UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE CENTRO DE CINCIAS BIOLGICAS E DA SADE CURSO DE CINCIAS BIOLGICAS

Karen Fulchini de Oliveira

AVALIAO DOS EFEITOS DO GLIFOSATO-ROUNDUP NO COMPORTAMENTO SOCIAL DE RATOS WISTAR.

So Paulo 2013

Karen Fulchini de Oliveira

AVALIAO DOS EFEITOS DO GLIFOSATO-ROUNDUP NO COMPORTAMENTO SOCIAL DE RATOS WISTAR.

Monografia apresentada ao Centro de Cincias Biolgicas e da Sade, da Universidade Presbiteriana Mackenzie como parte dos requisitos exigidos para a concluso do Curso de Cincias Biolgicas.

Orientadora: Prof. Ms. Esther Lopes Ricci

So Paulo 2013

Agradecimentos

Agradeo, primeiramente, aos meus pais por me darem sempre todo o apoio necessrio, fora e por esse amor incondicional. Absolutamente tudo o que eu j realizei e que ainda vou realizar eu devo a vocs dois e so vocs a minha inspirao de vida.

minha av Maria, que a minha segunda me, e a minha tia Pedrina. Vocs duas sempre foram essenciais na minha vida e so a base dela. Ao meu av Joo que nunca deixou de acreditar em mim e foi quem mais me incentivou a seguir essa carreira e ter fora de vontade pra chegar at o fim. E hoje eu tenho certeza que ele a estrela que mais brilha no cu.

Universidade Presbiteriana Mackenzie pelo ensino e, principalmente, ao curso de Cincias Biolgicas que me proporcionou momentos nicos de aprendizagem. todos os funcionrios e tcnicos do biotrio que sempre estiveram dispostos a ajudar. Ao veterinrio Alexandre que nunca deixou de passar o seu conhecimento.

minha orientadora Esther, quem me confiou este trabalho e sempre esteve presente oferecendo um apoio incondicional, alm de todo o aprendizado que me foi dado graas ela. Por respeitar a individualidade de cada um dos seus alunos e por incentivar, cada um deles, a trilhar seus prprios caminhos. Por cada reunio cheia de bom humor, onde as horas passavam voando e por cada esclarecimento de dvidas. Pelo exemplo de professora, pesquisadora e amiga.

professora Maria Lucila, que foi importantssima para a realizao deste trabalho, oferecendo todo o seu conhecimento sobre a rea comportamental e dando ideias pertinentes. s meninas do laboratrio j formadas, Lcia e Giuliana. Natlia e Maysa, que me auxiliaram durante meus experimentos. s minhas amigas e parceiras de faculdade e de laboratrio: Brbara e Giselle, vocs duas foram pessoas maravilhosas comigo, sempre ajudando,

conversando, me fazendo rir, animando os dias em que logo cedo tnhamos um

milho de coisas pra fazer no biotrio. Vocs so sensacionais e merecem todo o sucesso do mundo.

Aos meus colegas e amigos destes 4 anos de faculdade, em especial a Ana Zaia, Andr, Andressa, Cessa, Carol, Lais, Luiz, Maria Helena, Rafael e Renata. Vocs tornaram esse ltimo semestre de faculdade muito mais fcil, mais leve, embora complicado, mas com certeza, foi muito melhor com vocs do meu lado todas as manhs.

Aos meus amigos cincias sem fronteiras: lvaro e Vincius, agora australianos. Todos os dias com vocs dois na faculdade e fora dela foram incrveis, cada viagem se tornou inesquecvel (grande Nando!). Vocs me tiravam sorrisos o dia inteiro, topavam ir comigo em qualquer lugar, fazer qualquer coisa e esse ano eu fiquei morrendo de saudades. Vocs fazem muita falta! E ano que vem estou esperando os dois com meu canguru de pelcia. Maiara, agora irlandesa, minha primeira amiga da faculdade. Voc uma amiga tima, sempre feliz, sempre tentando animar todo mundo e essa tua alegria eu vou levar sempre comigo. Volta logo.

Natlia, minha parceira, minha amiga, minha maior companheira, minha dupla de dois durante esses 4 anos de curso e agora virando uma italianinha. Voc uma pessoa incrvel, e eu sou muito grata Deus por ter tido uma amizade como a sua durante esse tempo. Eu toro muito pro teu sucesso, voc merece demais tudo de bom que vem acontecendo na sua vida. E claro que ano que vem, no meio do ano, eu estou te esperando, porque a gente tem uma viagem marcada. A saudades j est bem forte. E o que melhor define a nossa amizade: os verdadeiros eu sei quem so!.

Ao Danilo, meu melhor amigo, o irmo que eu escolhi pra mim e ser humano maravilhoso. Eu sou muito grata por todo o incentivo que voc sempre me deu, pela fora, pelo quanto voc me animou pra continuar e no desistir. Por toda essa amizade de anos e que s se fortalece com o tempo. Eu tenho orgulho de te ter como amigo. E eu agradeo Deus por te ter na minha vida. De voc eu no abro mo nunca.

