Procedimentos de segurança e protocolos laboratoriais em imunologia

Departamento de Biologia
www.ensino.uevora.pt/imuno

I M U N O L O G I A

Textos de apoio
e
Protocolos laboratoriais

2006-2007

Carlos Sinogas

Imunologia 2006/07 2
NDICE

PROCEDIMENTOS DE SEGURANA...................................................................... 3
Risco qumico................................................................................................ 3
Risco radiolgico............................................................................................ 3
Risco biolgico .............................................................................................. 3
Regras ......................................................................................................... 4
Planeamento................................................................................................. 5
Procedimentos gerais ..................................................................................... 5
REGISTOS E RELATRIOS ................................................................................. 6
ANTICORPOS MONOCLONAIS............................................................................. 7
Introduo.................................................................................................... 7
Imunizao................................................................................................... 7
Fuso Celular ................................................................................................ 8
Seleco Metablica....................................................................................... 8
Seleco Imunolgica..................................................................................... 9
Clonagem e Preservao das Clulas Produtoras ................................................ 9
Caracterizao e Purificao de Anticorpos Monoclonais....................................... 9
Esquema geral para a obteno de Anticorpos Monoclonais.................................11
PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS..........................................................................12
TESTE IMUNIDADE NATURAL.......................................................................12
IMUNIZAO ARTIFICIAL ..............................................................................14
RECOLHA DE SANGUE - Preparao do soro .....................................................15
OBSERVAO DE CLULAS SANGUNEAS.........................................................16
PURIFICAO DE IMUNOGLOBULINAS - Precipitao diferencial ..........................17
IMUNOPRECIPITAO - Qualitativa (Teste do anel) ...........................................18
IMUNOPRECIPITAO - Qualitativa (Teste em lmina) .......................................19
IMUNOPRECIPITAO - Quantitativa (Curva de precipitao) ..............................20
IMUNOPRECIPITAO - Dupla difuso (Ouchterlony) .........................................21
ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) - "Checker board" .......................22
ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) .................................................24
Representao grfica de uma ELISA...............................................................26
Estudo da Imunizao Experimental de uma Cabra (Trabalho autnomo) ................27

PROCEDIMENTOS DE SEGURANA
O trabalho laboratorial em Imunologia envolve trs tipos principais de risco que
importa considerar. O risco qumico, o risco biolgico e o risco radiolgico. Quase
todos os pases tm regras prprias para abordar este tipo de questes que se
colocam experimentao laboratorial. Tambm os laboratrios onde o trabalho se
desenvolve adoptam prticas apropriadas ao tipo de trabalho que a se desenvolve.
No se pretendendo discutir em detalhe os procedimentos de segurana legalmente
exigveis, apontam-se apenas algumas regras gerais e prticas laboratoriais a ser
adoptadas.
Apesar de qualquer dos trs riscos indicados colocarem problemas especiais, que
requerem precaues de tipo diferente, existe um conjunto de precaues e
procedimentos de segurana aplicveis a todos e que devero ser observados no
trabalho laboratorial do mbito da imunologia.
As regras que adiante se listam constituem um quadro geral no qual os procedimentos
especializados, decorrentes das situaes particulares que se indicam, devero ser
enquadrados.
RISCO QUMICO
Os produtos qumicos empregues nos ensaios imunolgicos distribuem-se por diversos
tipos associados a diferentes riscos para o operador. Quando apropriado, os riscos
conhecidos dos reagentes a empregar sero indicados, devendo ento ser adoptadas
as regras especficas mais aconselhadas, como seja o uso de luvas ou culos, trabalho
em hotte, etc.
As prticas previstas no mbito desta disciplina no faro uso generalizado de
reagentes perigosos ou de grande risco conhecido para a Sade Humana.
RISCO RADIOLGICO
De todos os riscos associados com os trabalhos de imunologia, o mais emotivo, que
no necessariamente o mais srio, a radioactividade. Ao contrrio dos outros
reagentes qumicos, os compostos radioactivos, por este facto, no podem ser vistos e
so isentos de cheiro, no se manifestando os seus efeitos no imediato. As regras para
a manipulao de produtos radioactivos so bastante mais rigorosas e tornam-se
muito mais restritivas ao trabalho a desenvolver. s exigncias para manipulao
destes produtos no trabalho, acrescem procedimentos particulares para a eliminao
dos resduos e monitorizao das pessoas e ambientes envolvidos.
Os trabalhos a executar no mbito desta disciplina no faro uso de reagentes ou
outros compostos radioactivos.
RISCO BIOLGICO
Todas as amostras de produtos biolgicos devem ser consideradas potencialmente
infecciosas, em particular as que so provenientes do Homem, em que uma eventual
barreira de espcie na transmisso dos agentes infecciosos no existe. As outras
espcies animais mais usadas em trabalhos de imunologia, os coelhos, os caprinos e
os roedores, so mamferos afastados do Homem que no representam qualquer
ameaa significativa para as pessoas que trabalham nos laboratrios de imunologia.

