, pinzas) para tomar muestra a Pipetas bacteriolgicas de 10 mL, estriles, con algodn en el extremo superior (las necesarias de acuerdo con el nmero de diluciones) a. Pipetas bacteriolgicas de 1 mL, estriles, con algodn en el extremo superior (las necesarias de acuerdo con el nmero de diluciones) a. Pipetas Pasteur estriles a Stomacher (homogeneizador peristltico) o licuadora con vaso esterilizado. Bolsas estriles para stomacher a NOTA
a

Material necesario al inicio de la prctica

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PREPARACIN Y DILUCIN DE MUESTRAS PARA ANLISIS MICROBIOLGICOS

Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 mL de solucin diluyente. 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

10-1
Pesar 10 g de muestra en condiciones de asepsia Homogenizar con 90 mL de solucin diluyente

10-2

10-3

10-4

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PROCEDIMIENTO 1. Preparacin de la dilucin primaria: 1.1. Muestras lquidas no viscosas (como agua, leche, refrescos, etc. en las cuales la distribucin de microorganismos es homognea o fcilmente homogeneizable por medios mecnicos como agitacin) 1. Agitar la muestra manualmente en un arco de 30 cm., con 25 movimientos de arriba abajo, efectuados en un tiempo de 7 segundos. 2. En condiciones aspticas, tomar 10.0 mL de la muestra y 3. Diluir con 90.0 mL del diluyente el cual debe encontrarse a una temperatura similar a sta, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. 1.1.1. Alimentos originalmente lquidos o licuables y congelados: 1. Fundir por completo en bao de agua entre 40 y 45C en un tiempo mximo de 15 minutos y homogenizar agitando vigorosamente. 2. Proseguir como se indica en el punto 1 para muestras lquidas no viscosas. 1.1.2. Parte lquida de una muestra heterognea que sea considerada suficientemente representativa de la muestra total: 1. Proseguir como se indica en el punto 1 para muestras lquidas no viscosas. 1.2. Muestras slidas o semislidas. 1.2.1. Muestras slidas y semislidas no congeladas: 1. Pesar una cantidad de 10.0 g de la muestra por analizar en un recipiente o bolsa plstica estril de tamao adecuado. 2. Adicionar un volumen de 90.0 mL del diluyente, segn sea el caso, llevado a una temperatura similar a la de la muestra. 3. Operar la licuadora o el homogeneizador peristltico de 1 a 2 minutos hasta obtener una suspensin completa y homognea, segn se indique en la tcnica correspondiente para cada alimento. An en los equipos ms lentos, el tiempo de homogenizacin debe ser < 2.5 minutos. 4. Permitir que las partculas grandes se sedimenten, y transferir la cantidad deseada (alcuota), tomando sta de las capas superiores de la suspensin. NOTAS Cuando la dilucin primaria es muy viscosa o pegajosa, adicionar ms diluyente, lo cual debe tomarse en cuenta para los clculos y expresin de resultados. El homogeneizador peristltico (Stomacher) puede ser inadecuado para algunos productos, por ejemplo, aquellos con partculas agudas o
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constituyentes que no se dispersen fcilmente; slo debe utilizarse cuando exista evidencia (publicada o por ensayos comparativos) de que los resultados obtenidos no difieren significativamente con aquellos obtenidos con licuadora. 1.3. Muestras slidas y semislidas congeladas: 1. Descongelar en refrigeracin de 4 a 8C durante 18 h. y no ms de 24 h. antes de diluir y analizar. 2. Proseguir como se indica en el inciso 1 para muestras slidas y semislidas no congeladas NOTAS En todos los casos, si la cantidad disponible de muestra no permite tomar 10 mL o g, la dilucin primaria puede hacerse con 1 mL de muestra en 9 de diluyente. Despus se prosigue como se indica para las diluciones adicionales.

2. Preparacin de las diluciones decimales adicionales. 1. Transferir 1.0 mL o un mltiplo de la dilucin primaria, a otro recipiente que contenga nueve volmenes del diluyente estril a la temperatura apropiada, evitando el contacto entre la pipeta y el diluyente. Si se toma 1.0 mL de muestra en 9.0 mL de diluyente, se obtendr una dilucin 1:10; si se utilizan 10.0 mL de muestra se utilizarn 90.0 mL de diluyente y as se tendr la misma dilucin 1:10 2. Mezclar cuidadosamente cada nueva dilucin, siempre de la misma manera que se describe en el punto 1 del inciso A. 3. La seleccin de las diluciones a preparar, as como de aquellas que se van a inocular, depende del nmero esperado de microorganismos en la muestra, con base en los resultados de anlisis previos y de la informacin que se obtenga del personal de inspeccin que la haya colectado. En ausencia total de informacin, trabajar con las diluciones de la primera a la sexta. 4. Utilizar pipetas diferentes para cada dilucin inoculando simultneamente las cajas seleccionadas. El volumen transferido debe ser > 10% de la capacidad total de la pipeta. Si es terminal y se transfiere su capacidad total, escurrir aplicando la punta una sola vez en un rea de la caja Petri sin lquido. 5. Mientras se afora el lquido de la pipeta, la punta de sta debe apoyarse en el interior del cuello del frasco y mantenerla en posicin vertical, para lo cual este ltimo debe inclinarse lo necesario.

NOTAS En estudios donde se busca la presencia o ausencia de una determinada especie de microorganismos en 0.1 mL 0.1 g, no es necesario preparar diluciones mayores.

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En todos los casos, deben de prepararse las diluciones que permitan obtener resultados dentro del rango de sensibilidad del mtodo, por lo menos en una de tres diluciones; como el rango de sensibilidad del mtodo generalmente va de n a 10n (de 15 a 150 de 25 a 250 colonias, por ejemplo), el obtener resultados dentro del rango en 2 diluciones subsecuentes se considera evidencia de que s ha logrado la distribucin uniforme y se han controlado los factores de variacin.

El siguiente cuadro, seala los rangos de sensibilidad, estadsticamente confiables, de algunos de los mtodos importantes en microbiologa de alimentos de acuerdo con cada norma oficial mexicana:

Mtodo Cuenta en placa de bacterias termoflicas, Mesoflica, psicroflicas y psicrotrficas Coliformes totales en placa Hongos y levaduras Staphylococcus aureus en placas extendidas en agar Baird Parker Cuenta en placa de bacterias esporuladas, totales o termorresistentes en placas vertidas Clostridium perfringens en placas extendidas con agar TSC y yema de huevo Bacterias del yogurt

Intervalo de sensibilidad

25 a 250 colonias / placa 15 a 150 colonias / placa 10 a 150 colonias / placa

15 a 150 colonias / placa

30 a 300 colonias / placa

20 a 200 colonias / placa 10 a 300 colonias / placa

RESULTADOS Este ejercicio experimental es la base de los mtodos cuantitativos y cualitativos, pero en esta etapa no se contempla la obtencin de resultados numricos. Siempre se debern considerar todas las especificaciones planteadas para obtener resultados confiables en los anlisis realizados. Despus de efectuar el anlisis en cuestin, aplicar el factor de dilucin; por tratarse de diluciones decimales, el factor es el inverso de la dilucin. Es decir, que si los resultados estadsticamente confiables se obtuvieron en la dilucin 10-3, el
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factor de dilucin es 103. Si se us otra proporcin en las diluciones, el inverso de la proporcin en que se diluy ser el factor de dilucin.

BIBLIOGRAFA Secretara de Salud. NOM-110-SSA1-1994. Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. Norma Oficial Mexicana. Mxico. Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. International Commission on Microbial Specifications Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall 2nd ed. of Foods (2005)

Swanson K.M., Petran R.L., Hanlin J.H. (2001) Culture Methods for Enumeration of Microorganisms. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 53-67. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

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Cuenta en placa de bacterias

OBJETIVOS Realizar adecuadamente la tcnica de cuenta en placa para diversos grupos microbianos de importancia en alimentos. Interpretar adecuadamente los resultados de la cuenta en placa y sus implicaciones en la calidad del alimento.

GENERALIDADES Cuando se requiere investigar el contenido de microorganismos viables en un alimento, la tcnica comnmente utilizada es la cuenta en placa. Esta tcnica no pretende detectar a todos los microorganismos presentes, pero el medio de cultivo, las condiciones de temperatura y la presencia (o ausencia) de oxgeno, permiten seleccionar grupos de bacterias cuya presencia es importante en diferentes alimentos; por ejemplo, las bacterias mesoflicas aerobias, o mesfilos aerobios son un indicador general de la poblacin que pueden estar presente en una muestra y, por lo tanto, de la higiene con que ha sido manejado el producto. Este grupo en particular, se determina en la mayor parte de los alimentos, pero para algunos productos, tambin es importante determinar la presencia de bacterias termoflicas, psicroflicas y/o psicrotrficas para predecir la estabilidad del producto bajo diferentes condiciones de almacenamiento. La tcnica bsica es la misma, pero cambian las condiciones de incubacin, medios de cultivo y algunos otros detalles, que se mencionan en la tcnica. Si se modifican las condiciones de incubacin o se somete la muestra a algn tratamiento previo, el mtodo puede aplicarse tambin a la deteccin de otros grupos como anaerobios o esporulados, desde luego, con la adecuada seleccin de medios de cultivo. El mtodo permite numerosas fuentes de variacin, algunas de ellas controlables, pero sujetas a la influencia de diversos factores por lo que es muy importante apegarse a la tcnica y controlar cuidadosamente las condiciones.

FUNDAMENTO La tcnica se basa en contar las unidades formadoras de colonias o UFC presentes en un gramo o mililitro de muestra. Se considera que cada colonia que desarrolla en el medio de cultivo de eleccin despus de un cierto tiempo de incubacin a la temperatura adecuada, proviene de un microorganismo (o de un agregado de microorganismos) presente (s) en la muestra bajo estudio; ese microorganismo (o microorganismos) es capaz de formar la colonia, es decir una

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UFC. Para que las colonias puedan contarse de manera confiable, se hacen las diluciones decimales necesarias de la muestra, antes de ponerla en el medio de cultivo; la tcnica para realizar este procedimiento se describe en Preparacin y dilucin de muestras de alimentos para su anlsis microbiolgico.

NOTAS El medio de cultivo no debe fundirse ms de una vez, y debe mantenerse en bao de agua regulado a 45 C, durante el tiempo suficiente para que alcance esta temperatura, y hasta su utilizacin. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente, hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, con 90 mL de solucin amortiguadora de fosfatos o agua peptonada a. 4 a 6 tubos de ensayo de 16 x 150 con tapn de rosca, con 9 mL de solucin amortiguadora de fosfatos o agua peptonada a. 7 a 13 tubos de 22 x 175 con 20 mL c/u (o un matraz con 130 250 mL) de agar triptona-glucosa-extracto de levadura (agar para cuenta estndar) fundido y mantenido en bao de agua a 45 1.0 C (para tcnica de vertido en placa) a. 7 a 13 cajas de Petri con 20 mL c/u de agar tripotna-glucosa-extracto de levadura (agar cuenta estndar) estriles o el medio requerido en la tcnica a.

MATERIAL Y EQUIPO Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de 1.0C, provista con termmetro calibrado a. Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador b. Registrador mecnico o electrnico b Microscopio ptico b Bao de agua con termmetro, que mantenga la temperatura a 45 1.0 C a Utensilios estriles (cuchillo, tenedor, cuchara, pinzas) para tomar muestra a Pipetas bacteriolgicas de 10 mL, estriles, con algodn en el extremo superior (las necesarias, de acuerdo con las diluciones) a. Pipetas bacteriolgicas de 1 mL, estriles, con algodn en el extremo superior (las necesarias, de acuerdo con las diluciones) a. Varillas de vidrio estriles (en escuadra o L) a. Pipetas Pasteur estriles a 7 a 13 cajas Petri estriles a
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Stomacher (homogeneizador peristltico) a Bolsas estriles para Stomacher a Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador b. Registrador mecnico o electrnico b Microscopio ptico b

NOTAS
a b

Material necesario al inicio de la prctica Material necesario a las 24 y 48 horas de iniciada la prctica

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CUENTA EN PLACA DE BACTERIAS

Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 mL de solucin diluyente 1.0 mL

1.0 mL

1.0 mL

10-1
Pesar 10 g de muestra en condiciones de asepsia Homogenizar con 90.0 mL de solucion diluyente

10-2

10-3

10-4

Depositar 1.0 mL de cada dilucin en cajas de Petri estrilespor duplicado Adicionar de 15 a 20 mL de agar triptona extracto de levadura fundido y enfriado a 45C en cada placa

Homogeneizar la muestra y el agar mediante movimientos rotatorios

Incubar las cajas en posicin invertida Contar aquellas placas que tengan entre 25 a 250 colonias y reportar como UFC/g o mL de muestra 31

24 a 48 h / 37C

PROCEDIMIENTO 1. Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la tcnica de Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. 2. Tcnica de vertido en placa. 1. Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin y la adicin de medio de cultivo se puedan realizar cmoda y libremente. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de inocular. 2. Inocular por duplicado, 1 mL de la dilucin correspondiente en cada caja, mediante pipeta estril. Agregar de 18 a 20 mL del medio fundido y mantenido a 45 C. Para homogenizar, mezclar mediante 6 movimientos de derecha a izquierda, 6 en el sentido de las manecillas del reloj, 6 en sentido contrario y 6 de atrs a adelante, sobre una superficie lisa y horizontal hasta lograr la completa incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el medio no moje la cubierta de las cajas. Dejar solidificar. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se adiciona el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos. 3. Incluir una caja sin inculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad. 4. Incubar las cajas en posicin invertida durante el tiempo y a la temperatura que se requiera, segn el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, como se indica en el cuadro 1. 3. Tcnica de extensin superficial en placa. 1. Distribuir las cajas con el medio estril en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin se pueda realizar cmoda y libremente. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de inocular. 2. Inocular por duplicado, 0.1 mL de la dilucin correspondiente en cada caja, mediante pipeta estril. Para distribuir de manera homognea, extender el inculo utilizando una varilla de vidrio estril (en forma de escuadra o L) haciendo movimientos giratorios de manera perpendicular al medio de cultivo, hasta lograr la completa incorporacin del inculo en el medio; cuidar que el inculo se absorba antes de incubar (se recomienda un tiempo de espera aproximado de 10 minutos). El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se inocula en el medio de cultivo a las cajas, no debe exceder de 20 minutos.

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3. Cuando es necesario utilizar el mtodo de extensin en superficie pero se esperan cuentas bajas, se pueden utilizar de 3 a 5 cajas de Petri con el medio de cultivo, y sembrar 1 mL de la muestra lquida (o de dilucin 10-1), repartiendo el volumen en las 3 ( 5) cajas, es decir, sembrando 0.3+0.3+0.4 mL ( 0.2 mL en cada una de 5 cajas). 4. Incluir una caja sin inculo por cada lote de medio y diluyente preparado como testigo de esterilidad. 5. Incubar las cajas en posicin invertida durante el tiempo y a la temperatura que se requiera, segn el tipo de alimento y microorganismo de que se trate, como se indica a continuacin. CUADRO 1. Condiciones de incubacin para cuenta en placa de diferentes grupos Grupo Bacteriano Termoflicos Mesoflicos Psicrotrficos Psicroflicos Temperatura 55 2C 35 2C 20 2C 5 2C Tiempo de Incubacin 48 2 h 48 2 h de 3 a 5 das de 7 a 10 das

6. Despus de la incubacin, contar todas las colonias desarrolladas en las placas seleccionadas (excepto las de mohos y levaduras; si se sospecha que es una colonia de este grupo de microorganismos, se recomienda confirmar por microscopa), incluyendo las colonias puntiformes. Si hay desarrollo extendido o un nmero de colonias superior al del rango de sensibilidad del mtodo, aplicar las reglas indicadas en RESULTADOS. Realizar microscopa para resolver los casos en los que no se puedan distinguir las colonias de las partculas pequeas de alimento. Utilizar el registrador para contar las colonias. RESULTADOS La seleccin de las cajas que se toman en cuenta para los clculos es muy importante para la confiabilidad de los resultados; a continuacin se especifican las reglas generales para seleccionarlas, pero conviene enfatizar que la seleccin de cajas obedece a criterios: lgicos (elegir las que estn en rango), estadsticos (considerar los duplicados y el mayor nmero posible de datos) y funcionales (a falta de datos representativos, tomar los mejores disponibles).

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Las reglas para seleccionar las cajas para los clculos son las siguientes: 1. Se consideran representativas las cajas que tienen un nmero de colonias dentro del rango de sensibilidad del mtodo, en este caso, entre 25 y 250 UFC. 2. Una vez seleccionadas las cajas y hechos los promedios correspondientes, se aplica el factor de dilucin, que es el inverso y se redondea el nmero a 2 cifras significativas (o dgitos) y potencias de 10. Cuando el tercer dgito del promedio es 4 o menor, se omite dejando el nmero de 2 cifras significativas. Por ejemplo, si en una caja se cuentan 312 UFC, se debe reportar como 31 X 101, porque el tercer dgito es 2 y se redondea al segundo dgito. Cuando el tercer dgito es 5 o superior, el segundo dgito se redondea al siguiente, por ejemplo si en una caja se cuantifican 199 UFC se reportar como 20 x 10 1 UFC, porque el tercer dgito es superior a 5. En el ejemplo 5 del cuadro 2, el promedio es de 237.5 en la dilucin 10-3, por lo que se reportar como 24 x 104 UFC. 3. Cuando las 2 placas de una dilucin contienen un nmero de colonias caractersticas dentro del rango de sensibilidad del mtodo, se promedian los nmeros y se multiplica por el inverso de la dilucin. 4. Cuando hay una placa con crecimiento extendido, no se consideran sta ni su duplicado. 5. Cuando una de las 2 placas de una dilucin es representativa y la otra no, se consideran ambas y se promedian. 6. Cuando hay placas representativas en 2 diluciones subsecuentes, se promedian cada una con su duplicado (aunque el duplicado no lo sea), se aplica el factor de dilucin a cada una y luego se promedia nuevamente. 7. Si en las placas no hay colonias (o no son caractersticas del grupo en estudio), reportar el resultado como: menos de un (grupo) en 10 -x (la ms baja utilizada), por ejemplo < 100 / g si la dilucin ms baja fue 10 -2 < 1 / mL si la muestra se sembr directamente, sin diluciones. Se agrega la leyenda: valor estimado. 8. Si no hay placas representativas pero hay alguna con un nmero menor de UFC., se consideran las de la menor dilucin y se agrega valor estimado. 9. Cuando el nmero de colonias por placa exceda de 250, contar las colonias en aquellas porciones de la placa que sean representativas de la distribucin de colonias. Contar por ejemplo, una cuarta parte o una mitad del rea de la caja y multiplicar el valor obtenido por 4 2, respectivamente. Si solamente pueden contarse algunos cuadros, considerar que el fondo de una caja Petri de 100 mm de dimetro contiene 65 cuadros de la cuadrcula del contador. Agregar la leyenda "valor estimado". 10. Se cuentan como una sola colonia: Cadenas o pequeos grupos no separadas claramente entre s, que parecen ser causadas por la desintegracin de un cmulo de bacterias y que estn separadas de otras colonias o cadenas.
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Colonias extendidas como pelcula entre el fondo de la caja y el agar y que se diferencian claramente de otras. Colonias como pelcula en las orillas de la caja, sobre la superficie del agar. 11. Se considera crecimiento extendido el que se presenta cuando las colonias abarcan ms del 50 % de la superficie de la caja, con o sin inhibicin de crecimiento; en ese caso, y/o cuando la inhibicin exceda el 25 % de la superficie de la caja, se considera que las placas no son representativas y por lo tanto no se toman en cuenta.

El Cuadro 2, ejemplifica la aplicacin de estos lineamientos; consultarlo para seleccionar las cajas a considerar en los clculos.

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CUADRO 2. Ejemplos para el clculo de resultados de cuenta en placa, utilizando ensayos por duplicado. (Rango de sensibilidad: 25 a 250 colonias) Serie Diluc iones Resultado -2 -3 -4 Ejemplo duplic. 10 10 10 UFC. / g o mL Observaciones 1 A B 2 A > 250 > 250 > 250 178 190 220 16 17 25 23 x 104 En este caso se promedian datos de diluc. 10-3 (= 179 x 103,pasa a 180 x 103 18 x 104). Por otra parte se promedia datos de dilucin 10-4 (= 27 x 104). Finalmente se promedian los resultados de ambas diluciones y se redondea el resultado final Se promedian datos de diluc. 10-2 ; aunque estn fuera de rango, son los ms cercanos. Se anota valor estimado Se toma la ms alta que se pueda contar, aunque sea en cuadrantes o cuadrcula y se anota valor estimado. Se ignora la dilucin 10-4 por el crecimiento extendido; se promedian los datos de 10-3, se redondea 237.5 a 240. Se reporta como < 1 en la dilucin ms baja que se utiliz, en este caso 10-2. Se registra como sensibilidad del mtodo. Se promedia el nico dato que est dentro del rango (240), con su duplicado, aunque ste salga del rango (268). Se consideran las placas que estn dentro del rango y se promedian con sus duplicados, aunque stos salgan. Finalmente se promedian los resultados de ambas diluciones Se promedian datos de 10-3 , se promedian datos de 10-4 se realizan los clculos como en el ejemplo 2 18 x 104 Si estn dentro del rango, se promedian los datos de la dilucin 10-3 (184 x 103 se redondea a 18 x 104)

B 3 4 5 A B A B A B A B A B A B A B

> 250 18 14 > 250 > 250 > 250 > 250 0 0 > 250 > 250 > 250 > 250 > 250 > 250

138 2 0 > 250 > 250 240 235 0 0 240 268 216 262 215 235

28 0 0 512 495 34 Crecim extend. 0 0 24 19 23 42 20 26 16 x 102 valor estimado 50 x 105 valor estimado 24 x 104

6 7 8

< 100 valor estimado 25 x 104 28 x 104

23 x 104

Las cifras y recuadros resaltados en negritas son las que se consideran adecuadas para realizar los clculos.
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CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS Reportar como se indica a continuacin, con dos cifras significativas y potencias de 10: Bacterias mesoflicas aerobias en placa en agar triptona extracto de levadura incubadas por ____ h. a _____ C: _______ UFC / g ( / mL) de muestra. Sustituir mesoflicas por termoflicas, psicroflicas psicrotrficas, segn corresponda, anotando el tiempo y la temperatura correspondientes. Si se analiz un alimento para el cual existe norma y existe especificacin sobre el grupo estudiado, incluir en el reporte si el alimento cumple o no con la norma.

BIBLIOGRAFA Secretara de Salud. NOM-109-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Procedimiento para la Toma, Manejo y Transporte de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. Norma Oficial Mexicana. Mxico. Secretara de Salud. NOM-110-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. Norma Oficial Mexicana. Mxico. Secretara de Salud. NOM-092-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo para la cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. Norma Oficial Mexicana. Mxico. Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. Swanson K.M., Petran R.L., Hanlin J.H. (2001) Culture Methods for Enumeration of Microorganisms. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 53-67. International Commission on Microbial Specifications Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL of Foods (2005)

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Determinacin de coliformes totales por cuenta en placa

OBJETIVOS Explicar el fundamento de la determinacin de coliformes totales en un alimento, mediante la cuenta en placa. Realizar adecuadamente la determinacin de coliformes totales en un alimento, mediante la cuenta en placa. Interpretar los resultados obtenidos, de acuerdo con las normas aplicables.

GENERALIDADES La definicin generalmente aceptada para el trmino coliformes describe a estos microorganismos como bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que fermentan la lactosa con produccin de cido y gas, aunque algunos pueden ser fermentadores tardos o no fermentadores, como Citrobacter y Serratia, respectivamente. La mayora de los coliformes pueden encontrarse en la microbiota normal del tracto digestivo del hombre o animales, por lo cual son expulsados especialmente en las heces, por ejemplo Escherichia coli. Por esta razn, su presencia constante en la materia fecal, los coliformes son el grupo ms ampliamente utilizado en la microbiologa de alimentos como indicador de prcticas higinicas inadecuadas. Como los coliformes tambin pueden vivir en otros ambientes, se distingue entre coliformes totales y coliformes fecales. Esta prctica se refiere a coliformes totales. El uso de los coliformes como indicador sanitario puede aplicarse para: Evaluacin del cumplimiento y la eficiencia de las prcticas sanitarias, en el manejo de los alimentos, del equipo y del hielo y agua empleados en su fabricacin. Evaluacin de la calidad microbiolgica de un producto, aunque su presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario, cuando los coliformes son de origen no-fecal. La demostracin y la cuenta de microorganismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivos lquidos o slidos con caractersticas selectivas o diferenciales. Para la cuenta en placa se usa el agar-lactosa-bilis-rojo violeta (ABRV).

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FUNDAMENTO Los coliformes resisten la presencia de bilis en el medio de cultivo; cuando se desarrollan en ABRV, el cido producido por la fermentacin de la lactosa, ocasiona el vire del indicador rojo neutro y la precipitacin de las sales biliares por lo que las colonias son color rojo oscuro y generalmente estn rodeadas de un halo de sales biliares precipitadas, de color rojo claro o rosa. La posibilidad de contar las colonias se fundamenta en su dispersin y separacin, como se explic en la tcnica de preparacin de diluciones.

NOTAS Cuando se utiliza el medio de agar bilis rojo violeta (ABRV) para la cuenta en placa de coliformes, debe considerarse lo siguiente: Si el alimento contiene mono o disacridos en altas concentraciones, stos pueden ser fermentados por otro grupo de microorganismos, generando colonias semejantes a las de coliformes. El medio no debe esterilizarse ni sobrecalentarse por lo que se debe utilizar antes de 3 h. a partir de su preparacin; en cuanto se disuelva el agar se debe colocar en bao de agua a 45 C para mantenerlo fundido, hasta el momento de utilizarlo. Debe ponerse una sobrecapa de medio una vez que las placas vertidas han solidificado, para favorecer las condiciones de microaerobiosis, ms adecuadas para los coliformes. El sobrecalentamiento del medio y las variaciones en las condiciones de incubacin, especialmente la incubacin prolongada, pueden ocasionar la formacin de colonias rojas de cocos Gram positivos. El rango estadstico para tener confiabilidad en el aspecto cuantitativo (de sensibilidad del mtodo) es de 15 a 150 UFC por placa. El tiempo transcurrido desde el momento en que la muestra se incorpora al diluyente hasta que finalmente se vierten los medios de cultivo en las cajas con las muestras de diluciones, no debe exceder de 20 minutos.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 1 matraz erlenmeyer de 250 mL con 90.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.0 0.2 o agua peptonada. a 2 a 4 tubos de ensayo de 16 x 150 con tapn de rosca, con 9.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.0 0.2 o agua peptonada. a 6 a 10 tubos de ensayo sin labio, de 22 x 175 con 20.0 mL de agar bilis rojo violeta c/u, o un matraz erlenmeyer con 125.0 a 210.0 mL. a

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6 a 10 tubos de ensayo sin labio, de 16 x 150 con 5.0 mL de agar bilis rojo violeta c/u, o un matraz erlenmeyer con 30.0 a 50.0 mL. a

MATERIAL Y EQUIPO Incubadora con termostato que evite variaciones mayores de 1.0C, provista con termmetro calibrado. a Balanza granataria. a Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadrculada y lente amplificador. b Registrador mecnico o electrnico b Microscopio ptico b Bao de agua con termmetro calibrado, que mantenga la temperatura a 45 1.0 C. a Utensilios estriles (cuchillo, tenedor, cuchara, pinzas) para tomar muestra a Propipetaa Pipetas bacteriolgicas de 10 mL, estriles, con algodn en el extremo superior (las necesarias de acuerdo con el nmero de diluciones). a Pipetas bacteriolgicas de 1 mL, estriles, con algodn en el extremo superior. (las necesarias de acuerdo con el nmero de diluciones) a Pipetas Pasteur estriles a, b 5 a 9 cajas Petri estriles, de 15 x 100 mm. a Stomacher (homogeneizador peristltico). a Bolsas estriles para stomacher. a NOTAS
a b

Material necesario al inicio de la prctica Material necesario a las 24 y 48 horas de iniciada la prctica

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DETERMINACIN DE COLIFORMES TOTALES POR CUENTA EN PLACA

Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 mL de solucin diluyente. 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

10-1
Pesar 10 g de muestra en condiciones de asepsia Homogeneizar la muestra con 90.0 mL de diluyente

10-2

10-3

10-4

Depositar 1.0 mL de cada dilucin en cajas de Petri estriles por duplicado Adicionar de 15 a 20 mL de agar bilis rojo violeta fundido y enfriado a 45C en cada placa

Homogeneizar la muestra con el agar haciendo movimientos rotatorios

Incubar las cajas en posicin invertida Contar aquellas placas que tengan entre 15 a 150 colonias y reportar como UFC/g o mL de muestra

24 h/ 37C

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PROCEDIMIENTO 1. Pesar la muestra y preparar las diluciones como lo establece la tcnica de Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. Recordar que el rango de sensibilidad del mtodo es de 15 a 150 colonias por placa. 2. Distribuir las cajas estriles en la mesa de trabajo de manera que la inoculacin y la adicin de medio de cultivo se puedan realizar cmoda y libremente. Marcar las bases de las cajas con los datos pertinentes antes de colocar el inculo. 3. Inocular por duplicado, 1.0 mL de la dilucin correspondiente en cada caja, mediante pipeta estril y verter de 18.0 a 20.0 mL del medio ABRV fundido y mantenido a 45 1.0C en bao de agua. El tiempo transcurrido entre la preparacin de la dilucin primaria y el momento en que se vierte el medio de cultivo, no debe exceder de 20 minutos. 4. Mezclar cuidadosamente el inculo con el medio, mediante seis movimientos de derecha a izquierda, seis movimientos en el sentido de las manecillas del reloj, seis movimientos en el sentido contrario al de las manecillas del reloj y seis de atrs para adelante, sobre una superficie lisa y nivelada. Permitir que la mezcla solidifique dejando las cajas Petri sobre una superficie horizontal fra. No permitir que se mojen las tapas de las cajas. 5. En cuanto el medio solidifique, agregar a cada caja, una sobrecapa de 4 5 mL del mismo medio fundido y mantenido a 45 C, no permitir que se mojen las tapas de las cajas. La sobrecapa de agar se coloca para favorecer el crecimiento de los coliformes, que son facultativos. Dejar que solidifique. 6. Preparar una caja control con 18.0 a 20.0 mL de medio para verificar la esterilidad. 7. Solidificado el medio invertir las placas y colocarlas en la incubadora a 35C, durante 24 2 h. 8. Despus de este periodo, contar las colonias con el contador de colonias. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias. Las colonias tpicas son de color rojo oscuro, generalmente se encuentran rodeadas de un halo de precipitacin debido a las sales biliares, el cual es de color rojo claro o rosa, la morfologa colonial es semejante a lentes biconvexos con un dimetro de 0.5 a 2.0 mm. 9. Si hay desarrollo extendido o un nmero de colonias superior al del rango de sensibilidad del mtodo, aplicar las reglas indicadas en el inciso de RESULTADOS de la prctica de Cuenta de Bacterias en Placa. Hacer uso del microscopio para resolver los casos en los que no se pueden distinguir las colonias de las pequeas partculas de alimento.

CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS Para seleccionar cajas y reportar, seguir las indicaciones de la prctica Cuenta de Bacterias en Placa.

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Reportar como se indica a continuacin, con dos cifras significativas y potencias de 10. Coliformes totales en placas de agar bilis rojo violeta, incubadas por 24 + 2 h a 35 C: _____ UFC / g (o / mL) de muestra.

BIBLIOGRAFA Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. Secretara de Salud. NOM-110-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Preparacin y Dilucin de Muestras de Alimentos para su Anlisis Microbiolgico. Norma Oficial Mexicana. Mxico. Secretara de Salud. NOM-113-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodos para la cuenta de microorganismos coliformes totales en placa. Norma Oficial Mexicana. Mxico. Secretara de Salud. NOM-092-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo para la Cuenta de Bacterias Aerobias en Placa. Norma Oficial Mexicana. Mxico. Kornacki J.L. & Johnson J.L. (2001) Enterobacteriaceae, Coliforms, and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 69-82.

International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005) Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall. 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

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Mtodo para la determinacin de bacterias coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli por la tcnica de diluciones en tubo mltiple (Nmero ms Probable o NMP)
OBJETIVOS Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la bsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli. Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes fecales.

GENERALIDADES

Debido a que un gran nmero de enfermedades son transmitidas por va fecal-oral utilizando como vehculo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcionen como indicador de contaminacin fecal. stos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener una sobrevivencia similar a la de los patgenos intestinales y deben ser capaces de desarrollarse extraintestinalmente. El grupo coliforme constituyen un grupo heterogneo con hbitat primordialmente intestinal para la mayora de las especies que involucra, es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, su capacidad de sobrevivencia y multiplicacin fuera del intestino tambin se observan en aguas potables, por lo que este grupo se utiliza como indicador de contaminacin fecal en agua; encontrandose que mientras mayor sea el nmero de coliformes en agua, mayor ser la probabilidad de estar frente a una contaminacin reciente. Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no slo sobreviven, sino que se multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. Cuando los productos alimenticios han recibido un tratamiento trmico (pasteurizacin, horneado, coccin, etc.), estos microorganismos se utilizan como indicadores de malas prcticas sanitarias. Para su estudio, se dividen en dos grupos. El grupo de bacterias coliformes totales el cual comprende a todos los bacilos Gram-negativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas en un lapso mximo de 48 h. a 35C 1C. Este grupo est conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter y Klebsiella. El grupo de coliformes fecales, est constituido por bacterias Gram-negativas capaces de fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h de incubacin a

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44.5 0.1C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la ms prominente es Escherichia coli. La demostracin y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el empleo de medios de cultivo lquidos y slidos con caractersticas selectivas y diferenciales. Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, existen algunas cepas de E. coli patgenas que provocan enfermedades diarreicas. Estas se clasifican con base en las caractersticas que presentan sus factores de virulencia nicos, cada grupo provoca enfermedad mediante un mecanismo diferente. Se sabe que sus propiedades de adherencia a las clulas epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en plsmidos. De manera similar las toxinas son mediadas por plsmidos o fagos. Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli enterotoxignica (ETEC, por sus siglas en ingls), E. coli enteropatgena (EPEC), E. coli enterohemorrgica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) y E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras estn implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos contaminados. En el cuadro 1 se resumen algunas propiedades y sntomas causados por las cepas patgenas de Escherichia coli. Esta informacin se puede ampliar en el anexo 3 de la seccin 2, y complementar en la bibliografa.

FUNDAMENTO La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a 35C 1 C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase confirmativa. En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante.

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La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1 C por un periodo de 24 a 48 h. Finalmente, la bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioqumicas bsicas (IMViC) a las colonias tpicas.

Cuadro 1. Propiedades y sntomas causados por algunas cepas de Escherichia coli patgenas ETEC EPEC EHEC EIEC Toxina Lbil/estable Shiga o vero Invasiva Intiminas Enterohemolisina Aspecto de las heces Presencia de leucocitos en heces Fiebre Intestino involucrado Dosis infectiva Serotipos Aguadas + + + + -

Aguadas Aguadas muy Mucoides y sanguinolentas sanguinolentas sanguinolentas + + + Colon y parte baja del delgado Alta Varios

baja

Delgado Alta varios

Delgado Alta O26, O111 y otros

Colon baja O157:H7, O26, O111 y otros

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MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 1. Para anlisis de agua Para la preparacin del medio de cultivo utilizado en la prueba presuntiva de muestras de agua o hielo, consultar el cuadro 2. 5 10 tubos de 22 x 175 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio o caldo lactosado concentracin doble o triple con campana de Durham a. 5 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de Durhamb. 7 12 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC y campana de Durham o caldo EC MUG con campana de Durham b. 2 cajas Petri con agar para mtodos estndar d 2 cajas Petri con agar Eosina azul de metileno c 6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe 3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIM (opcional) e 3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de caldo citrato de Koser o citrato de Simmons (opcional)e

2. Para anlisis de alimentos 1 matraz de 250 mL con 90.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solucin amortiguadora de fosfatosa 2 tubos de 16 x 150 mm con 9.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solucin amortiguadora de fosfatos con tapn de roscaa 15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio concentracin sencilla o caldo lactosado concentracin sencilla con campana de Durhama 15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de Durhamb. 17 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC o EC-MUG con campana de Durhamb. 2 cajas Petri con agar para mtodos estndard 2 cajas Petri con agar Mac Conkeyc 6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe 3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIM e 3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de citrato de Simmons, o caldo citrato de Kosere

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SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES Frascos gotero con reactivo de Erlich o Kovace Frascos gotero con indicador rojo de metiloe Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1e Frascos gotero con solucin de hidrxido de potasio al 40 % VP2e Colorantes para tincin de Gramd

MATERIAL Y EQUIPO Mechero, a,b,c,d,e. Propipetaa. Gradillaa,b,c,e. Balanza granatariaa. Stomachera Bolsas para stomacher . Lmpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)c Lentes de seguridadc Pipetas de 10.0 mL estriles con tapn de algodna. Pipetas de 1.0 mL estriles con tapn de algodna. Pipetas Pasteur estriles a, b, c, d Asa bacteriolgicab,c,d,e Portaobjetosd Microscopio pticod Termmetro calibradob Bao de agua a 44.5 0,1C.b Incubadora a 35 2,0Ca. Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180Ca Autoclavea

NOTAS a Material necesario al inicio de la prctica. b Material necesario a las 48 h. de iniciada la prctica. c Material necesario a las 96 h. de iniciada la prctica. d Material necesario a las 120 h. de iniciada la prctica. e Material necesario a las 144 h. de iniciada la prctica.

