El lipopolisacrido: modificacin va biosinttica y la estructura.

Xiaoyuan Wang a, *, Peter J. Quinn b, 1

Resumen
El lipopolisacrido que constituye la cara externa de la membrana externa de la mayora de las bacterias Gram - negativas se conoce como una endotoxina. Se compone de un polisacrido hidrfilo y un componente hidrfobo que se refiere como lpido A. El lpido A es responsable de la mayor bioactividad de la endotoxina, y es reconocido por las clulas inmunes como una molcula asociado a patgenos. La mayora de las enzimas y los genes que codifican para protenas responsable de la biosntesis y exportacin de lipopolisacrido en Escherichia coli han sido identificados, y que son compartidos por la mayora de las bacterias Gram - negativas sobre la base de la informacin gentica. La estructura detallada de lipopolisacrido difiere de una bacteria a otra, consistente con el reciente descubrimiento de enzimas adicionales y productos gnicos que pueden modificar la estructura bsica de lipopolisacrido en algunas bacterias, especialmente los patgenos. Estas modificaciones no son necesarios para la supervivencia, pero estn fuertemente regulados en la clula y estrechamente relacionadas con la virulencia de las bacterias. En esta revisin se discuten los estudios recientes sobre la biosntesis y exportacin del lipopolisacrido, y la relacin entre la estructura del lipopolisacrido y la virulencia de las bacterias.

Contenido
1. Introduccin 2. Va de biosntesis de lipopolisacrido 2.1. Biosntesis de Kdo2-lpido A 2.2. Conexin de los oligosacridos de ncleo 2.3. La adicin de O-antgeno para formar lipopolisacrido 3. Transporte de lipopolisacrido 3.1. Cruzando la membrana interna 3.2. Al llegar a la superficie 4. La modificacin estructural de lipopolisacrido 4.1. La regulacin de la modificacin de lpidos A 4.2. Modificacin en la regin de la cadena de acilo graso 4.3. Modificacin de la regin hidrfila 5. Estructura de lpido A y la virulencia de las bacterias 6. Conclusin Agradecimientos Referencias. Abreviaturas: LPS, lipopolisacrido, TLR4, toll-like receptor 4; Kdo, cido 3-desoxi-D-manooctulosonic; Hep, L-glicero-D-mano-heptosa; campamentos, catinico pptidos antimicrobianos; aL-Ara4N, 4-amino-4-desoxi-aL-arabinosa; Und-Pa-LAra4N, undecaprenilo fosfato-L-Ara4N.

1. Introduccin
Las bacterias Gram-negativas tienen dos membranas distintas: una membrana interna y una membrana externa. Un componente prominente de la cara externa de la membrana externa es el lipopolisacrido (LPS). Los componentes LPS de muchas bacterias son txicos. El descubrimiento de la endotoxina en el siglo 19 se basa en la demostracin de que las bacterias del clera muertas por calor eran ellas mismos txicos en lugar de causar toxicidad por la secrecin de un producto del organismo vivo. Las toxinas secretadas se

hicieron ampliamente conocidas como '' exotoxinas ", y los materiales txicos de bacterias como ''endotoxina". Los aspectos histricos de la funcin de las endotoxinas en la patognesis bacteriana y su caracterizacin qumica como LPS han sido objeto de un examen exhaustivo [1].

La figura. 1. Estructura y va de biosntesis de LPS en E. coli. Cada reaccin es catalizada por una sola enzima. El nombre de la enzima se resalta en rojo, y el nombre del sustrato en azul. La estructura del lpido A se muestra en detalle, pero las estructuras deolisacridos bsicos y O-antgeno se simplifican como smbolos, ya que hay muchas variaciones en estas dos regiones. Los genes que codifican las enzimas de la biosntesis del lpido A estn presentes en un solo ejemplar y altamente conservado entre bacterias [2,3]. La regin de ncleo generalmente contiene 10-15 monosacridos. El antgeno O-por lo general contiene slo unos pocos monosacridos, pero se puede repetir muchas veces en LPS. Los componentes no hidratos de carbono se encuentran tambin en estas regiones.

La molcula de LPS se puede dividir en tres partes: lpido A, polisacridos bsicos y repite antgeno O- (Fig. 1). El lpido A representa el componente hidrfobo de LPS que se localiza en la cara externa de la membrana externa, mientras que los polisacridos de ncleo y repeticiones - antgeno O se muestran en la superficie de las clulas bacterianas [2,3]. El lpido A es conocido por ser responsable de los efectos txicos de las infecciones con bacterias Gram - negativas [4]. La estructura detallada de LPS vara de una bacteria a otra, y esta variacin podra afectar a la virulencia de la bacteria [5]. La va de biosntesis de LPS ha sido bien caracterizado en E. coli. Los mecanismos ruta biosinttica y exportacin de LPS son comunes a la mayora de las bacterias Gram - negativas, pero