Ao corintiano da minha vida, Dante, por sempre me ensinar a ver o lado positivo das coisas, me escutar, me oferecer um apoio incondicional, por ser essa pessoa incrvel que s me oferece coisas boas. Por conseguir me distrair do meu mundinho e me fazer pr os ps no cho sempre que necessrio. Eu no existo longe de voc. Ao Gustavo por toda a amizade que s vem a crescer, por me obrigar a estudar, por pensar no meu futuro e por ser esse amigo sensacional que eu tive a sorte de conhecer e de ter por perto. Ao Rmulo por me suportar quando nem eu me suporto mais, por ser esse amigo, esse parceiro que ele pra mim, por conseguir me fazer bem com os mnimos detalhes e por estar comigo, por mais difcil que isso seja.

rika, por ser essa amiga mpar, por toda a irmandade, por todos os conselhos, por me arrancar sorrisos quando eu no estou bem, por se manter to presente. nix que voa! Sempre. Gabrielle e Camila, por serem amigas maravilhosas e lindocas. Ao Leonardo que mesmo com a distncia uma das melhores pessoas que eu conheo e de quem eu tenho muito orgulho.

Aos animais, meus ratos do laboratrio, que so a parte mais importante deste trabalho, seres incrveis que me proporcionaram momentos de alegria a cada dia do experimento.

E por fim, agradeo Deus, pelo conforto durante todos os momentos difceis.

Resumo O uso dos herbicidas vem aumentando progressivamente no mundo, em decorrncia da crescente demanda populacional. Dentre estes e um dos mais importantes encontra-se o glifosato, um herbicida no-seletivo, sistmico e psemergente utilizado na agricultura. considerado um dos maiores poluidores de rios e guas de superfcie e sua presena na cadeia alimentar aponta para a possibilidade da contaminao no s de animais, como de seres humanos. Devido ao fato de o glifosato ter baixa solubilidade em gua, este formulado, muitas vezes, em herbicidas comercias como sais monoinicos, que so mais solveis, como o Roundup. Inmeros estudos sugerem que este herbicida um desregulador endcrino, sendo assim, o glifosato pode afetar o metabolismo de diversos hormnios e por consequncia afetar o comportamento animal, tanto em filhotes, quanto em animais adultos. Assim, o presente trabalho teve por objetivo analisar o comportamento de brincar de ratos juvenis machos e fmeas, assim como, a interao social de ratos adultos machos e fmeas da linhagem Wistar, ambos foram expostos a doses de 50mg do glifosato Roundup durante a fase perinatal. Para isto, ratas prenhes receberam a dose de 50mg/kg de glifosato ou seu veculo do 15 dia de gestao ao 7 dia de lactao. Aps o nascimento da prole, em torno do 30 dia de lactao foi realizado o teste de play-fighting e aps isto, entre o 90 e 95 dia de lactao foi realizado o teste de sociabilizao. Os presentes resultados mostraram que a administrao perinatal de 50mg/kg glifosato no alterou os parmetros de comportamento de brincar dos ratos jovens, nem o comportamento e a interao social entre ratos adultos. Dessa forma, visto que a dose de 50mg/kg de glifosato no apresenta um grau de toxicidade aparente, no ocasionando problemas nas proles de ratos.

Palavras-Chave: Herbicida, Glifosato, Perinatal, Comportamento de brincar, Interao social.

Abstract The use of herbicides has been increasing in the world, due to the increase on population demand. Among the herbicides the most important one is glyphosate, a non-selective, systemic and preemergent herbicide used in agriculture. This herbicide is considered one of the most polluter of rivers and waters, its presence indicate the possibility of contamination not only of animals, but of human beings as well. Because glyphosate has low solubility in water, it is generally formulated into commercial herbicides as mono-ionic salts which are more soluble, as Roundup. Several studies suggest that this herbicide is an endocrine disruptor; therefore the glyphosate can affect the metabolism of several hormones which results in changes in the animal behavior of descendant and adults. The present work has as purpose to analyze the behavior of play of female and male juvenile rats and the social interaction between female and male adults Wistar rats both exposed to 50 mg of glyphosate - Roundup during the perinatal period. The breeding rats received 50 mg/kg of glyphosate or its vehicle between the 15th of breeding and 7th day of lactation. After the rats were born, the test of play-fighting was performed about the 30th day of lactation, between the 90th and 95th day of lactation the socialization test was performed. The results showed that the administration perinatal of 50 mg/kg de glyphosate has not altered the play behavior parameters of juvenile rats, neither the behavior nor social interaction between adult rats. In conclusion, the results show that there is no apparent toxicity of glyphosate 50 mg/kg, in as much as there was no problem in rats descendents.

Key-words: Herbicides, glyphosate, perinatal, play behavior, social interaction.

SUMRIO
1. INTRODUO ............................................................................................... 1 1.1 Herbicidas ................................................................................................. 1 1.2 Desreguladores Endcrinos ...................................................................... 5 1.3 Comportamentos Sociais .......................................................................... 8 1.3.1 Comportamento de Brincar .................................................................. 9 1.3.2 Comportamento Social dos Adultos ................................................... 12 2. OBJETIVO ................................................................................................... 14 2.1 Objetivo Geral ......................................................................................... 14 2.2 Objetivos Especficos .............................................................................. 14 3. MATERIAL E MTODOS ........................................................................... 15 4. RESULTADOS ............................................................................................ 22 5. DISCUSSO ............................................................................................... 34 6. CONCLUSO ............................................................................................. 37 7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ........................................................... 38 ANEXOS .......................................................................................................... 44 Anexo 1 Comisso de tica no Uso de Animais ........................................ 44

1.

