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EXTRACCION Y ANALISIS DE CAROTENOIDES DEL PIMENTN (apsicum annuum) VERDE POR CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA Y CROMATOGRAFA EN CONLUMNA

Introduccin Unas de las tcnicas cromatografa ms sencillas y econmicas de separar componentes de inters de una muestra son la cromatografa en capa fina y en columna en esta ocasin estas tcnicas se emplearon para la separacin de ciertos carotenoides contenidos en el pimentn verde empleando solventes como ter de petrleo y acetato de sodio, obteniendo asi unos resultados satisfactorios.

Objetivos

Objetivo general Separar los componentes de inters (carotenoides) en un muestra de pimentn verde usando tcnicas de separaciones cromatografcas sencillas. Objetivos especficos. Determinar qu tipos de carotenoides tiene el pimentn verde usando rf obtenidos y comparndolos con los de referencia. Desarrollar habilidades en el manejo de las tcnicas cromatograficas empleadas. Entender la importancia de los carotenoides en este tipo de especies vegetales.

Marco Terico DEFINICION Los carotenoides o tetraterpenoides son una clase de pigmentos terpenoides con 40 tomosde carbono derivados biosintticamente a partir de dos unidades de geranil-geranilpirofosfato,en su mayora son solubles en solventes apolares y de coloraciones que oscilanentre el amarillo (por ejemplo el -caroteno) y el rojo (por ejemplo el licopeno). CLASIFICACION Y NOMENCLATURA Los carotenoides se clasifican en dos grupos: carotenos y xantofilas. Los carotenos solo contienen carbono e hidrgeno (por ejemplo el -caroteno, el licopeno, etc.), mientras que las xantofilas contienen adems oxgeno (por ejemplo la lutena). A los carotenoides generalmente se les denomina con nombres comnes que incluyen las variaciones estructurales de los anillos laterales, en especial la posicin del enlace doble. El bcaroteno,hoy es denominado b,b-caroteno, para indicar que los dos anillos de los extremos tienen el enlace doble en la misma posicin relativa. El a-caroteno, ahora se denomina b,ecaroteno En general para los carotenos se usa el sufijo caroteno, y para las xantofilas el sufijo ina. DISTRIBUCION Y ESTADO NATURAL Los carotenoides se encuentran ampliamente distribuidos en el reino vegetal, en bacterias, y muy pocos se han reportado en animales (por ejemplo los colores rojizos de las plumas del flamingo son debidos a la cantaxantina, un carotenoide), y particularmente invertebrados marinos como las esponjas, estrellas de mar, pepinos de mar, erizos de mar, y otros. En los animales superiores el -caroteno es un requerimento dietario esencial pues es precursor de la vitamina A.Se conocen ms de 600 carotenoides, y se les encuentra en forma libre, como steres decidos grasos o como glicsidos. Sin embargo los glicsidos carotenoides son muy raros, un ejemplo de estos ltimos es la crocina. Los carotenoides se encuentran principalmente en partes areas de las plantas, especialmente en hojas, tallos y flores, en frutos (por ejemplo tomate, pimentn, etc.), y en menor proporcin en races (por ejemplo la zanahoria). El caroteno ms comnmente encontrado es el b-caroteno, y normalmente constituye entre el 25-30 % del contenido total de carotenoides en las plantas. La lutena es la xantofila ms abundante (40-45 %), pero siempre se encuentra en menor proporcin que el b-caroteno1. Los carotenoides junto con los flavonoides y las clorofilas, son los pigmentos vegetales ms distribudos. En especial existen carotenoides que confieren coloraciones amarilla, naranja, roja y violeta a tejidos vegetales y algunos rganos animales. Los flavonoides confieren tambin coloraciones similares, inclusive coloracin azul a muchas flores y frutos, mientras que las clorofilas se reconocen fcilmente por su coloracin verde. Existen tambin vegetales tan conocidos como la remolacha Beta vulgaris, que debe su color caracterstico a pigmentos nitrogenados denominados betacianinas, menos distribudos que los primeros.