algunos patgenos bacterianos pueden modificar an ms la estructura bsica de su LPS. Los LPS pueden ser reconocidos por Toll-like receptor 4 (TLR4), un receptor que se encuentra en la superficie de diferentes clulas inmunes de los organismos husped, tales como monocitos, macrfagos , neutrfilos y clulas dendrticas [6,7]. El TLR4 funciona como un dmero, y depende de una pequea protena MD-2 para el reconocimiento de LPS [8]. Otras protenas tales como CD14 y LBP facilitan la presentacin de LPS a MD-2 [9,10]. Despus de la activacin por LPS, el TLR4 recluta molculas adaptadoras como MyD88, Mal, Trif y Tram en el citoplasma de las clulas para propagar una seal [11,12]. Estas molculas adaptadoras, a su vez activan otras molculas dentro de la clula, incluyendo las protenas quinasas IRAK1, IRAK4, TBK1, e Ikki, para amplificar la seal, y dar lugar a la induccin o represin de genes que orquestan la respuesta inflamatoria. Las altas concentraciones de LPS pueden inducir fiebre, aumento de la frecuencia cardaca, y llevar a un shock sptico y muerte despus de pulmn o insuficiencia renal. Sin embargo, en concentraciones relativamente bajas de lpido A es un inmuno - modulador activo, que puede inducir la resistencia no especfica a las infecciones bacterianas y virales. Debido a su importancia, la ruta de biosntesis y modificacin de la estructura del lpido A y LPS han sido objeto de gran inters. Aqu resumimos los estudios recientes sobre la modificacin biosntesis y la estructura del lpido A y LPS, y se discute la relacin entre la estructura del lpido A y la virulencia de las bacterias.

2. Va de biosntesis de lipopolisacrido
Las molculas de LPS son los principales constituyentes de la capa externa de la membrana externa en la mayora de las bacterias Gram - negativos. Son esenciales para la supervivencia de las bacterias, incluyendo algunos patgenos. Algunas molculas de LPS pueden causar enfermedades humanas como el shock sptico. La biosntesis de LPS se ha estudiado intensamente con el fin de desarrollar mtodos para el control de los patgenos Gram-negativos y para curar el shock sptico. Aunque los LPS se distribuyen sobre la superficie de las clulas bacterianas, su sntesis se inicia en el citoplasma. La manera como los LPS se sintetizan en el citoplasma y se exportan a la superficie de las bacterias ha sido ms ampliamente estudiado en E. coli. La biosntesis de LPS en E. coli se inicia a partir de una molcula pequea, UDP-N- acetilglucosamina (UDP-GlcNAc). Una multiplicidad de enzimas secuencialmente funcionan para convertir UDP-GlcNAc en disacrido-1-P, Kdo2-lpidoA, ncleo- lpido A, y culminando en LPS (Fig. 1). La estructura del lpido A es ms ampliamente conservada en bacterias diferentes como son los oligosacridos del ncleo o las repeticiones de tipo antgeno O de los LPS. Este es tambin el caso de las enzimas implicadas en la biosntesis de LPS. 2.1. Biosntesis de Kdo2 - lpido A E. coli es la bacteria Gram - negativa ms favorecida para los estudios de la biosntesis de LPS. La primera etapa de la ruta biosinttica es la sntesis de Kdo2 - lpido A [3,13]. La va est mediada por nueve enzimas (Tabla 1) y se lleva a cabo en el citoplasma y en la superficie interna de la membrana interna. El bloque inicial de lpidos es una base UDPGlcNAc. Las tres primeras reacciones son catalizadas por enzimas solubles IpxA , IpxD y LpxC, dando como resultado la adicin de dos cadenas de cidos grasos 3-OH a la 2- y 3posiciones de la UDP-GlcNAc para formar UDP -diacil-GlcN (fig. 1). La primera reaccin catalizada por IpxA es reversible; la segunda reaccin catalizada por LpxC es un paso comprometido. IpxA, IpxD LpxC y se han aislado y su estructura caracterizada por difraccin de rayos X y los mtodos de RMN [14-16]. Las formas activas de IpxA y IpxD son homotrmeros. LpxC es una enzima Zn2+-dependiente que no tiene homologa de secuencia con otras histonas la cual no ha sido secuenciada lo que la convierte en un objetivo prometedor para el desarrollo de nuevos antibiticos. El sitio activo de las funciones de E. coli IpxA como una regla de hidrocarburos precisa y se manifiesta