INTRODUO

1.1 Herbicidas. O crescimento constante da populao mundial traz a necessidade de produzir quantidades cada vez maiores de alimento, o que exige aumento no suprimento global da produo de gneros alimentcios. Isto torna necessrio o desenvolvimento de prticas intensivas na agricultura e os agrotxicos so muito utilizados, pois protegem as plantas, combatendo as pragas, e dessa forma otimizam a produo agrcola (CASTRO, 2005). No Brasil, de acordo com a lei n 7.802, de 11 de julho de 1989, os agrotxicos so:
Os produtos e os agentes de processos fsicos, qumicos ou biolgicos, destinados ao uso nos setores de produo, no armazenamento e beneficiamento de produtos agrcolas, nas pastagens, na proteo de florestas, nativas ou implantadas, e de outros ecossistemas e tambm de ambientes urbanos, hdricos e industriais, cuja finalidade seja alterar a composio da flora ou da fauna, a fim de preserv-las da ao danosa de seres vivos considerados nocivos, bem como substncias e produtos empregados como desfolhantes, dessecantes, estimuladores e inibidores de crescimento (BRASIL, 1989).

Os agrotxicos podem ser classificados quanto a sua ao e grupo qumico, e assim, so categorizados em Inseticidas, Fungicidas e Herbicidas. Os inseticidas so utilizados no combate insetos, exterminando-os por ingesto ou contato, e competem aos quatros principais grupos qumicos;

organofasforados, carbonatos, organoclorados e piretrides. Os fungicidas agem somente sobre os fungos, impedindo sua colonizao e germinao, e assim como os inseticidas, os fungicidas tambm cabem a quatro principais grupos qumicos: etileno-bis-ditiocarbonatos, trifenil estnico, captan e hexanocloro benzeno. J os herbicidas atuam sobre as ervas daninhas pr ou psemergnciais e tm como seus principais representantes: paraguat, glifosato, pentacloofenol, derivados do cido fenoxiactico e dinitrofenis. Este grupo, nos ltimos 20 anos vem sendo utilizado de forma emergente na agricultura (OPAS/OMS, 1996)

Os agrotxicos tambm podem ser classificados de acordo com sua periculosidade ambientale estes dividem-se em quatro classes, sendo a Classe I: produtos altamente perigosos ao meio ambiente, como a maioria dos organoclorados; Classe II: produtos muito perigosos ao meio ambiente, como o malation; Classe III: produtos perigosos ao meio ambiente, como o carbaril e o glifosato; e Classe IV: produtos pouco perigosos ao meio ambiente, como os derivados de leos minerais (BRAIBANTE; ZAPPE, 2012). Outro tipo importante de classificao dos agrotxicos em relao ao seu poder txico. E esta classificao torna-se fundamental para o conhecimento da toxicidade de um produto, em vista de seus efeitos agudos. No Brasil, esta classificao realizada pelo Ministrio da Sade, como mostra o Quadro 1, que faz uma relao entre a dose toxicolgica com a dose letal 50 (DL 50) (OPAS/OMS, 1996). A dose letal 50 consiste na dose mdia de uma determinada substncia que ir expressar o grau de toxicidade aguda da mesma. Esta dose capaz de matar 50% do lote de animais que sero utilizados em alguma experincia (CONCEITOS BSICOS DE TOXICOLOGIA, 2012). Quadro 1. Classificao toxicolgica dos agrotxicos segundo a DL 50.
Classe Toxicolgica I II III IV Toxicidade Extremamente txico Altamente txico Mediamente txico Pouco txico DL50 (mg/kg) 5 Entre 5 e 50 Entre 50 e 500 Entre 500 e 5000 Faixa Colorida Vermelha Amarela Azul Verde

Fonte: OPAS/OMS, 1996.

Considerando que a capacidade de determinada substncia causar a morte ou algum efeito sobre os animais depende da sua concentrao no corpo do indivduo, a dose letal expressa em miligrama da substncia por quilograma da massa corporal. A toxicidade de uma substncia tambm pode variar de acordo com o modo como ser administrada (BRAIBANTE; ZAPPE, 2012). Atualmente, um dos mais importantes agrotxicos o glifosato (N(fosfonometil)glicina), um herbicida no-seletivo, sistmico, ps-emergente, que

pertence ao grupo qumico dos aminocidos fosfonados e tal como seu precursor, a glicina, apresenta comportamento zwiterinico, com separao de duas cargas em pH neutro, uma positiva no grupo amino e uma negativa no grupo fosfonato, com frmula molecular C3H8NO5P e frmula estrutural representada pela figura 1. O glifosato representa 60% do mercado mundial de herbicidas no seletivos e contabiliza, assim, um total de US$1,2 bilho/ano com vendas do produto. Desde 1971, trs tipos qumicos de glifosato vm sendo comercializados: glifosato-isopropilamnio, glifosato-sesquisdio (patenteados por Monsanto e vendido como Round-up), e glifosato-trimesium (patenteado por ICI, atual Syngenta) (JUNIOR, et al., 2002). Por apresentar solubilidade baixa em gua, o glifosato formulado, muitas vezes, em herbicidas comercias como sais monoinicos, que so mais solveis, como o Roundup, que composto por 41% de sal de isopropilamina de glifosato e surfactante em gua. (CASTRO, 2005; COUTINHO; MAZO, 2005).

Figura 1. Frmula estrutural do glifosato. Fonte: Castro (2005).