Aislamiento y extraccin Debido a que los carotenoides en su mayora son solubles en solventes apolares como ter etlico, benceno, cloroformo, acetona, acetato de etilo, entre otros; y a que se deben extraer de tejidos frescos, los cuales presentan un alto contenido de agua la cual dificulta una extraccin

eficiente, es conveniente eliminar dicho agua. Un procedimiento recomendable es deshidratar los tejidos con etanol o metanol a ebullicin seguido de filtracin. El tejido deshidratado se puede entonces extraer con un solvente apolar. Una alternativa a este proceso de deshidratacin es la liofilizacin, la cual resulta ventajosa porque se realiza a baja temperatura y al vaco, eliminando la posibilidad de degradacin por altas temperaturas y presencia de aire. Si en el extracto existen carotenoides esterificados, estos se pueden hidrolizar disolviendo el extracto en un volumen pequeo de KOH 60% alcohlico. Esta mezcla se deja en la oscuridad durante la noche, con atmsfera de nitrgeno, a temperatura ambiente y con agitacin magntica, con lo cual los carotenoides son liberados. Si se desea un proceso ms rpido, es aconsejable la ebullicin durante 5-10 minutos. Separacin Las mezclas de carotenos y las xantofilas mono- y dihidroxiladas pueden separarse agitandouna solucin en ter de petrleo con un volumen de metanol al 90%. Las xantofilas dihidroxiladas quedan en la fase metanlica, las monohidroxiladas y los carotenos quedan en la fase etrea. Repitiendo este proceso con la fase etrea se separan en la fase metanlica las xantofilas monohidroxiladas, y en la fase etrea quedan los carotenos. Las xantofilas separadas en las fases metanlicas pueden recuperarse extrayndolas con ter etlico. Debido a que los extractos de carotenoides generalmente estn impurificados por otras sustancias como los esteroles, estos se pueden eliminar dejando el extracto concentrado en solucin de ter etlico, tapado y a -10C durante la noche. De esta manera los esteroles se precipitan y pueden ser retirados por centrifugacin o filtracin. Una vez obtenido el extracto o los extractos de carotenoides, estos se pueden separar y analizar por cromatografa en capa fina, en papel o en columna. El mtodo ms usado es la cromatografa en capa fina con varias clases de fases estacionarias que incluyen: xido de magnesio activado, slica gel, hidrxido de calcio y fosfato de magnesio entre otros.

Desarrollo experimental Todo el proceso de de extraccin y separacin se llev a cabo en tres fases Primera fase Extraccin se tom un pimentn con una coloracin verde de buen tamao y que estuviera en buenas condiciones luego se procedi a picarlo en finas partes de all se tomo una muestra de 30 g el cual fueron maceradas esta maceracin luego se agreg una mezcla de metanol y diclorometano en una relacin de volmenes 9-1 posteriormente esta mezcla se llev a un embudo de separacin se dejo en reposo por unos minutos luego para su fraccionamiento se agreg una solucin salina de cloruro de sodio se formaron dos fases luego se procedi a embazar la fase de inters en este caso el extracto primario la cual se dej en contacto con el medio ambiente durante una noche. Segunda fase Se procedi a realizar tcnica cromatograficas en columna Los solventes utilizados (fase mvil) fueron ter de petrleo, metanol y acetato de etilo. La fase estacionaria se utiliz silica gel.