mediante la incorporacin de cadenas hidroxiacil C14 a una velocidad de dos rdenes de magnitud ms rpido que las cadenas C12 o C16 cadenas, en consonancia con la estructura del lpido A (Fig.1) . La UDP -diacil - GlcN est prxima e hidrolizada por LpxH para formar lpidos X [17,18]. LpxB condensa lpido X y su precursor DP- diacil- GlcN para formar disacrido-1-P [19,20]. Ambas enzimas LpxH y LpxB catalizan que las reacciones son protenas de membrana perifrica. Las enzimas que catalizan las reacciones seguidas en la va, IpxK, kdtA, LpxL y LpxM, respectivamente, son protenas integrales de la membrana interna. IpxK es una quinasa que fosforila el 40 - posicin de la disacrido-1-P para formar lpidos IVA [21,22]. KdtA es una enzima bifuncional, que incorpora dos de cido 3-desoxi-D mano octulosonico (KDO) residuos en la 60 posicin del IVA de lpidos, usando el nucletido de azcar CMP- Kdo como el donante [23] . El IVA Kdo2 - lpido resultante se somete a posteriores reacciones catalizadas por LpxL y LpxM para formar Kdo2 - lpido A (Fig. 1). LpxL aade un residuo secundario de lauroilo y LpxM aade un residuo miristoil a la unidad de glucosamina distal, respectivamente [24]. Estos acilaciones posteriores no dependen de Kdo in vivo [25]. Las nueve enzimas implicadas en la biosntesis de Kdo2 lpido A todas tienen relativamente alta especificidad para sus respectivos sustratos (Tabla 1). Por ejemplo, IpxA, IpxD, LpxL y LpxM son aciltransferasas, pero catalizan selectivamente diferentes sustratos y emplean diferentes donantes de acilo. La estructura de LPS mnima necesaria para la viabilidad de E. coli es IVA lpidos aunque tales mutantes de E. coli muestran un crecimiento altamente atenuada [25]. E. coli mutantes capaces de sintetizar IVA Kdo2 lpidos son capaces de crecer con ms fuerza que el mutante IVA lpidos. El lento crecimiento de estos mutantes parece deberse a defectos en la exportacin de dichas especies moleculares mnimas LPS [ 25 ] . El grupo de genes, IpxD - fabZ - IpxA - lpxB , protenas de codificacin IpxD , fabz , IpxA y LpxB se ha caracterizado en E. coli y varias otras especies de bacterias [ 26,27 ] . Protenas IpxA , LpxB y IpxD catalizar primeros pasos en el lpido A va usando (3R)-hidroxiacil ACP como donante, mientras fabz cataliza la deshidratacin del cido (3R) - hidroxiacil-ACP para trans-2-acil-ACP [28], que se utiliza ms como un donante de cido graso en la biosntesis de fosfolpidos. Por lo tanto, este grupo de genes podra ser importante para la regulacin de las proporciones de LPS y fosfolpidos de las membranas de las bacterias. Otro grupo de genes, MSBA-IpxK, tambin existe en muchas bacterias gramnegativas, y estos dos genes se encuentran incluso a fundirse juntos en algunas bacterias marinas [29]. MsbA se conoce como un transportador especfico rimarily para LPS, mientras que IpxK es una quinasa que aade un grupo fosfato a la 40 posicin de lpido A [21,22]. Por qu estos dos genes se encuentran siempre en el mismo clster no est claro. 2.2 . Conexin de los oligosacridos de ncleo La estructura del lpido A est altamente conservada , mientras que la estructura de los oligosacridos de ncleo muestra algunas variaciones . Los oligosacridos de ncleo se ensamblan secuencialmente en lpido A en la superficie citoplasmtica de la membrana interna en un proceso que implica una serie de glicosiltransferasas asociadas a la membrana , usando azcares de nucletidos como donantes . La biosntesis de oligosacridos de ncleo es rpida y eficiente , lo que sugiere que las glicosiltransferasas funcionan como un complejo coordinado . Oligosacridos de ncleo puede dividirse en dos regiones estructuralmente distintos : el ncleo interno que conecta con el lpido A y el ncleo externo que se conecta a las repeticiones Oantigen . Los oligosacridos del ncleo interno suelen contener residuos de Kdo y L- glicero - D-mano - heptosa (Hep ) . El residuo Kdo es el componente ms conservada que se encuentra en la regin del ncleo de LPS . Los oligosacridos ncleo externo muestran ms diversidad estructural que los de el ncleo interior . Estructuras de oligosacridos de ncleo en E. coli cepas R1, R2 , R3, R4 , y K - 12 son diferentes [ 30,31 ] , pero las cadenas principales bsicos son todo un oligosacrido lineal de seis unidades , que se puede conectar a otras unidades para crear ramas. Los azcares comunes que se encuentran en los oligosacridos de ncleo son Kdo