Em qualquer dos casos convm ter presente que as principais vias de transmisso de
infeces ocorrem em golpes abertos ou outras solues de continuidade na pele das
mos do operador, por picada com agulhas contaminadas ou por inalao de
aerossis. por isto que fortemente recomendado que, quando se trate de trabalho
directo com amostras biolgicas, no existam golpes nas mos do operador que no
tenham sido previamente protegidos e convenientemente impermeabilizados.
O trabalho a desenvolver nas prticas da disciplina no faro uso de soros ou outros
materiais biolgicos de origem humana, caso em que precaues especiais teriam de
ser tomadas para minimizar o risco de associado aos agentes infecciosos
transmissveis pelo sangue humano, como os agentes da SIDA ou das Hepatites. Em
todo o caso sempre aconselhvel considerar todos os materiais biolgicos a
empregar como potencialmente infecciosos para o operador e adoptar as prticas mais
adequadas ao cenrio do "pior caso".
Adicionalmente h que considerar que o trabalho prtico decorrer no laboratrio de
Microbiologia, onde microorganismos de diferentes tipos so manipulados por outras
pessoas. A possibilidade de contaminao das superfcies e outros materiais tambm
dever ser considerada.
REGRAS
Para alm dos riscos para o operador, que atrs se referem, as experincias que se
realizaro so certamente novidade para alguns dos estudantes, com experincia
laboratorial limitada e rotinas de boas prticas laboratoriais no estabelecidas.
Importa, por isso, prevenir.
boa prtica observar, cumprir e fazer cumprir as regras, procedimentos e
comportamentos que se indicam:
Bata
O uso de uma bata comprida, limpa e devidamente ajustada ao corpo
indispensvel sempre que se opere em laboratrio. A bata protege o operador e o
seu vesturio de eventuais acidentes. Idealmente a bata dever ser usada apenas
no laboratrio, sendo vestida entrada e despida sada. Desta forma, alm de
proteger o experimentador, a bata minimiza o transporte de potenciais agentes
infecciosos para o exterior do laboratrio.
Mos
entrada e sada do laboratrio preciso lavar bem as mos com abundante
gua e sabo, tambm para minimizar potenciais contaminaes cruzadas.
Dependente do tipo de produtos a manipular, o uso de luvas impermeveis,
mscaras ou outras proteces, poder ser exigvel. Mesmo quando normalmente
no recomendado, o uso de luvas poder ser necessrio em situaes de soluo
de continuidade na pele das mos do operador.
Comer e beber
expressamente proibido comer, beber, fumar, manipular lentes de contacto ou
aplicar cosmticos durante a execuo de experincias laboratoriais. Usar sempre
pipetas mecnicas, nunca pipetar com a boca. aconselhvel adquirir o hbito de
manter as mos longe da boca.

Bancada de trabalho
O local de trabalho dever estar sempre devidamente limpo, para o que se impe
proceder limpeza da bancada antes de iniciados os trabalhos, para no permitir a
contaminao das prprias experincias com microrganismos de sesses
anteriores, e depois das manipulaes terminadas para minimizar a potencial
propagao de agentes infecciosos contaminantes dos materiais biolgicos com
que se operou.
Livros e cadernos
S permitido levar para a bancada o material de apoio estritamente
indispensvel execuo do trabalho, como o protocolo experimental, um bloco de
notas ou um caderno e um lpis. Todos os restantes pertences do operador, como
pastas, casacos ou sacos devero ser acondicionados em local prprio, antes de
iniciada a experimentao.
Materiais
Todo o equipamento e material de laboratrio amovvel, utilizado durante a
experimentao, dever ser reposto no local indicado depois de concluda a sua
utilizao. Particularmente os materiais que tenham contactado com amostras de
origem biolgica devero ser rejeitados em local prprio para descontaminao.
Acidentes
Qualquer acidente dever ser de imediato reportado ao responsvel pela sesso de
trabalho. Lquidos ou outro material biolgico, inadvertidamente transferidos para
fora dos contentores a que se destinam devero ser de imediato desinfectados
com o apoio do responsvel.
PLANEAMENTO
No iniciar qualquer experincia sem o conveniente planeamento. O conhecimento e
compreenso prvios dos procedimentos experimentais, grelhas adequadas para
registo dos resultados e a efectiva disponibilidade de todos os recursos materiais
necessrios constituem elementos importantes para o sucesso das experincias. O
tempo "perdido" num planeamento inicial largamente compensado pelo nvel da
aprendizagem conseguido e pela preveno da necessidade de repetio de
experincias eventualmente bloqueadas.
PROCEDIMENTOS GERAIS
Todos os procedimentos devero ser efectuados tendo em mente a minimizao da
contaminao do material em uso e a formao de aerossis ou respingos, numa
perspectiva de proteco do prprio operador e de terceiros. Mais importante que um
conjunto de regras a obedecer a presena de bom senso nos trabalhos a realizar.
muito importante usar a cabea antes das mos.