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DETERMINACIN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA Y HIELO POTABLES

37C

24 - 48 h

Tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio (CLSS) doble concentracin (2X)

CLSS + 20.0 mL de muestra

Siembra con asa bacteriolgica de los tubos positivos (produccin de gas) en caldo lactosa verde brillante bilis 2% y caldo EC

2 a 3 asadas/tubo

2 a 3 asadas/tubo

37C 24 48 h

44.5C

24 48 h -

Tubos con 10.0 mL de caldo Lactosa verde brillante bilis 2%

Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes totales /100 ml de muestra

Tubos con 10.0 mL de Caldo EC o EC-MUG

Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes fecales /100 ml de muestra.

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Siembra de tubos positivos en placas de Agar EMB para la bsqueda de Escherichia coli

DETERMINACIN DEL NMP DE COLIFORMES EN MUESTRAS SLIDAS O ALIMENTOS

Pesar 10.0 g de muestra en condiciones de asepsia Homogenizar la muestra con 90.0 mL de solucin diluyente Realizar 2 diluciones decimales ms en tubos con 9.0 mL de solucin diluyente

1.0 mL

1.0 mL

Sembrar por triplicado cada dilucin en tubos de caldo lauril sulfato de sodio (1X) 10-1 10-2 10-3

35C 24 - 48 h

10-1

10-2

10-3

10-1

10-2

10-3

Tubos con 10.0 mL de CLSS concentracin sencilla (1X) + 1.0 mL de muestra

Siembra con asa bacteriolgica de los tubos positivos (produccin de gas) en caldo lactosa verde brillante bilis 2% y caldo EC

35C

44.5C

24 - 48 h

24 - 48 h

10-1

10-2

10-1

10-2

10-1

10-2

10-1

10-2

Tubos con 10.0 mL de Caldo Lactosa verde brillante bilis 2%

Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes totales /g de muestra

50

Tubos con 10.0 mL de Caldo EC o EC-MUG

Lectura de tubos positivos en tablas. NMP de coliformes fecales /g de muestra. Siembra de tubos positivos en agar Mac Conkey para bsqueda de Escherichia coli

PROCEDIMIENTO 1. Agua y hielo 1.1 Prueba presuntiva Agitar la muestra y transferir volmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada uno de los tubos con caldo lauril sulfato de sodio que se hayan seleccionado. Agitar los tubos para homogeneizar la muestra. CUADRO 2. Preparacin de inculo con caldo lauril sulfato de sodio INOCULO (mL) CANTIDAD DE MEDIO POR TUBO (mL) 10 o ms 10 20 10 50 35 20 VOLUMEN DE CALDO LAURIL MEDIO MAS TRIPTOSA INOCULO REQUERIDO g/L (mL) 11 o ms 20 30 30 150 135 120 35,6 71,2 53,4 106,8 106,8 124.6 142.4 CONCENTRACIN

1 10 10 20 100 100 100

1X 2X 1.5 X 3X 3X 3.5 X 4X

Incubar los tubos a 35 0,5C. Examinar los tubos a las 24 h. y observar si hay formacin de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se observa produccin de gas, incubar 24 h. ms. 1.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva, a otro tubo de 16 x150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de Durham. Agitar los tubos para su homogeneizacin. Incubar a 35 2 C durante 24 a 48 h..

Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento) y produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.. Consultar la tabla 1 2 de NMP para conocer el nmero ms probable de organismos coliformes totales/100 mL.
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1.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC conteniendo campana de Durham. Agitar los tubos para su homogeneizacin. Incubar a 44.5 0.1 C en incubadora o un bao de agua durante 24 a 48 h.

Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h. Consultar la tabla 1 2 de NMP para conocer el nmero ms probable de organismos coliformes fecales/ 100 mL. Control de calidad 1. Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras. 1.4 Prueba confirmativa para Escherichia coli Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y sembrar por estra cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento. Incubar las placas invertidas a 35C por 18-24 h. Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfologa colonial: Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metlico. Si no hay colonias con morfologa tpica, probar una o ms colonias lo ms parecido E. coli de cada placa y sembrarlas en agar cuenta estndar para realizar las pruebas de morfologa microscpica y pruebas bioqumicas. Incubar las placas a 35C por 18-24 h. Hacer un frotis y teirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos cortos o cocobacilos Gram-negativos.

1.4.1 Identificacin bioqumica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC). A partir de las cajas de agar cuenta estndar, selecionar una colonia, resuspenderla en 2 ml de solucin salina isotonica para realizar las siguientes pruebas bioqupimicas.

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a. Produccin de indol (I) Tomar una asada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo con medio SIM, incubarlo a 35C por 24 2 h. Finalizada la incubacin, adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs o Ehrlich. La presencia de una coloracin roja en la superficie del tubo se considera como prueba positiva para la presencia de indol. b. Produccin de cidos mixtos (Rojo de metilo, RM) Tomar una asada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo que contenga caldo RM-VP, incubar a 35C por 48 2 h. Finalizada la incubacin, adicionar 5 gotas de solucin de rojo de metilo. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color amarillo es una prueba negativa. c. Produccin de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP) Tomar una asada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo que contenga caldo RM-VP, incubar a 35C por 48 2 h. Finalizada la incubacin , adicionar 0.6 mL de solucin KOH 40% (VP1), agiatr y 0.2 mL de solucin alfa- naftol (VP2 )y agitar. Dejar reposar el tubo destapado durante 10 minutos; se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.

d. Utilizacin del citrato (C) Tomar una asada de la suspensin bacteriana e inocular un tubo que contenga caldo citrato de Koser o agar citrato de Simmons (opcional) Incubar a 35C por 96 h. El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad en el caldo citrato de Koser, se considera una prueba positiva.

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NOTAS Para determinar la produccin de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al agar SIM. Este medio se inocula por picadura con el asa bacterioogca de forma recta. Se incuba a 35C por 24 2 h. Finalizado el periodo de incubacin se adiciona el reactivo de Kovac o Erlich cuyo fundamento es el mismo. Para determinar la utilizacin del citrato de sodio como nica fuente de carbono, tambin se puede utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se inocula en la superficie (pico de flauta). Se incuba a 35C de 24 a 48 h. La presencia de una coloracin azul debida al vire del indicador que contiene el medio, indica prueba positiva 1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG (4 metil-umbeliferil- -D-glucuronido)

FUNDAMENTO Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato especfico 4-metilumbeliferil-beta-D-glucurnido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una fluorescencia azul fcil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se puede identificar Escherichia coli. a. Prueba confirmativa A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) y de cada tubo que muestre formacin de gas , tomar una asada y sembrar en un nmero igual de tubos con medio de confirmacin EC-MUG. Incubar a 44,5 0,2C en bao de agua durante 24 h., observar si hay formacin de gas; si no se observa la formacin de gas continuar la incubacin 24 h. ms. Finalizado el periodo de incubacin, Irradiar los tubos con una fuente de luz UV, observar fluorescencia y hacer la lectura. Utilizar estos resultados para calcular el nmero ms probable (NMP) de E. coli.

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Control de calidad Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K. pneumoniae como control negativo.

2. Alimentos 2.1 Preparacin de la muestra. Pesar 10.0 gramos de la muestra previamente picada con cubiertos estriles y mezclar. Adicionar el alimento a 90.0 mL de agua peptonada al 0.1 %, homogeneizar en Stomaker y dejar en reposo de 2-3 minutos. Realizar 2 diluciones decimales ms usando tubos con 9.0 mL de agua peptonada al 0.1 %. 2.1.1 Prueba presuntiva. Aadir 1.0 mL de la dilucin 10- 1 g/mL a cada uno de 3 tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio. Aadir 1.0 mL de las diluciones 10- 2 g/mL y 10- 3 g/mL a dos series de 3 tubos cada una con caldo lauril sulfato de sodio. Incubar a 35-37C durante 24-48 h. Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h. 2.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva a tubos que contienen caldo de bilis verde brillante (brila) Agitar suavemente los tubos para su homogeneizacin. Incubar a 35 2 C durante 24 a 48 h.

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Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe crecimiento y produccin de gas, despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h. Consultar las tablas de NMP que se encuentran en el anexo para conocer el nmero ms probable de organismos coliformes totales por g de muestra. 2.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales. Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva a tubos con caldo EC. Agitar suavemente los tubos para su homogeneizacin. Incubar a 44.5 0.1 C en incubadora o un bao de agua durante 24 a 48 h.

Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe turbidez y produccin de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h. Consultar la tabla de NMP (ANEXO) para conocer el nmero ms probable de organismos coliformes fecales por g de muestra Control de calidad Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras. 2.4 Prueba confirmatoria de Escherichia coli. Confirmar la presencia de Escherichia coli en por lo menos el 10% de las pruebas con resultados positivos de coliformes fecales; sembrar en placas de agar McConkey a partir de los tubos que demostraron la presencia de gas en la prueba confirmativa. Incubar las placas a 35 0.5C durante 24 2 h., observar las colonias tpicas fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitacin de sales biliares. Hacer tincin de Gram para observacin de la morfologa de las bacterias. Seleccionar 1 o ms colonias aisladas para realizar pruebas IMViC.

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CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS Determinar el nmero ms probable conforme al procedimiento sealado en la tabla siguiente, para estimar la poblacin de bacterias coliformes totales, bacterias coliformes fecales y Escherichia coli en muestras de agua.

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TABLA 1. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20 mL de muestra de agua o hielo. No. de Tubos 95% de Lmite de Confianza (aproximado) positivos NMP/100 mL Inferior Superior 0 <1,1 0 3,0 1 1,1 0,05 6,3 2 2,6 0,3 9,6 3 4,6 0,8 14,7 4 8,0 1,7 26,4 5 >8,0 4,0 Infinito TABLA 2. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 mL de muestra de agua o hielo. No. de Tubos 95% de Lmite de Confianza (aproximado) Positivos NMP/100 mL Inferior Superior 0 <1,1 0,0 3,0 1 1,1 0,03 5,9 2 2,2 0,26 8,1 3 3,6 0,69 10,6 4 5,1 1,3 13,4 5 6,9 2,1 16,8 6 9,2 3,1 21,1 7 12,0 4,3 27,1 8 16,1 5,9 36,8 9 23,0 8,1 59,5 10 >23,0 13,5 Infinito

Todos los cultivos que: Sean bacilos o cocobacilos Gram-negativos, no esporulados, fermenten la lactosa con produccin de gas dentro de las 48 h. a 35C. y se obtenga las siguientes combinaciones para las pruebas IMVIC: Biotipo 1(++--) Biotipo 2 (-+--) son consideradas como Escherichia coli. Para calcular el NMP de E. coli utilizar a proporcin de los tubos positivos de la prueba confirmatoria en caldo EC.

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BIBLIOGRAFA NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-145-SSA1-1995. Productos crnicos troceados y curados. Productos crnicos curados y madurados. Disposiciones y especificaciones sanitarias. Apndice normativo B. De la estimacin de la densidad microbiana por la tcnica de nmero ms probable. CCAYAC-M-004 (2006) Estimacin de la densidad microbiana por la tcnica del nmero mas probable, deteccin de coliformes totales, cliformes fecales y Escherichia coli por el nmero mas probable Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9 th Arlington, VA: AOAC. Madigan, M T y Martinko, J M., Brock, Biology of Microorganisms, 11a ed. 2006, pp 935-936 Brooks, Geo F., Batel, Janet S. y Morse, Stephen A., Microbiologa Mdica de Jawetz. Manual Moderno 17a Edicin 2002, pp 274-275 Kornacki J.L. & Johnson J.L. (2001) Enterobacteriaceae, Coliforms, and Escherichia coli as Quality and Safety Indicators. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 69-82. International Commission on Microbiological. Specifications Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall. 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL of Foods (2005) ed.

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Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos.

OBJETIVOS Realizar adecuadamente mediante el mtodo de cuenta en placa, el nmero de mohos y levaduras presentes en productos alimenticios destinados al consumo humano. Evaluar la calidad microbiolgica de un alimento, que sea factible de estar contaminado con estos microorganismos, tomando como referencia la NOM-111SSA1-1994. Explicar el fundamento del mtodo de deteccin y cuantificacin de mohos y levaduras en alimentos.

GENERALIDADES Los hongos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden encontrarse como flora normal de un alimento, o como contaminantes en equipos mal sanitizados. Ciertas especies de hongos y levaduras son tiles en la elaboracin de algunos alimentos, sin embargo tambin pueden ser causantes de la descomposicin de otros alimentos. Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde el crecimiento bacteriano es menos probable. Estas condiciones pueden ser bajos niveles de pH, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, la presencia de antibiticos, o la exposicin del alimento a la irradiacin. Por lo tanto pueden ser un problema potencial en alimentos lcteos fermentados, frutas, bebidas de frutas, especias, oleaginosas, granos, cereales y sus derivados y alimentos de humedad intermedia como las mermeladas, cajetas, especias, etc. Los hongos y levaduras pueden utilizar ciertos sustratos como carbohidratos incluyendo pectinas y otros polisacridos, cidos orgnicos, protenas y lpidos. Tambin pueden causar problemas a travs de: (a) sntesis de metabolitos txicos (micotoxinas) y (b) habilidad para alterar sustratos no favorables permitiendo el crecimiento de bacterias patgenas. Pueden tambin causar malos olores y sabores y la decoloracin de las superficies de alimentos. El trmino moho se suele aplicar para designar a ciertos hongos filamentosos multicelulares cuyo crecimiento en la superficie de los alimentos se suele reconocer fcilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso, a veces pigmentado. Generalmente todo alimento enmohecido se considera no apto para el consumo. La identificacin y clasificacin de los mohos se basa en observaciones macroscpicas y microscpicas.

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Hifas y micelio. El talo de los mohos est formado por una masa de filamentos ramificados, llamados hifas, llamndose micelio al conjunto de las hifas. Las hifas pueden ser sumergidas o areas. Tambin se pueden clasificar en hifas vegetativas o en crecimiento, las cuales se encargan de la nutricin del moho, y en hifas frtiles o hifas que producen los rganos reproductores. Los mohos se dividen en dos grupos: septados, es decir, provistos de tabiques transversales que dividen a las hifas, y no septados cenocticos, cuyas hifas estn formadas por cilindros sin tabiques transversales. Este tipo de hifas posee ncleos diseminados a lo largo del cilindro y se les denomina multicelular. Determinadas estructuras del micelio o determinados rganos ayudan a identificar a los mohos. Por ejemplo los rizoides o anclajes de los gneros Rhizopus o Absidia, la clula basal del gnero Aspergillus y la ramificacin dicotmica, o en forma de Y, del gnero Geotrichum. rganos o estructuras reproductoras. Los mohos se reproducen principalmente por medio de esporas asexuales. Algunos mohos tambin producen esporas sexuales. A tales hongos se les denomina perfectos, los cuales se dividen en Oomycetes y Zygomycetes si no son septados, o bien en Ascomycetes y Basidiomycetes si son septados, en contraposicin a los mohos imperfectos, Fungi Imperfecti, los cuales slo poseen esporas asexuales. Esporas asexuales. Los mohos producen gran cantidad de esporas asexuales, son pequeas, ligeras y resistentes a la desecacin. Se diseminan fcilmente por la atmsfera para sedimentar y originar el talo de un nuevo moho. Los tres tipos principales de esporas asexuales son: (1) conidios, (2) artrosporas u oidios y (3) esporangiosporas. Los conidios se separan, o crecen, en determinadas hifas frtiles denominadas conidiforos y generalmente son libres, es decir, no se encuentran dentro de ningn receptculo, en contraposicin a las esporangiosporas, las cuales se encuentran dentro de un esporangio o receptculo, situado en el extremo de una hifa frtil, el esporangiforo. Las artrosporas se forman por fragmentacin de una hifa. El extremo engrosado del esporangiforo se denomina columnela y adopta formas tpicas en cada una de las distintas especies de mohos. Algunos mohos poseen conidios comprimidos uno contra otro, dispuestos en cadenas, y que nacen de una clula especializada, el esterigma o filide situada en el extremo del conidiforo. Propiedades fisiolgicas. En comparacin con la mayora de las levaduras y de las bacterias, la mayora de los mohos necesitan menor cantidad de humedad disponible. Un porcentaje total de humedad por debajo del 14 al 15 por ciento en la harina o en algunos frutos secos impedir o retardar mucho el crecimiento de los mohos. Los mohos podran considerarse mesfilos, es decir, que son capaces de crecer bien a temperaturas normales. La temperatura ptima de la mayora se encuentra alrededor de los 25 a 30C, aunque algunos son psicrtrofos y algunos son termfilos. Son aerobios, esto es cierto por lo menos en los mohos que crecen en la superficie de los alimentos. Casi todos los mohos son capaces de crecer dentro de un amplio intervalo de pH (pH comprendido entre 2 y 8.5), aunque la mayora crece mejor a pH cido. Son capaces de utilizar muchos tipos de alimentos, que van desde sencillos a complejos.

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Poseen enzimas hidrolticas, y de aqu que algunos se utilicen para la produccin industrial de las amilasas, pectinasas, proteasas y lipasas. Algunos gneros de mohos importantes en alimentos. Mucor. Intervienen en la alteracin de algunos alimentos y se utilizan en la fabricacin de otros. M. rouxii se utiliza para la sacarificacin del almidn, para la maduracin de quesos y para la fabricacin de algunos alimentos orientales. Rhizopus. La especie R. stolonifer, o moho del pan, es muy comn e interviene en la alteracin de algunos alimentos: bayas, frutas, hortalizas, pan, etc. Aspergillus. Los aspergilos son mohos muy abundantes. Algunas especies intervienen en las alteraciones que experimentan los alimentos, mientras que otros son de utilidad para preparar determinados alimentos. A. niger se utiliza para la produccin industrial de cido ctrico y glucnico y de algunas enzimas. A. flavus se utiliza para la fabricacin de ciertos alimentos orientales y en la obtencin de enzimas. Se han reportado casi 50 especies de Aspergillus como productores de metabolitos txicos denominados en general micotoxinas. Las de mayor importancia son: las denominadas aflatoxinas (producidas por A. flavus, A. parasiticus y A. nomius); la ocratoxina A producida por A. ochraceus, A. carbonarius y A. niger; sterigmatocistina producida principalmente por A. versicolor; el cido ciclopiaznico producidas por A. flavus y A. tamarii. La citrinina, patulina y cido peniclico tambin son producidas por especies de Aspergillus, las txinas tremorgnicas son producidas por A. terreus (territremas), A. fumigatus (fumitremorgenas) y A. clavatus (triptoquivalina). Las aflatoxinas son derivados de la difurancumarina. Las aflatoxinas B 1, B2, G1 y G2 se producen en la naturaleza por los mohos ya mencionados. Las letras B y G se refieren a los colores de flurescencia por sus nombres en ingls ( azul y verde, respectivamente) observados bajo longitudes de onda en la regin UV, y los subndices 1 y 2 se refieren a sus patrones de separacin cromatogrficos. Las aflatoxinas M1 y M2 se producen por la hidroxilacin de las respectivas aflatoxinas B. La aflatoxina B 1 tal vez sea el carcingeno de hgado ms potente para animales incluyendo al humano. La ocratoxina A y la citrinina afectan la funcin renal. Las toxinas tremorgnicas afectan el sistema nervioso central. Penicillium. Es otro gnero de mohos de frecuente incidencia y de importancia en los alimentos, P. expansum produce la podredumbre blanda de las frutas; P. digitatum y P italicum producen la podredumbre de frutas ctricas. Las especies P. camemberti, P. roqueforti se utilizan en la maduracin de quesos. Se han reportado ms de 80 especies de Penicillium como productores de micotoxinas. Estas micotoxinas pueden dividirse en dos grupos: las que afectan la funcin del heptica o renal, y las neurotoxinas. Las principales micotoxinas producidas por Penicillium son, ocratoxina A, citrinina, patulina, cido ciclopiaznico, citreoviridina, penitremo A, toxina PR y roquefortina y el cido secalnico. De stas la ocratoxina A es
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sin duda la ms importante, es un carcingeno renal y es producida por P. citrinum, P. viridicatum, P. verrucosum. La principal fuente de esta toxina es el pan de centeno o trigo, o a travs de cerdos alimentados con estos cereales cuya carne es posteriormente consumida por humanos. Se recomienda consultar la bibliografa para conocer otros gneros de mohos con importancia en los alimentos. Levaduras y hongos levaduriformes. El trmino levadura se refiere a aquellos hongos que generalmente no son filamentosos, sino unicelulares y de forma ovoide o esferoide, y que se reproducen por gemacin o por fisin. Las levaduras que se encuentran en los alimentos pueden ser benficas o perjudiciales. Las levaduras se utilizan en la elaboracin de alimentos como el pan, la cerveza, vinos, vinagre y quesos, tambin se utilizan en la obtencin de enzimas y alimentos fermentados. Las levaduras son perjudiciales cuando producen la alteracin del sauerkraut, de los zumos de frutas, de los jarabes, de la melaza, de la miel, de las carnes, del vino, de la cerveza y de otros alimentos. Los caracteres morfolgicos de las levaduras se determinan mediante su observacin microscpica. Su forma puede ser desde esfrica a ovoide, alimonada, piriforme, cilndrica, triangular e incluso alargada. La mayora se reproducen asexualmente por gemacin multicelular o por gemacin polar. Unas pocas especies se reproducen por fisin. En los cultivos en placas de agar es difcil diferenciar las colonias de levaduras de las colonias bacterianas; la observacin microscpica de los microorganismos es la nica forma segura de diferenciarlas. La mayora de las colonias jvenes de levaduras son hmedas y algo mucosas; la mayora de las colonias son blancuzcas, aunque algunas tienen un color crema o rosado. Son oxidativas, fermentativas, o bien su actividad metablica es a la vez de ambos tipos. La mayora de las levaduras crecen mejor con un alto contenido de humedad. No obstante, crecen mejor que la mayora de las bacterias en sustratos que contienen elevadas concentraciones de solutos (por ejemplo carbohidratos o cloruro de sodio), es decir son osmotolerantes. Sin embargo la mayora de las levaduras necesitan mayor humedad que los mohos. Para la mayora de las levaduras la Aw mnima de crecimiento oscila entre 0.88 y 0.94. El intervalo de temperaturas de crecimiento es parecido al de los mohos, con una temperatura ptima en torno a los 25 a 30C y una temperatura mxima en torno a los 35 a 47C. Crecen mejor en aerobiosis, aunque las especies de tipo fermentativo son capaces de crecer, aunque lentamente, en anaerobiosis. Los azcares son la fuente energtica ms apropiada para las levaduras, aunque las oxidativas, pueden oxidar los cidos orgnicos y el alcohol.

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Algunos gneros de importancia en alimentos son: Schizosaccharomyces. Levaduras de este gnero se han encontrado en frutas tropicales, en la melaza y en la miel. Saccharomyces. La especie S. cerevisiae se emplea en muchas industrias alimentarias, como en la fermentacin del pan, fermentacin de la cerveza, fermentacin de los vinos, en la produccin de alcohol, glicerol e invertasa. Kluyveromyces. K. marxianus (antes Saccharomyces fragilis) se utiliza en la obtencin de productos lcteos por su capacidad de fermentar la lactosa. Zygosaccharomyces. Las levaduras de este gnero son importantes por su capacidad para crecer en medios con elevadas concentraciones de azcar (osmfilas), intervienen en la alteracin de la miel, jarabes y melazas, y tambin en la fermentacin de la salsa de soya y de algunos vinos. Pichia. Crecen en la superficie de los lquidos formando una pelcula. P. membranafaciens produce una pelcula en la superficie de las cervezas y vinos. Debaromyces. Forman pelcula en la superficie de las salmueras. D. kloeckeri crece en la superficie de los quesos y de los embutidos. Hanseniaspora. Estas levaduras tienen forma de limn y crecen en los zumos de frutas. Torulopsis. Originan problemas en las fbricas de cervezas. T. sphaerica fermenta la lactosa, alterando productos lcteos. Otras especies alteran la leche condensada azucarada, los concentrados de zumos de frutas y los alimentos cidos. Candida. La especie C. utilis se cultiva para la obtencin de protena unicelular para incorporarla tanto a alimentos destinados al consumo humano como a piensos. La especie C. krusei se utiliza junto con los cultivos iniciadores de productos lcteos. C. lipolytica produce alteracin de la mantequilla y margarina. Brettanomyces. Producen grandes cantidades de cido e intervienen en la fermentacin de la cerveza belga de tipo lambic, de las cervezas inglesas y de los vinos franceses. Trichosporon. Estas levaduras crecen mejor a temperaturas bajas, encontrndose en las fbricas cerveza y en la superficie de vacuno refrigerada. Rhodotorula. Estas levaduras de color rojo, rosa o amarillo, pueden producir manchas en la superficie de los alimentos como en la superficie de las carnes, o zonas de color rosado en el sauerkraut.

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FUNDAMENTO El mtodo se basa en inocular una cantidad conocida de muestra, en un medio de cultivo selectivo especfico, aprovechando la capacidad de este grupo microbiano de utilizar como nutrientes a los polisacridos que contiene el medio. La hidrlisis de estos compuestos se efecta por enzimas que poseen estos microorganismos. La sobrevivencia de los hongos y levaduras a pH cidos se pone de manifiesto al inocularlos en el medio de cultivo acidificado a un pH de 3.5. As mismo, la acidificacin permite la eliminacin de la mayora de las bacterias. Finalmente, las condiciones de aerobiosis y la incubacin a una temperatura de 25 1 C da como resultado el crecimiento de colonias caractersticas para este tipo de microorganismos.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad, conteniendo 90.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%, estril a. 3 tubos de 16 x 150 mm, conteniendo 9.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%, estriles con tapn de algodn a. 4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrosa o 1 matraz Erlenmayer de 250 mL con 80.0 mL del mismo medio para facilitar la acidificacina . 4 tubos 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar extracto de malta o 1 matraz Erlenmayer de 250 mL con 80.0 mL del mismo medio para facilitar la acidificacin a. NOTA La Norma Oficial Mexicana utiliza nicamente el agar papa dextrosa para la deteccin y cuantificacin de estos grupos de microorganismos. Sin embargo se sugiere para la cuantificacin de las levaduras, la utilizacin del agar extracto de malta acidificado ya que es un medio ms rico en nutrientes y adecuado para el desarrollo de este grupo microbiano.

SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES Solucin colorante de lactofenol azul de algodn b. Colorantes para tincin de Gram b. Solucin estril de cido tartrico al 10.0 % a.

MATERIAL Y EQUIPO Vaso de licuadora estril o bolsa para Stomachera. Motor para licuadora o Stomachera.
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Pipetas graduadas estriles de 1 mL con tapn de algodn a. Pipetas graduadas estriles de 10 mL con tapn de algodn a. Pipetas Pasteur estriles a, b Propipetaa, b Cajas de Petri estriles (una se utiliza para pesar la muestra) a. Utensilios estriles para la manipulacin de muestras: cuchillos, cucharas, tenedores, etc. a Incubadora con termostato que pueda ser mantenido a 25 1C a. Bao de agua con control de temperatura y circulacin mecnica mantenida a 45 1C a. Portaobjetos, cubreobjetos, diurex b. Microscopio ptico b. Asa bacteriolgica y asa micolgicab. Contador de colonias de campo oscuro, con luz adecuada, placa de cristal cuadriculada y lente amplificador b. NOTAS
a b

Material necesario para el inicio de la prctica. Material necesario para los 3, 4 y/o 5 das despus de iniciada la prctica.

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DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS EN ALIMENTOS

Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 ml de solucin diluyente 1.0 mL 1.0 mL 1.0 mL

Pesar 10 g de muestra en condiciones de asepsia

Homogenizar con 90 .0 mL de solucin diluyente.

10-1

10-2

10-3

10-4

Depositar por duplicado 1.0 mL de cada dilucin en cajas de Petri estriles Adicionar de 15 a 20 mL de agar papa dextrosa y/ agar extracto de malta acidificados con 0.3 mL cido tartrico 10 % enfriado a 45C en cada placa

Homogeneizar la muestra con el agar mediante movimientos rotatorios

Incubar las cajas en posicin invertida

3,4 5 das / 28C

Contar aquellas placas que tengan entre 10 a 150 colonias de hongos y/o levaduras y reportar por separado como UFC/g o mL de muestra, indicando tiempo de incubacin

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PROCEDIMIENTO 1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja Petri estril y pasarla a un matraz Erlenmeyer que contenga 90.0 mL de una solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2 agua peptonada al 0.1%. 2. Homogeneizar la muestra con la solucin anterior en un vaso de licuadora estril o pasarla a una bolsa de Stomacher y homogeneizar durante 10.0 seg en el caso de la licuadora a velocidad mnima, 30.0 seg en el Stomacher a una velocidad normal. Esta es la dilucin primaria. 3. De la suspensin o solucin anterior, tomar 1.0 mL y transferirlo a un tubo de ensayo que contenga 9.0 mL de solucin amortiguadora de fosfatos de pH 7.2, agitar y repetir esta operacin tantas veces como diluciones sean necesarias. Se debe utilizar una pipeta estril para cada dilucin. NOTA Los microorganismos filamentosos forman las colonias a partir de una espora o de un fragmento de hifa o de un cmulo de hifas. Debido a esto, el nmero de UFC/mL puede variar dependiendo de las condiciones de homogeneizacin de la muestra (a mayor tiempo de homogeneizacin mayor ser la ruptura de las hifas y por lo tanto se aumentaran las UFC / mL), por lo que se debe poner especial cuidado en esta etapa. Los tiempos de homogeneizacin citados en esta metodologa son los recomendados en la Norma Oficial Mexicana para este grupo microbiano. 4. Colocar por duplicado en cajas Petri estriles, 1.0 mL de cada una de las diluciones de la muestra, utilizando una pipeta estril. 5. Fundir el medio contenido en los tubos de 22 x 175 mm con 20.0 mL de agar papa dextrosa y/o de agar extracto de malta estriles. Enfriarlos y mantenerlos a 45C. 6. Para lograr acidificar los medios a un pH de 3.5, adicionar por cada 100.0 mL de agar, 1.4 mL de cido tartrico al 10% esterilizado por filtracin en membrana, o bien esterilizar la solucin a 121C 1C durante 15 minutos. Esto significa que a cada tubo conteniendo 20.0 mL del medio fundido y mantenido a 45C se le deber adicionar 0.3 mL del cido, o colocarlas en la caja de Petri teniendo precaucin de que no toque la muestra antes de agregar el medio de cultivo. 7. La norma recomienda que despus de la acidificacin, se utilice un tubo de medio acidificado como testigo y medir el pH para corroborar que se encuentre a 3.5 utilizando un potencimetro. 8. En cada caja de Petri con inculo, verter de 15.0 a 20.0 mL de agar papa dextrosa acidificado y/o agar extracto de malta acidificado, fundidos y mantenidos a 45 C. El tiempo transcurrido entre la preparacin de las diluciones y el momento en que es vertido el medio de cultivo no debe de exceder de 20.0 min. 9. Mezclar cuidadosamente el medio con seis movimientos de derecha a izquierda, seis en el sentido de las manecillas del reloj, seis en sentido contrario y seis de atrs hacia adelante, sobre una superficie lisa, teniendo cuidado de no humedecer con el medio la tapa de la caja de Petri. Permitir que la mezcla en las cajas Petri solidifique, dejndolas reposar sobre una superficie horizontal fra.

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10. Verificar la esterilidad de los medios acidificados para lo cual se verter en una caja de Petri sin inculo, de 15.0 a 20.0 mL del agar papa dextrosa acidificada y/o agar extracto de malta acidificado. Despus de la incubacin estas cajas no debern presentar desarrollo de colonias. 11. Invertir las cajas y colocarlas en la incubadora a 25 1 C. 12. Contar las colonias de cada placa despus de 3, 4 y 5 das de incubacin. Despus de 5 das, seleccionar aquellas placas que contengan entre 10 y 150 colonias. Si alguna de las cajas muestra crecimiento extendido de mohos o si es difcil contar colonias bien aisladas, considerar la cuantificacin de 4 das de incubacin o incluso las de 3 das. En este caso, se informa el perodo de incubacin en los resultados de los anlisis. NOTA Los microorganismos filamentosos forman las colonias a partir de una espora o de un fragmento de hifa o de un cmulo de hifas. Debido a esto, el nmero de UFC/mL puede variar al revisar las cajas y retirar las mismas en los tiempos recomendados de incubacin. (un manejo brusco de las cajas al retirar de la incubadora ocasionar la ruptura de las hifas y por lo tanto se aumentaran las UFC / mL), por lo que se debe poner especial cuidado en esta etapa. 13. Realizar una tincin hmeda para mohos con colorante de lactofenol azul de algodn, para un examen microscpico y una posible identificacin de los mohos que se hayan desarrollado. 14. Realizar una tincin de Gram para la observacin microscpica de las levaduras obtenidas. 15. Contar las colonias de cada placa representativa, despus de 3, 4 y 5 das de incubacin (a 26 1C o a temperatura ambiente). 16. Considerar las cuentas de placas con 10 a 150 colonias como las adecuadas para el informe. Multiplicar por el inverso de la dilucin. 17. Informar las unidades formadoras de colonias por gramo o mililitro (UFC/g o mL) de mohos y levaduras (cada uno en forma independiente), incubadas a 25 1 C durante 5 das. 18. Describir las caractersticas macroscpicas y microscpicas observadas, de los mohos y/o levaduras desarrollados a partir de la muestra analizada. 19. Si alguna parte de la caja muestra crecimiento extendido de hongos, o si es difcil contar las colonias, considerar el desarrollo de estos microorganismos a los 4 das de incubacin y an a los 3 das. En este caso se debe informar el periodo de incubacin de 3 4 das, en los resultados del anlisis.

CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS Para elaborar un informe de resultados se sugiere seguir las indicaciones que a continuacin se expresan:

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ANLISIS CUANTITATIVO Para hacer un reporte de la parte cuantitativa de este anlisis, se deben seleccionar las placas que contengan entre 10 y 150 colonias (representatividad estadstica). Posteriormente, contar las colonias presentes y calcular el nmero de hongos y levaduras por separado. De esta manera se puede calcular las unidades formadoras de colonias por gramo o por mililitro dependiendo del estado fsico de la muestra analizada. Esto se logra multiplicando el nmero de UFC encontradas en una caja representativa, por el inverso de la dilucin correspondiente a esa caja. En el caso de las placas que contienen menos de 10 colonias (UFC) de hongos y/o levaduras, se debe reportar el nmero obtenido de UFC indicando la dilucin correspondiente. En el caso de no encontrar colonias caractersticas de hongos y/o levaduras, el resultado a reportar es: menos de 10 UFC/g bien menos de 10 UFC/mL (Sensibilidad del Mtodo) Para cualquiera de los casos citados se deber reportar el tiempo de incubacin en el que se realiz la cuantificacin. Para cualquiera de los casos citados se deber reportar por separado el resultado de la cuantificacin de hongos y de levaduras. ANLISIS CUALITATIVO Reportar las observaciones macroscpicas y microscpicas de los diferentes tipos de colonias de mohos y levaduras obtenidas durante el anlisis. Si es posible reportar el o los gneros probables.

BIBLIOGRAFA. Norma Oficial Mexicana. NOM-111-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos. Frazier W. & Westhoff D. (1994) Microbiologa de los Alimentos. 4. ed. Acribia, Espaa. 23-50. Beuchat L.R. & Cousin M.A. (2001) Yeasts and Molds. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 209-215. Pierson M. & Smoot L. (2001) Indicator Microorganisms and Microbiological Criteria. In: Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T. (Eds.) ASM Press. USA. 71-87.
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Hocking A. (2001) Toxigenic Aspergillus Species. In: Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T. (Eds.) ASM Press. USA. 451-465. Pitt J. (2001) Toxigenic Penicillium Species. In: Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. 2nd ed. Doyle M. Beuchat L. & Montville T. (Eds.) ASM Press. USA. 467480. Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. International Commission on Microbiological. Specifications Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall. 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL of Foods (2005)

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Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos.

OBJETIVOS Realizar adecuadamente la cuantificacin de Staphylococcus aureus en alimentos, mediante la tcnica descrita en la Norma Oficial Mexicana. Explicar el fundamento de todas las etapas del mtodo de deteccin de Staphylococcus aureus en alimentos.