, Hep , D-glucosa y D - galactosa . En E. coli y Salmonella , existen genes necesarios para la biosntesis de oligosacridos de ncleo en tres operones : gmhD , Waaq y kdtA operones [ 32 ] . En E. coli K - 12 , el opern gmhD contiene cuatro genes gmhD - WAAF - Waac - Waal que se requieren para la biosntesis de oligosacridos del ncleo interno [ 33 ] . Los genes gmhD , WAAF y Waac codifican protenas implicadas en la biosntesis y la transferencia de la hepatitis , mientras que el gen Waal codifica una enzima ligasa requerida para la unin de antgeno O al ncleo - lpido A [ 34 ] (Fig. 2 ) . El opern waaQ contiene 7-9 genes que codifican para enzimas que son responsables de la biosntesis de oligosacridos ncleo externo y su modificacin . El kdtA gen en el opern kdtA codifica kdtA que pueden aadir dos residuos de Kdo al IVA de lpidos [ 23 ] . 2.3. La adicin de O-antgeno para formar lipopolisacrido O-antgeno, de manera similar a los oligosacridos de ncleo, se sintetiza en la superficie citoplasmtica de la membrana interna. El uso de los nucletidos de azcar como donantes, las unidades de antgeno O se ensamblan por las enzimas glicosiltransferasa en el soporte unido a la membrana, fosfato de undecaprenilo que tambin se utiliza para la sntesis de peptidoglicano y polisacridos capsulares. El grupo de genes rfb tanto en E. coli y Salmonella enterica codifica las enzimas necesarias para la sntesis de los precursores de azcar-nucletido que son exclusivas de Oantigens, las glicosiltransferasas y polimerasas necesarias para el montaje de la O-antgeno y los componentes necesarios para la transferencia de polmeros antgeno O a travs de la membrana interna [3]. Los antgenos O de LPS muestran gran diversidad. El Oantigen puede ser homopolmeros o heteropolmeros. La conexin de unidades en O-antgeno puede ser lineal o ramificado. Las estructuras de la unidad de O-antgeno pueden diferir en el tipo de monmero, as como la posicin y la estereoqumica de los enlaces O-glucosdicos. Los nmeros de los grupos O-antgeno pueden ser de hasta 60 en S. enterica y 164 en E. coli, pero slo tres estructuras son compartidos por los dos gneros. Despus de la sntesis en la cara citoplsmica, tanto de ncleo-lpido A y Oantigen se transportan a la cara periplsmico de la membrana interna, donde O-antgeno se polimeriza por Wzy y WZZ y se lig al ncleo-lpido A por Waal, resultando en una naciente LPS [35] (Fig. 2). 3 . Transporte de lipopolisacrido Molculas de LPS son esenciales para la supervivencia de la mayora de las bacterias Gram - negativas . Se sintetizan en el citoplasma y periplasma , y se exportan a la cara externa de las membranas exteriores . El transporte de LPS es crtico debido a defectos en la exportacin de LPS son conocidos por ser letal . Las enzimas involucradas en la exportacin de lpido A y LPS y sus genes se enumeran en la Tabla 2 . Los procesos relacionados con la exportacin de lpido A y LPS se describen brevemente en la figura . 2 . Wzx voltea el antgeno O de la cara citoplsmica a la cara periplsmico de la membrana interna , y MsbA voltea el ncleo - lpido A de la misma manera . Ante periplsmico de la membrana interna , el antgeno O se polimeriza por Wzy y WZZ para formar repeticiones antgeno O- que son , a su vez , transfieren al ncleo - lpido A por Waal resultando en el LPS nacientes. Las protenas LPTA , LPTB , LPTC , LptF y LptG luego de transporte del LPS nacientes de la cara periplsmico de la membrana interna a la superficie interior de la membrana externa , donde LptD y LptE ensamblan LPS en la superficie exterior de la membrana externa . 3.1 . Cruzando la membrana interna LPS se monta en el periplasma pero precursores de LPS , el ncleo - lpido A y el antgeno O - , se sintetizan en la superficie citoplasmtica de la membrana interna . Por lo tanto , el ncleo - lpido A y el antgeno O - deben ser transportados a travs de la membrana interna [ 13 ] . El transporte de ncleo - lpido A se lleva a cabo por una protena de membrana MsbA [ 36,37 ] . En E. coli , MsbA es un homodmero y cada monmero contiene seis hlices transmembrana y un dominio citoslico ATPbinding [ 38 ] . MsbA est altamente

conservada en bacterias Gram - negativas y comparte homologa con la resistencia a mltiples frmacos ( MDR ) de protenas eucariotas . El transporte de la O - antgeno a travs de las membranas internas est mediada por la protena Wzx [ 39,40 ] . Protenas wzx de diferentes bacterias tienen perfiles de hidropata similares [ 41 ] y pueden complementarse entre s en la translocacin de diferentes precursores de azcar antgeno O- , pero no hay homologa de secuencia o residuos conservados se encuentran entre las protenas wzx [ 42 ] . Hay evidencia de que las protenas wzx podran funcionar mediante el reconocimiento de la primera fosfato de azcar unido a la undecaprenil - P [ 43 ] . Los dominios de unin a ATP no existen en las secuencias primarias de las protenas wzx [ 43,44 ]. 3 3.2. Al llegar a la superficie La siguiente pregunta es cmo LPS cruzan el espacio periplsmico y llegan a la superficie exterior de la membrana externa? Varias protenas han sido reportados para la funcin en este proceso (Fig. 2). Ellos son la protena periplsmica LPTA, la LPTB protena citoslica, las protenas de la membrana interna LPTC, LptF y LptG, y las protenas de membrana externa LptD y lptE [45-47]. Parece que algunas de estas protenas pueden funcionar como complejos [50]. El transportador de LptBFG ABC, el funcionamiento con LPTC y LPTA, se transloca LPS a la hoja interna de la membrana externa [45,46]. Cuando LPTA, LPTB, o ambos se agotaron, LPS se encontr a acumularse en el periplasma [45]. En la membrana externa, LPS nacientes se exporta al exterior prospecto por LptD y LptE [45,46,48-50]. Adems, en estudios in vitro son necesarios para confirmar las funciones de estos transportadores de LPS.