REGISTOS E RELATRIOS
conveniente usar um bloco ou caderno para registo de todas as ocorrncias e dos
resultados da experimentao. Sugere-se o uso de caderno de laboratrio, de
preferncia com folhas no amovveis, por forma a que no sejam eliminadas notas ou
registos considerados irrelevantes na altura, como sucede com frequncia quando se
passam os apontamentos "a limpo", mas de grande utilidade para consulta futura para
eventual repetio da experincia. O rigor e pormenor dos registos efectuados
facilitar a aprendizagem, a interpretao dos resultados obtidos e a redaco
posterior do relatrio do trabalho.
Um qualquer relatrio de uma experincia laboratorial dever documentar de forma
to completa quanto possvel o procedimento executado e os resultados obtidos. Para
alm disso dever ser tambm objectivo do relator redigir um documento
compreensvel para o leitor e susceptvel de apoiar a eventual repetio da mesma
experincia em idnticas condies. Para a elaborao dos relatrios sugerem-se,
como orientao, as seguintes seces:

Ttulo Identificador do contedo do relatrio
Resumo Pequeno texto de que constem os objectivos almejados e as
concluses obtidas
Objectivo Razo de ser do trabalho realizado
Introduo Dados conhecidos que justificam a realizao da experincia
relatada
Palavras-chave Termos directamente relacionados com o trabalho
Material e reagentes Listagem exaustiva do equipamento, reagentes e outro
material usado
Protocolo
experimental
Marcha geral dos procedimentos aplicados. Devero ser
relatados os procedimentos concretos executados, com
referncia a eventuais desvios relativamente ao procedimento
recomendado / descrito
Resultados Registo das observaes efectuadas e dos dados recolhidos
Discusso Comentrio crtico aos resultados obtidos
Concluso Descrio do cumprimento ou incumprimento do objectivo,
decorrente dos resultados obtidos
Nota crtica Comentrio globalidade da experincia, com recomendaes
para a sua repetio ou outras consideradas adequadas
Bibliografia Referncias consultadas ou utilizadas para a realizao do
trabalho
Dependente do tipo do trabalho executado, da forma do relatrio e da sensibilidade do
relator, algumas das seces descritas podero ser fundidas, como "Resultados e
discusso" ou "Discusso e concluses", por exemplo

ANTICORPOS MONOCLONAIS
INTRODUO
Anticorpos monoclonais so imunoglobulinas homogneas com especificidade definida,
possveis de produzir em largas quantidades. Podem ser obtidas por imortalizao de
linfcitos B, clonados e expandidos em culturas celulares contnuas (anticorpos
monoclonais propriamente ditos) ou por recombinao de DNA, expresso noutras
linhas celulares eucariticas (anticorpos monoclonais engineered).
Em 1975 Khler e Milstein descobriram e empregaram pela primeira vez a tecnologia
dos hibridomas: fizeram combinar o material gentico de clulas normais produtoras
de anticorpos com o de clulas de origem maligna da mesma linhagem. Iniciaram
ento uma nova metodologia que desde ento no parou de evoluir e conduziu ao
desenvolvimento da tecnologia para a produo de quantidades virtualmente
inesgotveis de anticorpos com nveis de pureza nunca antes atingidos. Trata-se de
uma tecnologia de aplicao horizontal em todas as reas cientficas da Biologia, cujo
impacto s comparvel ao da tecnologia da recombinao do DNA.
Os anticorpos so protenas produzidas por linfcitos B, destinadas a intervir nos
processos de defesa imunitria dos organismos superiores: as imunoglobulinas. Tm
como principal caracterstica, numa perspectiva de aplicao cientfica /
biotecnolgica, a capacidade de se ligarem ao antignio que reconhecem.
Actualmente, para a sua obteno, recorre-se quase exclusivamente chamada
tecnologia dos hibridomas para a preparao de anticorpos monoclonais.
Os hibridomas so, como o nome indica, clulas hbridas, imortalizadas em cultura de
tecidos, produtoras de anticorpos monoclonais com especificidade nica e pr-
determinada pelo processo da sua preparao.
No processo clssico para a obteno de hibridomas utilizam-se clulas de bao de
murganhos imunizados com o antignio que se pretende reconhecer. Estes linfcitos
activados so fundidos com clulas de mieloma da mesma origem animal, mutantes
no produtores de imunoglobulinas, na presena de polietilenoglicol. As clulas ento
fundidas so cultivadas em meio selectivo (contendo HAT) em condies que
determinam apenas a sobrevivncia dos hbridos formados entre linfcitos e clulas de
mieloma. Os hibridomas com as caractersticas pretendidas, nomeadamente no que se
refere especificidade antignica, taxas de produo e crescimento e tipo de
imunoglobulina so seleccionados por mtodos imuno-enzimticos e preservados por
clonagem e congelamento. A caracterizao do anticorpo produzido e o
desenvolvimento do processo para a sua produo em larga escala dependem dos
objectivos finais do investigador.
IMUNIZAO
O processo de imunizao destina-se a conseguir linfcitos B activados para participar
na fuso celular. A espcie animal e rgos donde podem ser obtidos (bao, timo,
ndulos linfticos, sangue perifrico), bem como os protocolos de imunizao do
animal dependem da origem do antignio, da sua imunogenicidade e do destino a dar
aos anticorpos a preparar.
O murganho Balb/C, espcie animal de referncia, a que mais frequentemente
utilizada na obteno de anticorpos monoclonais, por se tratar de um animal pequeno,
de fcil manuteno e manipulao no laboratrio, com um sistema imunitrio