GENERALIDADES Los estafilococos son cocos anaerobios facultativos, son Gram positivos y se presentan solos, en pares o racimos, no son mviles, ni esporulados; algunos biotipos son capaces de producir una toxina altamente termoestable, as por ejemplo, Staphylococcus aureus produce 5 toxinas, que pueden provocar severas intoxicaciones en el hombre. Su metabolismo es oxidativo/fermentativo, es catalasa-positivo y puede metabolizar una gran variedad de carbohidratos en condiciones aerbicas, con la subsecuente liberacin de cido, principalmente cido actico con pequeas cantidades de bixido de carbono; en condiciones anaerobias, el producto principal de la fermentacin es el cido lctico. Las tres condiciones necesarias para su ptimo desarrollo son: pH cercano a la neutralidad, temperatura alrededor de 30C y ausencia de microorganismos competitivos. Este ltimo punto es importante, ya que Staphylococcus aureus no es competitivo en presencia de otros microorganismos. Staphylococcus se puede encontrar en a) medio ambiente como puede ser: aire, polvo, superficies en donde se manejan alimentos, agua, agua residual, b) en alimentos: por ejemplo los que presentan un alto contenido proteico, como puede ser la leche y derivados lcteos, tambin se desarrolla en aquellos alimentos que presentan altas concentraciones de sal, uno de ellos sera el jamn; otro factor importante en los alimentos es el pH, as tenemos en el caso de la mayonesa, sta tiene un pH lo suficientemente bajo para inhibir el desarrollo de S. aureus, sin embargo, al diluirse y neutralizarse en una ensalada por ejemplo, el pH asciende lo suficiente como para permitir el desarrollo de este microorganismo enterotoxignico y finalmente c) tambin se puede localizar en personas y animales. Estos ltimos, los animales y las personas son los principales reservorios de estos microorganismos. Con respecto a las condiciones ambientales, los alimentos son susceptibles a una contaminacin postproceso con tipos enterotoxignicos de Staphylococcus aureus, por ejemplo, si son sometidos a un inadecuado manejo o bien a temperaturas de

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conservacin inapropiadas; este problema se acenta por la ausencia de flora competitiva, que normalmente restringe el desarrollo de este microorganismo El crecimiento de Staphylococcus aureus en alimentos, tiene gran importancia por tratarse de un microorganismo capaz de producir una poderosa enterotoxina, que al ingerirse causa intoxicaciones severas al hombre. Como se mencion con anterioridad son 5 enterotoxinas: A, B, C, D y E, siendo la A la ms nociva La cantidad de Staphylococcus aureus necesaria para producir suficiente toxina (1.0 microgramo), para causar intoxicacin, es de 106 UFC/g de alimento, de acuerdo con la Norma Oficial Mexicana, sin embargo Jablonski et al, comentan que el FDA, establece que una cantidad de Staphylococcus aureus patgeno, en el que se encuentren 105 UFC/g de alimento, provoca intoxicaciones y que un nivel basal de aproximadamente un nanogramo de toxina estafilocccica por gramo de alimento, es suficiente para causar sntomas asociados con la intoxicacin antes mencionada. Tambin es importante observar, que en la mayora de los brotes de intoxicacin causados por este microorganismo, se han detectado niveles de uno a cinco microgramos de toxina ingerida, aunque en algunos casos las concentraciones de toxina han sido an ms bajas, del orden de 0.01 microgramo, suficientes para provocar una intoxicacin en el hombre. Los alimentos contaminados con esta cantidad de bacterias, no presentan ninguna diferencia perceptible en cuanto a su apariencia, sabor y olor, por lo que no se distinguen de los alimentos que no estn contaminados con este microorganismo, por esta razn el peligro de ingerir alimentos contaminados con Staphylococcus aureus sin darse cuenta es alto. Los alimentos sometidos a intensa manipulacin durante su preparacin y que se mantienen a temperaturas de riesgo (por encima de 7.2 C y por debajo de 60 C) despus de su preparacin, son los alimentos ms involucrados en la intoxicacin estafilocccica. Los alimentos perecederos tales como carnes crudas y procesadas, ensaladas, productos de pastelera, como pasteles rellenos con crema, pies de crema, coberturas de chocolate, leche y sus derivados, rellenos para sndwiches y papas, son los ms comnmente asociados con intoxicaciones estafilocccicas. En los humanos, las cepas de Staphylococcus habitan en forma especfica en el tracto nasofarngeo, cabello y piel del 50% o ms de los individuos, sin causar dao aparente (portadores asintomticos), pudiendo transferirse de los dedos y manos a los alimentos y desarrollarse con rapidez en ellos. La especie aureus, es la considerada patgena dentro del gnero Staphylococcus y est comnmente asociado a casos de artritis, osteomielitis, meningitis, neumona y en algunos casos puede llegar a ocasionar prdida del conocimiento. Las cepas de este microorganismo que producen enzimas extracelulares y toxinas, son las ms importantes por ser causante de intoxicaciones alimentarias.

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El establecimiento de los sntomas de la intoxicacin, por lo general se presentan rpidamente y en muchos casos de forma aguda, aunque depende de: la susceptibilidad de la persona hacia la toxina, la cantidad consumida del alimento contaminado, la cantidad de toxina en el mismo y en general la salud del individuo. Los sntomas ms comunes de intoxicacin consisten en nusea, vmito, dolor o espasmos abdominales y postracin. Sin embargo, existen algunos individuos que pueden no manifestar todos estos sntomas asociados a la enfermedad. En casos ms severos, se puede presentar dolor de cabeza, calambres musculares as como cambios intermitentes en la presin sangunea y pulso. La recuperacin parcial se alcanza a los 2 das, sin embargo la recuperacin completa puede durar ms das en casos muy severos. El trmino Staphylococcus coagulasa-positivo se utiliza para describir aquellas cepas que secretan una enzima que provoca coagulacin del fibringeno sanguneo, utilizando el microorganismo esta capacidad contra la fagocitosis y otros mecanismos de defensa del husped. Esta reaccin se utiliza in vitro para la identificacin de cepas de Staphylococcus productoras de toxinas, mediante el uso de plasma. Algunas razones para determinar Staphylococcus aureus son: Confirmar la presencia de este microorganismo como agente causal de intoxicaciones. Determinar si un alimento o ingrediente de los mismos, es fuente potencial de este microorganismo enterotoxignico. Demostrar la contaminacin postproceso, la cual es usualmente debida a contacto humano o con superficies inadecuadamente sanitizadas.

FUNDAMENTO La presente tcnica para la deteccin de Staphylococcus aureus, consiste en los siguientes pasos: 1. Aislamiento selectivo, se utiliza un medio selectivo slido, el cual inhibe el desarrollo de gneros diferentes al Staphylococcus, pero adems permite reconocer el desarrollo caracterstico del microorganismo buscado. 2. Recuperacin de la cepa, este paso permite restaurar las clulas daadas de Staphylococcus aureus. 3. Identificacin bioqumica, en este punto se identifica el gnero y especie de Staphylococcus aureus enterotoxignico.

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Estas pruebas bioqumicas (de acuerdo a la Norma Oficial) son: presencia de la enzima coagulasa y presencia de la enzima termonucleasa. La caracterizacin bioqumica de Staphylococcus aureus toxignico en estas pruebas es la siguiente: Presencia de coagulasa positiva Presencia de termonucleasa positiva La determinacin del Staphylococcus aureus mediante extensin del inculo en superficie, es adecuado para el anlisis de alimentos en los que se espere encontrar ms de 100 clulas de Staphylococcus aureus/g 10 clulas de Staphylococcus aureus/ mL de alimento. El aspecto cuantitativo en la investigacin de Staphylococcus aureus es de suma importancia, no slo desde el punto de vista econmico, sino en el de salud pblica; la Norma establece un lmite mximo de 106 UFC/g de alimento para que ste pueda ser consumido. Desde este punto de vista y de acuerdo con la tcnica mencionada, la sensibilidad mnima de deteccin en el recuento en placa, utilizando el mtodo de extensin de superficie es de: 100 UFC/g de alimento para muestras slidas 10 UFC/mL para alimentos lquidos.

NOTA La sensibilidad se podr aumentar a 10 UFC/g 1 UFC/mL, solamente si se coloca 1.0 mL de la primer dilucin del alimento, distribuido en tres placas de agar Baird Parker, esto representa una cantidad aproximada de inculo de 0.33 mL por caja.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES 4 cajas de Petri con 20.0 mL de agar Baird Parker a. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo infusin cerebro corazn (BHI) b. 1 caja de Petri con 20.0 mL de agar DNA c. 7 tubos de 13 x 100 mm con 3.0 mL cada uno de caldo manitol c. (opcional) 1 matraz Erlenmeyer de 250 mL de capacidad conteniendo 90.0 mL de agua peptonada al 0.1% o una solucin amortiguadora de fosfatos 0.1 M de pH 7.2 a. 3 tubos 16 x 150 mm conteniendo 9.0 mL de agua peptonada al 0.1% o una solucin amortiguadora de fosfatos 0.1 M de pH 7.2 a.

SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES Colorantes para Tincin de Gram b Parafina o aceite mineral estrilc. (slo si se siembra en caldo manitol) Colorante azul de orto-toluidina 0.1M, (solamente que el medio de cultivo no contenga este indicador) d.

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HCl 1N, en caso de no contar con la orto toluidina d.

BIOLGICOS Plasma de conejo c.

MATERIAL Y EQUIPO Pipetas graduadas estriles de 1 mL con tapn de algodn a, c. (se debe utilizar una pipeta para cada dilucin) Pipetas Pasteur estriles a, b. c. d. Pipetas graduadas estriles de 10 mL con tapn de algodn . a. (en caso que la muestra sea lquida. Propipeta. a, b, c, d Varillas de vidrio de 3.5 mm de dimetro aproximadamente y 20 cm. de largo, dobladas en ngulo recto (forma de L), estriles (se debe utilizar una por dilucin). a Utensilios estriles para manipular las muestras: cuchillos, cucharas, pinzas, tijeras, esptulas y separador de huevo. a Vaso de licuadora estril o Bolsa para Stomacher a. Motor para licuadora o Stomacher a. Asa bacteriolgicab. Portaobjetosb. Microscopio ptico b. Balanza granataria a. Horno para esterilizar material de vidrio. Autoclave Bao de agua a ebullicind Incubadora a 35 2Cd

NOTAS
a b

Material necesario al inicio de la prctica. Material necesario a las 48 h de iniciada la prctica. c Material necesario a las 72 h de iniciada la prctica. d Material necesario a las 96 h de iniciada la prctica.

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DETERMINACIN DE Staphylococcus aureus EN ALIMENTOS

Homogenizar con 90.0 mL de diluyente Realizar diluciones decimales empleando tubos con 9.0 mL de solucin diluyente

1.0 mL

1.0 mL

1.0 mL

Pesar 10.0 g de muestra en condiciones de asepsia

0.1 mL

10-1

10-2

10-3

10-4

10-2

10-3

10-4

10-5

Depositar por duplicado 0.1 mL de cada dilucin en cajas petri con agar Baird Parker.

Incubar 24 - 48 h a 37C

Distribuir la muestra con una varilla de vidrio estril

Contar aquellas colonias negras con hidrlisis de lecitina

Coagulasa Incubar 24 h 37C

Fermentacin del manitol

Plasma ms desarrollo en BHI

DNAsa termoestable

Realizar pruebas bioqumicas a cada tubo 77

Siembra de colonias tpicas en tubos con caldo BHI. Consultar

Cuadro 1

PROCEDIMIENTO 1. Aislamiento selectivo. 1. Pesar 10.0 g de muestra en una caja de Petri estril. 2. Transferir la muestra pesada a una bolsa de Stomacher o vaso de licuadora estril. 3. Adicionar 90.0 mL de agua peptonada estril al 0.1% o solucin amortiguadora de fosfatos 0.1M de pH 7.2. 4. Homogeneizar 30 segundos en Stomacher a velocidad media o 10 segundos en licuadora a velocidad mnima. 5. Realizar diluciones decimales hasta 10-4 (el nmero de diluciones est en funcin de la procedencia de la muestra) en tubos de 16 x 150 mm conteniendo cada tubo 9.0 mL del mismo diluyente. 6. Transferir 0.1 mL de las diluciones 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4 a cajas de Petri con agar Baird Parker. 7. Extender el volumen inoculado a cada una de las cajas de Petri con una varilla de vidrio estril, en forma de L, iniciando a partir de la mayor dilucin (Mtodo de inoculacin por extensin en superficie). 8. Mantener las placas en su posicin hasta que el inculo sea absorbido por el agar, entre 5 y 10 minutos aproximadamente. 9. Invertir las placas e incubar a 35 1 C. durante 45 a 48 h. 10. Despus de incubar, observar las colonias caractersticas de este microorganismo en el agar Baird Parker (BP). stas se presentan como: colonias negras, circulares, brillantes, convexas, lisas con dimetro de 1 a 2 mm, muestran una zona circular opaca y un halo claro alrededor de la colonia. 2. Recuperacin de la cepa. 1. Seleccionar las placas que contengan entre 15 y 150 colonias tpicas de S. aureus, si no es posible, seleccionar las placas que contienen concentraciones de la muestra ms diluidas, no obstante que contengan ms de 150 colonias. 2. Cuando las placas contengan menos de 15 colonias tpicas, tambin pueden ser utilizadas y al reportar se deber agregar la nota de valor estimado. 3. Con ayuda del cuadro 1, determinar el nmero de colonias a evaluar, tomando en cuenta el nmero de colonias tpicas de S. aureus obtenidas en el agar BairdParker: As mismo seleccionar las colonias para realizar las pruebas cuantitativas y cualitativas; dentro de estas ltimas estn comprendidas la coagulasa y la termonucleasa. 4. Reinocular cada una de las colonias aisladas y seleccionadas, que son caractersticas de este microorganismo, utilizando asa bacteriolgica recta estril, en caldo infusin cerebro corazn. 5. Incubar a 35 1 C durante 24 h. 6. Inocular e incubar en la misma forma, cepas tipo de S. aureus ATCC 6538 y S. epidermidis ATCC 12228, como controles positivo y negativo respectivamente de las pruebas bioqumicas.

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CUADRO 1. Nmero de colonias a evaluar de S. aureus. Cuenta total de colonias sospechosas Colonias sospechosas a caracterizar en una caja representativa bioqumicamente Menos de 50 UFC 3 51-100 UFC 5 101-150 UFC 7

3. Pruebas bioqumicas. 1. Realizar la confirmacin bioqumica del microorganismo, haciendo las pruebas de presencia de las enzimas: coagulasa y termonucleasa. 3.1 Prueba de la presencia de la enzima coagulasa. 1. Con una pipeta estril de 1 mL, tomar 0.2 mL de la suspensin del microorganismo que desarroll en el caldo infusin cerebro corazn, adicionar 0.2 mL de plasma de conejo. Dicho plasma previamente diluido volumen a volumen con solucin salina estril. 2. Incubar en bao Mara o en incubadora, entre 35 y 37 C y observar durante 6 h. en intervalos de 1 hora; en caso de no presentarse formacin de cogulo, prolongar el perodo de observacin hasta por 24 h. 3. Para comprobar la coagulabilidad del plasma de conejo, tomar 0.5 mL de plasma reconstituido y depositarlo en un tubo de 13 X 100 mm, posteriormente aadir una gota de cloruro de calcio al 5%; se debe formar un cogulo entre 10 a 15 segundos. NOTA Analizar la consistencia del cogulo y registrar sta, de acuerdo con los valores del cuadro 2. Considerar la prueba positiva solamente si hay formacin de cogulo con un valor igual o superior a 2 cruces. CUADRO 2. Interpretacin de las reacciones en la prueba de la coagulasa VALOR CARACTERSTICA negativa No se observa formacin de cogulo. Formacin de cogulos pequeos 1+ (positiva) desorganizados. 2+ (positiva) Formacin de cogulo pequeo organizado 3+ (positiva) Formacin de un gran cogulo organizado Todo el contenido del tubo est coagulado. 4+ (positiva) Al invertir el tubo este cogulo se mantiene en el fondo del mismo.

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3.2 Prueba de la enzima termonucleasa. 1. Calentar 0.3 mL de la suspensin del microorganismo que creci en caldo infusin cerebro corazn durante 15 minutos en bao de agua hirviendo. 2. Hacer orificios circulares en el agar DNA y colocar una gota de la suspensin bacteriana, del punto anterior, con ayuda de una pipeta Pasteur estril. Es recomendable incluir testigos tanto positivos (S. aureus ATCC 6538), como negativos (S. epidermidis ATCC 12228). 3. Incubar a 35 2 C en cmara hmeda, durante 4 a 24 h. 4. Despus de incubar, adicionar el colorante azul de orto-toluidina 0.1M a los orificios hechos en el agar DNA. (Existe un agar DNA que ya contiene el indicador de ortotoluidina). 5. La formacin de un color rosa brillante extendido por lo menos un milmetro alrededor del orificio, en donde se inocul, indicar que el microorganismo posee la enzima termonucleasa. 6. En el caso de no contar con orto toluidina, se puede utilizar HCl 1.0N como indicador. De encontrarse esta enzima, se observa un halo transparente alrededor de la colonia, seguido de un precipitado blanco.

NOTA Si se utiliza el medio de cultivo comercial, generalmente ya tiene el indicador de orto toluidina, por lo que despus de la incubacin se podr observar la coloracin rosa en donde se inocul, en caso de encontrarse dicha enzima. Opcionalmente se pueden realizar otras dos pruebas bioqumicas: la fermentacin de manitol en anaerobiosis y la prueba para detectar la presencia de la enzima catalasa; cuando ambas pruebas son positivas, quiere decir que el microorganismo fermenta el manitol y produce cido en condiciones anaerbicas y adems contiene la enzima catalasa. 3.3 Prueba de fermentacin de manitol en anaerobiosis (opcional, no lo exige la norma). 1. Inocular 2 asadas en caldo manitol, de la suspensin del microorganismo que desarrollado en el medio infusin cerebro corazn. 2. Adicionar a cada tubo de caldo manitol que ha sido inoculado, entre 0.3 y 0.5 mL de parafina o aceite mineral estril. 3. Incubar a 35C 2 C por 24 h. y observar los resultados. 4. Considerar la prueba como positiva, si se presenta desarrollo y vira el indicador. Si el medio contiene como indicador el rojo de fenol, el medio debe virar a color amarillo por la produccin de acidez.

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3.4 Prueba de la catalasa (opcional, no lo exige la norma). 1. Con una asa bacteriolgica, tomar un inculo del caldo infusin cerebro corazn despus de su incubacin, y colocarlo sobre un portaobjetos, 2. Adicionar una o dos gotas de perxido de hidrgeno al 30%, mezclar perfectamente bien y observar los resultados. 3. Si se presenta formacin de burbujas, se considera positiva la prueba, esto es que s contiene la enzima catalasa. En caso de no formarse burbujas la prueba se interpretar como ausencia de esta enzima.

CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS Para determinar el nmero de S. aureus enterotoxignico presentes en 1.0 g de alimento se deben de considerar: a) el nmero total de colonias sospechosas y caracterizadas en el agar Baird Parker y b) el nmero de colonias que resultaron positivas en las pruebas bioqumicas efectuadas.

Ejemplo: Al analizar una torta de quesillo de acuerdo con esta metodologa, se encontr que la caja Petri representativa estadsticamente, contena 70 UFC sospechosas de S. aureus (negras, brillantes con halo y precipitado blanco). stas se localizaban en la caja Petri sembrada con la dilucin 10-3 (0.001g/mL), como en este mtodo se inoculan 0.1 mL el factor que hay que aplicar es 10-4 (0.0001g) para este caso. Tomando en cuenta el cuadro nmero uno, se tomaron 5 colonias para caracterizarlas bioqumicamente. De estas 5 colonias analizadas, solamente 2 resultaron positivas para las pruebas de la enzima coagulasa y de la enzima termonucleasa. Para conocer Cuntas UFC/g de S. auresus toxignico, se encuentran en este alimento? y se puede consumir el alimento?, el razonamiento es el siguiente: a) determinar el porcentaje de colonias de S. aureus toxignico. Cinco colonias representan el 100% de UFC muestreadas, dos colonias positivas, a qu porcentaje corresponden?, expresado en forma aritmtica es: 5 UFC 2 UFC X= 40% El total de colonias sospechosas es 70 X 104 UFC/g puesto que se encontraron 70 UFC en la caja sembrada con 0.1 mL de dilucin 10-3: 70 UFC X 0.0001 g (10-4g) 1g X= 700,000 UFC/g de alimento.
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100% X

De las 700,000 UFC/g de alimento, solamente el 40% son toxignicas (tomando en cuenta el primer clculo) entonces cuntas UFC toxignicas por gramo se encuentran en este alimento? 700,000 UFC/g X X=280,000 UFC/g 100% 40%

Tomando en cuenta solamente 2 dgitos y potencias de 10, la forma correcta de expresar el resultado es: Staphylococcus aureus enterotoxignico= 28X104 UFC/g Estas 280,000 UFC/g de alimento (28X104UFC/g), de acuerdo con lo que estupula la Norma Oficial Mexicana, el alimento se encuentra escasamente dentro de las especificaciones, sin embargo en la legislacin estadounidense de acuerdo con lo que estipula la FDA (Jablonski, 2001) presentan riesgo para la salud pblica; por lo que no se debe consumir.

NOTA No olvidar que la metodologa empleada es por extensin en superficie y que solamente nmeros de unidades formadoras de colonias de S. aureus toxignico superiores a 1x105 son potencialmente riesgosas y pueden causar intoxicacin alimentaria. Sin embargo deben consultarse las especificaciones sanitarias concretas del alimento estudiado, para determinar la aceptabilidad o rechazo del alimento en funcin del nmero de UFC/g de alimento del microorganismo estudiado. No obstante debe hacerse notar que no existen especificaciones para todos los alimentos en forma especfica, pero se deben desarrollar criterios a partir de las normas vigentes para otros alimentos similares que permitan aceptar o rechazar un alimento. Para elaborar un informe de resultados, se sugiere seguir las indicaciones que a continuacin se expresan: Cuando las UFC encontradas en una caja Petri, estn dentro del rango estadstico (de 15 a 150 UFC/caja), se reporta como en el ejemplo antes descrito. Si se est en el valor estimado, esto es que no existen colonias tpicas, se debe reportar la sensibilidad del mtodo, en este caso ser de 100 UFC/g para muestras slidas y 10 UFC/mL en caso de muestras lquidas. Cuando todas las pruebas bioqumicas son negativas, se informar: < 10 UFC/mL en muestras lquidas de la dilucin 1:10 < 100 UFC/g para muestras slidas de la dilucin 1:10

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BIBLIOGRAFA. Jablonskin L.M. & Bohach G:A. 2001. Staphylococcus aureus In:Doyle M. Beuchat. L:R. & Montville T:J. (Eds.) Food Microbiology Fundamentals & Frontiers. ASM. USA: 411-434. NOM-115-SSA1-1994. Bienes y servicios. Mtodo para la determinacin de Staphylococcus aureus en alimentos. Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. Lancette G.A. & Bennett W. (2001) Staphylococcus aureus, and Staphylococcal Enterotoxins. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 387-403.

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of

Foods

(2005)

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Mtodo para la determinacin de Salmonella spp. en alimentos.

OBJETIVOS Aplicar adecuadamente la tcnica descrita en la Norma Oficial Mexicana para la deteccin del gnero Salmonella. Explicar el fundamento de todas las etapas del mtodo de deteccin de Salmonella en alimentos.

GENERALIDADES Al inicio del siglo XIX, patlogos clnicos en Francia documentaron la asociacin de la ulceracin intestinal humana con un agente contagioso; la enfermedad fue denominada como fiebre tifoidea y posteriormente investigadores Europeos aislaron y caracterizaron al bacilo tifoideo responsable de sta, mientras que en los Estados Unidos, Salmon y Smith en 1885, aislaron de carne de puerco a Bacillus cholerae-suis, ahora conocido como Salmonella enterica serovar Cholaraesius. Salmonella spp. es un bacilo Gram-negativo anaerobio facultativo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae. Aunque los miembros de este gnero son capaces de moverse por medio de flagelos pertricos, existen variantes no mviles, S. enterica serovar Pullorum y S. enterica serovar Gallinarum, as como cepas no mviles debido a la presencia de flagelos disfuncionales. Las especies de Salmonella son quimioorgantrofas, con habilidad para metabolizar nutrientes por las vas fermentativa y respiratoria. Las bacterias crecen ptimamente a 37C y pueden catabolizar la Dglucosa y otros carbohidratos con produccin de cido y gas. Estos microorganismos son oxidasa negativos y catalasa negativos, crecen en citrato como nica fuente de carbono, generalmente producen cido sulfhdrico, descarboxilan la lisina y ornitina, y no hidrolizan la urea. La mayora de estas caractersticas se utilizan para la identificacin bioqumica de cepas aisladas de Salmonella. De acuerdo con la definicin contempornea, una cepa de Salmonella tpica produce cido y gas a partir de la glucosa en el agar hierro tres azcares, pero no es capaz de utilizar lactosa y sacarosa en ste medio, o en medios slidos selectivos tales como verde brillante, xilosa lisina desoxicolato y/o entrico de Hekten. Las especies tpicas de Salmonella producen en agar hierro lisina, una rpida reaccin alcalina por la descarboxilacin de la lisina y generan cadaverina. La variabilidad gentica observada en este microorganismo ha originado mutaciones, e intercambio intra e intergenrico de plsmidos lo cual ha reducido los biotipos tpicos de Salmonella. En muestras clnicas y de alimentos se han encontrado biotipos lac+ y/o sac+; biotipos que no descarboxilan la lisina, que incluso hidrolizan la urea, que producen indol y que crecen rpidamente en KCN. Esta situacin ha llevado a reevaluar el esquema de identificacin del gnero, e

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incluso a utilizar tecnologas moleculares para establecer loci genticos y/o productos nicos para el gnero Salmonella. La identificacin bioqumica de Salmonella se realiza generalmente junto con una confirmacin serolgica. Esta tcnica laboriosa implica la aglutinacin de los antgenos superficiales bacterianos con anticuerpos especficos para el gnero. Estos incluyen los lipopolisacridos (LPS) somticos (O) en la superficie externa de la membrana externa, los antgenos asociados con los flagelos pertricos (H) y el antgeno capsular (Vi), este ltimo presente solamente en Salmonella serovar Typhi, Paratyphi C y Dubln. La amplia distribucin de Salmonella spp. en el medio ambiente, aunada a las prcticas agrcolas utilizadas en la industria crnica, pesquera, de moluscos, lctea y el reciclaje de la materia prima como alimento para ganado, ha favorecido la continua permanencia de este patgeno humano en la cadena alimenticia. El sector avcola se sita como la principal fuente de Salmonella spp. y enmascara la importancia como vehculos de infeccin de las carnes de puerco, de res, de cordero, leche y sus derivados. Las frutas y verduras han ganado notoriedad en aos recientes como fuentes de salmonelosis humana. Esto se presenta como una consecuencia de diversos factores como: la fertilizacin de sembrados con lodos sin tratamiento o efluentes de drenajes potencialmente contaminados con Salmonella spp. resistente a antibiticos, la irrigacin de los campos y el lavado de frutas y verduras con aguas contaminadas, la manipulacin excesiva por los trabajadores, la exposicin a la contaminacin ambiental de especies y condimentos durante el secado y la resistencia del microorganismo a valores de pH bajos. El desarrollo incompleto del sistema inmune en recin nacidos e infantes, el abatimiento en la respuesta inmunolgica en individuos de la tercera edad, y la baja produccin de cidos gstricos en estos sectores de la poblacin facilita la colonizacin intestinal y distribucin sistmica del microorganismo. Se ha demostrado que la ingesta de solamente algunas clulas de Salmonella pueden ser infecciosas. La dosis infectiva en humanos flucta entre 1 a 10 clulas. La composicin qumica del alimento es otro factor determinante en la salmonelosis adems de la heterogeneidad inmunolgica en la poblacin humana y la virulencia de las cepas infectivas. Un denominador comn de los alimentos involucrados, es la presencia de un alto contenido de grasa en alimentos como el chocolate, el queso y la carne. Se ha sugerido que las clulas de Salmonella englobadas en las micelas lipdicas pueden resistir el efecto ltico de los cidos gstricos. Las infecciones por Salmonella en humanos pueden originar varias condiciones clnicas, incluyendo fiebre entrica (tifoidea), enterocolitis e infecciones sistmicas por microorganismos no tifoides. La fiebre entrica es una infeccin grave asociada con las cepas tifoidea y paratifoidea, las cuales estn particularmente bien adaptadas para invadir y sobrevivir en los tejidos del husped. Las manifestaciones clnicas de la fiebre entrica aparecen despus de un periodo de incubacin de 7 a 28 das y pueden incluir diarrea, fiebre prolongada con variaciones en la misma, dolor abdominal, dolor de
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cabeza, y debilitamiento. El diagnstico de la enfermedad radica en la deteccin del agente infectivo en etapas tempranas en la sangre o en heces al inicio de la sintomatologa clnica. El tratamiento incluye el uso de cloramfenicol, ampicilina, o trimetroprim con sulfametoxasol para eliminar la infeccin sistmica. En pases subdesarrollados como el nuestro, el uso indiscriminado de estos antibiticos ha originado la existencia de cepas resistentes que causan altas tasas de mortalidad cuando se presenta un brote de este tipo. La infeccin en humanos con Salmonella spp. no tifoide provoca enterocolitis, sta aparece de 8 a 72 h despus de tener contacto con el patgeno invasivo. La condicin clnica es auto limitante y la evacuacin de heces tpicas diarreicas no sanguinolentas y dolor abdominal se presentan a los 5 das. El tratamiento solo implica reemplazo de fluidos o electrolitos. El uso de antibiticos est contraindicado ya que prolonga la sobrevivencia y la excrecin intermitente del microorganismo. Este microorganismo se identific originalmente en hospitales y laboratorios clnicos y los mtodos empleados para su deteccin, se adaptaron posteriormente al anlisis de alimentos. Las modificaciones a los mtodos, consideraron dos aspectos principales, el primero es el debilitamiento o dao a las clulas bacterianas presentes, debido al proceso al que se somete el alimento (por ejemplo: tratamiento trmico, secado, etc.) y segundo, la variabilidad inherente a la naturaleza del producto bajo estudio. Para diferentes tipos de alimentos, existen distintos protocolos para el aislamiento de Salmonella, todos ellos son esencialmente similares en principio y emplean las etapas de preenriquecimiento, enriquecimiento selectivo, aislamiento en medios de cultivos selectivos y diferenciales, identificacin bioqumica y confirmacin serolgica de los microorganismos.

FUNDAMENTO La presente tcnica para la deteccin de Salmonella en alimentos, describe un esquema general que consiste de 5 pasos bsicos: Preenriquecimiento, es el paso en donde la muestra es enriquecida en un medio nutritivo no selectivo, que permite restaurar las clulas de Salmonella daadas, logrando de esta manera una condicin fisiolgica estable. Enriquecimiento selectivo, se logra a partir de un medio de cultivo que conjunte dos condiciones, por un lado debe incrementar las poblaciones de Salmonella y por otro inhibir otros microorganismos presentes en la muestra. Seleccin en medios slidos, este punto se deriva directamente del anterior y se utilizan medios selectivos, que restringen el crecimiento de otros gneros diferentes a Salmonella y que permitan el reconocimiento visual caracterstico de colonias sospechosas. Identificacin bioqumica, este paso permite la identificacin genrica de los cultivos de Salmonella y la eliminacin de cultivos sospechosos falsos.

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Serotipificacin, es una tcnica inmunolgica (antgeno-anticuerpo) que permite la identificacin especfica de un microorganismo.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES NOTA Los medios de cultivo que a continuacin se presentan son los utilizados en el procedimiento general. Para los medios de cultivo utilizados durante preenriquecimientos especficos consultar las modificaciones en el inciso 1.0. 1 matraz Erlenmeyer de 500 mL de capacidad, conteniendo 225.0 mL de caldo lactosado a. 1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 mL de caldo selenito-cistina b. 1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 mL de caldo tetrationatob. 1 tubo de ensayo de 16 x 150 mm conteniendo 10.0 mL de caldo VassiliadisRappaport b. 1 caja de Petri estril con 20.0 mL de agar xilosa lisina desoxicolato (XLD) c. 1 caja de Petri estril con 20.0 mL de agar bilis verde brillante (VB) c. 1 caja de Petri estril con 20.0 mL de agar entrico de Hekten (HE) c. 1 caja de Petri estril con 20.0 mL de agar sulfito de bismuto (SB) c. 1 caja de Petri estril con 20.0 mL de agar para Salmonella y Shigella (SS) c. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm conteniendo 3.0 mL de agar hierro-triple azcar (TSI) o agar hierro Kligler (KIA) solidificado e inclinado d. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de agar hierro-lisina (LIA) inclinado d . 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo urea o caldo Surraco e. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo urea rpido (puede utilizarse en sustitucin del caldo urea o Surraco) e. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de medio sulfuro-indol-manitol (SIM) e . 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de agar citrato de Simmons inclinado e . 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo manitol e. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo malonato e. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 3.0 mL de caldo rojo de metilo-Voges Proskauer (RM-VP) e. 2 tubos de ensayo de 13 x 100 mm con 5.0 mL de caldo soya tripticasena e. 2 cajas de Petri con 20.0 mL de agar infusin cerebro corazn e.

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SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES 1 frasco gotero con solucin salina isotnica estril d. 1 frasco gotero con solucin de verde brillante al 0.1% b 1 frasco gotero con solucin yodo yoduro de potasio b 1 frasco gotero con solucin salina formalizada e. 1 frasco gotero con reactivo de Kovacs f. 1 frasco gotero con solucin de rojo de metilo r. 1 frasco gotero con solucin reactivo de Voges-Proskauer N 1 (VP1; solucin etanlica de alfa-naftol al 5% P/V) f. 1 frasco gotero con solucin reactivo de Voges-Proskauer N 2 (VP2; hidrxido de potasio al 40% P/V) f. Juego de colorantes para la tincin de Gram d.

BIOLGICOS Suero anti Salmonella O (somtico) polivalente d. Suero anti Salmonella H (flagelar) polivalente d. Suero anti Salmonella Vi d.

MATERIAL Y EQUIPO Balanza granataria a. 1 caja de Petri de vidrio estril a. 1 bolsa de stomacher o un vaso de licuadora estril a. Utensilios necesarios para la manipulacin de muestras: cucharas, cuchillos, tenedores, estriles a. Stomacher o motor para licuadora a. Pipetas de vidrio de 1 mL, estriles con filtro de algodn b. Pipetas Pasteur estriles a, b, c, d, e, f Asa microbiolgica c, d, e. Mecheros de Bunsen a, b, c, d, e. Portaobjetos d. Pipetas Pasteur estriles con filtro de algodn d, e. Microscopio ptico d, e. Incubadora a 35C con termostato calibrado que evite variaciones mayores a 0.1C a, b, c, d, e . Incubadora a 42C que evite variaciones mayores a 0.1C b.

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a b c d e f

NOTAS Material necesario al inicio de la prctica. Material necesario a las 24 h. de iniciada la prctica. Material necesario a las 48 h. de iniciada la prctica. Material necesario a las 72 h. de iniciada la prctica. Material necesario a las 96 h. de iniciada la prctica. Material necesario a las 120 h. de iniciada la prctica.

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DETERMINACIN DE Salmonella spp. EN ALIMENTOS

Incubar 18- 24 h a 37C

Pesar 25 g de muestra en condiciones de asepsia

Homogeneizar con 225 mL de solucin diluyente segn el tipo de muestra

Siembra con asa bacteriolgica en caldo tetrationato o Vassiliadis y Caldo Selenito cistina

Incubar 18- 24 h a 37C

Incubar 18- 24 h a 37C

Aislamiento en medios selectivos y diferenciales (XLD, SS. Hecktoen, VB, Sulfito bismuto)

Incubar 18- 24 h a 37C

Bsqueda de colonias tpicas. Consultar cuadro 1

Resultados caractersticos Realizar bioqumicas presuntivas Kligler y LIA

Confirmacin serolgica

Resultados positivos para Salmonella

Incubar 18- 24 h a 37C Siembra de bioqumicas complementarias: malonato citrato, RM-VP, urea, SIM, manitol

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PROCEDIMIENTO El siguiente mtodo se basa en el anlisis de 25.0 g de la muestra, que se considera como una unidad analtica, en una proporcin de 1:9 de muestra/caldo. Esta cantidad puede variarse siempre que se mantenga la misma proporcin de 1:9 en el medio de preenriquecimiento. La mnima muestra recomendada es de 25.0 g, es decir, una unidad analtica. Para algunos casos donde el riesgo es mayor, se utilizan dos unidades analticas (50.0 g) o ms. 1. Preenriquecimiento. 1.1. Procedimiento general para la preparacin de muestras NOTA IMPORTANTE El presente procedimiento se basa en la tcnica general para la deteccin de Salmonella en alimentos. Sin embargo, deben consultarse los siguientes incisos para realizar las modificaciones pertinentes al preenriquecimiento dependiendo del alimento a analizar, los cuales se presentan en el complemento de la presente prctica. 1. Pesar en una bolsa de Stomacher estril, en rea asptica 25.0 g de muestra a analizar. 2. Verter 225.0 mL de caldo lactosado estril en la bolsa. 3. Homogeneizar la muestra con el diluyente durante 30.0 seg a velocidad media en el Stomacher. 4. Transferir aspticamente la mezcla homogeneizada a un recipiente estril de boca ancha con tapn de rosca y dejar reposar por 60.0 min. a temperatura ambiente con la tapa perfectamente cerrada. 5. Mezclar bien y determinar el pH de la muestra con papel pH. 6. Ajustar si es necesario, a un pH de 6.8 0.2 con NaOH 1N o HCl 1N estriles. 7. Mezclar y cerrar suavemente la tapa del matraz 8. Incubar la muestra homognea a 35 2 C durante 24 h. 2. Enriquecimiento selectivo. 1. Cerrar firmemente el tapn de rosca de los matraces con los cultivos de preenriquecimiento y agitar suavemente. 2. Transferir 1.0 mL del cultivo de preenriquecimiento (con una pipeta de vidrio de 1 mL, estril) a un tubo con 10.0 mL de cada uno de los siguientes medios de enriquecimiento: Caldo tetrationato (antes de su uso, deber activarse aadiendo al medio base 0.2 mL de solucin yodo-yoduro de potasio y 0.1 mL de solucin de verde brillante al 0.1 %)

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Caldo selenito cistina Caldo Vassiliadis-Rappaport (en sustitucin del caldo tetrationato) 3. Incubar los tubos inoculados en caldo selenito-cistina, caldo tetrationato y/o caldo Vassiliadis-Rappaport a 35 1 C durante 24 h. Para alimentos altamente contaminados debern incubarse los medios de enriquecimiento a 42C por el mismo periodo 3. Aislamiento diferencial. NOTA La metodologa descrita en esta seccin deber realizarse para cada uno de los caldos de enriquecimiento descritos en el inciso 2, es decir para los cultivos desarrollados en caldo selenito-cistina, caldo tetrationato y/o caldo Vassiliadis-Rappaport. 1. Homogeneizar el tubo con caldo de enriquecimiento ya incubado. 2. Tomar una muestra del cultivo anterior con asa microbiolgica estril y sembrar en estra por agotamiento en cuadrantes en cajas de Petri, en cada uno de los siguientes medios selectivos: a) Agar XLD b) Agar VB c) Agar HK d) Agar SB e) Agar SS f) Agar Mac Conkey 3. Incubar las cajas ya sembradas en posicin invertida a 35 2 C durante 24 2 h. 4. Observar las caractersticas macroscpicas de las colonias en los medios slidos selectivos. 5. Seleccionar al menos 2 colonias sospechosas de cada medio selectivo, de acuerdo con las caractersticas especficas de desarrollo en cada uno de los medios (Consultar el Cuadro 1). 6. Almacenar en refrigeracin de 5 a 8C, las placas con medios selectivos por si es necesario tomar ms colonias. 7. Realizar una tincin de Gram a las colonias sospechosas. 8. Registrar las caractersticas morfolgicas tanto macroscpicas como microscpicas; anotando la forma de la colonia, su color, color del medio circundante, morfologa al Gram, etc. 9. Realizar una purificacin de las colonias seleccionadas, sembrando nuevamente en estra por agotamiento en cuadrantes en cajas de Petri conteniendo un medio idntico del que se tom la colonia.