4. La modificacin estructural de lipopolisacrido

Las bacterias no slo requieren numerosos genes para la sntesis y el transporte de LPS, tambin han desarrollado mecanismos para modificar su estructura de LPS, incluso la parte ms conservada, el lpido A. La modificacin del lpido A ha sido el objeto de muchos estudios en los ltimos aos y se ha demostrado que esto puede implicar tanto en la regin hidroflica del disacrido, as como el dominio de cadena de acilo hidrfobo. La Tabla 3 enumera las enzimas que modifican la estructura del lpido A y sus genes.

Tabla 3 Las enzimas implicadas en la modificacin estructural del lpido A en bacterias Gram-negativas. La estructura y el esquema de numeracin de lpido A se muestra en la figura. 1

Enzimas LPxE LpxF LpxO Arnt LpxR PagL PAgP PMRC LpxXL LpxT LpxQ LmtA

Genes lpxE lpxF lpxO arnt lpxR pagL pagP pmrC lpxXL lpxT LpxQ lmtA

Funcin LPxE elimina el grupo fosfato a partir de la posicin 1 del lpido A. LpxF elimina el grupo fosfato de la 40 posicin del lpido A. LpxO aade un grupo OH a la AB30-posicin. Arnt transfiere la unidad de L-ara4N al lpido A. LpxR cataliza la eliminacin de la fraccin 30-aciloxiacilo. PagL elimina la cadena acilo 3-O-ligado de lpido A. PAgP transfiere un palmitato de glicerofosfolpidos a la posicin 2 del lpido A. PMRC agrega un fosfoetanolamina a la posicin 1 del lpido A. LpxXL agrega una cadena de cido graso muy largo al B2posicin. LpxT transfiere un grupo fosfato a la 1-fosfato del lpido A. lpxQ oxida la glucosamina proximal del lpido A para formar una unidad de aminogluconato. LMTA cataliza la metilacin de 1-fosfato del lpido A.

Los genes ortlogos necesarios para la biosntesis del lpido A en E. coli existen en la mayora de las bacterias Gram-negativas, lo que sugiere que la sntesis de lpido A se separa de las modificaciones in vivo. Las modificaciones del lpido A por lo general se producen en la cara periplsmica de la membrana interna o en la membrana externa. La modificacin de la estructura del lpido A puede ayudar a las bacterias para resistir a los pptidos antimicrobianos catinicos (CAMPs) liberados por el sistema inmune del husped, o para evadir el reconocimiento por el receptor inmune innato TLR4.

4.1. La regulacin de la modificacin de lpidos A

Algunas modificaciones del lpido A estn bajo el control del sistema PhoP - PhoQ y/o sistema de PmrA - PmrB [51]. PhoP-PhoQ es un sistema de dos componentes que gobierna la virulencia, media la adaptacin al entorno de Mg 2+- limitante y regula numerosas actividades celulares en bacterias Gram-negativas [52-54]. Se compone de un sensor de PhoQ en la membrana interna y un regulador PhoP citoplsmico (Fig. 3).

La figura. 3. La biosntesis de undecaprenilo fosfato -L- Ara4N y la transferencia de la fraccin de L- Ara4N al lpido A son regulados por los sistemas PhoP - PhoQ y PmrA - PmrB . En S. typhimurium , se promueve la transcripcin de genes activados - PmrA durante el crecimiento en bajo Mg2 + a travs del sistema PhoP - PhoQ , la protena PmrD , y el sistema de PmrA - PmrB , y en presencia de alta Fe3 + a travs del sistema PmrA - PmrB , independientemente de PhoP - PhoQ y PmrD . En E. coli , la transcripcin de genes activados - PmrA se promueve en la presencia de Fe3 + a travs del sistema PmrA - PmrB . La protena se produce en PmrD bajo Mg2 + de una manera PhoP - dependiente, pero no puede activar el sistema de PmrA - PmrB . El opern arn contiene siete genes necesarios para la biosntesis de Und- Pal- Ara4N y la transferencia de la fraccin de L- Ara4N al