bastante bem conhecido e para o qual existem disponveis linhas celulares de mieloma
adequadas obteno de hibridomas histocompatveis e enxertveis no animal.
O esquema de imunizao a adoptar depende tambm do tipo e origem do antignio e
do tipo de anticorpos pretendidos. Em geral uma administrao nica de antignio no
murganho conduz obteno de uma maior percentagem de IgM relativamente a IgG.
No que se refere aos linfcitos produtores especficos obtm-se em maior abundncia
no bao na sequncia de mltiplas administraes de antignio. Para antignios
solveis de elevado peso molecular, regra proceder-se a uma imunizao em doses
repetidas de antignio, separadas entre si cerca de trs semanas a um ms. A eficcia
do processo de imunizao avaliada 2 semanas aps uma das ltimas
administraes, por anlise do ttulo do soro do animal em anticorpos capazes de
reconhecer o antignio. A expanso clonal dos linfcitos B, induzida pela presena do
antignio, determina uma concentrao mxima daquelas clulas, produtoras de
anticorpos especficos, no bao do animal 2 a 3 dias aps a administrao do
antignio.
Para outro tipo de antignios, previsivelmente eliminados do organismo por
mecanismos em que o sistema imunitrio no desempenha o papel principal, como
so os casos de molculas hidrofbicas, hidroflicas de baixo peso molecular ou fraca
antigenicidade, necessrio recorrer adio de outros compostos que iniciem a
resposta imunitria (haptenos, carriers).
FUSO CELULAR
A fuso entre as clulas de uma mistura, destinada a imortalizar os linfcitos
produtores de anticorpos, pode ocorrer espontaneamente, mas com uma muito baixa
probabilidade. Para aumentar essa probabilidade introduzem-se outros agentes na
mistura de clulas.
As clulas do bao dos animais imunizados so recolhidas e misturadas com clulas de
mieloma, da mesma espcie animal, no produtoras de anticorpos e portadoras das
mutaes HGPRT- ou TK-. As clulas da mistura, quando na presena de agentes
fusognicos, como protenas do vrus Sendai, PEG ou campo elctrico (electrofuso,
electroporao), fundem os seus contedos, determinando o aparecimento de hbridos
intra- e inter-especficos. A imortalizao dos linfcitos, em particular quando se trata
de clulas de origem humana, pode tambm ser conseguida por transformao com
vrus tumorignicos (EBV).
SELECO METABLICA
Aps o processo de fuso obtm-se uma mistura de clulas de diversos tipos:
linfcitos e clulas de mieloma no intervenientes em qualquer fuso, hbridos
resultantes da fuso de mais de um linfcito, hbridos resultantes da fuso de mais de
uma clula de mieloma e hbridos resultantes da fuso de clulas de mieloma com
linfcitos. Nas condies de cultura subsequentes no sobrevivem os linfcitos
originais e os hbridos entre linfcitos, por no terem capacidade para crescer em
cultura na ausncia dos convenientes factores de crescimento. As clulas de mieloma
e os hbridos resultantes de fuses entre estas tambm no podero sobreviver, dado
que, apesar de possurem a capacidade de crescer em cultura, so portadoras de
mutaes das enzimas HGPRT ou da TK e, na presena de aminopterina, no
conseguem sintetizar os precursores para a sntese do DNA. S podem crescer em
cultura os hbridos entre clulas de mieloma e linfcitos que hajam adquirido a
capacidade de crescer em cultura, dos primeiros, e a capacidade de sintetizar os