O glifosato apresenta toxicidade baixa aguda em animais. Em ratos, por exemplo, de acordo com a Organizao Mundial da Sade (OMS) o DL50 oral de glifosato puro de 4.230 mg/kg considerado pouco txico, como visto no Quadro 1. Esta baixa toxicidade pode estar relacionada a forma como o glifosato atua bioquimicamente nas plantas, atuando na via do cido chiqumico, inibindo a ao de uma enzima especfica, a 5-enolpiruvil-chiquimato-3-fosfatosintase (EPSPS), inviabilizando a sntese de 3 aminocidos aromticos essenciais: o triptofano, a fenilalanina e a tirosina (figura 2), os quais so precursores de outros produtos, como lignina, alcalides, flavonides e cidos benzoicos. Devido inibio da biossntese destes aminocidos a planta para de crescer e consequentemente, ocorre a sua morte por deficincia metablica. J em relao aos animais, eles no so afetados desta forma, pois no produzem a enzima EPSPS, e no sintetizam estes aminocidos. Apesar disso, o glifosato

pode impedir a ao de outras enzimas. Alguns autores sugerem que este herbicida pode causar defeitos crnicos de nascimento em algumas espcies de animais quando administrado em doses elevadas por um perodo prolongado. Em ratos foi observada perda de peso, descarga nasal, morte de matrizes grvidas e desordens digestivas (BORGES FILHO, 2011; JUNIOR, et al., 2002).

Figura 2 Diagrama do chiquimato e da inibio do glifosato. Retirado de Nadula, 2010.

Em seres humanos os efeitos agudos e crnicos do glifosato so: dermatite de contato; irritao, dor e queimao ocular, turvao da viso, conjuntivite e edema palpebral; irritao das vias respiratrias; leses corrosivas na mucosa oral, esofgica, gstrica e duodenal aps a ingesto, assim como nuseas, vmitos, diarreias, clicas, pancreatite aguda, hipotenso arterial, tosse, falncia respiratria, hipxia, dentre outros (NORTOX, 2012). Vrios estudos foram conduzidos para demonstrar a segurana e as limitaes da utilizao do glifosato, e sua marca comercial mais conhecida, o

Roundup. Ensaios avaliando seus efeitos txicos sobre animais de laboratrio, incluindo camundongos, ratos, coelhos, ces, macaco e galos; e outros in vitro em culturas celulares distintas vm sendo realizados a partir da dcada de 70 (WILLIAMS et al., 2000). De acordo com Yousef et al. (1995, apud Dallegrave, 2003), j foram realizados estudos em coelhos com doses sub-letais de glifosato [1/100 DL50 (50mg/kg) e 1/10 DL50 (500mg/kg)] que causaram perda de massa corporal, reduo do libido, reduo da concentrao espermtica, sendo observado um aumento do nmero de espermatozides mortos ou que apresentavam anomalias. Assim, os resultados mostraram que ocorreu uma toxicidade sistmica e reprodutiva. As alteraes hormonais, como reduo dos nveis de testosterona atribudos a queda dos nveis sricos de LH, mantiveram-se por longos perodos ps-tratamento, sugerindo que este herbicida apresenta um efeito de longa durao sobre a formao dos espermatozides e de rgos reprodutivos dos animais tratados. Em vista dos efeitos resultantes da ao do glifosato sobre a espermatognese, ou indiretamente, sobre o eixo hipotlamo-hipofisriogonadal, surge necessidade da realizao de mais estudos sobre a toxicidade reprodutiva desta substncia, tanto em animais quanto no homem. Assim como estudos direcionados produtos comerciais que contm o glifosato como meio ativo, como o Roundup (DALLEGRAVE, 2003). 1.2 Desreguladores Endcrinos O sistema endcrino ou sistema hormonal o responsvel pela secreo dos hormnios, e est envolvido com o controle das funes metablicas no organismo, como crescimento celular, velocidade das reaes qumicas nas clulas, transporte de substncias, dentre outros. (GUYTON; HALL, 2002) Guyton e Hall (2002) afirmam que os hormnios so substncias qumicas transportadas atravs do sistema circulatrio para clulas do corpo, onde encontram seu receptor especifico, ligam-se a ele e iniciam diversas reaes. Alguns hormnios atuam em diferentes clulas do corpo, enquanto outros afetam

somente os tecidos alvos-especficos, pois estes apresentam os receptores para o hormnio. O termo endocrine disruptor (desregulador endcrino) foi proposto em uma conferncia organizada pela Dra. Theo Colborn, na cidade de Wingspread (EUA) para se referir a substncias exgenas, ou ento, uma mistura de substncias, naturais ou sintticas, que podem danificar um rgo endcrino, alterar a sua funo, interagir com um receptor de hormnios ou afetar o metabolismo de um hormnio em um rgo endcrino e, por consequncia, causar efeitos adversos sade de um organismo, de sua prole, ou ainda de uma populao (OLIVEIRA et al., 2008; BIANCO et al., 2010). Ainda de acordo com a Environmental Protection Agency (EPA) um desregulador endcrino definido como:
Um agente exgeno que interfere com sntese, excreo, transporte, ligao, ao ou eliminao de hormnio natural no corpo que so responsveis pela manuteno, reproduo, desenvolvimento e/ou comportamento dos organismos (US.EPA, 1997).