PhoQ contiene un parche cida en la superficie de su dominio periplsmico . Mg2 + puentea el parche cido con grupos de cabeza polares de fosfolpidos aninicos para mantener un estado de regulacin reprimida [55,56]. El sistema PhoP - PhoQ tambin se puede activar cuando la bacteria est expuesto a campos [6-58 ]. La activacin del sistema PhoP - PhoQ puede conducir a la activacin o represin de ms de 40 genes [59,60]. Tambin se requiere un sistema de dos componentes PmrA - PmrB para S. enterica virulencia en ratones [61]. Por lo general, es inducida por la alta Fe3 +, la seal especfica reconocida por la PmrB sensor [62]. Tambin puede ser inducida por la baja Mg2 +, que es detectada por el sensor de PhoQ del sistema PhoP - PhoQ [63]. La activacin por baja Mg2+ requiere PhoP, PhoQ, PmrA y protenas PmrB [64], as como la protena activada por phoP PmrD [65] (fig.3 ). En E. coli, la va PmrA - PmrB no puede ser activada por el sistema PhoP - PhoQ porque el PmrD no es funcional [66]. El mejor ejemplo de la regulacin de PmrA es el opern arn [67-70] y el gen ugd [71]. Productos de protenas codificadas por estos genes pueden sintetizar e incorporar una 4-amino-4-desoxi-A-L arabinosa (Al- Ara4N) en el lpido A [67,70,72]. Esta modificacin puede ayudar a que las bacterias resistan al antibitico polimixina B [73]. El opern arn contiene genes arnB - aRNC - Arna - Arnd - Arnt -Arne - arnF que codifican siete enzimas, ArnB, aRNC, Arna, Arnd, Arnt, Arne y ArnF, respectivamente [74]. UGD inicia la va mediante la conversin de UDP-glucosa a cido UDP - glucurnico. El dominio C -terminal de Arna cataliza la descarboxilacin oxidativa del cido UDP - glucurnico para generar UDP-4-ceto-piranosa. ArnB entonces cataliza una transaminacin utilizando cido glutmico como donador de amina para formar UDP-L-Ara4N. Posteriormente, el dominio N-terminal de Arna utiliza N-10formiltetrahidrofolato para sintetizar N-formilar UDP-A-LAra4N, que es, a su vez, transferido por aRNC a undecaprenilo fosfato. Entonces Arnd cataliza desformilacin de este sustrato para undecaprenilo fosfato-aL-Ara4N (Und-Pal-Ara4N). Arne y ArnF darle la vuelta al UndPal-Ara4N de la cara citoplasmtica de la cara periplsmico de la membrana interna [75], donde Arnt transfiere la unidad de L-Ara4N a la A-core lipdico (Fig. 3).

4.2. Modificacin en la regin de la cadena de acilo graso

Varias enzimas se han reportado para modificar la regin de la cadena de acilo graso de los lpidos A. Ellas son protenas de membrana pGAP, PagL, LpxR y LpxO. PAgP es una palmitoil transferasa que se localiza en la membrana externa, sino que transfiere un palmitato de glicerofosfolpidos a la B2- posicin de lpido A, lo que resulta en una estructura hepta-acilado [76]. PAgP est regulado por el sistema PhoP - PhoQ. Se identific originalmente en Salmonella como una protena que es importante para la resistencia a ciertos campos. La estructura hepta-acilado del lpido A podra prevenir la insercin de campos. PAgP ha sido bien caracterizado tanto en E. coli y Salmonella, y la estructura se ha determinado tanto por espectroscopa de RMN y cristalografa de rayos X

[77, 78]. PagL es una lipasa que elimina la cadena de acilo 3 -O - ligado de lpido A, pero no juega ningn papel en la resistencia pptido antimicrobiano [79]. Como PAgP, PagL tambin se encuentra en la membrana externa. El mutante pagL de pantallas de Salmonella typhimurium no hay fenotipos obvios en un modelo murino. Aunque PagL est bajo el control del sistema PhoP - PhoQ no est activo en la membrana externa de Salmonella cuando se cultivan bajo condiciones de Mg2+ limitantes. PagL podra ser inhibida despus de la traduccin dentro de la membrana externa, ya que podra ser activado en los mutantes de Salmonella que eran incapaces de modificar su lpido A con L - Ara4N. PagL de Pseudomonas aeruginosa consiste en un barril beta de ocho hebras con el eje inclinado en aproximadamente 30 grados con respecto a la bicapa lipdica. Contiene un sitio activo con una trada cataltica Ser -His- Glu y un agujero oxianin que comprende la Asn conservadas [80]. Las molculas de lpido A, PagL y PAgP todo localizan en la membrana externa de las bacterias, lo que facilita la rpida modificacin de la estructura de lpido A. LpxR es otra protena de membrana externa que elimina el 30 - aciloxiacilo resto de lpido A de Salmonella [81]. Los ortlogos de Salmonella LpxR se pueden encontrar en varias bacterias Gram-negativas tales como Helicobacter pylori, Yersinia enterocolitica, E. coli O157: H7, y Vibrio cholerae. LpxR generalmente permanece inactivo en la membrana externa de Salmonella, pero parece estar activado en H. pylori ya que las principales especies de lpido A de H. pylori es completamente desacilado - 30 -O. LpxR no est regulado por cualquiera de PhoP - PhoQ o PmrA - PmrB, pero requiere que el Ca2+ catin divalente para la actividad enzimtica. La estructura cristalina de S. typhimurium LpxR revel que es un beta- barril 12 de hebra - y su sitio activo se encuentra entre la pared del cilindro y una hlice alfa formado por un bucle extracelular [82]. LpxO es una protena de membrana interna que puede generar un 2-OH en la AB30- posicin de Salmonella lpido A [83,84]. Esta hidroxilacin es independiente del transporte MsbA, lo que indica un sitio activo citoplasmtica para LpxO. LpxO no se regula ni por la de los sistemas PmrA - PmrB PhoP - PhoQ o. La longitud de las cadenas de cidos grasos en el lpido A difiere en diferentes bacterias Gram-negativas [85]. Por ejemplo, las cadenas de acilo graso de E. coli lpido A son 12 o 14 carbonos de longitud, mientras que la de Francisella novicida lpido A son 16-18 carbonos de largo [86]. Curiosamente, el Rhizobium etli lpido A contiene una cadena de acilo graso muy larga que tiene 28 tomos de carbono y est unido al lpido A por aciltransferasa LpxXL [87]. LpxXL juega un papel importante en el desarrollo de bacterias [88].