precursores do DNA atravs das vias metablicas que utilizam a HGPRT e a TK,
provenientes dos linfcitos. So os hibridomas.
SELECO IMUNOLGICA
Os mtodos imunolgicos para a deteco, quantificao e caracterizao das
imunoglobulinas incluem a imunoprecipitao, ensaios imuno-enzimticos, imuno-
radiomtricos e de imuno-fluorescncia e cromatografias. Particularmente no que se
refere seleco inicial dos hibridomas resultantes da fuso impe-se a adopo de
mtodos de rpida execuo, aplicveis a centenas de amostras e de custos
reduzidos.
De entre os hibridomas resultantes, h que identificar as linhas celulares produtoras
de anticorpos especficos do antignio. Os mtodos mais frequentemente utilizados
nesta seleco imunolgica so a ELISA ("Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay"),
RIA ("Radio Immuno Assay"), IRMA ("Immuno Radio-Metric Assay" ou "Sandwich") e
Imuno-fluorescncia. O mtodo de primeira escolha, a ELISA, baseia-se numa fixao
do antignio a um suporte slido seguida do reconhecimento deste pelos anticorpos
produzidos pelos hibridomas. A presena dos anticorpos especficos revelada por
outros anticorpos, especficos da espcie (domnios constantes das imunoglobulinas),
e conjugados com enzimas capazes de alterar as caractersticas cromticas de um
substrato. So seleccionadas as culturas cujos sobrenadantes apresentem reaco
enzimtica positiva no ensaio.
CLONAGEM E PRESERVAO DAS CLULAS PRODUTORAS
Uma vez identificadas as culturas produtoras dos anticorpos convenientes h que
preserv-las e, frequentemente, caracteriz-las antes da sua utilizao para a
produo dos anticorpos monoclonais.
A partir do momento em que pela seleco imunolgica so detectados hibridomas
produtores, estas culturas devero ser congeladas, mesmo antes da clonagem, para
evitar a sua perda.
Sendo os hibridomas clulas poliploides, tm uma tendncia natural para segregar os
cromossomas que possuem em excesso, razo pela qual seria conveniente manter
uma presso selectiva para preservar o DNA responsvel pela sntese dos anticorpos.
No existindo qualquer antibitico ou metabolito que possa exercer esta presso
selectiva, a manuteno da expresso conseguida atravs da clonagem, processo
para isolamento e expanso de uma cultura a partir de uma s clula.
O mtodo mais expedito para a clonagem dos hibridomas a clonagem por diluio
limite, em que a cultura diluda e distribuda por microplacas em concentraes
inferiores a uma clula por poo. Outros mtodos, como a clonagem em agarose so
menos frequentemente utilizados porque mais laboriosos.
Os hibridomas, tal como outras clulas eucariticas estabelecidas em cultura, podem
conservar-se por congelao em azoto lquido, onde se mantm viveis durante vrios
anos.
CARACTERIZAO E PURIFICAO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS
A caracterizao do anticorpo obtido constitui um requisito essencial para a sua
conveniente utilizao.

A isotipagem, que consiste na determinao do tipo de imunoglobulina presente,
obtm-se por reaco imunolgica com anticorpos de outra espcie animal especficos
dos diferentes tipos de cadeias constantes de murganho (IgA, IgM, IgG1, IgG2, ...).
A especificidade epitpica relativa de diferentes monoclonais contra o mesmo
antignio determina-se por ensaio imunolgico em que com uma quantidade fixada de
antignio se fazem reagir misturas de anticorpos em diferentes percentagens
relativas. Dois anticorpos reconhecero diferentes epitopos se uma mistura dos dois
origina um sinal superior ao de qualquer deles isolado, na saturao do antignio.
Tambm a afinidade relativa de um anticorpo para o antignio poder ser relevante.
Determina-se fazendo reagir o antignio, radioactivamente marcado, com uma
determinada quantidade de anticorpo. O antignio fixado por unidade de massa do
anticorpo reflecte a afinidade entre os dois, nas condies experimentais usadas. Esta
quantidade de antignio, quando referida a unidade de volume do sobrenadante da
cultura do respectivo hibridoma, constitui um indicativo da produtividade desta
cultura.
O conhecimento das caractersticas fsico-qumicas, como a massa molecular e/ou o
ponto isoelctrico podero ser importantes para o desenho do respectivo processo de
purificao.
Partindo de linhas celulares de hibridomas produtores, os anticorpos monoclonais
podem obter-se por cultura de clulas in vitro e purificao a partir do sobrenadante
(com rendimentos da ordem dos 100 g/ml) ou a partir de ascites e soros de animais
portadores de tumores induzidos pela injeco dos respectivos hibridomas
(rendimentos da ordem dos 2 mg/ml).
So mtodos de eleio para a purificao de anticorpos monoclonais as
cromatografias de afinidade, nomeadamente com a Protena A Sepharose, se se tratar
de imunoglobulinas tipo G, ou com o antignio fixado a um suporte slido.

ESQUEMA GERAL PARA A OBTENO DE ANTICORPOS MONOCLONAIS

PROTOCOLOS EXPERIMENTAIS
TESTE IMUNIDADE NATURAL
Material e reagentes
Suspenso de Micrococcus
Soro fisiolgico estril
Soluo de Lisozima (10 mg/ml)
Espectrofotmetro e tubos
Pipetas e micropipetas
Procedimento experimental
1. Preparar 8 diluies decimais de lisozima, em tubos de espectrofotmetro
(1 grupo por turma):
Tubo # L0 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10
Lisozima 10
mg/ml (l)
1000
Amostra
anterior (l)
- 100 100 100 100 100 100 100 100 100 -
Soro fisiolgico
(l)
- 900 900 900 900 900 900 900 900 900 900
Diluio 10
0
10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
10
-6
10
-7
10
-8
10
-9
0