So aceitas quatro hipteses sobre os efeitos dos desreguladores endcrinos em diferentes espcies animais. A primeira hiptese afirma que as substncias qumicas destes desreguladores podem ter efeitos distintos no embrio, feto e no organismo perinatal, em relao ao adulto. A segunda hiptese diz que os efeitos vo se manifestar com maior frequncia nos filhos do que no progenitor exposto. A terceira hiptese conclui que o momento da exposio do organismo em desenvolvimento decisivo para determinar o seu carter e potencial futuro, e por fim, a quarta e ltima hiptese afirma que a exposio critica ocorre durante o desenvolvimento embrionrio, e assim, algumas manifestaes podem no se produzir at a maturidade

(SANTAMARTA, 2011). Santamarta (2011), ainda afirma que muitas populaes animais j foram afetadas pelo glifosato, e este causou efeito desregulador endcrino, pois foram observadas disfuno da tireide em aves e peixes; diminuio da fertilidade de aves, peixes, crustceos e mamferos, assim como a diminuio do sucesso da

incubao e deformidades no nascimento de tartarugas, aves e peixes. Foram observadas tambm anormalidades metablicas em mamferos, peixes e aves; comportamento anormal em aves e mamferos; desmasculizao e feminilizao em aves, peixes e mamferos machos e tambm desfeminilizao e masculinizao em peixes e aves fmeas. Havendo ainda perigo para os sistemas imunolgicos de aves e mamferos. Por fim, segundo Romano et al., (2008), ocorreram alteraes no desenvolvimento da puberdade em ratos (Rattus norvergicus) evidenciado pelo atraso da separao balanoprepucial e alteraes no peso ponderal em exposio prolongada ao Roundup em doses de 5, 50 e 250 mg/kg. Os desreguladores endcrinos podem alterar a homeostase dos hormnios esterides e gerar prejuzos na diferenciao sexual e no sistema reprodutivo, causando danos fertilidade. Alguns desreguladores podem prejudicar a esteroidognese e assim, inibir enzimas especficas que esto envolvidas na biossntese de certos hormnios, que no sero produzidos (OLIVEIRA et al., 2008). A esteroidognese ovariana ocorre atravs da interao das duas clulas que compem o folculo ovariano, que so as clulas da teca e da granulosa. E ambas expressam a protena reguladora aguda da esteroidognese (StAR); a CYP11A1 e a 3b-HSD, que permitem a estas clulas produzir pregnenolona, que posteriormente ser a testosterona, e progesterona a partir do colesterol. A protena responsvel pelo transporte do colesterol da membrana externa da mitocndria para a interna, onde se localizam a maioria das enzimas envolvidas na esteroidognese, a protena StAR, e consequentemente, ela quem regula a produo dos hormnios esterides em vrios tecidos (YOSHIZUMI; LIMA, 2012). As clulas testiculares tambm vo produzir pequenas quantidades de estrgenos, e estes so produzidos a partir da converso de androstenediona ou de testosterona, e caracterizada pela perda de uma molcula de carbono. Esta converso realizada pela enzima aromatase. Os esterides de maior ocorrncia com atividade estrognica so o estradiol, o estriol e a estrona (NORMAN; LITWACK, 1997).

De acordo com Richard et al. (2005), mesmo as concentraes no txicas de glifosato causam efeito de desregulao sobre a enzima aromatase em clulas de placenta humana in vitro. No momento em que o glifosato penetra na clula, o que favorecido nas formulaes de Roundup com adjuvantes, a atividade da enzima aromatase, que responsvel pela converso de androstenediona ou de testosterona, em estrgenos, reduzida. O mecanismo de desregulao do glifosato estudado por Walsh et al., (2000) em cultivo celular de Leydig da linhagem tumoral MA-10, quantificou a expresso da protena StAR e da enzima aromatase nos cultivos celulares submetidos a diferentes concentraes de Roundup (Monsanto). Houve a reduo de 90% dos nveis da protena StAR, implicando que, de cada 100 molculas de colesterol disponveis para o transporte ao interior da membrana mitocondrial, apenas 10 atingiram o sistema enzimtico P450scc. Em seguida, a converso de colesterol em pregnenolona foi reduzida em 71% pela inibio da atividade de P450scc. Ao final das transformaes bioqumicas observou-se a reduo de 94% na esteroidognese total. Portando, inquestionvel que grande parte do comportamento das espcies possvel graas presena ou ausncia de hormnios em determinados pontos do corpo (CARTHY; HOLMES 1980). E com esta sntese de hormnios prejudicada diversos comportamentos sociais em ratos podem sofrer algum tipo de alterao. 1.3 Comportamentos Sociais O termo comportamento animal usado para designar a forma como um animal reage ao ambiente que o cerca e s condies internas de seu corpo. O estudo do comportamento realizado a partir de observaes dos movimentos, postura e outros aspectos relacionados ao animal. Assim, toda forma de comportamento, seja ele simples ou complexo, depende de estmulos endgenos ou exgenos (CARTHY; HOLMES, 1980). O comportamento social requer dois ou mais indivduos e que estes animais tenham o instinto e motivao para permanecerem prximos. As