4.3. Modificacin en la regin hidrfila

Adems de los cambios en la regin de cido graso, la regin hidrfila de la molcula de lpido A tambin se puede modificar. El lpido A por lo general contiene dos grupos fosfato que imparten una carga negativa neta a la molcula. Las cargas negativas de lpido A permiten la unin de los campos de carga positiva. Para evadir el ataque por el sistema inmune algunos patgenos bacterianos han evolucionado una variacin menos cargada negativamente de lpido A. Modificacin de la regin hidrfila del lpido A se centra en la eliminacin o la decoracin de los grupos fosfato en el 1 - 40 posiciones y. La modificacin puede incluir la adicin de los residuos que contienen aminas, tales como Al - Ara4N y fosfoetanolamina. Estas modificaciones dan como resultado la resistencia a los CAMPs ya la polimixina B y son controlados por el sistema de dos componentes PmrA - PmrB. La eliminacin de los grupos de fosfato para reducir la carga negativa global del lpido A se produce en varios patgenos bacterianos o endosimbiontes . Por ejemplo, R. etli lpido A no contiene fosfato de [89], mientras que la Francisella tularensis lpido A contiene slo un grupo fosfato [90]. La ausencia de un grupo fosfato se reducira en gran medida la carga negativa superficie de estas bacterias. Dos genes LPxE y lpxF que codifican las fosfatasas lpido A se han identificado en F. novicida [91, 92]. LPxE elimina selectivamente el grupo fosfato en la posicin 1 del lpido A, mientras que LpxF elimina selectivamente el grupo

fosfato en la posicin 40- . El mutante de delecin lpxF de F. novicida ya no infecta a los ratones de acogida [93], lo que sugiere que el grupo fosfato en el lpido A est estrechamente relacionado con la infectividad de bacterias. Tambin existen Orthlogs de LPxE en R. etli y en H. pylori [94-96]. Se cree que la adicin de grupos amino en el lpido A podra ser otra estrategia que las bacterias emplean para escapar del sistema inmunitario. Arnt es una transferasa - amino arabinosa se encuentra en S. typhimurium y transferencias L- Arn4N al 40 -fosfato del lpido A [97]. PMRC codifica una protena necesaria para la adicin de fosfoetanolamina a la 1 fosfato del lpido A [98]. Bajo algunas condiciones, las posiciones de fosfoetanolamina y L Ara4N sustituyentes estn invertidos, y las especies de lpido A con dos unidades de fosfoetanolamina o dos restos L - Ara4N pueden estar presentes. La expresin de las enzimas ARNT y PMRC est bajo el control de PmrA. F. novicida lpido A contiene galactosamina unido al grupo 1 - fosfato, que se aade por una enzima codificada por un gen ortlogo de Arnt [90]. Recientemente, una va para la sntesis y la incorporacin de la galactosamina a lpido A se ha caracterizado en F. novicida [99, 100]. La posicin 1 del lpido A tambin puede ser modificada por las enzimas LpxT, LMTA y LpxQ. El uso de pirofosfato de undecaprenilo como el donante de sustrato, LpxT aade un segundo grupo fosfato en 1-fosfato del lpido A, por lo tanto, un tercio de la lpido A en E. coli contiene una unidad de difosfato en la posicin 1 [101]. LMTA es una enzima de la membrana en Leptospira interrogans que transfiere un grupo metilo de Sadenosylmethionine (SAM) a la 1 - fosfato del lpido A [102]. LpxQ puede oxidar la glucosamina proximal de Rhizobium lpido A en presencia de O2 para formar una unidad de aminogluconate [103].