2. Rejeitar 100 l da diluio do tubo #9
3. Recolher cerca de 2.5 ml de saliva em placa de petri esterilizada
4. Preparar diluies decimais de saliva, em tubos de espectrofotmetro
(restantes grupos da turma):
Tubo # S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6
Saliva (l) 1000
Amostra anterior
(l)
- 100 100 100 100 100 -
Soro fisiolgico (l) - 900 900 900 900 900 900
Diluio 10
0
10
-1
10
-2
10
-3
10
-4
10
-5
0

5. Rejeitar 100 l da diluio do tubo #5
6. Adicionar a cada tubo 2 ml de suspenso bacteriana
7. Homogeneizar com pipeta, evitando espuma
8. Ler e registar os valores da absorvncia de cada diluio a 540 nm a vrios tempos
at aos 20minutos.
9. Expressar resultados em grfico.
10. Avaliar a concentrao relativa de bactericidinas na saliva por comparao com o
controlo positivo de lisozima

Registo de resultados

LISOZIMA Absorvncia
Tempo
(min)
L0 L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10
0
1
2
3
4
5
10
15
20

SALIVA Absorvncia
Tempo
(min)
S0 S1 S2 S3 S4 S5 S6
0
1
2
3
4
5
10
15
20

Notas

IMUNIZAO ARTIFICIAL

Cabras
Excipiente oleoso (Adjuvante de Freund, Parafina lquida)
Soluo de antignio (lisozima a 10 mg/ml em SF)
Seringas e agulhas hipodrmicas

(Preparao da emulso para imunizao)
1. Adicionar 5 ml de soluo de antignio em tubo de ensaio
2. Adicionar 5 ml de adjuvante oleoso
3. Misturar vigorosamente, com auxlio de uma seringa com agulha
4. Verificar o estado da emulso com uma gota sobre a superfcie de gua fria
(no deve misturar-se)

Imunizao
Dia 1 Recolher amostra de sangue para teste
Injectar 3 a 4 ml de emulso por via subcutnea em diversos pontos (4 a
6 picadas)
Repetir a injeco da mesma quantidade de antignio emulsionado
Dia 45 Recolher sangue para anlise

5. Registar todos os dados de identificao dos animais, volumes de sangue e soro,
datas das operaes e outras ocorrncias

Notas

RECOLHA DE SANGUE - PREPARAO DO SORO

Material e reagentes.
Animais imunizados e/ou no imunizados (cabras)
Tubos de vcuo c/ agulha para recolha de sangue
Centrfuga
Microtubos
Azida de sdio a 2%

1. Picar a veia jugular e tomar amostra de sangue por aspirao (1/ grupo - mximo
50 ml)
2. Marcar o tubo e homogeneizar o sangue recolhido.
3. Aguardar cerca de 20 minutos a temperatura ambiente
4. Centrifugar 4000 rpm durante 10 min.
5. Pipetar soro sobrenadante para microtubos contendo entre 0,5 e 1 ml de soro
6. Adicionar azida de sdio a 0,02% final (sock 100 X)
7. Conservar congelado a -20C.

Notas

OBSERVAO DE CLULAS SANGUNEAS

Colorao de Wright
Sangue total capilar, fresco
Soluo de Wright (corante)
Soluo tampo (6.63 g KH
2
PO
4
; 2.56 g Na
2
HPO
4
; H
2
O ad. 1L)
Lminas de microscpio novas (lavadas e desengorduradas)
Procedimento experimental ( individual)
(Trabalho individual a efectuar com o prprio sangue)
1. Colocar I gota de sangue fresco a 1/3 da extremidade da lmina
2. Espalhar uniformemente a amostra com auxlio de outra lmina (ver esquema)
3. Deixar secar ao ar
4. Cobrir o esfregao com soluo corante de Wright
5. Deixar actuar durante 2 minutos
6. Adicionar igual volume de soluo tampo
7. Homogeneizar movimentando o corante com jacto de ar de pipeta
8. Deixar actuar durante 3 a 4 minutos
(as margens devero apresentar uma cor avermelhada e o centro um brilho
metlico esverdeado)
9. Remover o corante por lavagem em gua corrente. Lavar a lmina com gua
destilada
10. Deixar secar ao ar. Observar ao microscpio. Registar observaes, desenhando e
identificando os diferentes tipos de clulas

Notas

PURIFICAO DE IMUNOGLOBULINAS - PRECIPITAO DIFERENCIAL

Material e Reagentes
Soro a purificar
Soluo saturada de Sulfato de amnio em gua
PBS-A (pH 7,2)
- 0,8% NaCl
- 0,02% KH
2
PO
4

- 0,144% Na
2
HPO
4
.2.H
2
O
Microtubos
Manga de dilise

Procedimento experimental (por grupo)
1. Pipetar 500 l de soro a purificar para microtubo
2. Adicionar 400 l de sulfato de amnio saturado (40-45%)
3. Misturar e conservar no gelo durante 30 minutos
4. Centrifugar 5 min na eppendorf
5. Pipetar e rejeitar o sobrenadante
6. Escorrer bem o tubo
7. Dissolver o sedimento com 250 l de PBS
8. Dialisar contra PBS-A contendo 0,02% de azida de sdio, pelo menos durante uma
noite
9. Recuperar o contedo da manga de dilise
10. Congelar a -20 C.