ligaes sociais podem ocorrer entre pais e filhos, dois adultos ou entre outros membros do grupo, como os filhotes. Os comportamentos podem ser considerados positivos quando incluem afiliaes onde haja benefcios mtuos ou podem ser considerados negativos, no qual ocorre o comportamento agressivo (CARTER; KEVERNE, 2002). Diversas espcies so capazes de realizar sinais sociais, que so estmulos liberados por um membro desta espcie que gera uma resposta em outro membro. Este estmulo foi denominado liberadores, por Lorenz e podem ser visuais, auditivos ou de qualquer outra forma ao qual o receptor seja sensvel. Atualmente, este termo liberador relacionado qualquer tipo de sinal ao qual um animal responda comportamentalmente (CARTHY; HOLMES, 1980). O desenvolvimento social ocorre por meio do reconhecimento social no qual animais identificam e reconhecem indivduos da mesma espcie, gerando um pr-requisito para vrios tipos de comportamentos sociais, pois permite o estabelecimento de ligaes e de hierarquias dentro de um grupo (CHOLERIS; KAVALIERS; PFAFF, 2004). As relaes sociais so geradas atravs de interaes entre indivduos de um mesmo grupo, e o reconhecimento destes indivduos so fundamentais para o funcionamento grupal. Existem benefcios em relao ao convvio em grupo, como, por exemplo, os animais quando esto agrupados so atacados com menor frequncia por predadores; o desgaste fsico para alcanar uma caa menor, pois a caa ser mais eficiente j que ser realizada em grupo; e a convivncia entre animais adultos e jovens gera uma relao de aprendizagem para os mais novos, atravs da imitao de tarefas, ou aprendizado sobre a caa e locais importantes para a sobrevivncia. (SLATER, 2000). Em roedores o reconhecimento social apresenta-se como um

comportamento que utiliza o instinto natural dos roedores em investigar indivduos novos, avaliando o aprendizado e a memria do animal. Nestes animais, alm da memria social de longo prazo, h tambm a presena da memria social de curto prazo na qual h o reconhecimento de animais que

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foram apresentados durante um curto perodo de tempo (FERGUNSON; YOUNG; INSEL, 2002). 1.3.1 Comportamento de Brincar Um dos comportamentos sociais, conhecido em filhotes, o

comportamento de brincar que bastante frequente na vida de animais jovens, principalmente em mamferos. Visto que, a brincadeira demanda um alto gasto energtico e se manteve evolutivamente, sua funo aparenta ter significncia e importncia para os organismos, tanto adaptativamente, quanto para seu desenvolvimento e sobrevivncia (VIEIRA; SARTORIO, 2002). Para Homberg, et al., (2007), o comportamento de brincar parece ser muito importante para o desenvolvimento social e cognitivo. Martin e Caro (1985), tambm faz uma relao entre a funo da brincadeira e o desenvolvimento do animal, pois sabe-se que o comportamento ldico uma caracterstica predominante em animais jovens e estaria envolvido na fase de desenvolvimento, perodo em que ocorrem as mudanas no comportamento e aquisio de habilidades que permitem a independncia do indivduo em relao me, ocorrendo uma aprendizagem dos padres comportamentais. Assim, a brincadeira seria importante para acelerar o desenvolvimento de habilidades adultas. Contudo, de acordo com Bekoff e Byers (1998), a brincadeira uma preparao para o futuro. Em relao ao sistema motivacional para a realizao do comportamento de brincar diversos autores citam que a brincadeira aumenta significativamente aps um perodo de isolamento do animal, mas isto acaba gerando um processo de saciao (PANKSEPP; BEATTY, 1980). Alm do mais, constatou-se que em ratos a frequncia da brincadeira diminui com o passar do tempo (HOLE, 1991). Em relao aos aspectos causais que geram a brincadeira so observados fatores internos (endgenos e motivacionais) e externos (sociais) VIEIRA; SARTORIO, 2002). Os aspectos internos relacionam-se diferenas que existem entre o sexo dos animais na brincadeira. visto que na maioria das espcies o macho brinca mais do que a fmea. Sendo poucas as espcies que

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machos e fmeas brincam na mesma quantidade e em nenhuma espcie, filhotes fmeas brincam mais do que filhotes machos (MEANEY; STEWART; BEATTY, 1985). Alm do mais, no caso dos roedores, os machos iniciam mais o comportamento de brincar do que as fmeas (MEANEY; STEWART, 1981; THOR; HOLLOWAY, 1983), enquanto estas interrompem com maior frequncia um episdio de brincadeira e tendem a ter eventos de brincar mais curtos do que os machos (HOLE, 1988). Conforme afirma Pellis et. al. (1997) umas das explicaes para as diferenas sexuais no comportamento de brincar estaria relacionada com a concentrao de hormnios esterides no perodo perinatal do desenvolvimento, atribuindo-se tal concluso ao fato da existncia de experimentos que envolviam a castrao de ratos do sexo masculino logo aps seu nascimento e de outros que envolviam a administrao de hormnios andrgenos nas fmeas. Os dados obtidos evidenciaram que nos machos castrados a realizao do comportamento ldico foi reduzida aos nveis tpicos femininos, enquanto que no sexo oposto, a androgenizao levou ao aumento da frequncia de execuo do

comportamento para nveis prximos aos masculinos. Por fim, de acordo com Vieira e Sartorio (2002), um fator social que influencia a brincadeira, a idade do indivduo. O comportamento de brincar muito mais presente entre animais jovens do que em adultos, tendo nestes ltimos uma frequncia de brincar menor. Isto pode ter relao com o fato de que em adultos a brincadeira pode resultar em agresso. Um dos tipos mais conhecidos de brincadeira entre roedores a brincadeira de luta (play fighting) que, comumente, envolve dois ou mais animais que se atacam e se defendem um dos outros. No play fighting os alvos so regies especficas corporais, variveis entre as espcies. E no s o ataque, mas tambm o contra-ataque apresenta estas regies. Especificamente, nos ratos, a regio mais atingida durante os ataques a nuca. E quando isto no ocorre devido ao fato do animal ter conseguido se defender antes de o parceiro ter conseguido alcanar a mesma (PELLIS; PELLIS, 1998).