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4.

Pruebas bioqumicas preliminares

NOTA Se recomienda identificar seis cultivos por cada unidad analtica (25.0 g). Seleccionar colonias procedentes de ambos medios de enriquecimiento. 4.1. Agar triple azcar hierro o agar Kligler hierro 1. Registrar las caractersticas del medio TSI o KIA antes de la inoculacin (color del medio). 2. Por duplicado tomar suavemente una porcin del centro de la colonia con asa bacteriolgica recta y estril e inocular por picadura y estra en un tubo con agar triple azcar hierro (TSI) o agar de Kligler (KIA) inclinado. 3. Incubar el medio TSI o KIA a 35 2 C durante 24 h. 4. Consultar el Cuadro 2 para la interpretacin de los resultados. 4.2. Agar lisina hierro. 1. Hacer la misma operacin que se hizo para KIA o TSI (inciso 4.1.), tomando la asada de la misma colonia con la que se sembr en estos medios, pero sembrando ahora en el agar lisina hierro (LIA). 2. La interpretacin de resultados puede ser consultada en el Cuadro 2. 3. Retener todos los cultivos que muestren las reacciones caractersticas de Salmonella en los medios TSI (o KIA) y LIA para realizar las pruebas bioqumicas complementarias. 4. Los cultivos desarrollados en TSI o KIA que no parecen de Salmonella pero que presentan reacciones en LIA tpicos deben trabajarse como cultivos presuntivos positivos, ya que en estos casos, el medio LIA permitir detectar S. arizonae y cepas atpicas de Salmonella que utilicen lactosa o sacarosa. Descartar solamente los cultivos que muestre reacciones atpicas en ambos medios. 5. Pruebas bioqumicas complementarias 5.1. Caldo urea (convencional) 1. Con asa bacteriolgica recta estril, tomar del crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e inocular en el tubo con caldo urea o caldo Surraco. 2. Incubar a 35 2 C durante 24 2 h. 3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2). 4. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Conservar los cultivos que den la prueba negativa.

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5.2. Caldo urea (rpida) 1. Con asa bacteriolgica estril, tomar dos asadas de crecimiento del cultivo presumiblemente positivo de cada tubo de medio TSI/KIA o LIA e inocular tubos de caldo urea (rpida). 2. Incubar a 37 0.5 C durante 2 h en bao de agua. 3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2). 4. Descartar todos los cultivos que den ureasa positiva. Conservar los cultivos que den la prueba negativa. 5.3. Agar citrato de Simmons 1. Con asa bacteriolgica recta estril tomar crecimiento del tubo de TSI/KIA o LIA e inocular por estra en el tubo con agar citrato de Simmons. 2. Incubar a 35 2 C durante 96 2 h. 3. Interpretar los resultados (Consultar Cuadro 2). 5.4. Medio SIM (Sulfuro-indol-movilidad) 1. Con asa bacteriolgica recta estril tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e inocular por puncin vertical en el tubo con medio de SIM. 2. Incubar a 35 2 C durante 24 h. 3. Para verificar la produccin de indol, adicionar al tubo con medio SIM que presente crecimiento de 0.2 a 0.3 mL de reactivo de Kovacs. 4. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2). 5.5. Caldo RM-VP (Rojo de metilo-Voges Proskauer) 1. Con asa bacteriolgica recta estril tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e inocular el tubo con caldo RM-VP. 5.5.1. Prueba de Voges-Proskauer (VP) 1. Para la prueba de Voges-Proskauer incubar a 35 2 C durante 48 2 h. 2. Transferir a un tubo de 13 x 100 mm estril un mililitro de cultivo. 3. Adicionar a este cultivo, 0.6 mL de reactivo de VP1 (alfa-naftol etanlico al 5 %), agitar y agregar 0.2 mL del reactivo VP2 (hidrxido de potasio al 40%). 4. Adicionar algunos cristales de creatinina (opcional). 5. Agitar nuevamente y dejar reposar el tubo en forma inclinada, con el objeto que la reaccin se lleve a cabo en presencia de oxgeno. 6. Interpretar los resultados despus de 2 h. de incubacin a temperatura ambiente (Consultar Cuadro 2).

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5.5.2. Prueba de Rojo de Metilo 1. Para la prueba de rojo de metilo (RM) incubar a 35 2 C el resto del medio RMVP durante 48 h ms (96 h. de incubacin en total a partir de la inoculacin del medio RMVP). 2. Adicionar al medio de cultivo dos a tres gotas de solucin indicadora de rojo de metilo. 3. Agitar e interpretar los resultados en forma inmediata (Consultar Cuadro 2). 5.6. Caldo malonato (para confirmar la presencia de S. arizonae) 1. Con asa bacteriolgica recta estril, tomar crecimiento del medio TSI/KIA o LIA e inocularlo en el tubo que contiene caldo malonato. 2. Incubar a 35 2 C durante 40 2 h. 3. Interpretar los resultados despus de incubar (Consultar Cuadro 2). 5.7. Caldo manitol 1. Con asa bacteriolgica recta estril, tomar crecimiento del tubo TSI/KIA o LIA e inocular en el tubo que contiene caldo manitol. 2. Incubar a 35 2 C durante 24 2 h. 3. Interpretar resultados (Consultar Cuadro 2). NOTA Las pruebas bioqumicas se pueden interpretar en el Cuadro 2, sin embargo se sugiere que se consulten otras referencias, adems de las ya expresadas aqu, con el fin de determinar la especie del gnero en cuestin, esto quiere decir que no necesariamente se encuentre en el alimento analizado la Salmonella, pero s puede encontrarse otra Enterobacteria, el que es indispensable identificar. En este cuadro solamente se encuentran las pruebas bioqumicas ms generales de Salmonella. 6. Identificacin serolgica. 6.1. Investigacin de los antgenos somticos de Salmonella (suero anti Salmonella O polivalente). 1. Colocar con una asa bacteriolgica, dos gotas separadas de solucin salina estril (NaCl 0.85%) sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinacin. 2. Suspender en cada una de las gotas, una porcin del cultivo desarrollado en TSI/KIA o LIA.

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3. Agregar a una de ellas una gota del suero anti Salmonella O polivalente y mezclar con el canto del asa o empleando aplicadores de madera. 4. Agitar inclinando la lmina, hacer girar las gotas durante aproximadamente un minuto. 5. Observar bajo una buena iluminacin y sobre un fondo oscuro la reaccin. 6. Considerar cualquier grado de aglutinacin como positiva. 7. Consultar el Cuadro 3 para la interpretacin de los resultados.

NOTAS La suspensin del cultivo en la que no se adicion el suero anti Salmonella O polivalente se considerar como el control negativo para poder interpretar el resultado. Cuando la aglutinacin es positiva con el suero anti Salmonella O polivalente, puede determinarse el subgrupo empleando sueros inmunes para los diferentes subgrupos (los mas frecuentes son B, C, D y E). Si la aglutinacin con el suero anti Salmonella O polivalente es negativa, utilizar el suero anti Salmonella Vi polivalente y efectuar la prueba en las mismas condiciones ya descritas. Si hay aglutinacin con Vi calentar a ebullicin y repetir nuevamente la prueba con el suero anti Salmonella O polivalente. 6.2. Investigacin de los antgenos flagelares de Salmonella (suero anti Salmonella H polivalente) . 1. Para ensayo el antgeno flagelar en el mismo da , inocular el crecimiento del cultivo de TSI/KIA o LIA en agar infusin cerebro corazn (BHI). 2. Incubar a 35C durante 4 a 6 h. 3. Para ensayo del antgeno flagelar al da siguiente inocular una asada del cultivo desarrollado en el tubo de TSI o KIA, en un tubo de 13 x 100 mm conteniendo 5.0 mL de caldo soya tripticasena. 4. Incubar a 35 2 C durante 24 h. 5. Adicionar al cultivo (ya sea de agar infusin cerebro corazn o caldo soya tripticasena), 2.5 mL de solucin salina formalizada. 6. Colocar 0.5 mL del suero antiflagelar H polivalente en un tubo de ensayo para serologa (12 x 75 mm). 7. Adicionar 0.5 mL del cultivo formalizado (el obtenido en el punto 5 de este inciso). 8. Preparar un control de solucin salina mezclando 0.5 mL de solucin salina formalizada con 0.5 mL del antgeno formalizado. 9. Incubar las mezclas en bao de agua a una temperatura entre 48 y 50 C. 10. Observar en intervalos de 15 minutos por espacio de 1 hora. 11. Una prueba positiva es cuando se observa aglutinacin en la muestra de prueba pero no en el control.

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12. Debe interpretarse como negativa una prueba en la que ninguna de las mezclas muestre aglutinacin. 13. Cuando ambas mezclas se aglutinan, se considera la prueba inespecfica. 14. La interpretacin de los resultados se puede observar en el Cuadro 3.

CUADRO 1. Colonias tpicas de Salmonella spp. en medios slidos selectivos. MEDIO SELECTIVO Color antes de la Caractersticas inoculacin coloniales de Salmonella spp. Agar Verde Brillante Oscuro, color marrn Rosas o rojas pueden ser (VB) transparentes, rodeadas de medio enrojecido. Las bacterias fermentadoras de lactosa son amarillas Agar Sulfito Bismuto Opaco, verde plido Caf, grises o negras; con (SB) o sin brillo metlico. Algunas veces presencia de halo caf o negro. Agar Xilosa Lisina Claro, color rojo brillante Rosas o rojas pueden ser Desoxicolato (XLD) transparentes, con o sin centro negro. En algunos casos completamente negras Agar para Salmonella y Claro, color rosa Translcidas en ocasiones Shigella (SS) opacas. Algunas con centro negro. Las colonias fermentadoras de lactosa son rojas Agar entrico Hekten Oscuro, color verde Verdes o azul verdes con o sin centro negro. En algunos casos completamente negras

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CUADRO 2. Reacciones bioqumicas de Salmonella.

Medio Kligler: Fermentacin Glucosa Kligler: Fermentacin Lactosa Kligler: Produccin de H2S Agar LIA: Lisin descarboxilasa Agar LIA: H2S Agar LIA: Fermentacin Glucosa Caldo Surraco: Ureasa Caldo Surraco: Fermentacin sacarosa Medio SIM: Movilidad Resultado +
c a

Color antes de inocular/incubar Naranja

Color despus de inocular/incubar Fondo tubo amarillo Crecimiento Pico de flauta naranja. Crecimiento Ennegrecimiento Crecimiento Prpura intenso Crecimiento Ennegrecimiento Crecimiento Fondo tubo amarillo Crecimiento Rosa-violeta Crecimiento Amarillo Crecimiento Crecimiento en superficie y picadura, turbiedad/difusin fuera de picadura Con reactivo Kovacs: Formacin de anillo rojo en superficie Ennegrecimiento Crecimiento Con indicador rojo de metilo: Rojo Con reactivos VP1 y VP2: Anillo rojizo Azul Crecimiento Azul Amarillo Amarillo Desarrollo Amarillo

Naranja

+ + + +

Naranja Prpura tenue Prpura tenue Prpura tenue

Rosa mexicano Rosa

Amarillo tenue. Semislido, translcido Amarillo tenue. Semislido, translcido Amarillo tenue. Semislido, translcido Amarillo tenue, translcido Amarillo tenue, translcido Verde Verde Rojo Rojo Sin desarrollo Rojo

Medio SIM: Indol

Medio SIM: H2S Caldo RMVP: Prueba de rojo de metilo Caldo RMVP: Prueba Voges-Proskauer Agar Citrato Simmons Caldo malonato Caldo manitol rojo fenol Caldo dulcitol rojo fenol Caldo KCN Caldo manitol rojo fenol Observacin microscpica
a b

+ V
a+ c

+ +

Bacilos cortos Gram-negativos, no esporulados

+,90% o ms positivos en 1 2 das;- 90% o ms negativos en 1 2 das; v, variable. La mayora de los cultivos de S. arizonae son negativos. c La mayora de los cultivos de S. arizonae son positivos. d Excepto S. entrica serovar Pullorum y S. entrica serovar Gallinarum y cepas con flagelos disfuncionales
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CUADRO 3. Reacciones serolgicas de Salmonella. Reacciones bioqumicas Reacciones serolgicas Interpretacin Tpica Antgeno O, Vi o H Cepas consideradas como Salmonella Positivo Tpica Todas las reacciones positivas Puede ser Salmonella Tpica No probada Reacciones atpicas Antgeno O, Vi o H Positivo Reacciones atpicas Todas las reacciones No debe ser considerada Salmonella negativas

RESULTADOS 1. Interpretacin de resultados. Consultar los resultados obtenidos en los cuadros para la identificacin de los gneros y especies de las bacterias investigadas. 2. Informe de resultados. Reportar presencia o ausencia de Salmonella spp. o la especie identificada en 25.0 g o mL de alimento, o en la cantidad de muestra inicialmente pesada (mayor a 25.0 g o mL).

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COMPLEMENTO Preenriquecimientos especficos en diversos grupos de alimentos para la deteccin de Salmonella spp. (contina de inciso 1)
1.2. Preenriquecimiento para huevo en polvo, claras de huevo en polvo, huevos lquidos pasteurizados y congelados, frmulas infantiles y mezclas preparadas en polvo como harinas para hot cakes, galletas, donas, biquets y pan. Si el alimento est congelado, no descongelar sino hasta el momento del anlisis. Descongelar en un bao de agua a 45C agitando continuamente en un lapso de 15.0 min. aproximadamente, o bien se somete a una temperatura entre 2 y 5C durante 18.0 h. 1.2.1. Productos lquidos Realizar el preenriquecimiento como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.2.2. Productos en polvo 1. Pesar 25.0 g de muestra y transferirla a una porcin del caldo lactosado (aproximadamente 15.0 mL), para permitir la humectacin lenta del alimento. 2. Homogeneizar poco a poco con una varilla de vidrio estril y agregar ms caldo lactosado hasta completar 225.0 mL 3. Continuar igual que el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.3. Preenriquecimiento para productos no pasteurizados congelados de huevo 1. Descongelar la muestra como se indica en 1.2. 2. Pesar aspticamente y por duplicado 25.0 g de muestra. 3. Colocar una de las muestras en un matraz que contenga 225.0 mL de caldo selenito cistina 4. Colocar la segunda muestra en un matraz que contenga 225.0 mL de caldo tetrationato, sin verde brillante. 5. Ajustar si es necesario el pH a 6.8 0.2 con hidrxido de sodio 1N o cido clorhdrico 1N. 6. Al matraz que contiene el caldo tetrationato, adicionarle 2.25 mL de verde brillante al 0.1% y 4.5 mL de solucin yodo-yoduro. Mezclar bien. 7. Incubar a 35C durante 18 a 24 h, o en caso de tratarse de alimentos fuertemente contaminados incubar a 42C por el mismo periodo.

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1.4. Productos que contienen huevo en su formulacin: (pastas para sopa, rollos chinos, etc.); ensaladas preparadas (jamn, huevos, pollo, atn, pavo); frutas frescas, congeladas o secas; crustceos (camarones, cangrejos, jaibas, langostinos, langostas) y pescado 1. Preferentemente no descongelar la muestra antes de su anlisis, si esto es necesario, proceder igual que en el inciso 1.2. 2. Pesar 25.0 g de muestra y adicionar 225.0 mL de caldo lactosado estril. 3. Licuar el alimento durante 2.0 min. 4. Transferir la mezcla homogeneizada en el matraz que contena el medio de preenriquecimiento. 5. Continuar con la incubacin como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.5. Leche en polvo, entera, semidescremada o descremada. 1. Seguir el procedimiento general para el pesado de la muestra y adicionarla lentamente a un matraz Erlenmayer con 225.0 mL de solucin verde brillante al 0.1%, procurando que el polvo quede en la superficie del lquido y se hidrate suavemente. 2. Dejar la mezcla en reposo por 60 min. 3. Incubar como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.6. Queso 1. Preenriquecer como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.), utilizando solucin amortiguadora de peptona como medio de cultivo. 1.7. Casena 1. Seguir la metodologa sealada en el procedimiento general (inciso 1.1.). 2. Licuar durante 2 min. 3. Ajustar cuidadosamente el pH a 6.8 0.2 1.8. Coco 1. Proceder como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.), ajustar el pH a 6.8 0.2. 2. Adicionar hasta un mximo de 2.25 mL de tergitol aninico 7 estril (121 1C/15 min.) y mezclar bien. Tambin puede utilizarse tritn X-100 estril. Usar la cantidad necesaria de estos detergentes utilizando el volumen mnimo para que se inicie la formacin de espuma. Puede ser para el tritn X-100 de dos a tres gotas. 3. Incubar como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.)

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Levadura seca 1. Seguir el procedimiento general (inciso 1.1.), utilizando como medio de preenriquecimiento caldo soya tripticasena estril. 2. Mezclar para formar una suspensin homognea 3. Ajustar el pH a 6.8 0.2 4. Terminar el procedimiento como se indica en el inciso 1.1. 1.9.1. Levadura seca inactiva. 1. Continuar el enriquecimiento selectivo como se indica en el inciso 2 1.9.2. Levadura seca activa 1. Mezclar la muestra incubada (inciso 1.9.) 2. Transferir 1.0 mL a cada tubo de 10.0 mL de caldo tetrationato (con 0.2 mL de solucin yodo-yoduro de potasio y 0.1 mL de solucin de verde brillante al 0.1%) y 10.0 mL de caldo lauril-triptosa. 3. Incubar los medios de enriquecimiento a 35C por 24 h 2 h 1.10. Carnes, sustitutos de carnes, derivados crnicos, sustancias de origen animal, productos glandulares y harinas (pescado, carne y hueso) 1.10.1. Productos procesados trmicamente y productos secos. 1. 2. 3. 4. Seguir el procedimiento general (inciso 1.1.) hasta la homogeneizacin. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse. Despus de reposar, mezclar bien y ajustar el pH a 6.8 0.2. Para emulsionar las grasas, agregar los detergentes en las similares proporciones y con las mismas recomendaciones que para el coco (inciso 1.8.) La cantidad de los mismos depender en gran medida de la composicin del alimento. Los detergentes no sern necesarios en los productos glandulares en polvo. 5. Incubar las muestras como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.)

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1.10.2. Productos crudos o altamente contaminados. 1. Pesar porciones de 25.0 g de producto por duplicado en dos vasos para licuadora o en dos bolsas de Stomacher. 2. Si la muestra es en polvo o molida, el licuado puede omitirse y pesar directamente el producto en matraces Erlenmayer estriles de 500 mL. 3. Adicionar 225.0 mL de caldo selenito-cistina o 225.o mL de caldo tetrationato (sin verde brillante) a cada muestra pesada. 4. Licuar por dos min. y pasar aspticamente a matraces Erlenmayer de 500 mL. 5. Dejar reposar y ajustar el pH a 6.8 0.2 6. Adicionar al caldo tetrationato, 2.25 mL de solucin de verde brillante 0.1% y 4.5 mL de solucin yodo-yoduro de potasio 7. Mezclar el matraz con los reactivos aadidos. 8. Incubar como se describe en el procedimiento general (inciso 1.1.). 9. Continuar el enriquecimiento selectivo como se indica en el inciso 2. para muestras en general. 1.11. Dulces y dulces cubiertos (incluyendo chocolate) 1. Pesar aspticamente 25.0 g de muestra en un vaso de licuadora o bolsa de Stomacher, y agregar 225.0 mL de leche descremada reconstituida estril. 2. Licuar por dos min. 3. Continuar igual que en el procedimiento general (inciso 1.1.) hasta despus de ajustar el pH. 4. Adicionar 0.45 mL de la solucin de verde brillante al 0.1% y mezclar bien. 5. Incubar como se indica en el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.12. Especias 1.12.1. Pimienta negra, pimienta blanca, semilla de apio, comino, perejil seco, romero, tomillo, chile en polvo, pprika o pimentn, ajonjol, hojuelas de vegetales (vegetales secos) 1. Pesar aspticamente 25.0 g de muestra y verter en un matraz Erlenmeyer con tapn de rosca de 500 mL con 225.0 mL de caldo soya tripticasena estril y mezclar bien. 2. Continuar con el procedimiento como en el inciso 1.1.

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1.12.2. Ajo en polvo u hojuelas; cebolla en polvo u hojuelas 1. Pesar aspticamente 25.0 g de la muestra y verter en un recipiente de tapn de rosca de 500 mL con 225.o mL de caldo soya tripticasena estril adicionado con sulfito de potasio y mezclar bien. 2. Continuar con el procedimiento general (inciso 1.1.) 1.12.3. Pimienta de Jamaica (Pimienta Inglesa), clavo de especia, canela y organo 1. No se conoce un mtodo para neutralizar la toxicidad de estas cuatro especias. Diluir por lo tanto ms all de su poder de toxicidad. 2. Examinar la pimienta, canela y organo en una proporcin 1:100 muestra/caldo, y el clavo a 1:1000 muestra/caldo. 3. Continuar con el procedimiento descrito en el inciso 1.12.1. 1.13. Gelatina 1. Pesar aspticamente 25.0 g de muestra en un recipiente de boca ancha y tapn de rosca de 500 mL. 2. Adicionar 225.0 mL de caldo lactosado estril con 5.0 mL de solucin acuosa de gelatinasa al 5.0% y mezclar bien. 3. Dejar reposar 60 min. 4. Continuar como en el procedimiento general (inciso 1.1.)

BIBLIOGRAFA Norma Oficial Mexicana. NOM-114-SSA1-1994. Bienes y Servicios. Mtodo para la determinacin de Salmonella en alimentos. Marshall, R. T. (1992) Standard methods for the examination of Dairy Products. American Public Health Association. Copyright, Washington, D. C. DAoust J., Maurer J. & Bailey J.S. (2001). Salmonella Species. In: Food Microbiology. Fundamentals and Frontiers. Doyle M., Beuchat L.R. & Montville T.J. (Eds.) 2d. ed. ASM Press USA: 141-157. Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9th ed. Arlington, VA: AOAC.

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Andrews W.H., Flowers R.S., Silliker J., & Bailey S. (2001) Salmonella. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4 th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington: 357-380.

International Commission on Microbiological. Specifications Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall. 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

of

Foods

(2005)

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Mtodo para la determinacin de Vibrio cholerae en alimentos, hielo y agua.

OBJETIVO Realizar adecuadamente el anlisis microbiolgico para detectar Vibrio cholerae en alimentos, agua y/o hielo. Explicar el fundamento de cada etapa del anlisis. GENERALIDADES Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETAs), pueden ser de tipo infeccioso y de origen qumico, como las intoxicaciones. La incidencia de estas enfermedades constituye uno de los problemas de salud pblica ms extendidos en el mundo contempraneo y permanecen como una de las causas principales de morbilidad, ocupan el segundo lugar entre las enfermedades transmisibles de notificacin obligatoria. Entre los alimentos involucrados en ETAs que estn contaminados por V. cholerae resaltan los moluscos bivalvos as como los crustceos y los pescados frescosrefrigerados y congelados. Estos productos pueden generar enfermedades a los consumidores debido a que desde su origen estn sometidos a contaminacin microbiolgica y qumica entre otras, aunado a la forma de consumo que en muchos casos es cruda. El fin principal de la Norma Oficial Mexicana que regula estos productos desde el punto de vista sanitario es el de proteger la salud del consumidor. El clera es una enfermedad relacionada con el abastecimiento de aguas con poca higiene, o bien de los alimentos provenientes de aguas contaminadas con materia fecal y que se consumen crudos. Tambin puede aparecer V. cholerae O1 en moluscos bivalvos, crustceos o pescados que se obtienen de aguas no contaminadas en donde el microorganismo forma parte de la microbiota autctona. La enfermedad del clera fue descrita por primera ocasin por Pacini en 1854. Esta se presenta por la ingesta de la bacteria viable, la cual se establece en el intestino delgado y libera una toxina termolbil. La produccin de esta toxina provoca diarrea acuosa causando los sntomas caractersticos del clera. Los sntomas del clera asitico pueden ir desde una diarrea acuosa ligera, hasta una diarrea severa con aspecto de agua de arroz. El establecimiento de la enfermedad por lo general es repentino, con periodos de incubacin que varan entre las 6 h. y los 5 das. Esta enfermedad generalmente es autolimitante.

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Las personas con clera requieren de hidratacin intravenosa u oral con soluciones que contengan cloruro de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de potasio y glucosa, ya que la muerte sobreviene debido a la deshidratacin y prdida de electrolitos esenciales. Mediante estudios en personas voluntarias saludables, se ha demostrado que la dosis infectiva necesaria para provocar la enfermedad es aproximadamente de un milln de organismos, y se ha concluido que una vez adquirido el clera la administracin de tetraciclina as como de anticidos, mejora rpidamente el curso de la enfermedad. El gnero Vibrio incluye a los bacilos rectos o curvos Gram-negativos, oxidasa positivos (excepto las especies metschnikovii y gazogenes), anaerobios o anaerobios facultativos. Muchas especies de Vibrio spp. son patgenas para humanos y estn implicadas en toxiinfecciones transmitidas por alimentos. La mayora de los microorganismos que pertenecen a este gnero no crecen en medios sin cloruro de sodio a excepcin de V. cholerae y V. mimicus, por lo tanto, debido a esta caracterstica no es considerado un vibrio haloflico, aunque requieran trazas del in sodio para su crecimiento. Las especies de Vibrio cholerae comprenden varios grupos antignicos somticos incluyendo el grupo O1, el cual se asocia con los biotipos clsico y El Tor. A su vez, este grupo O1 puede tener varios serotipos incluyendo Inaba, Ogawa e Hikojima. Las especies de V. cholerae no-O1 (referidos en la literatura como vibrios no aglutinables o NAG), se encuentran en aguas estuarinas y pueden causar enfermedad gastrointestinal, aunque tpicamente es menos severa que la causada por el V. cholerae O1. El serotipo O139 identificado por primera vez en 1992 como el causante de una nueva epidemia de clera en la India y Bangladesh y el cual no se ha podido encontrar en aguas estuarinas, es una excepcin de los vibrios NAG que si produce los sntomas clsicos del clera. Otros microorganismos pertenecientes al gnero Vibrio que son causantes de enfermedades gastrointestinales transmitidas por alimentos son V. parahaemolyticus y V. vulnificus. V. parahaemolyticus es una bacteria haloflica encontradas normalmente con microbiota normal de aguas y animales estuarios. El microorganismo tiene una distribucin mundial en ambientes estuarios y costeros, y se ha aislado de muchas especies de pescados, mariscos y crustceos. V. vulnificus es una bacteria haloflica encontrada en ambientes estuarios y es fenotpicamente similar a V. parahaemolyticus. Esta bacteria causa enfermedades transmitidas por alimentos y en heridas, cualquiera de stas puede progresar rpidamente hasta una septicemia mortal. Los moluscos bivalvos crudos son la principal fuente de transmisin alimentaria del V. vulnificus.

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Otros Vibrio spp. haloflicos, V. fluvialis, V. hollisae, V. alginolyticus, V. furnissii y V. metschnikovii, se han asociado con gastroenteritis y estn presentes en ambientes estuarios junto con otras especies patgenas y no patgenas de Vibrio.

FUNDAMENTO El mtodo de deteccin estndar para la recuperacin y la deteccin de Vibrio cholerae es cualitativo. Sin embargo se recomienda para las especies aisladas de V. cholerae de los serotipos O1 y no-O1 demostrar la produccin de la toxina del clera. Este mtodo describe un esquema general que consiste en: Enriquecimiento a diferentes temperaturas, dependiendo del tipo de alimento que se desee analizar, donde se pretende incrementar las poblaciones de Vibrio e inhibir otros microorganismos presentes en la muestra. Aislamiento diferencial en medio slido selectivo, el cual restringe el crecimiento de otros gneros diferentes a Vibrio, permitiendo el reconocimiento de colonias sospechosas de la especie Vibrio cholerae. Purificacin: Las colonias caractersticas sospechosas de pertenecer a la especie cholerae, se purifican en medios no selectivos. Identificacin bioqumica, que permite la identificacin de los cultivos de V. cholerae. Pruebas serolgicas, que permitan la identificacin de los cultivos de V. cholerae.

MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES Material necesario para preenriquecimiento de V. cholerae en agua y hielo: 1 2 matraces Erlenmeyer de 500 mL con 225.0 mL de agua peptonada alcalina (1% P/V) (pH=8.5 0.2) (APA)a. Material necesario para preenriquecimiento de V. cholerae en crustceos frescos, refrigerados o congelados: 2 matraces Erlenmeyer de 500 mL con 225.0 mL de agua peptonada alcalina (1% P/V) (pH=8.5 0.2) (APA)a. 4 tubos de 16 x 150 con 9.0 mL de agua peptonada alcalina (APA)a. Material necesario para preenriquecimiento de V. cholerae en pescados frescos, refrigerados o congelados: 1 matraz Erlenmeyer de 500.0 mL con 225.0 mL de agua peptonada alcalina (1% P/V) alcalina (pH=8.5 0.2) (APA)a. 2 tubos de 16 x 150 con 9.0 mL de agua peptonada alcalina (1% P/V) alcalina (pH=8.5 0.2) (APA)a.

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Material necesario para preenriquecimiento de V. cholerae en moluscos bivalvos frescos, refrigerados o congelados: 1 matraz Erlenmeyer de 1000 mL con 450.0 mL de agua peptonada alcalina (1% P/V) alcalina (pH=8.5 0.2) (APA)a. 1 matraz Erlenmeyer de 500 mL vaco y estrila. 4 tubos de 16 x 150 con 9.0 mL de agua peptonada alcalina (1% P/V) (pH=8.5 0.2) (APA)a. Material necesario para preenriquecimiento de V. cholerae en quesos: 1 matraz Erlenmeyer de 1000,0 mL con 500,0 mL de agua peptonada alcalina (1% P/V) alcalina (pH=8.5 0.2) (APA)a. 5 tubos de 16 x 150 con 9,0 mL de agua peptonada alcalina (1% P/V) alcalina (pH=8.5 0.2) (APA)a. Material necesario para preenriquecimiento de V. cholerae en helados y bases o mezclas para helados: 1 matraz Erlenmeyer de 500,0 mL con 225,0 mL de agua peptonada alcalina (1% P/V) alcalina (pH=8.5 0.2) (APA)a. 5 tubos de 16 x 150 con 9,0 mL de agua peptonada alcalina (1% P/V) alcalina (pH=8.5 0.2) (APA)a.

NOTA El siguiente material ser el mismo para el anlisis de cualquier tipo de muestra: 3 cajas de Petri con 20.0 mL de agar tiosulfato-citrato-bilis-sacarosa (TCBS)b. 3 cajas de Petri con 20.0 mL de agar T1N1 (Agar triptona con 1% NaCl) y/o 3 cajas de Petri con 20.0 mL de agar soya tripticasa con 2% de NaCl (P/V)c. 1 caja de Petri con 20.0 mL de agar gelatina (dividir en tres)c. 1 caja de Petri con 20.0 mL de agar gelatina con 2% de NaCl (P/V) (dividir en tres)c. 3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL de agar triple-azcar-hierro (TSI) y/o agar de hierro Kligler inclinados (KIA) d. 3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL de agar arginina glucosa inclinados (AAG)d. 3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL de caldo triptona sin NaCl (T1N0) y/o 3 cajas con agar gelatina al 0% de NaCld. 3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL de caldo triptona ms 3% de NaCl (T1N3) y/o 3 cajas con agar gelatina al 3% de NaCld. 3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL de caldo triptona ms 6% de NaCl (T 1N6) y/o 3 cajas con agar gelatina al 6% de NaCld. 6 tubos de 13 x 100 con 5.0 mL de medio Hugh y Leifson ms 1% de glucosa (P/V) d. 3 discos para prueba de oxidasad. 3 discos para prueba de ONPGd. 3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL de agar hierro lisina (LIA) inclinados d.

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3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL de caldo RM/VPd. 3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL de caldo rojo de fenol ms 1% de arabinosa (P/V) d. Opcional: adems del TCBS, 3 cajas de Petri con 20.0 mL de agar modificado con celobiosa, polimixina B y colistina (mCPC) b. SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES 1 frasco gotero con reactivo de Kovacs d. 1 frasco gotero con reactivo o discos para la prueba de la oxidasa (tetrametil-pfenilendiamina; TMPD) d. Colorantes necesarios para la tincin de Gramc, d. Aceite mineral vaspar c. Aceite de inmersinc,d,e.

MATERIAL Y EQUIPO 1 bolsa para Stomacher o vaso de licuadora estrila. Stomacher o motor para licuadoraa. Mechero Bunsena. 1 pipeta estril con algodn de 1.0, 5.0 y 10.0 mLa. Pipetas Pasteur estriles a, ,b ,c, d, e Propipetaa,b,c,d,e. 1 caja de Petri estrila. Bao de agua a 35 2 y 42 1Ca,b,c,d. Incubadora a 37 2Ca,b,c,d. Incubadora a 42 2Ca,b,c,d. Balanza granataria a. Cucharas estriles u otros instrumentos apropiados para transferir muestras de alimentosa. Asas bacteriolgicas de 3 mm de dimetrob,c,d. Asa bacteriolgica de platino para efectuar la prueba de oxidasad. Tijeras y pinzas estrilesa. Microscopio c,d,e.

NOTAS
a b c d e

Material necesario al inicio de la prctica. Material necesario a las 24 h. de iniciada la prctica. Material necesario a las 48 h. de iniciada la prctica. Material necesario a las 72 h. de iniciada la prctica. Material necesario a las 96 h. de iniciada la prctica.

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DETERMINACIN DE V. cholerae EN AGUA Y HIELO

Incubar un matraz a 35-37C y otro a 42C/24 h Despus de la incubacin y sin agitar la pelcula, de cada matraz efectuar aislamiento en uno de los sigs. Medios de cultivo: TCBS (mCPC opcional adems del TCBS).

Aadir 25.0 mL de agua o hielo fundido en 2 matraces con 225.0 mL de APA, o bien filtrar 500-1000 mL y poner la membrana en un tubo con 10.0 mL de APA

Seleccionar al menos 3 colonias sospechosas de cada placa y aislar

Incubar, TCBS 18 24 h a 35-37C. sacarosa (+) = amarillo mCPC 18-24 h a 39 40C. celobiosa ( - ) = prpura

Aislamiento en medios selectivos y diferenciales

Agar T1N1 o agar soya tripticasa 2% NaCl. Inc. 35-37C/12-18 h. Comprobar pureza en GA o GS en el 2do. da. Inc. 35-37C/12-18 h. Confirmacin serolgica

Bioqumicas presuntivas TSI, KIA Y AAG Inc. 35-37 C/18-24 h.

Resultados caractersticos

Resultados positivos para V. cholerae

Siembra de bioqumicas complementarias: pruebas de halofilia en T1N0, T1N3, T1N6 y O/F, ONPG, RM-VP, oxidasa y fermentacin de la arabinosa.

111

DETERMINACIN DE V. cholerae EN CRUSTACEOS FRESCOS, REFRIGERADOS O CONGELADOS

+
Realizar 2 mezclas con 10 crustceos (aprox. 250.0 g c/u). De cada mezcla tomar 25.0 g y colocar en 225.0 mL de APA. Homogeneizar 2 min. Para cada matraz realizar 2 dil. seriadas en 9.0 90.0 mL APA.

10-2

10-3
Incubar una serie a 3537C y otra a 42C / 24 h. Despus de la incubacin y sin agitar la pelcula, efectuar aislamiento en uno de los sigs. medios de cultivo: TCBS (mCPC opcional adems del TCBS).

Seleccionar al menos 3 colonias sospechosas de cada placa y aislar

Incubar, TCBS 18 24 h a 35-37C. sacarosa (+) = amarillo mCPC 18-24 h a 39 40C. celobiosa ( - ) = prpura Aislamiento en medios selectivos y diferenciales

Agar T1N1 o agar soya tripticasa 2% NaCl. Inc. 35-37C/12-18 h. Comprobar pureza en GA o GS en el 2do. da. Inc. 35-37C/12-18 h. 35-37C/12-18 h. Confirmacin serolgica

Bioqumicas presuntivas TSI, KIA Y AAG Inc. 35-37 C/18-24 h.

Resultados caractersticos

Resultados positivos para V. cholerae

Siembra de bioqumicas complementarias: pruebas de halofilia en T1N0, T1N3, T1N6 y O/F, ONPG, RM-VP, oxidasa y fermentacin de la arabinosa.

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DETERMINACIN DE V. cholerae EN PESCADOS FRESCOS, REFRIGERADOS O CONGELADOS; QUESOS Y HELADOS.

Pesar 25.0 g de pescado incluyendo vsceraso helado Pesar 50.0 g de queso

225.0 mL de APA y realizar 2 dil. seriadas en (5 dil para helado) 9.0 90.0 mL APA. En queso diluir en 500 ml de APA y realizar 5 dil seriadas en 9.0 o 90.0 ml APA

10-2

10-3
Incubar a 35-37C / 24 h. Despus de la incubacin y sin agitar la pelcula, efectuar aislamiento en uno de los sigs. medios de cultivo: TCBS (mCPC opcional adems del TCBS).