En primera instancia se procedi con una mezcla de ter de petrleo acetato de etilo en un volumen de 60 ml con una relacin 9-1 eter/acetato Separando as tres componentes distintos Luego aumento la polaridad preparando una mezcla de ter de petrleo y acetato de etilo en una relacin 4-1 de ter/acetato. Logrando separar as tres componentes mas Posteriormente se procedi a preparar las misma mezcla en una relacin 7-3 en volumen de 50 ml logrando separar as dos componentes mas Nuevamente se prepar la misma mezcla en una relacin 6-4 Por ltimo se agreg metanol debido a que algunas especies se encontraban muy retenidas logrando separar as dos componentes. En total fueron utilizados 26 viales para la recoleccin de los eluatos. El tiempo de empleado para esta separacin fue 5h aproximadamente Tercera fase Se procedi a realizar la cromatografa en capa fina. De la cromatografa en columna se obtuvieron 10 muestras diferentes el cual se procedieron a separar los carotenoides existentes en dichas muestras. Tomando como referencias las muestras 1, 3 , 5, 9, 12, 15, 18 , 21, 24 25. Anlisis de resultados Se utilizaron dos reveladores. Vapor de yodo y luz U.V . Medidas de Rf. Ecuacin empleada Rf= donde X= distancia recorrida por la especie retenida (cm) L= longitud de la placa (cm)

Datos: Longitud de la placa= 3.8 cm Rf obtenidos usando como revelador luz U.V Muestra N 3 X= 3.6 cm Rf= 0.94 Muestra N 5 X=2.3 cm Rf=0.60 X=2.3 cm Rf=0.60 Muestra N12 X1=2.3 cm Rf=0.60 X2=3cm Rf=0.78 Muestra N9 Muestra N 15

X=2.4 cm Rf=0.63 Muestra N 18 X1=0.6 cm Rf=0.15 X2=2.4 cm Rf=0.63 Muestra N 21 X= 2.3 cm Rf= 0.60 Muestra N 24 Rf No Identificado Muestra N 25 X=1.4 cm

Rf=0.36

Rf obtenidos empleando como revelador vapores de yodo Muestra N 1 X1=2.8 cm Rf=0.73 X2=3.7 cm Rf=0.97 Muestra N5 X1=3.7 cm Anlisis de resultados. Con los valores de Rf de referencia y comparndolos con los obtenidos experimentalmente pudimos establecer que los posibles tipos de carotenoides presentes son -caroteno Rf de referencia = 0.74 Rf= 0.97 X2=2.7 cm Rf= 0.71 Muestra N 9 X=2.6 cm Rf=0.68

Se obtuvo un Rf experimental de 0.71 en la muestra N 5 usando como revelador vapores de yodo -caroteno Rf de referencia= 0.80 Se obtuvo un Rf experimental de 0.78 en la muestra N 12 usando como revelador luz U.V Luteina. Rf de referencia=0.35 Se obtuvo un Rf experimental de 0.36 en la muestra N 25 usando como revelador luz U.V Capsantina. Rf de referencia= 0.16 Se obtuvo un Rf experimental de 0.15 en la muestra N 18 usando como revelador luz U.V

Conclusin De la anterior practica se pudo establecer los posible carotenoides presentes en el pimentn verde tales carotenoides fueron -caroteno, -caroteno, Luteina, capsantina. Las medidas Rf obtenidas experimentalmente fueron muy cercanas a los valores Rf de referencia consultado, lo cual indica que la prctica de laboratorio supero los mrgenes mnimos de errores, brindando as resultados confiables.

Bibliografa Merck Co Inc reactivos de coloracin para cromatografa de capa fina y papel. Robinson T. The Organic constituensts of Higher plants, 5th ed. Cordus Press, North Amherst MA U.S.A 1983. Dalmases, P., Bonet J. J., Tecnicas de Cromatografia Liquido-Solido en Columna .1984.

Universidad de Crdoba Facultad de Ciencias Bsicas Departamento de Qumica Laboratorio de Anlisis de Sustancias Bioactivas

Extraccin y Anlisis de Carotenoides del Pimentn (apsicum annuum) Verde por Cromatografa en Capa Fina y Cromatografa en Columna.

Ana Milena Borja Cristhian David Rubio Jos Guillermo Ortiz Jorge Mario Rolon Reinaldo Jos Pestana

Dr. Gilmar Santa Fe Patio Profesor

Octubre de 2013 Monteria-Cordoba