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O play fighting envolve, basicamente, o ataque e a defesa da nuca. Iniciase quando um dos animais, o atacante, aproxima-se por trs do outro para atingilo com seu focinho, na nuca. Em resposta, o defensor poder reagir de cinco diferentes maneiras, determinando se haver continuidade ao comportamento ldico ou no. O defensor pode permanecer imvel, e assim, o atacante realiza um breve contato com a nuca de seu companheiro e ento salta para longe dele, podendo repetir o ataque aps algum tempo. Outra resposta que no gera continuidade ao play o movimento de esquiva, ou evaso, em que o defensor desvia lateralmente de seu parceiro, indo para longe dele (figura 3) (PELLIS, 1988, PELLIS et al., 1997).

Figura 3. Respostas que no geram continuidade ao play fighting. (A) Imobilidade. Rato permanece imvel aps o ataque, com isso o atacante salta para longe dele. (B) Esquiva. Defensor desvia lateralmente do atacante. Fonte: Adaptado de Pellis et al. (1997).

Caso o play fighting apresente continuidade, algumas sequncias de movimentos, em resposta ao ataque, aparecem. Um destes movimentos ocorrem quando o atacante tenta atingir a nuca do parceiro, que realiza uma rotao parcial como defesa. Permanecendo sobre suas patas traseiras, o defensor gira a parte dianteira do corpo em torno do seu prprio eixo longitudinal,

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de modo a afastar sua nuca do atacante. Outra resposta defensiva o contraataque, o qual ocorre quando o defensor atinge a nuca do atacante aps ter tido a sua nuca atingida. Por fim, aps sofrer o ataque, o defensor pode realizar uma rotao completa em torno do seu eixo longitudinal. Neste movimento o defensor gira completamente seu corpo, permanecendo com o dorso apoiado no cho e o ventre voltado para cima. A partir desta posio, o defensor ento pode usar suas patas para segurar o atacante, que est posicionado sobre ele, assim como tambm pode lanar ataques em direo nuca de seu parceiro (figura 4) (PELLIS et al., 1997).

Figura 4. Respostas que geram continuidade ao play fighting. (A) Contra-ataque. Defensor atinge a nuca do atacante aps ter sido atacado. (B) Rotao parcial. Defensor rotaciona a parte dianteira do seu corpo em torno do seu eixo logitudinal, afastando sua nuca do atacante. (C) Rotao completa. Defensor atinge posio de supina, afastando sua nuca do parceiro e segurando-o com suas patas dianteiras. Fonte: Adaptado de Pellis et al. (1997).

1.3.2 Comportamento Social dos Adultos O comportamento social nos indivduos adultos so regulados atravs do reconhecimento da identidade grupal, ou seja, o cheiro caracterstico, por

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exemplo, permite o reconhecimento mtuo entre os indivduos. Caso um indivduo perca seu cheiro caracterstico que reconhecido pelos outros membros do grupo, este pode acabar sendo atacado e morto pelos mesmos parceiros que minutos antes mantinham com ele interaes amistosas (CARVALHO ALMEIDA, 1988). Conforme afirma Popik e Van Ree (1998), os comportamentos sociais para animais adultos podem ser classificados em quatro categorias principais, que incluem os comportamentos sociais de investigao, contato direto, comportamentos atentos (attentive behaviors) e comportamentos do tipo agressivo. O comportamento social de investigao aquele no qual o rato obtm informaes sobre o outro cheirando e lambendo-o, ou ento, utilizando suas vibrissas para obter informaes de natureza ttil. Os contatos sociais diretos incluem passar por cima ou por baixo do companheiro, montar e realizar o social grooming. Comportamentos atentos incluem aproximao e perseguio do co-especfico. Enquanto os comportamentos do tipo agressivo incluem mordiscadas, chutes e posturas ameaadoras. De acordo com Fergunson; Young; Insel, (2002), o sistema olfatrio principal e o sistema olfatrio acessrio so ativados durante os encontros sociais nos ratos. O fato de o animal cheirar o corpo do outro indicam que no somente sinais olfatrios volteis so utilizados para a discriminao, como tambm sinais feromonais no volteis. Os neurotransmissores esto envolvidos na memria social e incluem a ocitocina, vasopressina e a dopamina. Estes so liberados em determinadas regies do SNC e so de enorme importncia para que ocorra o reconhecimento social. A ocitocina liberada em regies do SNC durante as interaes, tanto sociais, quanto sexuais (CHOLERIS; KAVALIERS; PFAFF, 2004). E em ratas fmeas o estrognio regula a ao da ocitocina em relao memria social (CARTER; KEVERNE, 2002).

15

2.

OBJETIVO

2.1 Objetivo Geral Estudar os efeitos da exposio perinatal a uma formulao comercial do glifosato no comportamento social da prole de ratos Wistar. 2.2 Objetivos Especficos Avaliar os efeitos no peso corporal da prole de ratas submetidas 50mg/kg de glifosato-Roundup na fase perinatal. Determinar o efeito da exposio dose de 50mg/kg de glifosato-Roundup administrado durante a fase perinatal no comportamento de play-fighting dos filhotes machos e fmeas. Determinar o efeito da exposio dose de 50mg/kg de glifosato-Roundup administrado durante a fase perinatal na interao social dos ratos adultos machos e fmeas.