Seleccionar al menos 3 colonias sospechosas de cada placa y aislar

Incubar, TCBS 18 24 h a 35-37C. sacarosa (+) = amarillo mCPC 18-24 h a 39 40C. celobiosa ( - ) = prpura

Aislamiento en medios selectivos y diferenciales

Agar T1N1 o agar soya tripticasa 2% NaCl. Inc. 35-37C/12-18 h. Comprobar pureza en GA o GS en el 2do. da. Inc. 35-37C/12-18 h. Confirmacin serolgica

Resultados caractersticos Bioqumicas presuntivas TSI, KIA Y AAG Inc. 35-37 C/18-24 h.

Resultados positivos para V. cholerae

Siembra de bioqumicas complementarias: pruebas de halofilia en T1N0, T1N3, T1N6 y O/F, ONPG, RM-VP, oxidasa y fermentacin de la arabinosa.

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DETERMINACIN DE V. cholerae EN MOLUSCOS BIVALVOS FRESCOS, REFRIGERADOS O CONGELADOS

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Incubar una serie a 35-37C y otra a 42C / 24 h. Despus de la incubacin y sin agitar la pelcula, efectuar aislamiento en uno de los sigs. medios de cultivo: TCBS (mCPC opcional adems del TCBS).

Desconchar 10-12 moluscos (aprox. 50.0 g) y colocar en 450.0 mL de APA. Homogeneizar 2 min. Dividir en 2 matraces estriles.

Para cada matraz realizar 2 dil. seriadas en 9.0 90.0 mL APA.

Seleccionar al menos 3 colonias sospechosas de cada placa y aislar en;

Incubar, TCBS 18 24 h a 35-37C. sacarosa (+) = amarillo mCPC 18-24 h a 39 40C. celobiosa ( - ) = prpura

Aislamiento en medios selectivos y diferenciales

Agar T1N1 o agar soya tripticasa 2% NaCl. Inc. 35-37C/12-18 h. Comprobar pureza en GA o GS en el 2do. da. Inc. 35-37C/12-18 h. Confirmacin serolgica

Bioqumicas presuntivas TSI, KIA Y AAG Inc. 35-37 C/18-24 h.

Resultados caractersticos

Resultados positivos para V. cholerae

Siembra de bioqumicas complementarias: pruebas de halofilia en T1N0, T1N3, T1N6 y O/F, ONPG, RM-VP, oxidasa y fermentacin de la arabinosa.

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PROCEDIMIENTO 1. Enriquecimiento. TEMPERATURA DE INCUBACIN DEL PREENRIQUECIMIENTO 35-37C/24 h 42C/24 h

TIPO DE MUESTRA

PREPARACIN DE LA MUESTRA

Agua y Hielo

25.0 mL del agua o hielo fundido en 225.0 mL de APA, o bien, filtrar 5001000 mL y colocar la membrana en un tubo con 10.0 mL de APA. Se puede incubar a una bien a dos temperaturas diferentes

Realizar dos mezclas con 10 crustceos X X Crustceos y un peso aprox. de 250.0 g c/u. (3 diluciones) (3 diluciones) frescos, De cada mezcla tomar 25.0 g y colocar refrigerados o en 225.0 mL de APA. Homogeneizar 2 congelados min. De cada mezcla realizar 2 diluciones ms en 9.0 90.0 mL de APA.

Tomar carne del rea de las vsceras, X Pescados incluyendo stas. (3 diluciones) frescos, 25.0 g de la muestra en 225.0 mL de refrigerados o APA. Homogeneizar 2 min. congelados Realizar 2 diluciones ms en 9.0 90.0 mL de APA.

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Moluscos bivalvos, frescos, refrigerados o congelados

Desconchar 10-12 moluscos (carne y lquido). X X 50.0 g de la muestra en 450.0 mL APA. (3 diluciones) (3 diluciones) Homogeneizar 2 min. Dividir en 2 matraces estriles. Realizar 2 diluciones ms en 9.0 90.0 mL de APA.

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TIPO DE MUESTRA

PREPARACIN DE LA MUESTRA

TEMPERATURA DE INCUBACIN DEL PREENRIQUECIMIENTO

Quesos de suero

A 50,0 g de queso en cubos de aprox 6 mm y pasar a vasos de 2 litros. Aadir 800,0 a 1000,0 ml de solucin hirviente de cido fosfrico (1:40). Agitar continuamente a baja velocidad por 20 minutos hasta disolver la muestra. Filtrar y lavar la muestra para evitar que X el filtro se obstuya. (6 diluciones) En caso de obstruccin agregar al agua de lavado una solucin alcalina (hidroxido de sodio al 5% o acido fosforico 1:40 o alcohol caliente) asta que el filtro quede limpio. Examinar el papel filtro en el microoscopio. A 25 g de muestra introducirlos en 225,0 ml de agua peptonada alcalina (APW) y homogeneizar por 2 minutos a X la mxima velocidad (6 diluciones) De cada mezcla realizar 2 diluciones ms en 9,0 o 90,0 ml de APA.

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Helado y basespara helado

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Para todos los casos proseguir con el inciso 2. 2. Resiembra Despus de la incubacin, y sin agitar la pelcula transferir el inculo a una placa de agar TCBS y optativo mCPC adems del TCBS: 1. Agar con tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa (TCBS). Incubar durante a 3537C durante 18 a 24 h.. 2. Agar modificado con celobiosa, polimixina B y colistina (mCPC). La polimixina inhibe al biotipo Clsico de V. cholerae. Incubar durante 18 a 24 h. de 39-40C. 3. Morfologa colonial. Examinar las placas a fin de determinar si se presentan las caractersticas coloniales que a continuacin se describen:

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Agar TCBS. Las colonias de V. cholerae (El Tor y Clsico) son grandes, lisas, amarillas (positivas para la fermentacin de la sacarosa) y ligeramente achatadas, con el centro opaco y los bordes translcidos. NOTA Las especies de Vibrio no producen colonias pequeas de color crema en agar TCBS, en cambio las colonias de V. mimicus, que estn estrechamente relacionadas con V. cholerae, son verdes (sacarosa negativas). La mayora de las dems especies de Vibrio crecen en agar TCBS y producen colonias amarillas y verdes. Agar mCPC. Las colonias de V. cholerae El Tor son prpuras (negativas para la fermentacin de la celobiosa). El V. vulnificus produce colonias amarillas achatadas, con el centro opaco y los bordes translcidos. La mayora de las dems especies de Vibrio no crecen fcilmente en agar mCPC. 4. Seleccin Seleccionar por lo menos 3 colonias sospechosas de cada placa y aislarlas en: 1. Agar T1N1 o agar soya tripticasa con 2% de NaCl e incubar a 35-37C durante 1218 h.. Es necesario hacer un cultivo en un medio no selectivo a fin de garantizar la pureza de las colonias antes de las pruebas bioqumicas, esto es, se puede inocular en: 2. Agar gelatina (GA) o agar gelatina sal (GS) en el segundo da. Los resultados sern confiables si las placas de aislamiento y la observacin microscpica muestran que las colonias elegidas estn puras. 5. Diferenciacin La frmula para todos los medios de pruebas bioqumicas debern contener por lo menos un 2% de NaCl. Se recomiendan los siguientes medios porque las reacciones permiten efectuar una diferenciacin presuntiva entre la mayora de las especies de Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas y otras bacterias. La diferenciacin de las colonias sospechosas se realiza por duplicado en: 5.1. Prueba de oxidasa. 1. Colocar un crculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas de reactivo de oxidasa. Alternativamente se puede utilizar un disco reactivo comercial.

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2. Tomar suavemente una porcin del cultivo desarrollado en agar soya tripticasa con NaCl al 2%, u otro medio que no contenga carbohidratos fermentables (Inciso 4) y depositarlo en el papel filtro anterior. NOTA Para los microorganismos oxidasa positivos, el papel se tornar prpura oscuro o azul en pocos segundos. Las especies patgenas de Vibrio son oxidasa positivas (excepto el V. metschnnikovii). 5.2. Agar triple azcar hierro (TSI) y Agar Kligler hierro (KIA) 1. Registrar las caractersticas del medio TSI y KIA antes de la inoculacin (color del medio). 2. Tomar suavemente una porcin del centro de la colonia con asa bacteriolgica recta y estril e inocular por picadura y estra en un tubo con agar triple azcar hierro (TSI) y agar de Kligler (KIA) inclinado. 3. Incubar el medio TSI y KIA a 35 2 C durante 18 a 24 h.

5.3. Agar arginina y glucosa (AAG) 1. Registrar las caractersticas del medio AAG antes de la inoculacin (color del medio). 2. Tomar suavemente una porcin del centro de la colonia con asa bacteriolgica recta y estril e inocular por picadura y estra en un tubo con medio AAG inclinado. 3. Incubar el medio AAG a 35 2 C durante 18 a 24 h.

5.4. Prueba de halofilia. 1. Tomar suavemente una porcin del cultivo desarrollado en KIA o TSI o AAG con asa bacteriolgica estril y suspender el inculo en un tubo con los siguientes medios: Caldo triptona con NaCl al 0% (T1N0) Caldo triptona con NaCl al 3% (T1N3) Caldo triptona con NaCl al 6% (T1N6). 2. Incubar los medios a 35 2 C durante 18 a 24 h.

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NOTAS El V. cholerae y el V. mimicus crecern en T1N0 y T1N3 y no crecen en T1N6. Algunos gneros de bacterias que no son Vibrio y que presentan reacciones similares a las de V. cholerae en medios de TSI y LIA no crecen en T1N3. La mayora de las especies de Vibrio spp. que incluyen algunos V. cholerae no O1, crecen nicamente en T1N3 y no crecen en T1N6 ni en concentraciones mayores de sal. 5.5. Prueba de halofilia alternativa. Alternativamente se realiza la prueba de halofilia en cajas de Petri con los siguientes medios de cultivo: Agar gelatina (GA) Agar gelatina con NaCl al 3% (GS 3%) Agar gelatina con NaCl al 6% (GS 6%)

1. Dividir cada placa en ocho sectores. Tomar suavemente una porcin del cultivo desarrollado en KIA o TSI o AAG con asa bacteriolgica estril e inocular en el centro de cada sector una estra recta. 2. Incubar a 35-37C durante 18 a 24 h.. NOTA V. cholerae y V. mimicus crecen al 0% y al 3% de sal, rara vez al 6% de sal y no crecen en concentraciones del 8% ni 10% de cloruro de sodio. Para leer la reaccin de la gelatinasa sostener la placa sobre una superficie negra, observar un halo opaco alrededor de la colonia de los microorganismos gelatinasa positivos.

5.6. Prueba de oxidacin-fermentacin. 1. Tomar suavemente una porcin del cultivo desarrollado en KIA o TSI o AAG con asa bacteriolgica estril e inocular por picadura en un tubo con el medio HughLeifson. 2. Aadir una capa de aceite mineral estril a uno de los tubos para incubacin en anaerobiosis. 3. Incubar ambos tubos a 35-37C durante 18 a 24 h. NOTA Las especies de Vibrio spp utilizan la glucosa tanto para la oxidacin como para la fermentacin. Las especies de Pseudomonas, que comnmente se aslan del pescado y los mariscos con mtodos de enriquecimiento que se usan para las especies de Vibrio, utilizan slo la glucosa para la oxidacin.
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6. Identificacin y confirmacin de V.chloreae O1, V.cholerae no O1 y V. mimicus a travs de pruebas bioqumicas complementarias. Leer los resultados de las prueba bioqumicas de TSI, KIA, AAG, T 1N0, T1N3, T1N6 o GA y GS con 3% y 6% de NaCl, adems del caldo glucosa de Hugh-Leifson. Tambin se sugiere realizar una tincin de Gram a un cultivo de 18 a 24 h. de incubacin. La interpretacin de las pruebas bioqumicas para identificacin de V. cholerae y otras especies bacterianas afines figuran en los cuadros 1, 2 y 3.

6.1 Prueba serolgica de aglutinacin. 1. Inocular los cultivos sospechosos presuntivos en agar tripticasa soya (TSA) e incubar a 35-37C durante 16 a 24 h. 2. Colocar con una asa bacteriolgica, dos gotas separadas de solucin salina estril (NaCl 0.85%) sobre un portaobjetos o en dos secciones de una placa para aglutinacin. 3. Suspender en cada una de las gotas, una porcin del cultivo desarrollado en TSA. 4. Agregar a una de ellas una gota del suero anti Vibrio cholerae Grupo O1 subgrupo Inaba (factor AC) y mezclar con el canto del asa o empleando aplicadores de madera. 5. Agitar inclinando la lmina hacer girar las gotas durante aproximadamente un minuto. 6. Observar bajo una buena iluminacin y sobre un fondo oscuro la reaccin. 7. Considerar cualquier grado de aglutinacin como positiva. 8. Realizar el mismo procedimiento con el suero anti Vibrio cholerae Grupo O1 subgrupo Ogawa (factor AB).

NOTAS La suspensin del cultivo en la que no se adicion el suero anti Vibrio cholerae Grupo O1 subgrupo Inaba (factor AC) o el suero anti Vibrio cholerae Grupo O1 subgrupo Ogawa (factor AB) se considerar como el control negativo para poder interpretar el resultado. Existe la posibilidad que los antgenos anti Vibrio cholerae estn relacionados entre s, por lo que se considera pertinente realizar pruebas bioqumicas para confirmar que el cultivo puro sea de V. cholerae O1 o no O1. Es conveniente incluir cultivos positivos y negativos, adems de los controles salinos para cada antisuero usado. Los cultivos que aglutinan con el suero polivalente (grupo O1) y con los sueros Inaba y Ogawa, tienen los 3 factores (A, B y C) y son del serotipo Hikojima.
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Los cultivos que aglutinan con el suero polivalente, pero no aglutinan con sueros Inaba y Ogawa, no se pueden tipificar con estos antisueros. Los cultivos de V. cholerae cuya identidad se haya confirmado con mtodos bioqumicos y que no aglutinen con el suero del grupo O1 se deben considerar como V. cholerae O1.

CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS Consultar los resultados obtenidos y comparar con los Cuadros 1, 2 y 3 para la identificacin de los gneros y especies de la bacteria investigada. En caso de que los resultados obtenidos no correspondan a ninguna especie del gnero Vibrio consultar el cuadro de la Familia Enterobacteriaceae e intentar la identificacin del problema.

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CUADRO 1. Reacciones de algunas especies de Vibrio spp. y microorganismos relacionados en medios slidos diferenciales. Agar hierroAgar hierro-tres Agar arginina Kligler (KIA) azcares (TSI) glucosa (AAG) Pico de Fondo Pico de Fond Pico de Fondo flauta de flauta o de flauta de tubo tubo tubo Lac Gluc + Lac + Gluc + Arg. Dihid. Gluc (- raro) lig. + Lac Gluc + Lac Gluc + Arg. Dihid. Gluc + (+ raro) Lac Gluc + Lac Gluc + Arg. Dihid. Gluc + Lac Gluc + Lac + Gluc + Arg. Dihid. Gluc + Lac Gluc + Lac Gluc + Arg. Dihid. Gluc + o+ (+ raro) Lac Gluc + Lac Gluc + Arg. Dihid. Gluc o+ o+ Lac Gluc + Lac Gluc + Neutro Neutro o+ o+

Microorganismo

V. cholerae V. mimicus V. parahaemolyticus V. alginolyticus V. vulnificus A. hydrophila P. shigelloides

Ninguna de las especies de Vibrio spp. aqu enlistadas producen cido sulfhdrico en KIA, TSI o AAG, o gas de la glucosa en cantidades detectables en KIA, TSI AAG. Algunas especies de Aeromonas spp. pueden producir gas a partir de la glucosa en estos medios.

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CUADRO 2. Caractersticas mnimas para la identificacin de Vibrio cholerae Vibrio cholerae Bacilo Gram-negativo (pueden ser curvos) Lac + (- raro) Gluc + gas H2S Fermentacin + oxidacin + + + El Tor + Tipo Clsico + 0% + 3% + 6% usualmente 8% 10% + + -

Caracterstica Morfologa TSI

Prueba de oxidacin-fermentacin Citocromo oxidasa Dihidrolasa arginina Lisina descarboxilasa Voges Proskauer Crecimiento a 42C Prueba de halofilia con NaCl

Fermentacin de la sacarosa ONPG Fermentacin de la arabinosa

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CUADRO 3. Caractersticas diferenciales de especies y biotipos del gnero Vibrio

V. V. cholerae alginolyticus A A V. fluvialis V V. parahaemolyticus V V. vulnificus V V. mimicus V V. hollisae NC V. furnissii A

Crecimiento en TCBS Agar mCPC P NC NC NC A NC NC NC Medio AAG Ka KA KK KA KA KA Ka KK Crecimiento con: 0% NaCl + -/d + 3% NaCl + + + + + + + + 8% NaCl + d + d 10% NaCl + d Crecimiento a: 4C ND ND ND 30C + + + + + ND ND ND 35C + + + + + ND ND ND 40C + + + + + ND ND ND Oxidasa + + + + + + + + OF/glucosa OF OF OF OF OF OF OF OF ONPG + + + + + Vogesd + Proskauer Rojo de Metilo + NC NC NC d + Indol + d + d + + Movilidad + + d + + + Citrato + + d d + + Arginina + + dihidrolasa Descarboxilacin + + + + + de lisina Descarboxilacin + + + + + de: Ornitina Gelatinasa + + + + + d + Ureasa D Produccin de: + + + + + ND ND ND amilasa H2S (SIM) Utilizacin de: + + + + + + + D-glucosa Gas a partir de + glucosa D-Xilosa L-Arabinosa + d + + D-Galactosa + d + + + + + + Sacarosa + + + + Celobiosa d + Lactosa + d Salicina + D-Gluconato + + + + + Putrescina d d + SMBOLOS: TCBS, tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa; mCPC, agar celobiosa-polimixina B-colistina; modificado; AAG, agar arginina-glucosa A, amarillo; V, verde; P prpura; OF, metabolismo oxidativo/fermentativo; N, no crece; K, alcalino; a, ligeramente cido; V, reaccin variable dependiendo de las especies o biotipos; S, sensible; R, resistente; d, resultados diferentes; +, la mayora de las cepas +, usualmente 90% o ms; -, casi ninguna cepa positiva, usualmente positivas; ND, no hay datos.

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EXPRESIN DE RESULTADOS Reportar presencia o ausencia de Vibrio cholerae o la especie identificada en 25.0 50.0 g de alimento (segn sea el caso) en 25.0 mL de agua o hielo.

BIBLIOGRAFA Norma Oficial Mexicana NOM-027-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca. Pescados Frescos Refrigerados y Congelados. Especificaciones sanitarias. Mxico. Norma Oficial Mexicana NOM-029-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca. Crustceos frescos-refrigerados y congelados. Especificaciones sanitarias. Mxico. Norma Oficial Mexicana NOM-031-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Productos de la pesca. Moluscos Bivalvos Frescos Refrigerados y Congelados. Especificaciones sanitarias. Mxico. Apndice B. Norma Oficial Mexicana NOM-041-SSA1-1993. Bienes y Servicios. Agua purificada envasada. Especificaciones sanitarias. Mxico. Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. Kaysner C. A., & DePaola A. Jr. (2001) Vibrio. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 405-420.

International Commission on Microbiological. Specifications of Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall. 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

Foods

(2005)

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Mtodo para la determinacin de Listeria monocytogenes en alimentos.

OBJETIVO Aplicar la tcnica descrita en la Norma Oficial Mexicana para detectar Listeria monocytogenes en alimentos. Interpretar adecuadamente los resultados del anlisis y sus implicaciones en la calidad del alimento.

GENERALIDADES Listeria monocytogenes es un bacilo corto y con extremos redondeados Grampositivo, mvil mediante flagelos, anaerobio facultativo, catalasa positivo no formador de esporas y crece bien a temperatura de refrigeracin. Mide entre 0,5 2 de largo por 0,2 - 0,5 de ancho, a veces adopta forma de cocobacilo. Se presenta aislado, en parejas, cadenas cortas o agrupaciones en V. Este microorganismo se destruye a temperatura de pasteurizacin (71.7C durante 15 segundos). Es extremadamente resistente en comparacin con la mayora de otras clulas vegetativas, ya que resiste periodos de congelamiento y descongelamiento repetitivo, adems de sobrevivir a varios perodos den condiciones de deshidratacin. La movilidad que presenta este microorganismo, se debe a flagelos pertricos y se manifiesta mejor entre 20 - 25C; a 37C llega a ser imperceptible o nula, reducindose el nmero de flagelos a uno o dos situados en la regin polar. Se mueve de forma caracterstica mediante un lanzamiento rpido combinado con saltos y rotacin. La movilidad es ptima entre 20 - 22C. Respecto a la temperatura de crecimiento, sus lmites estn entre 1 - 45C, con una ptima de 30 - 37C. Es una bacteria psicrotrfica, aunque a 4 - 5C su crecimiento es ms lento.

Listeria monocytogenes se puede desarrollar entre valores de pH comprendidos entre 5.6 a 9.6, aunque existen reportes que indican que en medios de laboratorio puede iniciar su desarrollo incluso a partir de 4.4 . Pasados estos lmites se inhibe su crecimiento, pero sobrevive. Su pH ptimo es 7,5. Se conocen ocho especies del gnero Listeria: L. monocytogenes, L. innocua, L. seeligeri, L. welshimeri, L. ivanovii, L. grayi, L. murrayi y L. denitrificans . Actualmente L. denitrificans se ha clasificado como Jonesia denitrificans. Originalmente, dentro de L. monocytogenes se encuentran dos grupos que corresponden a cepas hemolticas patgenas y a cepas no hemolticas y no patgenas. La cepa no patgena de L. monocytogenes se denomina como L. innocua. La nica especie de Listeria patgena para el hombre es L. monocytogenes.

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Para la caracterizacin bioqumica y diferenciacin de Listeria spp, la fermentacin de ramnosa y xilosa son las pruebas cruciales. Ni L. monocytogenes ni L. innocua fermentan xilosa, L. monocytogenes fermenta xilosa. L. monocytogenes fermenta ramnosa al igual que la mayora de los serotipos de L. innocua. Estas dos especies pueden distinguirse a partir de la ausencia de actividad hemoltica en L. innocua, al contrario de L. monocytogenes y L. seeligeri; aclarando que L. seeligeri solo presenta una leve actividad hemoltica en placas de agar sangre de carnero despus de 48 h de incubacin, mientras que para L. monocytogenes desde las 24 h se hace evidente. Ya que esta ltima produce hemolisina beta, caracterstica relacionada con su patogenicidad. Debido a que L. innocua comparte antgenos con L. monocytogenes, es necesario que para su caracterizacin se realicen las reacciones xilosa-ramnosa y/o patogenicidad en ratones. La prueba Christie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP) es til para la caracterizacin de las especies. Bsicamente esta prueba consiste en realizar siembras diametralmente opuestas en agar sangre de carnero, tanto de Staphylococcus aureus hemoltico como de Rohodococcus equi, as como siembras en paralelo del cultivo a caracterizar en los ngulos correctos entre las cepas de S.aureus y R. equi, para finalmente examinar la presencia de hemlisis en las placas tras haber incubado a 35 C durante 24-48 horas. La hemlisis del L. monocytogenes se incrementa en la zona influenciada por Staphylococcus aureus. Por el contrario, la hemlisis del L. ivanovii se incrementa cerca del R. equi. Tambin L. seeligeri puede dar reaccin dbilmente positiva pero solo despus de 48 h de incubacin. Las dems especies permanecen como no hemolticas. La hemlisis puede interpretarse con mayor facilidad cuando las placas de agar sangre estn recin preparadas y con la capa ms delgadas de lo usual. La reaccin de L. monocytogenes es ptima a las 24 horas ms que a las 48 horas. Se recomienda no olvidar incluir el uso de testigos. Otra consideracin importante para recuperar L. monocytogenes es la refrigeracin de las muestras a 4 C durante la manipulacin y almacenamiento hasta el arribo al laboratorio donde se analizarn, ya que se propicia el desarrollo del microorganismo, aunque de forma lenta a esta temperatura. Y si la muestra est congelada, deber mantenerse congelada hasta la realizacin del anlisis. Las pruebas clsicas para definir la patogenicidad de la Listeria incluyen entre otras, la prueba de Antn en conejos, inyecciones intraperitoneales en ratones e inoculacin de ratones e inoculacin de embriones de pollo. El cuadro No. 2 presenta la informacin relativa a la caracterizacin serolgica de la Listeria spp. Ms del 90% de las cepas de L. monocytogenes aisladas pueden tipificarse serolgicamente con suero disponible comercialmente.La mayora de las cepas puras de L. monocytogenes que se obtienen de pacientes y del medio ambiente corresponde a los tipos 1 4.

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Debido a que todas las especies patgenas, exceptuando L. welshimeri, comparten uno o ms antgenos somticos con L. monocytogenes, es necesario caracterizar bioqumicamente las cepas antes de aplicar las prueba inmunolgicas. La listeriosis es el nombre de la enfermedad provocada por la ingesta de alimentos contaminados con L. monocytogenes. Para que se presente listeriosis, es necesario ingerir los microorganismos vivos. Los sntomas de la enfermedad se caracterizan por inflamacin de las meninges con o sin septicemia. Al inicio de la enfermedad se presenta fiebre repentina, avanzando con intenso dolor de cabeza, nausea, vmito, delirio y finalmente puede sobrevenir el coma sobre todo en personas mayores, inmunocomprometidas, infantes, y muyeres embarazadas. En este ltimo grupo de personas, puede causar aborto. El grado de fatalidad es del 30%. Sin embargo, en otro tipo de huspedes solo suele causar sntomas que van desde ligeros hasta agudos, fiebre, as como sntomas parecidos a un resfriado comn. La forma de accin del microorganismo, consiste en invadir el epitelio gastrointestinal. Una vez que el microorganismo ha logrado penetrar a los monocitos, macrfagos o leucocitos polimorfonucleares del husped, empieza la septicemia y se multiplica. Su presencia intracelular en los fagocitos, tambin permite la diseminacin del microorganismo al cerebro y probablemente exista migracin transplacentaria al feto en mujeres embarazadas. La patogenicidad de L. monocytogenes recae en su habilidad para sobrevivir y multiplicarse en clulas fagocticas del husped. La fuente de este microorganismo, son los animales domsticos y salvajes infectados, aves de corral y humanos. Se puede encontrar en agua y lodo. La utilizacin de ensilaje estacional es seguida por un incremento de listeriosis en animales, lo que hace suponer que tanto la leche como los productos del campo pueden estar contaminados. Adems, algunos estudios sugieren que del 1 al 10% de los humanos son portadores de L. monocytogenes en el intestino. Este microorganismo a pesar de ser una bacteria que no posee esporas, es altamente resistente a condiciones adversas tales como: congelamiento, secado y calentamiento. Su transmisin se asocia con el consumo de verduras y productos lcteos contaminados, particularmente variedades de quesos no madurados y helados, as como salchichas fermentadas crudas, carnes crudas pollo crudo y cocido y pescado crudo y ahumado. En neonatos se transmite a travs de la madre y cuando el feto se encuentra an en el tero. La dosis infectiva est relacionada con la susceptibilidad del husped. As, para individuos susceptibles la infeccin ocurre incluso con 100 clulas, mientras que personas no susceptibles resisten hasta 10 000 000 clulas. Como medidas de control para evitar la listerioris a travs del consumo de alimentos contaminados, se recomienda y solo por mencionar algunas lo siguiente, pH bajo, tratamiento trmico adecuado, evitar la recontaminacin y un aw bajo.
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De acuerdo con la Organizacin Mundial de la Salud (OMS), el problema de la Listeria no est en impedir su presencia, sino en controlar su supervivencia y crecimiento, con el fin de reducir las cantidades en que se encuentran en los alimentos.

FUNDAMENTO El mtodo para detectar la presencia de L. monocytogenes se basa en el aislamiento y diferenciacin de especies de Listeria spp., principalmente utilizando la inhibicin selectiva de los componentes dentro de la formulacin de los medios de cultivo propuestos, as como el sistema de indicador esculina y el hierro (II). La diferenciacin de las especies de este gnero se sustenta en la fermentacin de carbohidratos y la actividad hemoltica.

MEDIOS DE CULTIVO 1 matraz Erlenmeyer de 500,0 ml con 250,0 ml de caldo de enriquecimiento para Listeria (EB) pH 7,3 (tambin se puede utilizar caldo Fraser)a. 1 caja de medio Oxford (OXA)b. 1 caja de agar cloruro de litio-cloro-feniletano-moxalactam (LPM)b. 5 cajas de agar soya tripticasena con 0,6% de extracto de levadura (ASTEL) o bien utilizar slo 2 cajas de ASTEL y realizar las siembras en al menos en 5 cuadrantes diferentesc. 5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo soya tripticasena con 0,6 % de extracto de levadura (CSTEL)d. (Para prueba de movilidad en fresco). 1-2 cajas de agar sangre de carnero (para observacin de hemlisis)e. 1-2 cajas de agar recin preparadas de sangre de carnero y con una capa ms delgado de lo usual (para la prueba de CAMP)e. 5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo nitratose. 5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de medio SIM sin inclinar (o medio para movilidad MTM, ver formulacin en la seccin de medios de cultivo)e. 5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo prpura con 0,5% de dextrosae. 5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo prpura con 0,5% de esculinae. 5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo prpura con 0,5% de maltosae. 5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo prpura con 0,5% de ramnosae. 5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo prpura con 0,5% de manitole. 5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo prpura con 0,5% de xilosae. 5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de agar bilis esculina inclinadose. (Para prueba de tolerancia a la bilis y esculina). 5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo soya tripticasena con 0,6% de extracto de levadura (CSTEL) e. (Para tolerancia a la temperatura). 5 tubos de 13 x 100 con 3,5 mL de caldo triptosae. (Para pruebas serolgicas).

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EQUIPO Y MATERIAL Aceite de inmersinb. Asa bacteriolgica de plstico,c,d,e. Cubreobjetosb,c. Lmpara de luz blancab. Pipetas estriles con algodn de 1.0, 10.0 y 25.0 mLa,b,c,d,e. Pipetas Pasteur estriles a, ,b ,c, d, e 1 propipetaa,b,c,d,e. Portaobjetos escabadob,c. 1 mechero Bunsena,b,c,d,e. Incubadora a 30C y a 35Ca,b,c,d,e. Cucharas estriles u otros instrumentos apropiados para transferir muestras de alimentosa. Balanzaa. Microscopio de contraste de fase con un objetivo 100Xb,c. Licuadora stomachera. 2 Tubos limpios, 16 x 125 mm u otros tamaos apropiados con tapn de rosca d,e. Cajas Petrie.

REACTIVOS Y SOLUCIONES Acrilflavina HCl Agar -naftilamina -naftol en etanol absoluto al 5% Agar sangre base No.2 Cicloheximida Sangre de carnero, desfibrinada Etanol absoluto Amortiguador de anticuerpos fluorescente Glicina anhidra Colorantes para la Tincin Gram Solucin de perxido de hidrgeno al 3% para la prueba de catalasa KOH, solucin al 40% juego de sueros comerciales ante Listeria. Acido nalidxco (sal de sodio) Reactivos A, B o C y/o zinc para la prueba de reduccin de nitratos Caldo nutritivo Acido sulfanlico Aceite de inmersin

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NOTAS
a b c d e

Material necesario al inicio de la prctica. Material necesario a las 48 h. de iniciada la prctica. Material necesario a las 96 h. de iniciada la prctica. Material necesario a las 7 das de iniciada la prctica. Material necesario a las 8 das de iniciada la prctica.

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DETERMINACIN DE Listeria monocytogenes EN ALIMENTOS

Incubar 24 a 48 h a 30C

Aislamiento en medios selectivos y diferenciales

Pesar 25.0 g mL de muestra

225.0 mL de caldo de enriquecimiento + suplementos

OXA Incubar 35C 24 a 48 h

LPM Incubar 30C 24 a 48 h

Almacenar a 4C hasta la realizacin de pruebas bioqumicas Incubar 24 h a 35C Purificar 5 colonias tpicas en placas de ASTEL Movilidad en fresco, Catalasa

GRAM

movilidad nitratos carbohidratos

hemlisis

CAMP

Tolerancia a bilis esculina baja temperatura

Confirmacin serolgica

Resultados positivos para L. monocytogenes

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PROCEDIMIENTO 1. Enriquecimiento. 1. Tomar una muestra representativa del alimento, tanto de la superficie externa como del interior 2. Colocar 25,0 mL o 25,0 g de la muestra en un recipiente que contenga 225,0 mL de caldo de enriquecimiento para Listeria (EB), homogeneizar e incubar por 48 h a 30C. 3. En el caso de muestras en donde se sospecha presencia de clulas daadas de Listeria spp, se recomienda la incubacin en un caldo de enriquecimiento sin suplementos. Incubar a 30C por 6 h. Despus de las 6 h de incubacin agregar los suplementos y continuar la incubacin hasta un total de 48 h a 30 C. 2. Aislamiento. 1. Despus de 24 y 48 h de incubacin en el medio EB, resembrar en los medios LMP y OXA. Incubar las placas del medio LMP a 30 C por 24 a 48 h y las de medio OXA a 35 C durante 24 a 48 h. 2. Observar el crecimiento en las placas del medio LMP con luz blanca en un ngulo de 45 (iluminacin de Henry), a simple vista o con la ayuda de una lupa. En este medio generalmente aparecen las colonias de color blanco o azul iridiscentes. 3. En el medio OXA las colonias de Listeria son negras, con halo negro. Algunas colonias pueden aparecer con un tono caf oscuro que se define mejor a los siete das de incubacin. 4. Seleccionar cinco o ms colonias tpicas del medio de OXA y/o LMP y pasar a placas de medio ASTEL. Este paso es importante debido a que las colonias aparentemente aisladas en los medios OXA y LMP pueden estar contaminadas con flora competitiva parcialmente inhibida, invisible a simple vista. 5. Debido a que puede estar presente ms de una especie de Listeria en la muestra, deben identificarse como mnimo cinco colonias. 3. Identificacin. 1. Se deben utilizar cepas de referencia positivas y negativas para cada una de las pruebas. Seleccionar colonias tpicas y sembrar en medio ASTEL. Incubar a 35 C por 24 h. Estos cultivos pueden mantenerse a 4 C y utilizarse como inculo para realizar las pruebas de identificacin. 3.1. Movilidad en fresco Hacer preparaciones en fresco a partir de un cultivo lquido incubado a 20C en CSTEL durante 24 h. La suspensin debe ser densa y emulsificarse completamente, observar con objetivo 10X o 40X en un microscopio de
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contraste de fase o microscopio de contraste de fase o microscopio de campo oscuro. Las clulas de Listeria spp. son bacilos cortos con movilidad rotatoria o como si brincaran. Los bacilos con movimientos rpidos no son Listeria spp. 3.2. Prueba de catalasa 1. Emulsificar un cultivo puro, con una gota de solucin de perxido al 3%. 2. La formacin inmediata de burbujas indica que la prueba es positiva. Las especies de Listeria son catalasa positiva. 3. Precauciones, la emulsin debe realizarse con un asa de plstico o palillo de madera estril evitando el contacto del metal con el reactivo. Si las colonias provienen de agar base con sangre. Cualquier contaminacin de eritrocitos puede dar pruebas falsas positivas. 3.3. Tincin de Gram 1. Hacer una tincin de Gram de cultivos de 16 a 24 h. Todas las especies de Listeria son bacilos cortos Gram positivo; sin embargo en cultivos viejos pueden presentarse como formas cocoides. En extensiones delgadas se observan de color plido y pueden confundirse con Bacteroides spp. 3.4. Hemlisis 1. Dibujar una cuadrcula de 20 a 25 espacios en el fondo de la placa de agar sangre de carnero al 5%. Inocular por picadura un cuadro por cada cultivo. Incubar por 48 h a 35C. Al inocular, observar la reaccin hemoltica en las placas. L. monocytogenes y L. seeligeri producen una zona ligeramente clara alrededor del punto de picadura. Confirmar las reacciones dudosas con la prueba de CAMP. 3.5. Reduccin de nitratos 1. Inocular los tubos conteniendo caldo nitratos, incubar a 35C por 5 das. Para la lectura se debe agregar 0,2 mL del reactivo A y 0,2 mL del reactivo B, un color rojo indica una prueba positiva (presencia de nitritos). Si esta coloracin no se observa, adicionar zinc en polvo. El desarrollo de color rojo despus de una hora confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). 2. En forma alternativa adicionar al cultivo en caldo nitratos 0,2 mL del reactivo B y 0,2 mL del reactivo C. Un color naranja indica una prueba positiva (presencia de nitritos). Si esta coloracin no se observa, adicionar 0,2 mL del reactivo de cadmio, el desarrollo de un color naranja confirma una prueba negativa (presencia de nitratos). Este procedimiento alternativo elimina el uso del alfa naftilamina, que es carcinognica.