Notas

IMUNOPRECIPITAO - QUALITATIVA (TESTE DO ANEL)

Soro a testar
Imunoglobulinas purificadas
Soluo de antignio
Glicerol a 10%
Microtubos de ensaio em vidro
Micropipetas

1. Equilibrar todas as solues e tubos a 37C
2. Pipetar 200 l de soro a testar e/ou imunoglobulinas para o fundo do tubo
3. Adicionar 20 l de glicerol, homogeneizando com a pipeta
4. Pipetar 200 l de soluo de antignio para a superfcie do soro, cuidadosamente e
sem misturar as fases
5. Incubar a 37C durante 30 minutos a 1 hora
6. Observar a formao de um precipitado em anel na zona da interface entre as
duas solues

Notas

IMUNOPRECIPITAO - QUALITATIVA (TESTE EM LMINA)
Soro a testar
Soluo de antignio
Lminas de microscpio
Micropipetas

1. Equilibrar todas as solues e lminas a 37C
2. Pipetar I gota de soluo de antignio no centro de uma lmina
3. Pipetar I gota de soro a testar sobre a gota precedente
4. Repetir com as imunoglobulinas purificadas
5. Incubar a 37C durante 30 minutos a 1 hora
6. Observar a formao de precipitado
7. Registar observao

Notas

IMUNOPRECIPITAO - QUANTITATIVA (CURVA DE PRECIPITAO)
Soro a testar (diludo a 1:10)
Soluo de antignio (1 mg/ml)
PBS-A
Microtubos
Micropipetas

1. Preparar diluies do antignio: 10
-0
, 3 X 10
-1
, 10
-1
, 3 X 10
-2
, 10
-2
, 3 X 10
-3
, PBS
2. Pipetar 200 l de soro a testar em cada tubo
3. Repartir 200 l de cada diluio por tubo
4. Misturar no vortex
5. Incubar em estufa a 37C durante uma hora
6. Centrifugar 2 minutos
7. Observar e registar os nveis de precipitado em cada tubo
(quantificar os precipitados por determinao do azoto ou pesagem dos
sedimentos a peso seco)
8. Definir o ponto de equivalncia do soro relativamente ao antignio

Notas

IMUNOPRECIPITAO - DUPLA DIFUSO (OUCHTERLONY)
Soros a testar
Soluo de antignio
Agar ou Agarose tipo V (ou II)
Azida de sdio 10%
Soluo corante de Coomasie (0.25% de azul de Coomasie em soluo
descorante)
Soluo descorante (cido actico glacial - 10%, metanol - 50%)
Lminas de microscpio
1. Preparao do gel
a. Lavar duas vezes com gua gelada 0.1 gr de agar ou agarose
b. Adicionar 10 ml de PBS. Fundir em forno de microondas
c. Arrefecer a cerca de 50C. Adicionar 50 l de azida a 10%
d. Aplicar cuidadosamente em cada lmina uma quantidade que permita uma
altura de 3mm (5 ml por lmina)
e. Deixar solidificar sobre superfcie horizontal
f. Perfurar a agarose, conforme ilustrao
(em pontos equidistantes e separados de 1 cm do orifcio central)
g. Aspirar o agar cortado com pipeta.
2. Ensaio
a. Encher o orifcio central com soluo de antignio
b. Colocar em cada um dos outros orifcios volumes iguais de soro a testar e
imunoglobulinas purificadas (no diludo e diludo a 1:10)
c. Incubar em estufa a 37C, em cmara hmida, durante, pelo menos, 1 hora
d. Observar linhas de precipitao
e. Registar e desenhar as observaes
3. Colorao
a. Corar o gel com azul de Coomasie
b. Diferenciar em soluo descorante
c. Lavar em PBS
d. Secar o agar com papel absorvente (compresso prolongada com mltiplas
camadas de absorvente)
e. Observar e registar os resultados

Notas

ELISA (ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY) - "CHECKER BOARD"
Microplacas para ELISA
(2 X 8 poos)
Soluo de antignio a 10
mg/ml
Soro de cabra pr-imune
(diludo a 1:100 em
Tampo de bloqueio)
2. Anticorpo
Soro de coelho anti-cabra
conjugado com peroxidase
(RAGIG-HRPO) (diludo em
Tampo de bloqueio
1:5000)
Tampo de Fixao pH
9,6
- 0,159% Na
2
CO
3

- 0,293% NaHCO
3

- 0,02% NaN
3

Tampo de Bloqueio
- 0,5% BSA em PBS-A
Tampo de Lavagem
pH 7,2
- 0,8% NaCl
- 0,02% KH
2
PO
4

- 0,144%
Na
2
HPO
4
.2.H
2
O
- 0,05% Tween 20
Tampo de Substrato
pH 5,0
- 1,118% Na
2
HPO
4