5. Estructura de lpido A de LPS y la virulencia de bacterias

El LPS est presente en la superficie de las bacterias Gram - negativas y es responsable de la activacin del sistema inmune innato. En infecciones limitadas, la respuesta a LPS es beneficioso, ayudando a limpiar el microbio invasor. Sin embargo, en infecciones abrumadoras, niveles elevados de citocinas circulantes pueden causar el sndrome de choque sptico [104]. El lpido A es el componente bioactivo de los LPS [4]. La respuesta del sistema inmune del husped depende tanto de la gravedad de la infeccin y la estructura particular de lpido A de las bacterias invasoras. Algunos patgenos Gramnegativas sintetizan molculas de lpido A que son poco reconocidos por TLR4 humano, estos incluyen H. pylori [105, 106], F. tularensis [107,108], L. pneumophila [109], Porphyromonas gingivalis [110], y Chlamydia trachomatis [111]. Los grupos fosfato y la longitud y el nmero de cadenas de acilo graso de lpido A juegan un papel importante en la activacin de TLR4 [112-114]. El lpido a de la E. coli, que contiene dos grupos fosfato y seis cadenas de acilo compuestos por 12 o 14 tomos de carbono (Fig. 1), es un potente activador del sistema inmune innato [115]. F. tularensis, es un patgeno humano de lata categora infecciosa, que puede sintetizar LPS sin ncleo-oligosacridos y antgeno O [90]. El lpido a de F. novicida es un disacrido de glucosamina, acilado con cadenas de 3 - hydroxystearoyl primarios en 2 - , 3 - , y 20 posiciones, y un residuo de palmitoil secundaria en posicin 20. Los 40 - y 30 - posiciones de lpido A no son derivatizados. El lpido a de F. novicida no puede activar TLR4. Varios genes han sido identificados como responsables de la estructura nica del lpido A en Francisella [91, 92, 100]. Por ejemplo, el gen codifica una protena lpxF LpxF responsable de la eliminacin del grupo fosfato de E. coli lpido A. El mutante de F. novicida que carecen de lpxF sintetiza una molcula de lpido A con un grupo fosfato adicional en 40 - posicin y un grupo cido graso adicional en 30 posiciones cuando se compara con el lpido A de

tipo salvaje (Fig. 4A). El mutante lpxF de F. novicida es no virulento en un modelo de ratn de infeccin (Fig. 4B) y es hipersensible a los pptidos antimicrobianos catinicos (Fig. 4C y D). Tras la inyeccin intraperitoneal de corto plazo, las bacterias mutantes lpxF desencadena la produccin de un subconjunto de citoquinas, mientras que no lo hacen las clulas de tipo salvaje [93]. El lpido A de Francisella lpxF mutante no activa el TLR4, y las clulas mutantes lpxF no activan la produccin de TNFa. La hipersensibilidad del mutante lpxF a campos puede causar dao a la envoltura bacteriana y exponer a otros ligandos. Las cadenas de cidos grasos en el lpido A tambin estn relacionados con la infectividad de bacterias. Yersinia pestis causa la infeccin a travs de las picaduras de pulgas. En las pulgas que tienen una temperatura corporal alrededor de 21-27 C, Y. pestis sintetiza lpido A que contiene seis cadenas de cidos grasos, pero en el husped humano (37 C) de Y. pestis sintetiza lpido A que contiene cuatro cadenas de cidos grasos [116]. El lpido A con seis cadenas de cidos grasos puede activar el sistema inmune a travs de TLR4, pero el lpido A con cuatro cadenas de cidos grasos no puede [116]. Por lo tanto, Y. pestis puede escapar ataque por el sistema inmune debido a su estructura molecular nica de lpido A. La modificacin del patrn de acilacin del lpido A de Salmonella por cualquiera de PAgP o PagL tambin resulta en la atenuacin de la sealizacin del lpido A a travs de la va de TLR4 y, por lo tanto, pueden promover la evasin del sistema inmune innato durante la infeccin [79]. Las molculas de lpido A de meliloti Sinorhizobium, un simbionte leguminosa y Brucella abortus, un patgeno de mamfero filogenticamente relacionadas, son inusualmente modificadas con un cido graso de cadena muy larga. Esta inusual modificacin de lpidos podra ser crucial para la infeccin crnica de ambos S. meliloti y B. abortus [17].

6. conclusin
Como el componente principal de la membrana externa, el LPS es esencial para la supervivencia de la mayora de las bacterias Gram - negativas. Por lo tanto, las enzimas implicadas en la biosntesis y el transporte de lpido A y LPS se han convertido en objetivos para el desarrollo de nuevos antibiticos. En la actualidad, las tres primeras enzimas IpxA, IpxD LpxC y del lpido A va de biosntesis han sido purificados, y sus estructuras se han caracterizado por difraccin de rayos X y los mtodos de RMN [14, 16, 118]. Sobre la base de la informacin estructural a partir de estas protenas, la investigacin en el desarrollo de nuevos antibiticos se ha iniciado [119,120]. Ms enzimas han sido identificadas que modifican las regiones centrales y del lpido A interiores de LPS. Diversas estructuras bioqumicas de lpido A se han encontrado en la superficie exterior de diferentes bacterias [5]. Algunas modificaciones de la estructura de lpido A son reguladas por sistemas de regulacin de dos componentes en respuesta a estmulos ambientales especficos [51], mientras que otras bacterias parecen modificar su lpido A constitutivamente [90]. LPS o lpido A pueden causar enfermedades como el shock sptico, disfuncin orgnica mltiple y el fracaso. La comprensin de la bioqumica de las modificaciones de los lpidos A y su impacto en la patognesis podra dar lugar a nuevas opciones de tratamiento para estas enfermedades. Mediante la modificacin de las estructuras del lpido A, podramos desarrollar nuevos adyuvante o antagonistas inmunolgicos de LPS [113, 121, 122], o mejorar las vacunas vivas de bacterias Gramnegativas tradicionales.