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3.6. Movilidad en agar 1. Inocular en medio SIM o MTM, incubar por 7 das a temperatura ambiente (2025 C), observar diariamente. Las especies de Listeria son mviles, dando un crecimiento tpico en forma de paraguas. 3.7. Prueba de utilizacin de carbohidratos 1. Inocular tubos de caldo prpura para fermentacin de carbohidratos al 0,5 % de los siguientes carbohidratos: dextrosa, esculina, maltosa, ramnosa, manitol y xilosa. Incubar 7 das a 35C. Una coloracin amarilla indica fermentacin del carbohidrato probado. Todas las especies de Listeria fermentan la dextrosa, esculina y maltosa. Consultar el cuadro 1 para reacciones con ramnosa, xilosa y manitol. Si la pigmentacin prematura del aislamiento en el medio OXA no deja lugar a duda, el ensayo de esculina puede omitirse. 3.8. Prueba de monocytogenes Cristie-Atkins-Munch-Peterson (CAMP) para Listeria

1. Sembrar Staphylococcus aureus hemoltico (ATCC 49444, NCTC 7428, ATCC 25923 CIP 5710) y Rhodococcus equi ( ATCC 6339 NCTC 1621) en paralelo y diametralmente opuestos en agar sangre de carnero recin preparadas y con una capa ms delgada de lo usual. Estriar perpendicularmente las colonias seleccionadas a caracterizar, entre las cepas de S.aureus y R. equi. 2. Incubar a 35C por 24-48horas y examinar la hemlisis en las placas. 3. La hemlisis del L. monocytogenes se incrementa en la zona influenciada por el S. aureus; la hemlisis del L. ivanovii se incrementa cerca del R. equi, y L. seeligeri es dbilmente hemoltico cerca del S. aureus despus de 48 h de incubacin. Las otras especies permanecen como no hemolticas. 4. La reaccin de L. monocytogenes es generalmente ptima a las 24 horas en vez de 48 horas. No olvidar incluir testigos de Listeria spp. en otra caja de agar sangre de carnero lo ms fresco posible. 3.9. Tolerancia a la bilis y esculina 1. Inocular densamente tubos con agar bilis esculina inclinados, incubar a 35C durante 48 h. L. monocytogenes tolera la bilis en su crecimiento y es capaz de hidrolizar la esculina.

3.10. Tolerancia a la baja temperatura 1. Inocular tubos con CSTEL, incubar a 4C durante 10 das. L. monocytogenes es tolerante a las bajas temperaturas.

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4. Serologa La determinacin de los tipos serolgicos de Listeria se aplica cuando las consideraciones epidemiolgicas son cruciales. 1. Inocular en caldo triptosa por 24 h a 35 C. Transferir a dos tubos de agar inclinado de triptosa e incubar 24 h a 35 C. Para realizar la prueba utilizar sueros anti Listeria monocytogenes comerciales, siguiendo las instrucciones del fabricante.

EXPRESIN DE RESULTADOS Comparar los resultados obtenidos con el cuadro 1 y determinar el gnero y especie de las cepas aisladas. CUADRO 1. Diferenciacin de las Especies de Listeria Especies Hemoltico Reduccin Produccin CAMP a (beta) nitratos de cidos de M R X S.a R.e L. + + + monocytogenes L. ivanovii + + + L. innocua bV L. welshimeri bV + L. seeligeri + + +1 L. grayic bV + bV a Sangre de carnero desfibrinada bV Variable L. grayi incluye ahora las cepas de la especie L. murrayi reductoras de nitratos y ramnosa variable M Manitol R Ramnosa X Xilosa S.a Staphylococcus aureus R.e Rhodococcus equi 1 Puede haber reacciones dbilmente positivas, particularmente a las 48 h. de incubacin.

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CUADRO 2. Serologa de las especies de Listeria Especies Serotipo L. monocytogenes 1/2A, 1/2B, 1/2C 3A, 3B, 3C 4A, 4AB, 4B 4C, 4D, 4E, "7" L. ivanovii 5 L. innocua 4AB, 6A, 6B, Una L. welshimeri 6A, 6B L. seeligeri 1/2B, 4C, 4D, 6B, Una Una Indefinido

INFORME DE LA PRUEBA Reportar presencia o ausencia en 25.0 g 25.0 mL de muestra.

BIBLIOGRAFIA Norma Oficial Mexicana. NOM-143-SSA1-1995. Bienes y servicios. Mtodo de prueba microbiolgico para alimentos. Determinacin de Listeria monocytogenes. Food and Drug Administration (2003) Bacteriological Analytical Manual. 9th ed. Arlington, VA: AOAC. Ryser E.T., & Donnelly C.W. (2001) Listeria. In: Compendium of Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito K. (Eds.) APHA. Washington. 343-356. International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005) Microorganisms in Foods 6 Chapman & Hall. 2nd ed. http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL

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ANEXO I

Medios de Cultivo
NOTA Los medios de cultivo son presentados independientemente de su estado fsico. Agua Peptonada. Peptona Cloruro de sodio Agua destilada 1.0 g 8.5 g 1.0 L en orden alfabtico,

Disolver los componentes de la formulacin en un litro de agua y ajustar la solucin a pH de 7.0, con solucin de hidrxido de sodio 1N; distribuir en matraces o tubos, de acuerdo a los requerimientos de la tcnica y esterilizar a 121C1C durante 15 minutos. Despus de la esterilizacin, los volmenes y el pH de la solucin deben ser iguales a los iniciales.

Agua Peptonada Alcalina (APW). Peptona Cloruro de sodio Agua destilada 10.0 g 10.0 g 1.0 L

Disolver los ingredientes. Ajustar el pH de tal forma que despus de esterilizar ste sea de 8,5 0,2. Esterilizar en autoclave 10 minutos a 121C. Principio de accin Medio utilizado para enriquecimiento selectivo del gnero Vibrio ya que las condiciones ptimas de desarrollo se favorecen por un pH alcalino. Agua de Peptona amortiguadora. Peptona Cloruro Sdico Fosfato sdico dibsico Fosfato potsico monobsico Agua destilada 10.0 g 5.0 g 3.5 g 1.5 g 1.0 L

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Disolver los componentes en agua, calentando si es necesario. Ajustar el pH, despus de la esterilizacin a 7.0 en caso de ser necesario. Distribuir en recipientes de vidrio con la capacidad necesaria para obtener las porciones necesarias para la prueba. Esterilizar a 121 1C durante 20.0 minutos. Principio de accin El agua de peptona tamponada al ser un medio nutritivo no selectivo, puede ser utilizada como medio de preenriquecimiento, antes del enriquecimiento selectivo de Salmonella en alimentos. Proporciona condiciones para la recuperacin de clulas daadas por los procesos de conservacin de alimentos.

Almidn, agar. Peptona Extracto de carne Cloruro de sodio Almidn de maz Agar Agua destilada 5.0 g 3.0 g 5.0 g 10.0 g 20.0 g 1.0 L

Suspender homogneamente el almidn, en 100 mL de agua destilada fra, hasta eliminar cualquier grumo. Por otra parte, disolver los dems ingredientes en 900 mL de agua, calentar y agitar continuamente. Ajustar el pH a 7.20.1 y aadir la suspensin de almidn a la solucin anterior, agitar continuamente hasta completa homogeneizacin. Esterilizar a 121C, durante 15 minutos Principio de accin: Esta prueba se basa en la capacidad que tienen algunos microorganismos de hidrolizar el almidn (polisacrido); este compuesto est constituido por un conjunto de unidades de -D-glucosa cuya estructura qumica es una hexosa. Por otra parte, se sabe que el almidn forma un complejo de color azul intenso en presencia de yodo, en ocasiones la coloracin es rojiza debido al alto contenido de dextrinas que presenta el almidn, sin embargo los mono y disacridos no se enlazan con el yodo, por lo tanto no dan coloracin azul ni rojiza. Algunos microorganismos contienen enzimas como las o amilasas, capaces de hidrolizar el almidn dando como productos de la reaccin mono o disacridos, por lo que al adicionar a estos azcares la solucin de yodo, no aparecer coloracin azul ni rojiza (no confundir con el color de la solucin de yodo que es caf).

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Arginina y glucosa, agar. Peptona Extracto de levadura Triptona Cloruro de sodio Glucosa Clorhidrato de L-arginina Citrato frrico amnico Tiosulfato de sodio Prpura de bromocresol Agar Agua destilada 5.0 g 3.0 g 10.0 g 20.0 g 1.0 g 5.0 g 0.5 g 0.3 g 0.2 g 13.5 g 1.0 L

Suspender los ingredientes en agua destilada y hervir hasta disolucin del agar; envasar cantidades de 5.0 mL en tubos de 13 X 100 mm. Ajustar el pH entre 6.8 y 7.0. Esterilizar en autoclave a 121C durante 10 a 12 minutos. Dejar solidificar el medio inclinando los tubos. Principio de accin: La descarboxilacin del aminocido L-arginina, es realizada por microorganismos que poseen la enzima descarboxilasa y se lleva a cabo cuando se rompe la unin del grupo carboxilo, liberando dixido de carbono (gas) y formando putrescina, esta ltima es una diamina que se caracteriza por presentar reaccin alcalina. Por otra parte el indicador, prpura de bromocresol en medio alcalino presenta una coloracin prpura y en medio cido es amarillo. Por lo tanto si se produce putrescina el medio intensifica el color prpura por la alcalinidad producida, en caso contrario el medio no cambia de color; finalmente tambin se podr observar la fermentacin de la glucosa con su respectiva produccin de acidez, virando el medio a color amarillo verdoso. ASTEL, agar. (Ver: Soya tripticasena con 0,6% de extracto de levadura, agar). Baird Parker, agar. Ingredientes del medio base* Peptona de casena Extracto de levadura Extracto de carne Glicina Cloruro de litio Piruvato de sodio Agar Agua destilada

10.0 g 1.0 g 5.0 g 12.0 g 5.0 g 10.0 g 15.0 g 950.0 mL

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Suspender 58.0 g del medio en 950 mL de agua y calentar con agitacin constante, dejando hervir durante un minuto, posteriormente esterilizar a 121C1.0C durante 15 minutos. Enfriar y mantener el medio a 45C. Solucin de telurito de potasio: Preparar una solucin de telurito de potasio al 1% en agua, esterilizar a 121C durante 15 minutos. La solucin puede ser almacenada por varios meses a una temperatura entre 0 y 5C. Emulsin de yema de huevo: La preparacin de la emulsin de yema de huevo, tambin se realiza por separado, para lo cual lavar los huevos frescos con agua y jabn, enseguida limpiar los cascarones con una solucin de tintura de yodo (solucin alcohlica al 2%), o bien sumergirlos en una solucin de cloruro mercrico (1:1000); enjuagar con agua estril y secar con gasa tambin estril. En una campana de flujo laminar o en condiciones aspticas, abrir los huevos y vaciarlos en un separador de claras estril. Transferir las yemas en una probeta, hasta un volumen de 60.0 mL y completar a 90.0 mL con solucin salina isotnica estril, posteriormente verter la emulsin a un matraz Erlenmeyer que contenga perlas de vidrio estriles y agitar fuertemente para que se forme la emulsin, despus se filtra sobre gasa estril. Preparacin del medio: Medio base Solucin de telurito de potasio Emulsin de yema de huevo

95.0 mL 1.0 mL 5.0 mL

Mezclar perfectamente bien los ingredientes, manteniendo el medio a 45C, posteriormente repartir en cajas de Petri entre 15.0 y 20.0 mL de este medio, dejar enfriar hasta solidificacin del medio. Las cajas pueden almacenarse hasta por 48 h. despus de su preparacin, conservndolas a una temperatura entre 0 y 5C. Principio de accin: S. aureus tiene la capacidad de reducir el telurito de potasio (K2O3Te) a telurio metlico (Te), por esta razn las colonias se presentan de color negras metlicas de acuerdo a la siguiente reaccin: Te4+ Te0

Las lecitinas son fosfoglicridos, cuya estructura corresponde a steres de cidos grasos unidos con el cido fosfrico, glicerol y colina; son componentes normales de la yema de huevo. Las lecitinas pueden ser hidrolizadas por enzimas denominadas lecitinasas, existen 4 tipos de ellas, la A; B; C y D, siendo la C la producida generalmente por las bacterias; los productos de dicha hidrlisis son cido fosfrico y colina, por esta razn las colonias de S. aureus patgeno, al

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llevar a cabo la hidrlisis de la lecitina, forma halos transparentes alrededor de la colonia negra (reduccin del telurito), adems al romperse las uniones lipoproticas, se liberan grasas que son insolubles en el medio provocando una opalescencia alrededor de la colonia.

Bilis rojo violeta, agar. Peptona de carne Extracto de levadura Cloruro de sodio Lactosa Mezcla de sales biliares Rojo neutro Cristal violeta Agar Agua destilada 7.0 g 3.0 g 5.0 g 10.0 g 1.5 g 0.03 g 0.002 g 13.0 g 1.0 L

Humectar perfectamente los ingredientes del medio en 750.0 mL de agua, posteriormente ajustar el pH a 7.40.1 y esterilizar en matraz durante 30 minutos en bao de vapor. No esterilizar en caso de usarlo al momento. Principio de accin: La bilis de buey que contiene una mezcla de sales biliares y que se encuentra en el medio, inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas, permitiendo el desarrollo de bacterias coliformes cuyo Gram es negativo. Las sales biliares se presentan como derivados del cido clico y desoxiclico, su estructura qumica bsica es la del ciclo pentano perhidrofenantreno.

Bilis verde brillante, agar. Bilis de buey deshidratada Lactosa Peptona de gelatina Verde brillante Agar Agua destilada 20.0 g 10.0 g 10.0 g 0.0133 g 18.0 g 1.0 L

Suspender 40.0 g del medio en un litro de agua destilada, agitando constantemente para ayudar a la humectacin, despus hervir con agitacin constante para evitar que ste se queme. Se esteriliza en matraz a 121C1.0C durante 15 minutos.

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Principio de accin: La bilis de buey que contiene el medio, inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas, permitiendo el desarrollo de bacterias coliformes Gram negativas. Las sales biliares son derivados del cido clico y desoxiclico, su estructura qumica bsica es la del ciclo pentano perhidrofenentreno. Salmonella, desarrolla bien en este medio y presenta colonias rosas. Sus requerimientos nutricionales se satisfacen con la lactosa y la peptona de gelatina.

Bilis verde brillante con lactosa, caldo (Brila). Bilis de buey deshidratada Lactosa Peptona de gelatina Verde brillante Agua destilada 20.0 g 10.0 g 10.0 g 0.0133 g 1.0 L

Suspender 40.0 g de medio en un litro de agua destilada, agitar constantemente para ayudar a la disolucin. Distribuir el medio de cultivo en tubos de ensayo que contengan campanas de Durham. Esterilizar a 121C durante 15 minutos. Tener cuidado que ninguna campana de Durham presente gas despus de la esterilizacin. Principio de accin: La enzima -D-galactosidasa presente en las bacterias coliformes, hidroliza a la lactosa presente en el medio de cultivo, produciendo glucosa y galactosa, monmeros que, secuencialmente, son metabolizados hasta cidos y CO 2; este ltimo subproducto se detecta en las campanas de fermentacin despus de incubar de 24 a 48 h. Este medio de cultivo posee dos inhibidores bacterianos: las sales biliares y el verde brillante. Las sales biliares inhiben el crecimiento de microorganismos Gram positivos y tambin tienen efecto txico sobre algunos microorganismos Gram negativos. Las sales biliares se presentan como derivados del cido clico y desoxiclico, su estructura qumica bsica es la de ciclo pentano perhidrofenantreno. El verde brillante es un colorante que inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas y la mayora de bacilos Gram negativos excepto los coliformes. Incluso suprimen el crecimiento de los microorganismos anaerobios fermentadores de la lactosa como el Clostridium perfringens que dara reacciones falsas positivas.

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BPLS modificado, agar. Peptona de carne Extracto de levadura Extracto de carne Fosfato monobsico de sodio Fosfato dibsico de sodio (Na2HPO4) Lactosa Sacarosa Rojo de fenol Verde brillante Agar Agua destilada 10.0 g 3.0 g 5.0 g 0.6 g 1.0 g 10.0 g 10.0 g 0.09 g 0.0047 g 12.0 g 1.0 L

Suspender 52.0 g del medio en 750.0 mL de agua, para humectar los polvos insolubles, despus adicionar el resto del agua y calentar a ebullicin durante un minuto, el pH final debe ser de 6.9. No esterilizar el medio y repartirlo en cajas Petri. Principio de accin: En este medio se pueden distinguir las bacterias que fermentan la lactosa, las cuales presentan colonias que viran el medio a color amarillo por la formacin de acidez a partir del azcar. Las colonias rojas indican que los microorganismos no fermentan la lactosa.

Brewer anaerbico, agar. Peptona de casena Peptona de soya Cloruro de sodio L-cistina Dextrosa Tioglicolato de sodio Formaldehdo sulfoxilato de sodio Azul de metileno Agar Agua destilada 10.0 g 5.0 g 5.0 g 0.4 g 10.0 g 2.0 g 1.0 g 0.002 g 12.6 g 1.0 L

Suspender 55.0 g del medio en 750.0 mL de agua para humectar perfectamente bien, posteriormente adicionar el resto del agua, agitar y calentar hasta ebullicin durante un minuto o bien hasta que el medio se disuelva por completo. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos; el pH final debe ser de 7.20.2.

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Principio de accin: El tioglicolato de sodio consume el oxgeno ambiental, creando una atmsfera anaerbica, que es el objetivo de este medio. Adems este medio contiene ms sustancias reductoras como la cistina, el sulfoxilato y el formaldehdo, los cuales garantizan una anaerobiosis suficiente para los microorganismos. El azul de metileno es un indicador para reacciones de xido reduccin.

Bismuto sulfito, agar. Extracto de carne de res Mezcla de peptonas Glucosa Fosfato sdico dibsico (anhidro) Sulfato ferroso (anhidro) Sulfito de bismuto Verde brillante Agar Agua destilada pH final 5.0 g 10.0 g 5.0 g 5.0 g 0.3 g 8.0 g 0.025 g 20.0 g 1.0 L 7.6 0.2

Suspender todos los ingredientes en el agua destilada. Calentar hasta su disolucin completa, agitando frecuentemente. Ajustar el pH. Enfriar a 45C y verter en cajas de Petri estriles, distribuyendo de manera homognea el precipitado propio del medio. El aspecto de las placas es opaco, ce color verde plido y deben usarse el mismo da de su preparacin. Si la coloracin es parda, no deben utilizarse. El medio no debe esterilizarse en autoclave; el sobrecalentamiento afecta su selectividad. Principio de accin: En este medio el sulfito de bismuto acta con el verde brillante como agente selectivo para la inhibicin de coliformes, permitiendo el desarrollo de Salmonella. Los compuestos de azufre funcionan como sustrato para la produccin de cido sulfhdrico, mientras que la reduccin de las sales de bismuto a bismuto metlico tie las colonias de un brillo negro o caf metlico por la reduccin del sulfito a sulfuro, produciendo cido sulfhdrico.

BRILA, caldo (Ver: Bilis verde brillante con lactosa, caldo).

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Celobiosa, polimixina B y colistina modificado, agar (mCPC) Solucin 1: Peptona Extracto de carne Cloruro de sodio Solucin Stock de colorante 1000 X Agar Agua destilada

10.0 g 5.0 g 20.0 g 1.0 mL 15.0 g 0.9 L

Ajustar el pH a 7.6, posteriormente hervir hasta que el agar se funda, despus esterilizar a 121C durante 15 minutos. Enfriar entre 48 y 55C. Solucin stock de colorantes 1000 X: Azul de bromotimol Rojo de cresol Etanol al 95% 4.0 g 4.0 g 100.0 mL

Para obtener un color firme del medio, usar una solucin colorante stock, en lugar de estar pesando repetidamente los colorantes en polvo. Disolver los colorantes en el alcohol etlico hasta obtener una concentracin de 4% (peso/volumen); de esta solucin se toma un mililitro y se adiciona a un litro del medio mPCP (solucin 1), que se encuentra enfriado entre 48 y 55C. Solucin 2: Celobiosa Colistina Polimixina B Agua destilada

10.0 g 400000 UI 100000 UI 0.1 L

Disolver la celobiosa por calentamiento en agua destilada, enfriar y agregar los antibiticos. Esterilizar por filtracin y adicionar la solucin 2 a la solucin 1, mezclar y distribuir en cajas Petri. Principio de accin: La polimixina B, es un antibitico que inhibe el crecimiento de microorganismos Gram positivos, esto es un antibitico de espectro reducido. Permite entre otros, el desarrollo del gnero Vibrio, por ser stos Gram negativos. Adems contiene una alta concentracin de cloruro de sodio, en el que desarrollan los microorganismos halotolerantes.

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Cianuro, caldo (KCN). *Cianuro de potasio Polipeptona NaCl KH2PO4 Na2HPO4 Agua destilada 0.5 g 3.0g 5.0 g 0.225 g 5.64 g 1.0 L

Disolver todos los ingredientes excepto el cianuro de potasio, esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min. Principio de accin. Los citocromos son hemoprotenas que contienen hierro y actan como el ltimo eslabn de la cadena respiratoria aerobia, transfiri electrones al oxgeno con formacin de agua. El sistema citocromo se encuentra en oganismos aerobios y anaerobios facultativos, lo que posibilita la identificacin de aqullos que carecen de dicha enzima. El cianuro interrumpe el ltimo eslabn de la cadena respiratoria, sin embargo hay microorganismos que generan su energa metablica por vas alternas.

Cuenta Estndar, agar (Ver Mtodos estndar, agar).

Citrato Simmons, agar. Sulfato de magnesio Fosfato dihidrogenado de amonio Fosfato dipotsico Citrato de sodio tribsico Cloruro de sodio Azul bromotimol Agar Agua destilada pH 0.2 g 1.0 g 1.0 g 2.0 g 5.0 g 0.08 g 15.0 g 1.0 L 7.0 0.2

Disolver 23.0 g en 1 litro de agua destilada. Calentar hasta ebullicin para disolver completamente los ingredientes. Distribur en tubos y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min. Inclinar los tubos despus de esterilizar. Enfriar antes de su

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uso y conservar en refrigeracin (4-10 C). La caducidad es aproximadamente de 6-8 semanas. Se inocula a partir de un cultivo en medio slido (se recomienda agar Kligler hierro); no se recomiendan las suspensiones en caldo. Estriar SOLO EN EL PICO DE FLAUTA Principio de accin. El agar Citrato de Simmons se recomienda para la diferenciacin de la familia Enterobacteriaceae basada en la capacidad de utilizar el citrato como nica fuente de carbono. La energa puede ser proporcionada a algunas bacterias en ausencia de fermentacin o produccin de cido lctico por la utilizacin del citrato como nica fuente de carbono. Los microorganismos podrn introducir el citrato al citoplasma por una permeasa, donde ocurre un desdoblamiento a travs de la enzima citrato oxaloacetato liasa, dando como productos acetato, formato, lactato y/o dixido de carbono. El medio contiene tambin sales inorgnicas de amonio. Un microorganismo que puede utilizar el citrato como fuente de carbono tambin utiliza las sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, stas son degradadas a amoniaco alcalinizando el medio con lo cual se genera el vire del indicador azul de bromotimol de verde a pH neutro a un color azul a pH alcalino, considerndose de esta forma la reaccin como positiva.

Descarboxilasa (arginina, lisina y ornitina), medio base. Peptona Extracto de levadura Dextrosa (D-glucosa) Prpura de bromocresol Agua destilada 5.0 g 3.0 g 1.0 g 0.02 g 1.0 L

Se sugiere aadir 20.0 g de cloruro de sodio, en cada litro de medio de cultivo, cuando se desee identificar Vibrio cholerae; para Vibrio spp. haloflicos, adicionar 15.0 g de cloruro de sodio en cada litro de medio base; para otros gneros y especies de microorganismos seguir la formulacin descrita. Adicionar 5.0 g del aminocido de prueba; arginina, lisina y ornitina, en cada litro de medio base. Como control, usar base sin suplemento (aminocido). El medio se distribuye en tubos y se esterilizan a 121C durante 10 minutos; el pH del medio despus de esterilizar debe estar en 6.50.2 Principio de accin La base de nutrientes de este medio, permite las mejores condiciones de desarrollo de los microorganismos. La descarboxilacin del aminocido que contiene el medio de cultivo y que se realiza por la enzima descarboxilasa que poseen algunos microorganismos, provocan la liberacin del grupo carboxilo, quedando el grupo amino en el medio de cultivo, por lo que el medio se alcaliniza, dando una coloracin prpura.
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La lisina al ser descarboxilada, da como producto la cadaverina, en tanto que la ornitina y arginina, dan como productos finales putrescina. Debido a que la descarboxilacin solamente se lleva a cabo en medio cido (por debajo de pH 6.0), el medio debe acidificarse mediante la fermentacin de la glucosa; esto quiere decir que este medio slo se utiliza para la diferenciacin de microorganismos fermentadores de la glucosa y que posean la enzima descarboxilasa. Los microorganismos que son descarboxilasa negativos, pero son fermentadores de la glucosa, ocasionan que el medio se acidifique, por lo que el indicador vira a amarillo. En perodos de incubacin muy prolongados, se puede presentar alcalinizacin de la superficie del medio, dando por consecuencia un cambio en el color del medio, esto es se intensifica el color violeta.

DNA, agar. cido desoxirribonuclico (DNA) helicoidal de timo de ternera o 0.03 g equivalente Agar 1.0 g Solucin de cloruro de calcio anhidro 0.01M 0.1 mL Cloruro de sodio 1.0 g Solucin de azul de toluidina 0.1M 0.3 mL Solucin de Tris-(hidroximetil- aminometano) 0.05M, pH 9.0 100.0 mL Mezclar todos los ingredientes, excepto el azul de toluidina y agitar hasta disolucin del cido desoxirribonuclico, calentar a ebullicin. Posteriormente adicionar el azul de toluidina y distribuir en frascos pequeos con tapn de hule; NO ES NECESARIO ESTERILIZAR. Este medio es estable a temperatura ambiente an despus de 4 meses, funciona de manera correcta an despus de fundido varias veces. Principio de accin: Los cidos nucleicos, estn constituidos por azcar-fosfato-bases nitrogenadas, el azcar es la -D-desoxirribosa, que forma uniones ster con el cido fosfrico, unidas tambin a bases nitrogenadas como la adenina, guanina, timina y citosina, dando una forma en el espacio de una espiral o helicoidal. Estos steres pueden ser hidrolizados por enzimas; en el caso de la hidrlisis del DNA por la nucleasa microcccica (S. aureus), se producen principalmente mono y dinuclotidos, son productos de la ruptura del azcar (carbono 3 y 5) con el fosfato. Es importante hacer notar que la enzima DNAasa, es ms activa sobre el DNA desnaturalizado (por calentamiento) que sobre el DNA original, adems es una caracterstica de S. aureus patgeno.

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Dulcitol rojo de fenol, caldo. Peptona de casena Extracto de carne Cloruro de sodio Rojo de fenol Dulcitol Agua destilada pH

10.0 g 1.0 g 5.0 g 0.018 g 10.0 g 1.0 L 7.40.2

Pesar con precisin la cantidad descrita en el envase. Rehidratar con el agua destilada. Calentar suavemente la solucin. El carbohidrato se puede agregar antes de la esterilizacin. Ajustar el pH del medio antes de esterilizar. Esterilizar 116-118C durante 15 min. Es altamente recomendable la esterilizacin del medio base SIN EL CARBOHIDRATO a 121C durante 15 min, enfriar el medio base a 45C y agregar la solucin del carbohidrato esterilizada por filtracin en membrana. Distribuir en tubos estriles. Conservar en refrigeracin (4-10C). La caducidad es aproximadamente de 6-8 semanas. Se inocula a partir de un cultivo puro (agar Kligler hierro u otro medio adecuado) de 18 a 24 horas de incubacin. Principio de accin Se determina la capacidad de un microorganismo para fermentar un carbohidrato especfico en un medio basal y producir cido o cido con gas visible. La fermentacin es un proceso anaerbio de oxidacin-reduccin, en el cual un sustrato orgnico acta como el aceptor final de electrones. Los productos caractersticos de la fermentacin bacteriana son: a) cido lctico, b) cidos actico y frmico, c) cido lctico y alcohol etlico, d) etanol, e) acetilmetilcarbinol y CO2, f) cido succnico a cido propinico y CO2, g) CO2 y acetona a alcohol isoproplico y h) cido butrico a alconol butlico. El indicador de pH utilizado para demostrar la fermentacin del hidrato de carbono es el rojo de fenol, ya que la mayora de los productos finales del metabolismo de carbohidratos son cidos y generaran un vire del indicador a amarillo.

EC, caldo (Escherichia coli, caldo para). Bacto triptosa Bacto lactosa Bacto sales biliares No. 3 Fosfato dipotsico Fosfato monopotsico Cloruro de sodio Agua destilada 20.0 g 5.0 g 1.5 g 4.0 g 1.5 g 5.0 g 1.0 L

Disolver todos los ingredientes en un litro de agua destilada y calentar ligeramente para una mejor disolucin. Ajustar el pH a 6.9 0.2 (25C) y distribuir 10 mL del medio a cada tubo de ensayo, con campanas de Durham. Esterilizar en autoclave
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durante 15 minutos a 121C. Se recomienda que antes de abrir la autoclave, se deje bajar la temperatura a 75C para evitar que se introduzcan burbujas de aire en las campanas de Durham. Principio de accin: La lactosa es hidrolizada por la enzima -D-galactosidasa presente en las bacterias coliformes, generndose como subproductos glucosa y galactosa que, secuencialmente, son metabolizados hasta cidos y CO2; este ltimo se detecta en las campanas de Durham. Cuando la fermentacin de lactosa se lleva a cabo a 44.5 C la prueba positiva indica presencia de Escherichia coli. Las sales biliares inhiben el crecimiento de bacterias Gram-positivas particularmente los bacilos y los estreptococos fecales. La triptona constituye la fuente ms importante de nutrimentos y los fosfatos constituyen el sistema regulador del pH. El cloruro de sodio regula el equilibrio osmtico.

EC-MUG, caldo (Escherichia coli, caldo con metilumbeliferil glucurnido). Preparar el caldo EC y adicionar 50.0 mg de 4-metilumbeliferil- (MUG) por cada litro medio de cultivo antes de esterilizar (121C por 15 minutos). Principio de accin: Alrededor del 97% de las cepas de E. coli (incluidas las no productoras de gas) producen la enzima -D-glucuronidasa (GUD), la cual escinde al sustrato MUG dando como producto final la 4-metilumbelliferona; este ltimo compuesto es fcilmente detectable cuando se expone a una fuente de luz ultravioleta.

Eosina azul de metileno de Levin, agar (EMB-L). Peptona Lactosa Fosfato dibsico de potasio Eosina Y Azul de metileno Agua destilada 10.0 g 10.0 g 2.0 g 0.4 g 0.065 g 1.0 L

Disolver la peptona, el fosfato y el agar en un litro de agua, calentar a ebullicin hasta la disolucin completa. Posteriormente distribuir en porciones de 100 200 mL y esterilizar a no ms de 121C por 15 minutos; el pH debe ser de 7.1 0.2. Fundir el medio antes de su uso y adicionar a cada porcin de 100 mL: a) 5 mL de solucin de lactosa al 20% b) 2 mL de solucin acuosa de eosina al 2%

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c) 4,3 mL de solucin acuosa de azul de metileno al 0,15%. Nota: Cuando se use el producto deshidratado, disolver todos los ingredientes de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Principio de accin El agar eosina azul de metileno es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La accin selectiva se debe a la presencia de los colorantes eosina y azul de metileno, los cuales inhiben el crecimiento de las bacterias Gram-positivas. El medio es diferencial porque permite diferenciar los microorganismos fermentadores de lactosa y productores de una gran cantidad de cido, de aquellos microorganismos que producen poco cido, o que no fermentan la lactosa. Las colonias de los microorganismos fermentadores de lactosa productores de gran cantidad de cido se observan de color verde metlico, esto se debe a la precipitacin de los colorantes -sobre la superficie de las colonias e incluso en la superficie del medio de cultivo-, cuando las condiciones son extremadamente cidas.

Eosina azul de metileno, agar (EMB-lactosa sacarosa, agar). Peptona Lactosa Sacarosa K2HPO4 Eosina Yellow Azul de metileno Agar Agua destilada 10.0 g 5.0 g 5.0 2.0 g 0.4 g 0.065 g 13.5g 1.0 L

Humectar y disolver los ingrediente, posteriormente hervir el medio y ajustar el pH a 7.1 0.2, esterilizar a 121C durante 15 minutos y finalmente verter en placas. Principio de accin La sacarosa y lactosa permiten distinguir al gnero Salmonella y Shigella, (porque ambas no fermentan dichos azcares), de la flora acompaante, por ejemplo Citrobacter, Aeromonas y Proteus las cuales no fermentan la lactosa pero s la sacarosa; cuando el resto de la flora acompaante son bacterias Gram positivas, stas son inhibidas por la eosina y el azul de metileno.

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Entrico de Hekten, agar. Proteosa peptona Extracto de levadura Lactosa Sacarosa Salicina Sales biliares Cloruro de sodio Tiosulfato de sodio Citrato frrico amoniacal Azul de bromotimol Fucsina cida Agar Agua destilada pH final 12.0 g 3.0 g 12.0 g 12.0 g 2.0 g 9.0 g 5.0 g 5.0 g 1.5 g 0.064 g 0.1 g 13.5 g 1.0 L 7.5 0.2

Suspender los ingredientes en el agua destilada estril, hervir con agitacin hasta la disolucin completa del agar. No sobrecalentar. Dejar enfriar entre 55 y 60C, posteriormente distribuir en cajas de Petri estriles en condiciones aspticas. Principio de accin La concentracin alta de peptona, disminuye la actividad inhibitoria de las sales biliares en contra de las especies de Shigella. Los carbohidratos adicionales (sacarosa y salicina) mejoran la diferenciacin con respecto a la lactosa, y la menor toxicidad del doble indicador mejora la recuperacin. Debido a los dos indicadores, azul de bromotimol y fucsina cida, las colonias lactosa-positivas muestran una diferencia cromtica de color amarillo, frente a las colonias lactosanegativas (colonias azules o verdes). Igual ocurre en el caso de colonias que fermentan lentamente la lactosa y ms fcilmente la sacarosa y la salicina, sustancias reaccionantes fcilmente fermentables, lo que impide hallazgos de patgenos falsamente positivos. El incremento en el contenido de lactosa ayuda al reconocimiento principal de los organismos que fermentan la lactosa lentamente. El tiosulfato y el citrato frrico se utilizan para la deteccin de los organismos productores de cido sulfhdrico por reduccin del tiosulfato. Una mezcla de sales biliares inhibe a una gran parte de la microbiota acompaante. Se recomienda la adicin de novobiocina en una concentracin de 15.0 mg/mL, lo cual mejora la selectividad del medio inhibiendo a especies de Citrobacter y Proteus.

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Esculina bilis, agar. Extracto de carne Peptona Sales biliares Citrato frrico amoniacal Esculina Agar Agua destilada 3,0 g 5,0 g 40,0 g 0,50 g 1,0 g 15,0 g 1000,0 mL

Disolver por calentamiento el extracto de carne, la peptona y el agar en 400,0 mL de agua destilada. Por otra parte, se disuelven las sales biliares en 100,0 mL de agua destilada y el citrato frrico amoniacal en otros 100,0 mL de agua destilada. Mezclar todas las soluciones y completar hasta 1000,0 mL con agua destilada. Calentar la mezcla hasta la completa disolucin de los ingredientes. Ajustar el pH a 7,4 y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min. Enfriar a temperatura de 50C y aadir 100,0 mL de solucin de esculina al 1% esterilizada por filtracin. Distribuir aspticamente en tubos de ensayo y dejar solidifcar en posicin inclinada. Principio de accin La peptona y extracto de carne proveen de carbono, nitrgeno, minerales, vitaminas y otros factores de crecimiento para que los organismos crezcan. La esculina es hidrolizada por las especies de Listeria para formar esculetina y dextrosa. La esculetina reacciona con la sal de fierro (citrato frrico amoniacal) que contiene el medio para producer un complejo negro a caf rojizo que aparece en el medio rodeando las colonias. La Listeria monocytogenes es tolerante a las sales biliares. El agar es el agente solidifante.

Extracto de Malta, agar. Extracto de malta Peptona de harina de soya Agar Agua destilada 30,0 g 3,0 g 15.0 g 1.0 L

Suspender 33.6 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada y dejar humectar el polvo, calentar y agitar frecuentemente, dejar hervir durante un minuto. Esterilizar a 121C durante 15 minutos. Ajustar el pH a 5.6 0,1. Principio de accin: Se utiliza para la demostracin, aislamiento y numeracin de hongos y levaduras. A partir del extracto de malta y la harina de soya se observa que stos favorecen el crecimiento de hongos y levaduras, al igual que a otras bacterias, sin embargo se le confiere selectividad al medio para que desarrollen los hongos y las
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levaduras, acidificando el medio con una polucin de cido tartrico al 10%, adicionando a cada litro de medio de cultivo, 14 mL del cido.

Fraser base, caldo. Digerido pancretico de casena Proteosa peptona No. 3 Extracto de carne Extracto de levadura Cloruro de sdio Fosfato disdico Fosfato monopotsico Esculina Acido nalidxico Acrilflavina HCl Cloruro de ltio Fraser caldo, suplemento Vial com 10 mL de citrato frrico amoniacal 5,0 g 5,0 g 5,0 g 5,0 g 20,0 g 9,6 g 1,35 g 1,0 g 0,02 g 24,0 mg 3,0 g

0,5 g

Suspender 55 g de polvo en un 1,0 L de agua destilada. Mezclar para homogeneizar. Calentar con agitacin frecuente y hervir durante 1 minuto hasta disolucin completa. Esterilizar a 121C durante 15 minutos. Enfriar a temperatura ambiente. Aspticamente aadir 10,0 mL del suplemento para caldo Fraser. Mezclar bien. Principio de accin Las peptonas, extracto de carne y extracto de levadura proporcionan nitrgeno, vitaminas y minerales. El fosfato de sdio y potasio son los agentes amortiguadores. La diferenciacin se ve estimulada por la adicin del citrato frrico amoniacal. Debido a que todas las especies de Listeria hidrolizan la esculina, la adicin de iones fierro al medio detectar la reaccin. Un ennegrecimiento del medio por las bacterias que hidrolizan la esculina da como resultado la formacin del 6,7-dihidroxicumarina que reacciona con los iones fierro. La selectividad es propiciada por la presencia del cloruro de ltio, cido nalidxico y acrilflavina en la frmula. La alta tolerancia de Listeria a la sal se utiliza como medio para inhibir el crecimiento de los enterococos.