- 0,56% cido ctrico
Soluo OPD
(extemp.)
OPD (O-fenileno-
diamina) - 20 mg
H
2
O
2
- 10 l
Tampo de substrato -
- 60 ml
4N H
2
SO
4

1. Distribuir 100 l de Tampo de Fixao em cada poo da microplaca
2. Pipetar 100 l de soluo de antignio para os poos 1 da microplaca.
Homogeneizar
3. Tomar 100 l de soluo do poo 1 para o poo 2. Homogeneizar
4. Repetir sequencialmente o passo 4 at ao poo 7 (rejeitar 100 l deste poo)
5. Registar diluies de cada poo
6. Incubar 4C durante, pelo menos, 24 horas, ao abrigo da dissecao
7. Lavar trs vezes cada poo da microplaca com 200 l de Tampo de Lavagem,
repousando durante 3 min de cada vez
8. Distribuir 200 l de Tampo de Bloqueio. Incubar durante 30 minutos a 37C
9. Repetir Lavagem.
10. Distribuir 100 l de soluo de soro de cabra a 1:100 em cada poo
11. Incubar 37C durante 30 minutos (ou a 4C durante uma noite), ao abrigo da
dissecao
12. Repetir Lavagem
13. Distribuir 100 l da soluo do 2 Anticorpo por cada poo da microplaca
(Cada grupo utiliza diferentes solues diludas - 1:1000; 1:2000; 1:5000;
1:10000)
14. Incubar 37C durante 30 minutos, ao abrigo da dissecao
15. Repetir Lavagem
16. Adicionar 200 l de soluo OPD a cada poo
17. Incubar 37C durante 15 min, ao abrigo da dissecao e no escuro
18. Adicionar 50 l de H
2
SO
4
por poo
19. Observar e registar as intensidades de cor relativas


Concentraes de antignio
1 2 3 4 5 6 7 8
A
B

Concentraes de soro
1 2 3 4 5 6 7 8
A
B

Concentraes de 2 anticorpo (conjugado)
1 2 3 4 5 6 7 8
A
B

Resultados observados (de ++++ a -)
1 2 3 4 5 6 7 8
A
B

Notas

ELISA (ENZYME LINKED IMMUNOSORBENT ASSAY)
(os mesmos que para Checker board)
Soro de cabra a testar
Soluo de antignio a 10 mg/ml
Soro pr-imune (negativo)
2 Anticorpo - RAGIG-HRPO
diluir cada soluo de acordo com os
resultados da experincia anterior

1. Distribuir 100 l de soluo de antignio por poo de microplaca
2. Incubar 4C durante, pelo menos 24 horas, ao abrigo da dissecao
3. Lavar trs vezes cada poo da microplaca com 200 l de Tampo de Lavagem,
repousando durante 3 min de cada vez
4. Distribuir 200 l de Tampo de Bloqueio. Incubar durante 30 minutos a 37C
5. Repetir Lavagem
6. Distribuir 100 l de Tampo de Bloqueio em cada poo (excepto poos 2)
7. Pipetar 100 l de soro pr-imune para poos 2
8. Pipetar 50 l de soro a testar para um poo 3. Homogeneizar.
9. Tomar sequencialmente 50 l de diluio do soro para o poo seguinte, conforme o
esquema:

A3 A4 A5 A6 A7 A8

B3 B4 B5 B6 B7 B8

1 2 3 4 5 6 7 8
A 0 Neg. 3 x
10
-1

10
-1
3 x
10
-2

10
-2
3 x
10
-3

10
-3

B 0 Neg. 10
-6
3 x
10
-6

10
-5
3 x
10
-5

10
-4
3 X
10
-4

10. Incubar 37C durante 30 minutos (ou a 4C durante uma noite), ao abrigo da
dissecao
11. Repetir Lavagem
12. Distribuir 100 l da soluo do 2. Anticorpo por cada poo da microplaca
13. Incubar 37C durante 30 minutos, ao abrigo da dissecao
14. Repetir Lavagem
15. Adicionar 200 l de soluo OPD a cada poo
16. Incubar 37C durante 15 min, ao abrigo da dissecao e no escuro
17. Adicionar 50 l de H
2
SO
4
por poo
18. Observar as intensidades de cor relativas
19. Avaliar ttulo aproximado do soro (ltima diluio positiva = diferente do controlo
negativo)


Resultados observados (de ++++ a -)
1 2 3 4 5 6 7 8
A
B

Fila A Fila B
Coluna Amostra Resultad
o
Colun
a
Amostra Resultad
o
1 1
2 2
3 3
4 4
5 5
6 6
7 7
8 8

Ttulo do
soro:

Notas

REPRESENTAO GRFICA DE UMA ELISA

ESTUDO DA IMUNIZAO EXPERIMENTAL DE UMA CABRA
(TRABALHO AUTNOMO)
Registo de operaes e observaes

D:\UEVORA\Disciplinas\Imunologia\2005 2006\ManualImuno.doc
Carlos Sinogas

Procedimentos de segurança e protocolos laboratoriais em imunologia

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