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Gelatina, agar (GA). Tripticasa (digerido pancretico de casena) Cloruro de sodio Gelatina Agar Agua destilada 10.0 g 10.0 g 30.0 g 15.0 g 1.0 L

Suspender los ingredientes en el agua y hervir hasta disolucin de la gelatina y el agar; ajustar el pH a 7.20.2 y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Enfriar el medio entre 45 y 50C y distribuir en cajas de Petri.

Principio de accin: En el caso especfico de la determinacin de V. cholerae se utiliza este medio de cultivo para purificacin de colonias sospechosas provenientes de los medios de cultivo TCBS o mCPC, utilizando el principio de la halofilia o halotolerancia.

Gelatina con sal, agar (GS). Tripticasa (digerido pancretico de casena) Cloruro de sodio Gelatina Agar Agua destilada 10.0 g 30.0 g 30.0 g 15.0 g 1.0 L

Suspender los ingredientes en agua y hervir hasta disolucin de la gelatina y el agar; ajustar el pH a 7.20.2 y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Enfriar el medio entre 45 y 50C y distribuir en cajas de Petri. Si es necesario para inhibir la diseminacin de Vibrio spp, tal como Vibrio alginolyticus, usar entre 25.0 y 30.0 gramos de agar por litro del medio. Principio de accin: En este medio se puede observar si los microorganismos licuan la gelatina o no, en caso afirmativo, se interpreta que el microorganismo contiene enzimas proteolticas. Por otra parte el medio contiene 3% de cloruro de sodio, lo cual sirve para poner de manifiesto la tolerancia que un microorganismo puede tener a estas concentraciones de sal.

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Gelatina con sal, caldo (GS). Tripticasa (digerido pancretico de casena) Cloruro de sodio Gelatina Agua destilada 10.0 g 30.0 g 30.0 g 1.0 L

Suspender los ingredientes en agua y calentar si es necesario para ayudar a la disolucin del medio; ajustar el pH a 7.20.2 y esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos en tubos de 13 x 100. Principio de accin: Este medio se utiliza para observar la tolerancia al cloruro de sodio que presentan algunos microorganismos. Hierro y tres azcares, agar (TSI). Peptona de carne Peptona de casena Cloruro de sodio Lactosa Sacarosa Glucosa Agar Rojo de fenol Sulfato ferroso amnico pentahidratado Tiosulfato de sodio Agua destilada 10.0 g 10.0 g 5.0 g 10.0 g 10.0 g 1.0 g 13.0 g 0.025 g 0.20 g 0.20 g 1.0 L

Suspender los ingredientes en el agua destilada. Calentar a ebullicin agitando ocasionalmente hasta disolucin completa. Enfriar a 60C y ajustar el pH a 7.3 0.2. Distribuir en volmenes de 3.0 mL en tubos de 13 x 100 mm y esterilizar a 121C durante 15 minutos. Inclinar los tubos de manera que el medio de cultivo en el fondo alcance una altura de 3.0 cm. y una profundidad de 4.0 cm. El medio es de color rojo. Principio de accin En esta prueba bioqumica, se pueden observar: a) fermentacin de los diferentes azcares que contiene, b) produccin de gas: CO2 e H2 y c) produccin de cido sulfhdrico H2S. En el pico de flauta se encuentra la lactosa (1%), el que puede ser fermentado en condiciones tanto aerobias como anaerobias. Este disacrido lo degrada la galactosidasa produciendo glucosa y galactosa; estos 2 ltimos azcares pueden ser metabolizados en condiciones aerobias a travs del ciclo de Krebs, dando como productos finales CO2, H2O y energa: pero si el metabolismo se realiza en
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condiciones anaerobias por la va de Embden-Meyerhof-Parnas, se obtiene como producto intermedio, cido pirvico, llegando finalmente a travs del ciclo de Krebs a CO2, H2O y energa. El indicador rojo de fenol, en medio cido es amarillo y en alcalino es rojo. Por lo tanto el medio antes de la fermentacin de los azcares es de color rojo. La glucosa (0.1%) se detecta en el fondo del tubo (bioqumica) y es metabolizada en condiciones anaerobias siguiendo el ciclo de Embden-Meyerhof-Parnas, dando como productos intermedios ATP y cido pirvico y como productos finales: cidos orgnicos, aldehdos, alcoholes, CO2, H2O y energa. La sacarosa (1%) se pone de manifiesto virando todo el tubo a una coloracin amarilla, esto puede traer confusin, cuando se encuentra un microorganismo que no fermenta la lactosa, pero s la sacarosa, sin embargo el resultado del resto de bioqumicas ayudarn a la interpretacin de esta prueba. Otro sistema para la diferenciacin es aportado por los indicadores de cido sulfhdrico presentes en el medio; una sal, el citrato de amonio frrico, y otro producto qumico, el tiosulfato de sodio. Ambos indicadores deben estar presentes. En una primera etapa de la reaccin el microorganismo en ambiente cido reaccionar con el tiosulfato de sodio para generar el cido sulfhdrico. En la segunda etapa de la reaccin este compuesto reaccionar con los iones frricos generando un precipitado negro insoluble debido a la formacin del sulfuro ferroso. Este compuesto puede enmascarar el resultado de ambiente cido, sin embargo para la formacin del cido sulfhdrico existe una condicin cido aunque no sea visible. El TSI es un medio para la diferenciacin de Enterobacterias de acuerdo a su capacidad para fermentar la lactosa, sacarosa y/o glucosa, y para producir cido sulfhdrico. No solamente algunas especies de Proteus, pueden mostrar reacciones similares a Salmonella y/o Shigella, siendo necesario distinguirlas de stas por su habilidad para degradar la urea. Por esta razn se recomienda realizar al mismo tiempo otra prueba bioqumica como el caldo urea o el agar urea.

Hugh Leifson con glucosa 1%, medio. Peptona Extracto de levadura Cloruro de sodio Dextrosa Prpura de bromocresol Agar Agua destilada 2.0 g 0.5 g 20.0 g 10.0 g 0.015 g 3.0 g 1.0 L

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Suspender los ingredientes en el agua y hervir hasta que se disuelva el agar; ajustar el pH a 7.40.2, posteriormente colocar el medio en tubos y esterilizar a 121C durante 15 minutos. El medio debe quedar de color verde. Principio de accin El metabolismo de los carbohidratos se lleva a cabo en condiciones aerobias o anaerobias, sin embargo la fermentacin es un proceso anaerobio y las bacterias que realizan este proceso por lo general son anaerobias facultativas. Los microorganismos al fermentar un azcar, hidrolizan el carbohidrato, dando como productos finales, compuestos que contienen entre uno y cuatro carbonos, dependiendo de las diferentes bacterias, siendo el principal intermediario el cido pirvico. La ms importante va metablica para fermentar la glucosa es la de Embden-Meyerhof-Parnas. Al aadir un carbohidrato al medio de cultivo, se puede llevar a cabo la degradacin de ste con la subsecuente produccin de cido, lo que se hace evidente por el indicador de pH, prpura de bromocresol, el que vira a color amarillo. La degradacin se lleva a cabo mientras el medio est expuesto al aire (esta degradacin puede ser oxidativa o fermentativa), o en ausencia del aire (degradacin fermentativa solamente). Para cada carbohidrato, inocular un tubo con un cultivo puro del microorganismo seleccionado como patrn positivo, la inoculacin se hace por picadura hasta el fondo de los tubos, despus de lo cual un tubo se sella con parafina estril y otro no se sella. El microorganismo utilizado para la inoculacin deber estar en fase logartmica de desarrollo. Incubar de 24 a 48 h a temperatura de 35C 2C de incubacin. Una coloracin amarilla en ambos tubos, abierto y sellado con parafina, significa una degradacin fermentativa, mientras que una coloracin amarilla slo en el tubo abierto, indica que el carbohidrato en cuestin es degradado solamente por va oxidativa. La degradacin oxidativa se presenta slo o cercanamente en la superficie del medio, mientras que la degradacin fermentativa, se presenta en todo el tubo, inclusive en la superficie de ste. Se comprueba finalmente el crecimiento microbiano producido mediante la observacin de turbidez, si sta se observa solamente a lo largo de la lnea de la picadura (cepa no mvil) o a lo largo de todo el medio (cepa mvil).

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Infusin cerebro corazn, caldo. Infusin cerebro corazn, agar (BHI, caldo/ BHI, agar). Infusin de cerebro de ternera Infusin de corazn de res Peptona de gelatina Cloruro de sodio Fosfato dibsico de sodio, dodecahidratado Glucosa Agar bacteriolgico a Agua destilada a En caso de requerirse agar infusin cerebro corazn 200.0 mL 250.0 mL 10.0 g 5.0 g 2.5 g 2.0 g 15.0 g 1.0 L

Disolver los ingredientes en el agua y calentar a disolucin de los cristales de agar si es necesario, posteriormente distribuir en matraces o tubosde acuerdo a la monografa correspondiente y esterilizar a 121C1.0C durante 15 minutos. En caso de requerirse en cajas de Petri deber enfriarse a 45C y verter en condiciones de asepsia. Principio de accin: Los componentes de la infusin de cerebro de ternera y de la infusin de corazn de res hacen del medio BHI un medio de cultivo de enriquecimiento ideal para microorganismos con requerimientos nutricionales exigentes.

Kligler hierro, agar. Extracto de carne Extracto de levadura Peptona Proteosa peptona Lactosa Glucosa Sulfato ferroso heptahidratado Citrato de amonio frrico / citrato de amonio Cloruro de sodio Tiosulfato de sodio Rojo fenol Agar Agua desionizada pH 3.0 g 3.0 g 15.0 g 5.0 g 10.0 g 1.0 g 0.2 g 0.5 g 5.0 g 0.3 g 0.024 g 12.0 g 1,000 mL 7.40.2

Disolver los ingredientes en el agua y calentar a disolucin de los cristales de agar si es necesario, posteriormente distribuir en tubos de acuerdo a la monografa correspondiente y esterilizar a 121C1.0C durante 15 minutos. Deber enfriarse a 45C e inclinar.
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Principio de accin En esta prueba bioqumica, se pueden observar: a) fermentacin de los diferentes azcares que contiene, b) produccin de gas: CO2 e H2 y c) produccin de cido sulfhdrico H2S. En el pico de flauta se encuentra la lactosa (1%), el que puede ser fermentado en condiciones tanto aerobias como anaerobias. Este disacrido lo degrada la galactosidasa produciendo glucosa y galactosa; estos 2 ltimos azcares pueden ser metabolizados en condiciones aerobias a travs del ciclo de Krebs, dando como productos finales CO2, H2O y energa: pero si el metabolismo se realiza en condiciones anaerobias por la va de Embden-Meyerhof-Parnas, se obtiene como producto intermedio, cido pirvico, llegando finalmente a travs del ciclo de Krebs a CO2, H2O y energa. El indicador rojo de fenol, en medio cido es amarillo y en alcalino es rojo. Por lo tanto el medio antes de la fermentacin de los azcares es de color rojo. La glucosa (0.1%) se detecta en el fondo del tubo (bioqumica) y es metabolizada en condiciones anaerobias siguiendo el ciclo de Embden-Meyerhof-Parnas, dando como productos intermedios ATP y cido pirvico y como productos finales: cidos orgnicos, aldehdos, alcoholes, CO2, H2O y energa. Otro sistema para la diferenciacin es aportado por los indicadores de cido sulfhdrico presentes en el medio; una sal, el citrato de amonio frrico, y otro producto qumico, el tiosulfato de sodio. Ambos indicadores deben estar presentes. En una primera etapa de la reaccin el microorganismo en ambiente cido reaccionar con el tiosulfato de sodio para generar el cido sulfhdrico. En la segunda etapa de la reaccin este compuesto reaccionar con los iones frricos generando un precipitado negro insoluble debido a la formacin del sulfuro ferroso. Este compuesto puede enmascarar el resultado de ambiente cido, sin embargo para la formacin del cido sulfhdrico existe una condicin cido aunque no sea visible. El agar Kligler hierro es un medio para la diferenciacin de Enterobacterias de acuerdo a su capacidad para fermentar la lactosa y/o glucosa, y para producir cido sulfhdrico. No solamente algunas especies de Proteus, pueden mostrar reacciones similares a Salmonella y/o Shigella, siendo necesario distinguirlas de stas por su habilidad para degradar la urea. Por esta razn se recomienda realizar al mismo tiempo otra prueba bioqumica como el caldo urea o el agar urea

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Koser citrato de, caldo. NaNH4HPO4 4H2O KH2PO4 MgSO4 7H2O Citrato de sodio 2H2O Agua destilada 1,5 g 1,0 g 0,2 g 3,0 g 1.0 L

Disolver todos los ingredientes en el agua, si es necesario calentar para ayudar a la disolucin, despus ajustar el pH final de 6,7 0,2 y distribuir preferentemente en tubos de ensayo con tapa de rosca. Esterilizar a 121C por 15 minutos. Esta formulacin se recomienda en los Mtodos de Anlisis Oficial de AOAC y en los Mtodos Estndares para el Anlisis de Agua y Aguas de Desecho (APHA). Principio de accin: En ausencia de carbohidratos fermentables como la glucosa y lactosa, algunos microorganismos son capaces de utilizar el citrato como fuente de carbono para la obtencin de energa. Esta capacidad depende de la presencia de la enzima citrato permeasa, la cual facilita el transporte del citrato dentro de la clula. El citrato es el principal intermediario del ciclo de Krebs y es producido por la condensacin del acetilo activo con el cido oxaloactico. El citrato es hidrolizado por la enzima citrasa, generando como productos cido oxaloactico y acetato. Estos productos son convertidos enzimticamente a cido pirvico y dixido de carbono. La presencia de turbidez en el medio de cultivo indica que la prueba es positiva.

Lactosa bilis (2%) verde brillante, caldo. Ver: Bilis verde brillante con lactosa, caldo (Brila).

Lactosa verde brillante bilis al 2%, caldo (Brila). Ver: Bilis verde brillante con lactosa, caldo (Brila).

Lactosado, caldo. Extracto de carne Peptona Lactosa Agua destilada 3.0 g 5.0 g 5.0 g 1.0 L

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Disolver los ingredientes en el agua destilada, calentando a 65C. Distribuir en porciones de 225.0 mL, en frascos de 500 mL de capacidad. Esterilizar a 121 1C durante 15.0 min. Principio de accin El caldo lactosado se utiliza para la identificacin presuntiva de organismos coliformes en leche, agua y alimentos. Por ser un medio nutritivo no selectivo, puede tambin utilizarse como medio de preenriquecimiento, antes del enriquecimiento selectivo de Salmonella en alimentos. Proporciona condiciones para la recuperacin de clulas daadas por los procesos de conservacin.

Lauril sulfato de sodio, caldo. Bacto triptosa Bacto lactosa Fosfato potsico, dibsico Fosfato potsico, monobsico Cloruro de sodio Lauril sulfato de sodio Agua destilada 20.0 g 5.0 g 2.75 g 2.75 g 5.0 g 0.1 g 1.0 L

Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentando si es necesario, para ayudar a la disolucin; posteriormente ajustar el pH a 6.8 0.2 a 25C y distribuir en tubos de ensayo conteniendo campanas de Dirham la cantidad necesaria del medio. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121C. Antes de abrir el autoclave, dejar bajar la temperatura a 75C para que no queden burbujas en las campanas de Durham. Preparacin de caldo lauril sulfato de sodio de acuerdo con el inculo utilizado INOCULO (mL) 1 10 10 20 100 100 100 CANTIDAD MEDIO TUBO (mL) 10 o ms 10 20 10 50 35 20 DE VOLUMEN DE CALDO LAURIL POR MEDIO MAS TRIPTOSA INOCULO (mL) REQUERIDO g/L 11 o ms 20 30 30 150 135 120 35,6 71,2 53,4 106,8 106,8 137,1 213,6

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Principio de accin Este medio se usa como prueba presuntiva en la deteccin del grupo coliforme. El lauril sulfato de sodio, es un agente tensoactivo que inhibe el desarrollo de bacterias Gram positivas, debido a los constituyentes de la membrana de stos, sin embargo s se pueden desarrollar bacterias Gram negativas. La triptona proporciona nitrgeno, azufre, carbono y algunos minerales que son esenciales para el crecimiento microbiano. Los fosfatos funcionan como amortiguadores del pH en el medio de cultivo y el cloruro de sodio mantiene el equilibrio osmtico. La lactosa es utilizada como fuente de carbono por los microorganismos. La fermentacin de la lactosa da como productos finales cido y gas, este ltimo es detectado en las campanas de fermentacin (Durham).

Leche descremada reconstituida Leche descremada Verde brillante al 0.1% Agua destilada 100.0 g 0.45 mL 1.0 L

Diluirla leche descremada reconstituida en el agua destilada. Agitar circularmente hasta disolucin. Distribuir en volmenes de 225.0 mL en matraces Erlenmayer de 500 mL. Esterilizar a 121 1C por 15 min. Principio de accin La leche por ser un alimento rico en nutrientes (protenas y azcares) puede utilizarse para el preenriquecimiento de Salmonella en ciertos alimentos. Para inhibir la microbiota acompaante se debe adicionar 0.45 mL de una solucin de verde brillante al 0.1%.

Lisina Hierro, agar (LIA). Peptona de gelatina Extracto de levadura Glucosa L-Lisina Citrato frrico de amonio Tiosulfato de sodio Prpura de bromocresol Agar Agua destilada 5.0 g 3.0 g 1.0 g 10.0 g 0.5 g 0.04 g 0.02 g 15.0 g 1.0 L

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Disolver los ingredientes en el agua destilada y mezclar bien; calentar hasta ebullicin con agitacin frecuente hasta conseguir la disolucin completa. Esterilizar en autoclave 12 minutos a 121C. Enfriar de 50-60C y ajustar el pH de 6,7 0,1. Distribuir en volmenes de 3 ml en tubos de 13 x 100 mm. Los tubos se enfran en posicin inclinada, de tal modo que se obtengan columnas de medio de 3 cm y una parte inclinada de 2 cm. Principio de accin La lisina puede ser descarborxilada por los microorganismos y transformarla en la amina cadaverina. Esto produce un viraje al violeta del indicador de pH prpura de bromocresol. Puesto que la descarboxilacin slo tiene lugar en medio cido (pH inferior a 6.0), es necesario que se produzca previamente la acidificacin de medio de cultivo, por fermentacin de la glucosa. Por este motivo, este medio de cultivo slo puede utilizarse para la diferenciacin de cultivos que fermentan la glucosa. Los microorganismos que no descarboxilan la lisina, pero fermentadores de la glucosa, producen un viraje al amarillo de la totalidad del medio de cultivo. La incubacin prolongada puede ocasionar una alcalinizacin en la zona de la superficie del medio de cultivo y en consecuencia, se produce un viraje al violeta. La formacin de HxS produce una coloracin negra debida al sulfuro de hierro producido. Las cepas del grupo Proteus-Providencia, con excepcin de algunas cepas de Proteus morganii, desamina a la lisina a cido -cetocarbnico. Este ltimo forma compuestos pardo-rojizos en la regin superficial del medio de cultivo con la sal de hierro y bajo la influencia de oxgeno.

Listeria para enriquecimiento (EB) pH 7,3, caldo. Aadir aspticamente a 500 mL de caldo soya tripticasena con extracto de levadura (CSTEL) estril, 5,0 mL de cada una de las siguientes soluciones que integran el medio (solucin de acrilflavina, solucin de cicloheximida y solucin de cido nalidxico). El caldo de enriquecimiento as preparado (EB), se distribuye en matraces Erlenmeyer de 500,0 mL estrilies a razn de 250,0 mL: Solucin de acriflavina Clorhidrato de acriflavina Agua destilada Solucin de cido nalidxico Acido nalidxico (sal sdica) Hidrxido de sodio 0.05N Solucin de cicloheximida Cicloheximida Etanol Agua destilada

15,0 mg 10.0 mL 40,0 mg 10.0 mL 50,0 mg 4.0 mL 6.0 mL

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Precaucin: La cicloheximida es una sustancia qumica altamente txica, durante su manejo deben emplearse guantes, lentes de proteccin y lavarse las manos Principio de accin Las peptonas y el extracto de levadura son fuente de nitrgeno, vitaminas y minerales. La dextrosa es la fuente de carbohidratos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico del medio. Los fosfatos proveen de capacidad amortiguadora. El piruvato de sodio ayuda a resucitar organismos estresados. El cido nalidxico inhibe el crecimiento de organismos gram-negativo. El clorhidrato de acrilflavina suprime el crecimiento de bacterias gram-positivo. La cicloheximida se incorpora para inhibir hongos saprofticos.

LMP, medio. Cloruro de litio feniletanol-moxolactam (para Listeria). Fenil etanol agar 35,5 g Glicina anhidra 10,0 g Cloruro de litio 5,0 g Solucin de moxolactam al 1% disuelto en solucin amortiguadora 2,0 mL de fosfatos de pH 6,0 Agua 1,0 L Esterilizar el medio (sin moxolactam) en autoclave a 121 1C durante 15 minutos. Enfriar entre 48 y 50C y agregar la solucin de moxolactam previamente esterilizada por filtracin. Distribuir volmenes de 12 a 15 mL del medio en cajas de Petri estriles. Las placas delgadas facilitan la observacin de las colonias.

Mac Conkey, agar. Proteasa peptona o polipeptona Peptona o gelizante Lactosa Sales biliares No. 3 Cloruro de sodio Rojo neutron Cristal violeta Agar Agua destilada 3.0 g 17.0 g 10.0 g 1.5 g 5.0 g 0.03 g 0.001 g 13.5 g 1.0 L

Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentar si es necesario para disolver, ajustar el pH a 7.1 0.2 a 25C y esterilizar a 121C durante 15 minutos. Enfriar a 45-50C y vaciar en cajas Petri.

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Principio de accin El agar Mac Conkey es un medio esta dada por las sales biliares positivas. El cristal violeta es un algunas bacterias Gram-positivas. fuente de nutrimentos.

selectivo y diferencial. La selectividad del medio que inhiben el desarrollo de bacterias Gramcolorante que tambin inhibe el crecimiento de Finalmente, las peptonas constituyen la principal

El medio es diferencial porque permite diferenciar los microorganismos fermentadores de lactosa de los que no lo son, mediante el indicador de pH rojo neutro. Cuando la lactosa es fermentada, el medio de cultivo se acidifica, esto provoca el vire del indicador a rojo; por lo que las colonias de los microorganismos fermentadores de lactosa aparecen de color rojo oscuro o rosadas. Las colonias de las bacterias no fermentadoras de lactosa son transparentes, incoloras o mbar.

Manitol rojo de fenol, caldo Peptona de casena Extracto de carne Cloruro de sodio Rojo de fenol Manitol Agua destilada pH 10.0 g 1.0 g 5.0 g 0.018 g 10.0 g 1.0 L 7.40.2

Pesar con precisin la cantidad descrita en el envase. Rehidratar con el agua destilada. Calentar suavemente la solucin. El carbohidrato se puede agregar antes de la esterilizacin. Ajustar el pH del medio antes de esterilizar. Esterilizar 116118C durante 15 min. Es altamente recomendable la esterilizacin del medio base SIN EL CARBOHIDRATO a 121C durante 15 min, enfriar el medio base a 45C y agregar la solucin del carbohidrato esterilizada por filtracin en membrana. Distribuir en tubos estriles. Conservar en refrigeracin (4-10C). La caducidad es aproximadamente de 6-8 semanas. Se inocula a partir de un cultivo puro (agar Kligler hierro u otro medio adecuado) de 18 a 24 horas de incubacin. Principio de accin Se determina la capacidad de un microorganismo para fermentar (degradar) un carbohidrato especfico en un medio basal y producir cido o cido con gas visible. La fermentacin es un proceso anaerbio de oxidacin-reduccin, en el cual un sustrato orgnico acta como el aceptor final de electrones. Los productos caractersticos de la fermentacin bacteriana son: a) cido lctico, b) cidos actico y frmico, c) cido lctico y alcohol etlico, d) etanol, e) acetilmetilcarbinol y CO2, f) cido succnico a cido propinico y Co2, g) CO2 y acetona a alcohol isoproplico y h) cido butrico a alconol butlico. El indicador de pH utilizado para demostrar la fermentacin del hidrato de carbono es el rojo de fenol, ya que la mayora de los

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productos finales del metabolismo de carbohidratos son cidos y generaran un vire del indicador a amarillo.

Malonato, caldo. Extracto de levadura Sulfato de amonio Fosfato dipotsico Fosfato monopotsico Cloruro de sodio Malonato de sodio Glucosa Azul de bromotimol Agua desionizada pH 1.0 g 2.0 g 0.6 g 0.4 g 2.0 g 3.0 g 0.25 g 0.025 g 1,000 mL 6.70.2

Pesar la cantidad exacta como se indica en el rtulo. Rehidratar en el agua desionizada. Calentar la solucin suavemente. Colocar a proximadamente 3.0 mL en tubos de 13 x 100. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 min. Principio de accin Determina la capacidad de un microorganismo de utilizar el malonato de sodio como nica fuente de carbono con la resultante alcalinidad. El malonato es un inhibidor enzimtico competitivo de la enzima succinato deshidrogenada. El amonato se une a la enzima y ocupa los sitios activos de tal manera que la enzima no puede combinarse con el sustrato normal, el cido succnico, cesando de esta manera la funcin normal del ciclo de Krebs. El resultado final es que los microorganismos no pueden crecer y reproducirse a menos que puedan fermentarn o utilizar el malonato como nica fuente de carbono. Microorganismos que pueden realizar esta actividad metablica pertenecen al grupo de Klebsiella-Enterobacter.

mCPC, agar. Ver: Celobiosa, polimixina B y colistina modificado, agar

Mtodos Estndar, agar Peptona de casena Extracto de levadura Dextrosa Agar Agua destilada 5.0 g 2.5 g 1.0 g 15.0 g 1.0 L

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Disolver los ingredientes en un litro de agua destilada, calentar hasta ebullicin para disolver por completo y ajustar el pH a 7.0 0.2 a 25C. Distribuir en tubos de ensayo con tapn de rosca o en un matraz, despus esterilizar a 121C durante 15 minutos. Enfriar a 45-50C y vaciar en cajas Petri. Puede volverse a fundir una sola vez cuando se necesite. Principio de accin La peptona de casena proporciona aminocidos y otras sustancias nitrogenadas complejas necesarias para el crecimiento bacteriano. El extracto de levadura proporciona vitaminas del complejo B y la dextrosa es utilizada por los microorganismos como la fuente de carbono y energa. Es un medio general por lo que no contiene inhibidores.

MTM, medio. Extracto de carne Peptona Cloruro de sodio Agar Agua destilada 3.0 g 10.0 g 5.0 g 4.0 g 1.0 L

Agitar y calentar a ebullicin hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 mL en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave a 121 1C durante 15 minutos y ajustar el pH final a 7,4 0,2 con HCl 0.1 N o NaOH 0.1 N.

Nitratos, caldo. Nitrato de potasio Cloruro de sodio Peptona Agua destilada 1.0 g 0.5 g 2.0 g 1.0 L

Agregar los ingredientes a un litro de agua, agitar hasta disolucin completa. Verter en tubos de 13 x 100 mm con tapn de rosca. Esterilizar en autoclave a 121 1C durante 15 minutos. Principio de accin En el presente medio se pretende poner de manifiesto, si el microorganismo tiene reductasas, para lo cual se utiliza como sustrato la sal de nitrato, en caso afirmativo, este sustrato se puede reducir a nitritos (se pueden detectar por una reaccin de diazoacin y copulacin) o bien llegar a nitrgeno libre, que se detecta por burbujas en el medio.

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Oxford, medio base (OXA). Base de agar Columbia Esculina Citrato frrico amnico Cloruro de litio Agua 39,0 g 1,0 g 0,5 g 15,0 g 1.0 L

Agregar los ingredientes a un litro de agua y llevar a ebullicin hasta disolucin completa. Posteriormente esterilizar en autoclave a 121 1C durante 15 minutos. Enfriar el medio base a 50C y en condiciones aspticas agregar los siguientes suplementos: Un litro de medio Oxford debe contener los siguientes suplementos: Cicloheximida 400 mg Sulfato de colistina 20 mg Acriflavina 5 mg Cefotetan 2 mg Fosfomicina 10 mg Disolver la cicloheximida, el sulfato de colestina, acriflavina, cefotetn y la fosfomicina en 10 mL de una mezcla 1:1 de etanol:agua. Esterilizar por filtracin antes de agregar al medio base. Mezclar y vaciar en cajas Petri estriles. Las placas del medio Oxford se pueden almacenar como mximo dos semanas. Principio de accin: La flora acompaante indeseable se inhibe con el cloruro de litio, acrilflavina, sulfato de colistina, cefotetn, cicloheximida y fosfomicina. L. monocytogenes degrada la esculina presente en el medio de cultivo, dando esculetina, con formacin de hierro (III), que producen compuestos complejos negros, que luego tien de negro las colonias de L. monocytogenes.

Papa dextrosa, agar. Infusin de papa Dextrosa Agar Agua destilada 200.0 g 20.0 g 15.0 g 1.0 L

Se suspenden los ingredientes en el agua destilada, permitiendo la humectacin de los polvos, para evitar la formacin de grumos que son difciles de disgregar, calentar el medio hasta ebullicin y finalmente esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Enfriar el medio de cultivo en bao de agua hasta 45C 1C, despus acidificar a un pH de 3.50.1, con cido tartrico al 10% previamente esterilizado (1.4 mL de cido tartrico por cada 100 mL de medio de cultivo).

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Despus de adicionar el cido tartrico al medio de cultivo, medir el pH con un potencimetro. Principio de accin A partir de los hidratos de carbono contenidos en la infusin de papa, se observa que stos favorecen el crecimiento de hongos y levaduras, al igual que de otras bacterias, sin embargo se le confiere selectividad al medio para que desarrollen los hongos y las levaduras, acidificando el medio con una polucin de cido tartrico al 10%, adicionando a cada litro de medio de cultivo, 14 mL del cido.

Prpura de bromocresol para fermentacin de carbohidratos, caldo. Proteosa peptona No. 3 Cloruro de sodio Extracto de carne Prpura de bromocresol Agua destilada 10.0 g 5.0 g 1.0 g 0.02 g 1.0 L

Calentar si es necesario para disolver los ingredientes. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 1C. El pH final debe ser de 6,8 0,2. Posteriormente agregar la solucin del carbohidrato que se desee, previamente esterilizada por filtracin, para obtener una concentracin final de 0,5 %. Principio de accin Este medio sirve para observar la fermentacin de azcares con produccin de acidez. Nota: Los sistemas bioqumicos comerciales validados pueden usarse como alternativa para las pruebas bioqumicas convencionales.

RM-VP, caldo (prueba de rojo de metilo y Voges Proskauer). Peptona tamponada Glucosa K2HPO4 Agua destilada 7.0 g 5.0 g 5.0 g 1000.0 mL

Disolver los ingredientes con calentamiento suave si es necesario, distribuir en volmenes de 10 mL en tubos de ensayo de 16x150 mm y esterilizar a 121C por 15 minutos. El pH final debe ser de 6,9 0,2.

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Principio de accin La glucosa es el principal sustrato utilizado por los microorganismos para la obtencin de energa. Los productos finales de la oxidacin de la glucosa varan dependiendo de la ruta metablica y de las enzimas presentes en la bacteria. Por lo tanto se describen a continuacin dos vas: Prueba de Rojo de metilo La prueba de rojo de metilo se lleva a cabo para determinar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener estables los cidos orgnicos generados por la fermentacin de la glucosa. El indicador de pH rojo de metilo a pH de 4.4 tiene un color rojo y a pH de 6.0 o superior, su color es amarillo. Aunque todos los microorganismos entricos fermentan la glucosa y producen cidos orgnicos, esta prueba se emplea para diferenciar Escherichia coli de Enterobacter aerogenes Estos microorganismos en las primeras h. de incubacin producen cidos orgnicos. Escherichia coli es capaz de estabilizar y mantener el pH cido (4.04.4) hasta finalizar el periodo de incubacin (24-48 h) debido a que produce ms cidos por lo que vence el sistema amortiguador. Por su parte, Enterobacter aerogenes es capaz de convertir estos cidos en productos neutros como etanol y acetilmetilcarbinol (acetoina) por lo que el pH se eleva aproximadamente a 6. Prueba de Voges-Proskauer Esta prueba determina la capacidad de algunos microorganismos de generar como productos finales del metabolismo de la glucosa, compuestos neutros como el acetilmetilcarbinol (acetoina). La glucosa es metabolizada por algunas bacterias hasta cido pirvico, la descarboxilacin de dos molculas de este cido producen la acetoina, que es un precursor del 2,3-butanodiol. Tanto la acetoina como el 2,3-butanodiol son compuestos neutros. En presencia de oxgeno atmosfrico y lcali, la acetoina como el 2,3-butanodiol reaccionan con el alfa-naftol generando diacetilo este compuesto se condensa con la guanidina presente en el medio de cultivo generando un compuesto de color rojo o rosa (prueba positiva) en un tiempo aproximado de 15 minutos. Si la acetoina no esta presente los reactivos no cambian de color (prueba negativa)

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Salmonella y Shigella, agar (SS). Extracto de carne Polipeptona Lactosa Sales biliares Citrato de sodio deshidratado Tiosulfato de sodio pentahidratado Citrato frrico Agar Rojo neutro Verde brillante Agua destilada 5.0 g 5.0 g 10.0 g 8.5 g 8.5 g 8.5 g 1.0 g 13.5 g 0.025 g 0.330 mg 1.0 L

Suspender los ingredientes en agua destilada estril y calentar hasta disolucin completa. Ajustar el pH a 7.0 0.2. No esterilizar en autoclave. Enfriar a 50C y distribuir en cajas de Petri estriles en condiciones aspticas. El aspecto del medio fundido es claro y de color rosado. Principio de accin El agar SS es un medio selectivo diferencial para el aislamiento de especies de Salmonella y Shigella a partir de muestras patolgicas, alimentos contaminados, etc. Los organismos coliformes, Gram-negativos y la microbiota acompaante son inhibidos por los componentes inhibitorios como el verde brillante, sales biliares. El tiosulfato en combinacin con el fierro acta como indicadores de la produccin de cido sulfhdrico, lo cual se evidencia por el oscurecimiento en el centro de las colonias. Las colonias de coliformes quedan sealadas por la demostracin de la degradacin de la lactosa a cido, a cargo del indicador de pH rojo neutro, de tal forma que las colonias de microorganismos lactosa-negativos son incoloras, y las de microorganismos lactosa-positivos son rosadas hasta rojas.

Sangre de carnero, agar Base de agar sangre Sangre de carnero desfibrinada 95.0 mL 5.0 mL

Preparar el agar base de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Enfriar a 45 2C y agregar aspticamente la sangre de carnero, la cual previamente se debe encontrar a temperatura ambiente (20 - 25C). Homogeneizar el medio y verter en las cajas Petri estriles de 12 a 15 mL para la prueba de CAMP y de 15 a 20 mL para la prueba de hemlisis.

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Principio de accin Este medio detecta a los microorganismos que pueden lisar los eritrocitos, pudiendo diferenciar las hemlisis alfa o beta.

Selenito-cistina, caldo. Triptona o polipeptona Lactosa Fosfato sdico dibsico Selenito cido de sodio L-cistina Agua destilada estril pH final 25C 5.0 g 4.0 g 10.0 g 4.0 g 0.01 g 1.0 L 7.0 0.2

Disolver los ingredientes en el agua destilada estril. Distribuir en volmenes de 10.0 (tubos de ensayo) o bien, 225.0 mL en (matraces) recipientes estriles, segn se requiera. El caldo as preparado es transparente de color ladrillo. De preferencia usarlo el mismo da de su preparacin. Si se desea conservar el medio por varios das, puede exponerse al calor en autoclave a 110 1C durante 5 minutos tomando entonces un color salmn. Precaucin: Descartar el medio preparado si se observan grandes cantidades de precipitado rojo debidas al selenito reducido. No se incube por ms de 24 h. porque el efecto inhibitorio del selenito disminuye despus de 6-12 h. de incubacin. El biselenito de sodio es txico por inhalacin o ingesta. Existe peligro de efectos acumulativos. Cuando se utilice no coma, beba o fume. Despus del contacto con la piel, enjuague inmediatamente con abundante agua. En caso de ingestin accidental acuda al mdico inmediatamente. Principio de accin El caldo selenito-cistina se utiliza como medio de enriquecimiento de Salmonella a partir de heces, alimentos y otros materiales. El selenito inhibe el crecimiento de bacterias coliformes y enterococos en las primeras 6-12 h. siguientes al inicio de la incubacin. La toxicidad del selenito para ciertos microorganismos no es del todo clara, se sugiere que reacciona con los grupos sulfuro y sulfhidrilo de ciertos componentes celulares esenciales. Proteus y Pseudomonas parecen ser resistentes a sus efectos. La lactosa se adiciona como carbohidrato fermentable para prevenir un incremento en el pH durante la incubacin ya que cualquier aumento en el pH puede reducir la actividad selectiva del selenito. El hecho de que Proteus y Pseudomonas, y naturalmente Salmonella, no fermenten la lactosa puede explicar que resistan la inhibicin. El efecto de la cistina puede deberse a dos factores: 1) Su capacidad reductora, que disminuye la toxicidad microbiana del selenito y 2) Suministra compuestos azufrados adicionales primordiales para la bacteria, reduciendo de nuevo la actividad inhibitoria del selenito.

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Sulfuro Indol Movilidad, medio (SIM). Peptona de casena Peptona de carne Sulfato de hierro y amonio Tiosulfato de sodio Agar Agua 20,0 g 6,1 g 0,2 g 0,2 g 3,5 g 1.0 L

Agitar y calentar a ebullicin hasta disolver el agar. Envasar en porciones de 4 mL en tubos de 13 x 100 mm. Esterilizar en autoclave a 121 1C durante 15 minutos. El pH final deber estar en 7,3 0,2. Principio de accin El presente medio pone de manifiesto: a) si el microorganismo es mvil, esto es que presente flagelos, lo cual se observa si despus de incubar existe desarrollo ms all de donde pas el asa microbiolgica al inocular al medio, b) si el microorganismo es capaz de reducir el tiosulfato hasta cido sulfhdrico, que al estar este ltimo en presencia de sales de hierro, se forma el sulfuro ferroso que es de color negro y c) si el microorganismo es capaz de desdoblar el triptofano que se encuentra en las peptonas, hasta formar el indol, esto implica la eliminacin del grupo alquilo, que est constituido por un aminocido, transformndose esta fraccin a cido pirvico y amonaco, gracias a la presencia de la triptofanasa.

Sodio lauril sulfato de, caldo. Ver: Lauril sulfato de sodio, caldo.

Soya tripticasena con 0,6% de extracto de levadura, agar (ASTEL). (Listeria). Agar soya tripticasena Extracto de levadura Agua 40,0 g 6,0 g 1,0 L

Agitar y calentar a ebullicin hasta disolver el agar. Esterilizar a 121 1C durante 15 minutos, el pH final ser de 7,3 0,2. Principio de accin Este medio es altamente nutritivo y verstil, es recomendado para uso en general. Debido a la formulacin de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adicin de suero, etc.

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Soya tripticasena con 0,6 % de extracto de levadura, caldo (CSTEL. (Listeria). Caldo soya tripticasena Extracto de levadura Agua 30,0 g 6,0 g 1,0 L

Agitar hasta disolver los ingredientes. Esterilizar a 121 1C durante 15 minutos. El pH final de la solucin debe ser 7,3 0,2. Principio de accin Este medio es altamente nutritivo y verstil, es recomendado para uso en general. Debido a la formulacin de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adicin de suero, etc.

Soya tripticasena, caldo / Soya tripticasina, agar. Tripticasa o triptosa Fitona Glucosa Cloruro de sodio Agar bacteriolgico Agua destilada 17.0 g 3.0 g 2.5 g 2.5 g 15.0 g 1.0 L

Disolver los ingredientes en el agua destilada, calentando lentamente hasta su disolucin completa. Distribuir porciones de 225.0 mL dentro de matraces de 500 mL y esterilizar en autoclave a 121 1C durante 15 minutos. En caso de requerirse en cajas de Petri enfriar el agar a 45C y verter en condiciones de asepsia. El pH final debe ser de 7.3 0.2. Principio de accin Este medio es altamente nutritivo y verstil, es recomendado para uso en general. Debido a la formulacin de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adicin de suero, etc. El caldo triptona soya es uno de los medios recomendados por la AOAC para el preenriquecimiento de Salmonella.

Soya tripticasena estril adicionado con sulfito de potasio, caldo. Caldo soya tripticasa Sulfito de potasio 1.0 L 5.0 g

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Adicionar al caldo soya tripticasena el sulfito de potasio por cada 1.0 L de medio, de tal forma que la concentracin final del sulfito de potasio sea 0.5%. Esterilizar a 121 1C por 15 minutos. Principio de accin Este medio es altamente nutritivo y verstil, se recomienda para uso en general. Debido a la formulacin de la triptona y la peptona de soya, el medio estimula el crecimiento abundante de organismos fastidiosos sin la adicin de suero, etc. El caldo triptona soya es uno de los medios recomendados por la AOAC para el preenriquecimiento de Salmonella. El sulfito de potasio acta como un agente selectivo para inhibir el crecimiento de coliformes, mientras que permiten el desarrollo de Salmonella. Los compuestos de azufre fungen como sustrato para la produccin de cido sulfhdrico.

SS, agar. Ver Salmonella Shigella, agar.

Sulfito de Bismuto agar. Ver: Bismuto sulfito, agar.

Surraco, caldo Sacarosa Urea Azul de timol Base caldo rojo de fenol Agua destilada 0.8 g 0.8 g 4 gotas 1.5 g 100 mL

Disolver 1.5 g del medio base caldo rojo de fenol en 100 mL de agua destilada, agregar 0.8 g de sacarosa y 4 gotas de azul de timol SI. De esta solucin se toman 10 mL en un matraz Erlenmayer de 10 mL. Esterilizar ambas soluciones en autoclave a 121C (15 libras de presin) durante 10 minutos ( EVITAR SOBRECALENTAMIENTO). Esterilizar un equipo de microfiltracin, agujas y jeringas. Una vez esterilizado el material y los mdios, dejar enfriar. Al matraz con los 10 mL de caldo sacarosa adicionar en condiciones de esterilidad 0.8 g de urea, agitar para disolver completamente. En condiciones de esterilidad tomar el contenido del matraz con una jeringa de 10 mL y pasar por el filtro (ya preparado) al matraz que contiene los 90 mL restantes del medio. Agitar la mezcla estril y distribuir volmenes de 3.0 mL en tubos de ensayo de 13 X 100 mm esterilizados previamente. Principio de accin. Medio para la diferenciacin de microorganismos, especialmente de la familia Enterobacteriaceae basndose en la produccin de ureasa y/o de fermentar la sacarosa. El medio de cultivo est libre de carbohidratos fermentables, si el
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microorganismo en estudio es capaz de fermentar la sacarosa, se produce vire del indicador a amarillo. Los microorganismos que tienen la capacidad de utilizar la urea, forman amonio, produciendo reaccin alcalina en el medio que se manifiesta por un color rosa fuerte por vire de los indicadores rojo de fenol y azul de timol.

TCBS, agar. Ver: Tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa, agar.

T1N1, agar (tripticasa y sal, agar). Triptona o tripticasa o digerido pancretico de casena Cloruro de sodio Agar Agua destilada 10.0 g 10.0 g 20.0 g 1.0 L

Suspender los ingredientes en el agua y hervir hasta disolucin del agar. En caso de desearlo inclinado, distribuirlo en tubos y despus de esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos, inclinarlos; el pH final deber estar en 7.20.2. Para el llenado de placas, dejar enfriar el medio a una temperatura entre 45 y 50C antes de llenar las cajas. Principio de accin Este medio es utilizado para observar la tolerancia de los microorganismos a las diferentes concentraciones de sales, sustituyendo la concentracin del cloruro de sodio de esta frmula por la deseada.

Tripticasa y sal, caldo (T1N1, caldo). Triptona o tripticasa o digerido pancretico de caseina Cloruro de sodio Agua destilada 10.0 g 10.0 g 1.0 L

Suspender los ingredientes en el agua y calentar si es necesario. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos; el pH final deber estar en 7.20.2. Principio de accin Este medio es utilizado para observar la tolerancia de los microorganismos a las diferentes concentraciones de sales, sustituyendo la concentracin del cloruro de sodio de esta frmula por la deseada.

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Tiosulfato, citrato, sales biliares y sacarosa, agar (TCBS). Peptona de casena Peptona de carne Extracto de levadura Sacarosa Tiosulfato de sodio pentahidratado Citrato de sodio dihidratado Colato de sodio Bilis de buey Cloruro de sodio Citrato frrico Azul de bromotimol Azul de timol Agar Agua destilada 5.0 g 5.0 g 5.0 g 20.0 g 10.0 g 10.0 g 3.0 g 5.0 g 10.0 g 1.0 g 40.0 mg 40.0 mg 15.0 g 1.0 L

Preparar en un matraz por lo menos tres veces ms grande que el volumen requerido de medio. Adicionar los ingredientes en agua destilada tibia y calentar con agitacin constante hasta ebullicin e inmediatamente retirar del calor. No esterilizar y ajustar el pH a 8.60.2 a 25C; enfriar a 50C y colocar el medio en cajas Petri. Dejar secar las placas entre 37 y 45C antes de usarlas. Principio de accin La alta concentracin de tiosulfato y citrato, as como la fuerte alcalinidad de este medio, inhiben el crecimiento de la familia Enterobacteriaceae. Las sales biliares y el colato de sodio suprimen primariamente a los enterococos. Cualquier bacteria coliforme que pudiera crecer, no puede metabolizar la sacarosa; solamente unas cuantas especies de Proteus, sacarosa positivas, pueden crecer para formar colonias amarillas, parecidas a las colonias de los vibrios. La mezcla de indicadores azul de timol y azul de bromotimol, cambian a color amarillo cuando hay liberacin de cido, an en este medio fuertemente alcalino. Se debe incubar a 35C aerbicamente durante 18 a 24 h. De acuerdo a las caractersticas metablicas del microorganismo, se presentan las colonias en este medio, como se describen en el siguiente cuadro: Apariencia de las colonias Amarillas, planas, con dimetro entre 2 y 3 mm Pequeas con centro azul verde Grandes amarillas Azules Muy pequeas, transparentes Microorganismos V. cholerae, V. cholerae variedad El Tor Vibrio parahemolyticus Vibrio alginolyticus Pseudomonas y Aeromonas Enterobacteriaceae y otros

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Tetrationato, caldo. Proteosa peptona o triptona Sales biliares Carbonato de calcio Tiosulfato de sodio pentahidratado Agua destilada 5.0 g 1.0 g 10.0 g 30.0 g 1.0 L

Disolver los ingredientes en el agua destilada estril y ajustar el pH a 7.00.1. Distribuir, agitando constantemente en porciones de 10.0 y 225.0 mL, en recipientes estriles, de acuerdo a las necesidades. Guardar en refrigeracin. Antes de usar el medio agregar 2.0 mL de una solucin de yodo-yoduro de potasio y 1.0 mL de solucin de verde brillante al 0.1% por cada 100.0 mL de medio. El medio deber utilizarse el mismo da. Principio de accin El caldo tetrationato se recomienda para el enriquecimiento selectivo de Salmonella typhi y otras especies de Salmonella, presentes en heces, ensilados, etc. Las sales biliares estimulan el crecimiento de las bacterias intestinales e inhiben junto con la solucin de verde brillante especialmente a la microbiota Gram-positiva. La adicin de la solucin yodo-yoduro funciona para formar el tetrationato. Los organismos que poseen la enzima tetrationato reductasa se desarrollan bien en este medio, como por ejemplo Salmonella y Proteus, mientras que muchos microorganismos fecales como E. coli y Shigella son inhibidos. Miembros del grupo Proteus, reducen el tetrationato y en consecuencia disminuyen la selectividad. Esta desventaja se puede disminuir adicionando al medio de cultivo 40.0 g de novobiocina por cada mililitro de medio antes de la adicin del yodo-yoduro.

Triptona al 1%, caldo (Prueba de indol). Triptona o tripticasa Agua destilada 10 g 1.0 L

Disolver los ingredientes y si es necesario calentar. Distribuir porciones de 5 mL del medio, en tubos de ensaye de 16 x 150 mm. Esterilizar a 121C por 15 minutos. El pH final debe ser de 6.9 0.2 Principio de accin La triptona es un compuesto rico en triptofano y por lo tanto se utiliza para la diferenciacin de bacterias con base en la prueba de indol. El triptofano es un aminocido que puede ser oxidado por ciertas bacterias hasta indol, escatol e indolactco.

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La enzima triptofanasa cataliza la reaccin de desaminacin del triptofano produciendo indol, cido pirvico y amonaco. El cido pirvico puede ser catabolizado por las bacterias mediante el ciclo de Krebs hasta CO 2 y agua; el amonaco producido puede ser utilizado por el microorganismo para sintetizar nuevos aminocidos. El indol puede ser detectado si se combina con el paradimetilaminobenzaldehido, el producto de esta combinacin es un una quinona de color rojo.

TSI, agar. Ver: hierro y tres azcares, agar.

Urea, caldo. Fosfato monopotsico Fosfato disdico Extracto de levadura Urea de alta pureza (20%) Rojo fenol Agua desionizada pH

9.1 g 9.5 g 0.1 g 20.0 g 0.01 g 1,000 mL 6.8

Pesar la cantidad con precisin segn las directivas del rtulo. Rehidratar con el agua desionizada. No calentar la solucin, con el calor la urea se descompone. Esterilizar el resto de los componentes del medio (medio base) a 121C durante 15 minutos y enfriar. Esterilizar la urea por filtracin en membrana y agregar al medio base ya estril y fro. De manera asptica distribur aproximadamente 3.0 mL en tubos de 13 x 100 con tapn de rosca. Principio de accin El sustrato urea, a menudo se designa como una carbamida. Todas las amidas son hidrolizadas con facilidad. La urea es hidrolizada por una enzima especfica, la ureasa (o urea amidohidrolasa), para dar dos molculas de amoniaco. En solucin, la urea se hidroliza a carbonato de amonio como producto final. La ureasa es una enzima constitutiva microbiana importante relacionada con la descomposicin de compuestos orgnicos, clasificada como una amidasa. La ureasa acta en los compuestos a nivel de los puentes C-N, excepto en aquellos que contienen puestes peptdicos. El indicador rojo de fenol virar a un colo rosarojo intenso cuando la prueba sea positiva.

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Urea rpido, caldo. Extracto de levadura Urea Fosfato monopotsico Fosfato disdico Rojo fenol Agua desionizada pH 0.1 g 20.0 g 0.091 g 0.095 g 0.01 g 1,000 mL 6.9

Esterilizar por filtracin utilizando una membrana de 0.45 m. Fraccionar en condiciones aspticas 3.0 mL en tubos de 13 x 100 con tapn de rosca estriles. Principio de accin Ver caldo urea. Para la prueba rpida de la urea el indicador virar a color cereza (prpura rojizo), en caso de ser positiva.

Urea y sacarosa, caldo. Ver: Surraco, caldo.

Vassiliadis-Rappaport, caldo. Solucin A Triptona Cloruro de sodio Fosfato monobsico de potasio Agua destilada

5.0 g 8.0 g 1.6 g 1.0 L

Disolver los componentes en el agua destilada por calentamiento a 70C. Solucin B Cloruro de magnesio hexahidratado Agua destilada

400.0 g 1.0 L

Disolver el cloruro de magnesio en el agua destilada. Como esta sal es muy higroscpica es conveniente disolver el contenido entero de cloruro de magnesio desde un envase recientemente abierto, de tal modo que la concentracin de la solucin sea de 0.4 g/mL. Conservar en frasco mbar a temperatura ambiente. Solucin C Oxalato de verde de malaquita Agua destilada

0.4 g 100.0 mL

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Disolver el oxalato de verde de malaquita en el agua destilada. Conservar en frasco mbar a temperatura ambiente. Preparacin del medio completo Solucin A Solucin B Solucin C 1000.0 mL 100.0 mL 10.0 mL

Preparar el medio completo con las proporciones descritas para cada una de las soluciones. Distribuir antes de usar dentro de tubos estriles en cantidades de 10.0 mL. Esterilizar a 115C durante 15 min. Ajustar el pH si es necesario para que al final de la esterilizacin sea de 5.2. Almacenar en refrigeracin. Principio de accin Este medio se recomienda para el enriquecimiento selectivo durante el aislamiento de Salmonella de alimentos y muestras ambientales. Puede tambin utilizarse para aislar Salmonella de heces humanas sin el preenriquecimiento utilizando una cantidad de inculo pequea. La formulacin se desarroll denotando cuatro caractersticas que posee Salmonella cuando se compara con la familia Enterobacteriaceae: 1. Habilidad para sobrevivir a presiones osmticas relativamente altas 2. Habilidad para multiplicarse a valores de pH relativamente bajos 3. Resistencia ligeramente mayor al verde de malaquita 4. Requerimientos nutricionales relativamente menos estrictos Puede utilizarse novobiocina para inhibir el crecimiento de Proteus.

Verde brillante, agar. Extracto de levadura Polipeptona (proteosa peptona No. 3) Cloruro de sodio Lactosa Sacarosa Rojo de fenol Agar Verde brillante Agua destilada 3.0 g 10.0 g 5.0 g 10.0 g 10.0 g 0.08 g 20.0 g 0.0125 g 1.0 L

Suspender los ingredientes en el agua destilada y calentar a ebullicin, hasta disolucin completa. Ajustar el pH a 6.9 0.2. Esterilizar en autoclave a 121 1C durante 15 minutos. Enfriar el medio a 50C y distribuirlo en cajas de Petri estriles. El aspecto del medio es oscuro color marrn.

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Principio de accin El medio de cultivo contiene lactosa, cuya degradacin a cido se reconoce por el viraje a amarillo del rojo de fenol, que acta como indicador de pH. En ambiente alcalino presenta color rojo intenso. La microbiota acompaante Gram-positiva, as como Salmonella typhi y Shigella resultan muy reprimidas por la presencia del verde brillante. Puesto que Salmonella no puede degradar ni la lactosa ni la sacarosa, el contenido en sacarosa permite el reconocimiento de la microbiota acompaante lactosa-positiva dbil o lactosa negativa pero sacarosa-positiva. Para la inhibicin de Proteus se recomienda la adicin de desoxicolato de sodio al 0.2%. La adicin de sulfonamidas mejora el aislamiento de Salmonella. Adicionar 1.0 g de sulfonamida o 0.8 g de sulfadiazina por cada litro de medio y esterilizar en la forma habitual. Verde brillante bilis al 2 % lactosa, caldo. Ver: Bilis verde brillante con lactosa, caldo (Brila).

Xilosa lisina desoxicolato, agar (XLD). Xilosa 3.75 g L-lisina 5.0 g Lactosa 7.5 g Sacarosa 7.5 g Cloruro de sodio 5.0 g Extracto de levadura 3.0 g Rojo de fenol 0.08 g Agar 15.0 g Desoxicolato de sodio 2.5 g Citrato frrico amoniacal 0.8 g Tiosulfato de sodio 6.8 g Agua destilada 1.0 L 0.2 Suspender los ingredientes en el agua destilada, y calentar en bao de agua a 55C, agitando frecuentemente, hasta disolucin completa. Ajustar el pH a 6.9 0.2. Enfriar a 50C y verter en cajas de Petri estriles. No se esterilice. El sobrecalentamiento produce una precipitacin, la reactividad del medio puede ser satisfactoria, pero las colonias sueles ser muy pequeas. Principio de accin Este es un medio selectivo ideal para el aislamiento e identificacin presuntiva de Salmonella y Shigella. Basado en la fermentacin de la xilosa, la descarboxilacin de la lisina y la produccin de cido sulfhdrico para la diferenciacin inicial entre Shigella y Salmonella de otras bacterias no patgenas. La Salmonella es reductora de las sales de azufre como el tiosulfato, cuyo producto final es el cido sulfhdrico, que en presencia de sales de hierro forma el sulfuro ferroso, que es un

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compuesto de color negro. La fermentacin rpida de la xilosa es casi universal entre las bacterias entricas excepto para los miembros de los gneros Shigella, Providencia y Edwardsiella. La xilosa se incluye al medio de tal forma que las especies del gnero Shigella pueden identificarse por una reaccin negativa. Las especies de Salmonella se diferencian de los fermentadores no patognicos por la incorporacin de lisina al medio. Salmonella consume la xilosa y descarboxila la lisina, alterando el pH hacia la alcalinidad, simulando la reaccin presentada por Shigella. Sin embargo, la presencia de los gneros Salmonella y Edwardsiella se diferencia de las de Shigella por un indicador de la produccin de cido sulfhdrico. Por otra parte, la gran concentracin de cido producido por la fermentacin de la lactosa y sacarosa, evita que los coliformes lisin descarboxilasa-positivos reviertan el pH a un valor alcalino. Los microorganismos no productores de cido sulfhdrico no descarboxilan la lisina. El nivel de acidez evita el oscurecimiento de estos microorganismos hasta despus de 18-24 h. de incubacin. El desoxicolato de sodio se incorpora al medio como un inhibidor de coliformes sin disminuir el desarrollo de Shigella y Salmonella.

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DILUYENTES, SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES.

Azul de toluidina, solucin 0.1M. Azul de toluidina Agua destilada 3.05 g 100.0 mL

En un matraz aforado de 100.0 mL disolver el azul de toluidina y aforar a volumen con el agua.

Calcio cloruro, solucin 0.01M. Cloruro de calcio anhidro (peso molecular 110.99) Agua destilada Disolver el cloruro de calcio en agua y llevar a un litro. 1.199 g 1.0 L

Etanol 70 %. 70.0 mL Alochol etlico absoluto Agua destilada 100.0 mL

Solucin de desoxicolato de sodio al 0,5% en agua destilada estril. Desoxicolato de sodio Agua destilada estril Disolver el desoxicolato de sodio en agua destilada estril. 0,5 g 99,5 mL

Solucin reguladora de Fosfatos pH 7.2, (solucin concentrada). Fosfato monobsico de potasio Agua destilada 34.0 g 1.0 L

Disolver el fosfato en 500 mL de agua y ajustar el pH a 7.2, con solucin de hidrxido de sodio 1N, aforar con agua a un litro. Esterilizar la solucin a 121C1.0C y conservar en refrigeracin. Solucin de trabajo: Tomar 1.25 mL de la solucin anterior (solucin concentrada) y transferirlos a un matraz volumtrico de un litro, aforando con agua; despus de distribuir en matraces o tubos, los volmenes especificados en

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cada monografa, se debe esterilizar a 121C1.0C durante 15 minutos. Despus de la esterilizacin, los volmenes finales y el pH, deben ser iguales a los iniciales. Reactivo de Kovacs. p-dimetilaminobenzaldehdo Alcohol amlico (normal) HCI concentrado 5g 75 mL 25 mL

Disolver el p-Dimetilaminobenzaldehdo en alcohol amlico normal y adicionar lentamente el HCl. Almacenar a 4C. Para la prueba de indol: Adicionar de 0,2 a 0,3 mL del reactivo anterior, a 5 mL del cultivo de bacterias en caldo triptona. Destapar el tubo e inclinarlo para permitir la entrada de una mayor cantidad de oxgeno ambiental que ayude a la reaccin. Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo en la superficie del tubo. Principio de accin El triptofano es un aminocido, que por accin de la triptofanasa lo degrada en indol, escatol y cido indolactico . Un intermediario importante es el cido indolpirvico, que al desaminarse forma el indol. En caso de que se descarboxile el cido indolactico, se forma el escatol

Prueba del Ortonitrofenil galactsido (ONPG). Reactivos Buffer de fosfato de sodio, 1M, pH 7. o-nitrofenil- -galactosido (ONPG), 0,75 M Solucin fisiolgica Tolueno Realizar la prueba a partir de agar-hierro de Kligler (KIA) agar triple azcar hierro (TSI). Emulsificar un asa cargada de desarrollo bacteriano con 0,5 mL de solucin fisiolgica hasta producir una suspensin abundante. Aadir a dicha suspensin una gota de tolueno y mezclar enrgicamente unos segundos para liberar la enzima de las clulas bacterianas. Aadir a la suspensin igual cantidad de solucin buffer de ONPG y colocar la mezcla en bao de agua a 37C. Interpretacin. La velocidad de hidrlisis del ONPG a ortonitrofenol puede ser rpida en algunos organismos, producindose una reaccin que se visualiza por la aparicin de un color amarillo en 5 a 10 minutos. La mayora de las pruebas son

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positivas en una hora, sin embargo, las reacciones no se deben interpretar como negativas antes de las 24 horas de incubacin. El color amarillo indica que el organismo ha producido ortonitrofenol a partir del sustrato ONPG por accin de la -galactosidasa. Principio de accin El ortonitrofenil galactsido (ONPG) es estructuralmente similar a la lactosa, salvo que la glucosa ha sido substituida por el ortonitrofenil. Por accin de la -galactosidasa, el ONPG se hidroliza en dos residuos, galactosa y ortonitrofenol. El ONPG es un compuesto incoloro mientras que el ortonitrofenol es amarillo, lo cual es una evidencia de la hidrlisis. Las bacterias fermentadoras de lactosa poseen dos enzimas, permeasa y galactosidasa, requeridas para la produccin de cido a partir de la fermentacin de lactosa. La permeasa es necesaria para que la molcula de lactosa penetre en la clula bacteriana, donde la -galactosidasa puede romper la unin galactsido, produciendo glucosa y galactosa. Los no fermentadores de lactosa carecen de ambas enzimas y son incapaces de producir cido a partir de lactosa. Algunas especies bacterianas aparecen como no fermentadoras de lactosa pues carecen de permeasa pero si tienen -galactosidasa y dan una prueba de ONPG positiva. Los llamados fermentadores tardos de lactosa pueden demorar en producir cido a partir de la lactosa debido a una lenta actividad de permeasa. En estos casos una prueba de ONPG positiva puede proveer una identificacin rpida de los fermentadores tardos.

Reactivo de oxidasa. N-Tetrametil-p-Fenilendiamina Agua destilada 0.5 g 100 mL

Conservar en frasco oscuro a 5-10C. El reactivo se conserva durante 14 das. Realizar la prueba de oxidasa con cultivos puros de agar soya tripticasa (2% de NaCl) u otro medio que no contenga carbohidratos fermentables. Un mtodo fcil consiste en colocar un crculo de papel filtro en una caja de Petri y humedecerlo con algunas gotas de reactivo de oxidasa. Con un palito aplicador de madera, un mondadientes o una asa de platino estril, sacar un poco de cultivo de la placa y tocar el papel humedecido, si hay microorganismos oxidasa positivos, el papel se tornar prpura oscuro o azul en pocos segundos. Las especies patgenas de Vibrio son oxidasa positivas (excepto el V. metschnnikovii). Interpretacin. La reaccin positiva se observa por la produccin de un color azul en un minuto.

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Principio de accin Los citocromos son hemoprotenas que contienen hierro y actan como el ltimo eslabn de la cadena respiratoria aerobia, tranfiriendo electrones (hidrgeno) al oxgeno, con formacin de agua. El sistema citocromo se encuentra en los microorganismos aerobios o anaerobios facultativos, de modo que la prueba de oxidasa es importante para identificar a aquellos organismos que carecen de la enzima o son anaerobios obligados. La prueba de citocromo oxidasa utiliza el diclorhidrato de Tetrametil-pFenilendiamina, que aca como aceptor artifical de electrones, sustituyendo al oxgeno. La p-fenilendiamina es incolora en estado reducido, pero en presencia de citocromo oxidasa y oxgeno atmosfrico se oxida formando azul de indofenol.

Plasma de Conejo. Emplear plasma de conejo liofilizado rehidratado, siguiendo las instrucciones del fabricante. El anticoagulante que se debe de utilizar para obtener el plasma es cido etilendiaminotetractico (EDTA) al 0.1% en plasma rehidratado. Si se utiliza plasma deshidratado, diluir con agua estril en proporcin 1:3. Puede utilizarse plasma de conejo liofilizado adicionado de EDTA. No debe emplearse plasma de sangre citratada. Principio de accin El plasma en presencia de la enzima coagulasa bacteriana, forma un cogulo de fibrina. El mecanismo esta dado porque la protrombina en presencia de sales de calcio y la enzima trombocinasa (tromboplastina), forman la trombina y sta ltima al encontrarse frente al fibringeno, forma un cogulo de fibrina. La tcnica para determinar la coagulasa ligada o factor de agregacin, se realiza en un portaobjetos. Es responsable de la absorcin del fibringeno, el cual precipita sobre los estafilococos, propiciando la agregacin de estos microorganismos, observndose una aglutinacin celular. En este caso, el factor de agregacin, transforma el fibringeno en fibrina de manera directa, no toman parte los factores plasmticos, tampoco se inhibe por los anticuerpos contra la coagulasa libre. La prueba de la coagulasa en tubo, detecta tanto la coagulasa libre como la ligada; la coagulasa libre extracelular, reacciona con una sustancia denominada factor de reaccin de la coagulacin, que se abrevia CRF, (sustancia termoestable parecida a la trombina), formando un complejo, el cual transforma el fibringeno en fibrina, liberando pptidos. En este caso el CRF, reacciona con la coagulasa, sin necesitar iones de calcio para formar el cogulo.

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Rojo de metilo, reactivo. Rojo de metilo Etanol al 95 % Agua destilada 0.2 g 300 mL 200 mL

Mantener el reactivo en refrigeracin cuando no se utilice, el reactivo es estable de 2 a 3 semanas. Prueba de Rojo de metilo Transferir 2.5 mL del cultivo a probar con 48 h. de incubacin a un tubo de ensayo. Agregar 5 gotas del indicador rojo de metilo e interpretar el color de inmediato: Una coloracin roja indica produccin de acidez por lo que la prueba es positiva.

Salina isotnica, solucin. Cloruro de sodio Agua destilada 8.5 g 1.0 L

Disolver el cloruro de sodio en el agua y esterilizar a 121C1.0C durante 15 minutos.

Tartrico cido al 10%. cido tartrico Agua destilada 10.0 g 100.0 mL

Disolver el cido en el agua y esterilizar a 121C durante 15 minutos, o bien por filtracin a travs de una membrana de 0.45 m.

Tris-(hidroximetilaminometano), solucin amortiguadora 0.05M. Tris-hidroximetilaminometano, (peso molecular 121.1), pH 9.0 Agua destilada 6.055 g 100.0 mL

Disolver el Tris-(hidroximetilaminometano) en un matraz volumtrico de 100.0 mL y llevar a volumen con el agua.

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Voges-Proskauer, reactivos (VP). VP 1 alfa-naftol Alcohol absoluto VP 2 Hidrxido de potasio Agua destilada Prueba de Voges-Proskauer (VP): Transferir 1 mL del cultivo a probar, con 48 h. de incubacin, a un tubo de ensayo. Despus adicionar 0,6 mL de la solucin VP 1 y 0,2 mL de la solucin VP 2. Agitar despus de la adicin de cada solucin. Para intensificar y acelerar la reaccin adicionar unos cuantos cristales de creatina y mezclar. Dejar a temperatura ambiente y leer los resultados despus de 4 h. de adicionados los reactivos. El desarrollo de una coloracin rosa es una prueba positiva. 40.0 g cbp 100 mL 5g 100 g

Nitritos, reactivos para la determinacin de.

Reactivo A Alfa-naftilamina cido actico 5N Reactivo B cido sulfanlico cido actico 5N Reactivo C Alfa-naftol cido actico 5N 1,0 g 200,0 mL 1,0 g 125,0 mL 0,5 g 100,0 mL

Solucin de sulfato de cadmio al 20% Colocar granallas de zinc en solucin de sulfato de cadmio al 20% de 4 a 6 h. Disolver el precipitado de cadmio, adicionando cido clorhdrico 1N.
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TINCIONES Gram

Alcohol-acetona Etanol (95%) Acetona Mezclar perfectamente ambos lquidos. 700,0 mL 300,0 mL

Cristal violeta Solucin A Cristal violeta Etanol (95%) Disolver el cristal violeta en el etanol.

2.0 g 20,0 mL

Solucin B Oxalato de amonio Agua

0.8 g 80.0 mL

Disolver el oxalato de amonio en el agua. Despus de preparar las soluciones A y B, verter una en la otra y agitar hasta que se mezclen perfectamente.

Solucin de Yodo Yodo Yoduro de potasio Agua 1,0 g 2,0 g 300,0 mL

Triturar finamente el yodo y el yoduro de potasio en un mortero, de ser posible en una campana de extraccin. Aadir una pequea cantidad de agua para lavar el mortero, agregar el resto del agua y agitar. Guardar la solucin en envases de color ambar. Nota: Evitar el contacto de los reactivos con la piel!

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Solucin de Safranina Safranina Etanol (95%) Agua 0,25 g 10,0 mL 100,0 mL

Disolver la safranina en el etanol, mezclar, agregar el agua y volver a agitar. Filtrar la solucin con papel filtro.

Tcnica de la tincin de Gram: 1. Colocar sobre un porta-objetos una gota de agua y la colonia que se desea teir, fijando a calor moderado la preparacin. En caso de utilizar un cultivo lquido, omitir la gota de agua y colocar directamente sobre un porta-objetos una gota del cultivo lquido. 2. Adicionar cristal violeta a la preparacin y dejarlo durante un minuto 3. Lavar con agua (usar de preferencia una piceta) y dejar escurrir 4. Cubrir la preparacin el lugol (solucin yodo-yodurada), y dejarlo actuar durante un minuto. 5. Lavar con agua y decolorar con etanol al 95%, hasta que deje de salir colorante, (aproximadamente 30 segundos). 6. Inmediatamente despus enjuagar con agua y escurrir. 7. Aplicar el colorante de contraste (safranina), esperar durante 30 segundos y 8. Enjuagar con agua, escurrir y dejar secar, para posteriormente hacer la observacin microscpica.

Impronta Hmeda Lactofenol azul algodn Agua destilada Cristales de fenol QP cido lctico Glicerina Azul algodn 20.0 mL 20.0 g 20.0 mL 20.0 mL 0.05 g

Disolver el fenol en el agua, agregar el cido y la glicerina y calentar a 70C y adicionar el colorante. Filtrar. Conservar en frascos de vidrio mbar perfectamente tapados.

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Tcnica de la impronta hmeda para observacin de hongos. 1. Colocar una gota de lactofenol azul de algodn sobre un portaobjetos 2. Utilizando tcnica asptica y con asa micolgica tomar una muestra del hongo (desarrollado sobre la caja de Petri), tratando de no romper las estructuras. 3. Si se tiene un cultivo puro, utilizar un bistur estril y cortar una porcin muy delgada del agar en el que se desarroll el hongo, transferirlo al portaobjetos y calentarlo suavemente para fundir el agar, de esta manera no se rompen las estructuras y se asegura una buena observacin. 4. Cubrir la preparacin, colocarla en la platina del microscopio. 5. Enfocar con el objetivo de 10X, observar el campo para localizarlo y para mejorar el detalle cambiar el objetivo de 40X. 6. Hacer esquemas de los microorganismos vistos y registrar las caractersticas observadas.

Tcnica de la impronta hmeda para observacin de hongos (DIUREX) 1. Colocar una gota de lactofenol azul de algodn sobre un portaobjetos 2. Colocar en el ltimo tercio del asa micolgica un pedacito de direx de 1.5 cm de largo, enrollndolo ligeramente. 3. En condiciones de asepsia, destapar la caja de Petri que contiene el cultivo del hongo, introducir el asa con el direx y presionar ligeramente sobre una fraccin de la colonia, tratando de no romper las estructuras. 4. Depositar la muestra en el portaobjetos que contiene el colorante, extender el direx y colocar encima un portaobjetos. 5. Colocar la preparacin en la platina del microscopio. 6. Enfocar con el objetivo de 10X, observar el campo para localizarlo y para mejorar el detalle cambiar el objetivo de 40X. 7. Hacer esquemas de los microorganismos vistos y registrar las caractersticas observadas.

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ANEXO II CARACTERSTICAS DE LAS CEPAS PATGENAS DE Escherichia coli

Escherichia coli enterotoxignica ETEC es reconocida como el agente causal de la diarrea del viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de infecciones es muy frecuente en pases subdesarrollados y afecta principalmente a los nios. Patognesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una toxina termolbil de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y funcin es similar a la toxina del clera, la otra toxina que produce es termoestable y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de resistir temperaturas de ebullicin hasta por 30 minutos. La infeccin puede ser adquirida por el consumo de alimentos tales como vegetales frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jvenes y ancianos la dosis infectiva puede ser ms baja. Escherichia coli enteropatgena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes particularmente en los pases en vas de desarrollo. La ECEP se adhiere a las clulas de la mucosa del intestino delgado. Sus factores de virulencia favorecen la adhesin y en ocasiones penetra a las clulas mucosas. La infeccin por ECEP provoca diarrea acuosa generalmente autolimitada aunque en ocasiones puede ser crnica. Patognesis. El microorganismo produce dos protenas: la intimina que es codificada por el gen eae y un factor de adherencia que es codificado por un plsmido, ambas protenas permiten su unin a los enterocitos y la destruccin de las microvellosidades intestinales. Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua contaminada y productos crnicos. En estudios con voluntarios se encontr que la dosis infectiva es de 106 microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado con mltiples serotipos especficos de E. coli los cuales pueden ser identificados mediante la tipificacin del antgeno O (somtico) y en ocasiones del antgeno H (flagelar). Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra estrechamente relacionado con el gnero Shigella, produce una enfermedad similar a la shigelosis. La enfermedad se presenta comnmente en nios de pases subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares. La EIEC

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provoca la enfermedad (diarrea disentrica invasiva) al invadir las clulas epiteliales de la mucosa intestinal. A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos, en el caso de EIEC la dosis infectiva es de aproximadamente 10 6 bacterias. Algunas caractersticas importantes de este microorganismo que permiten diferenciarlo de la cepa tpica de E. coli son: No utiliza la lactosa como fuente de carbono, no descarboxilan la lisina, es inmvil y anaerognicas. La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y destruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas. Escherichia coli enterohemorrgica EHEC produce verotoxina, denominada as por su efecto citotxico sobre las clulas Vero, una lnea de clulas renales de mono verde africano. Existen al menos dos variantes antignicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis hemorrgica, una variedad grave de diarrea; y con el sndrome urmico hemoltico, enfermedad capaz de producir insuficiencia renal aguda, anemia hemoltica microangioptica y trombocitopenia. La verotoxina tiene propiedades similares a la toxina shiga producida por algunas cepas de Shigella dysenteriae tippo 1; De los serotipos de E. coli que producen la verotoxina el ms comn y el nico que puede identificarse en muestras clnicas es el O157:H7. La E. coli O157:H7 no emplea sorbitol y es negativa a la prueba de MUG. La causa ms comn de esta infeccin es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis hemorrgica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la coccin completa de la carne

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