16

3.

MATERIAL E MTODOS Droga

Foi utilizado Roundup Transorb (Monsanto Co., St. Louis, MO) cuja composio de 648 g/L de sal de isopropilamina de glifosato, 480 g/L de equivalente cido de N-fosfonometilglicina (glifosato) e 594 g/L de ingredientes inertes. Como soluo controle empregou-se a gua. A administrao da formulao comercial e da gua foi feita por gavagem. Animais

Foram utilizados 24 ratos da linhagem Wistar, fmeas e machos adultos, obtidos do biotrio do Departamento de Patologia (VPT) da Faculdade de Medicina Veterinria (FMVZ) - Universidade de So Paulo (USP), por meio de cruzamentos sucessivos. Os animais foram alojados em gaiolas de polipropileno mantidas em uma sala com temperatura controlada por meio de aparelhos de ar condicionado (20 2oC) e com ciclo de luz de 12-12H comeando 7:00, no biotrio da Universidade Presbiteriana Mackenzie. gua e comida foram fornecidas ad libitum aos animais durante todo procedimento experimental. Diagnstico de prenhez

Para o acasalamento as fmeas foram distribudas duas a duas em gaiolas de polietileno, onde no final da tarde foi colocado um macho sabidamente frtil. Na manh subsequente, os machos foram retirados, e os lavados vaginais coletados. A figura abaixo mostra a coleta do lavado vaginal realizado com 10 L de salina a 0.9%.

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Figura 5 - Coleta do lavado vaginal em rata Wistar, com 10 L de salina. Fonte: Marcondes; Bianco; Tanno, (2002).

Os fatores indicativos de prenhez foram: presena de espermatozides e de clulas indicativas de estro (caracterizada como a fase estrognica mxima, onde se encontram apenas clulas queratinizadas). Este foi considerado como o dia 0 de gestao (GD 0). Durante a gestao foi mantida uma fmea por gaiola, sendo que estas foram pesadas para o controle de ganho de peso. A figura abaixo mostra uma lmina do lavado vaginal das fmeas com a presena de espermatozoides.

Figura 6: Lavado vaginal positivo de ratas contendo espermatozides, observado ao microscpio ptico em aumento de (A) 20x e (B) 40x.

18

Tratamento

A dose de glifosato de 50 mg/kg foi escolhida baseada na NOAEL (50 mg/kg). As ratas controles receberam gua via gavagem, a fim de serem submetidas ao mesmo tipo de estresse das ratas experimentais que receberam a droga. O perodo de administrao, do 15 dia de gestao (DG 15) ao 7 dia de lactao (DL 7), corresponde ao perodo de desenvolvimento do sistema de nervos central dos ratos. Desenvolvimento Perinatal

Avaliao do desenvolvimento ponderal dos filhotes Todos os filhotes de cada fmea foram pesados, individualmente, no segundo dia de vida e sexados pelo mtodo da medio da distncia anogenital. Alm disso, nas primeiras horas de vida foram avaliados fisicamente para observao da ocorrncia ou no de malformaes visveis. Posteriormente, a ninhada foi padronizada para um nmero de oito filhotes em propores iguais de sexo. As medidas de peso corporal foram realizadas do DL2 ao DL7, DL14 e DL21. Ao final foram observados os respectivos ganhos de peso dos animais controle e experimentais para avaliao indireta da toxicidade.

Figura 7 - Padronizao das Ninhadas em 4 machos e 4 fmeas.

19

Os animais ficaram alojados em gaiolas de polipropileno mantidas em uma sala com temperatura controlada por meio de aparelhos de ar condicionado (20 2oC) e com ciclo de luz de 12-12H comeando 7:00, no biotrio da Universidade Presbiteriana Mackenzie. gua e comida foram fornecidas ad libitum at que se iniciassem os testes comportamentais. Play Fighting O teste foi realizado com 24 filhotes, quando estes estavam com aproximadamente 30 dias de vida (entre 28 e 30 dias), durante o ms de Novembro de 2012 no laboratrio de anlise experimental do comportamento da Universidade Presbiteriana Mackenzie, no perodo da manh (das 10h s 12h). A aparelhagem e a metodologia empregadas na realizao do teste foram adaptadas de Pletnikov et al (1999). Aps o desmame, e trs dias antes das ninhadas atingirem os 28, 29 ou 30 dias de vida, dois filhotes de cada prole foram retirados de suas gaiolas (um macho e uma fmea) e isolados cada um em uma nova gaiola limpa. Assim, por trs dias, os animais foram submetidos a duas condies de alojamento diferentes: um animal em isolamento social e outro animal foi mantido agrupado, condio em que os filhotes permaneceram em gaiolas com at cinco indivduos da mesma prole e do mesmo gnero. Antes da realizao do teste, a gaiola de um indivduo que permaneceu isolado e a de um que esteve agrupado, de ninhadas diferentes, foram levadas ao laboratrio de anlise experimental do comportamento, onde permaneceram por cinco minutos para aclimatao. Aps a aclimatao, o filhote que permaneceu isolado foi colocado juntamente com um filhote agrupado, pertencente a outra ninhada que no a dele, em uma gaiola limpa e sem maravalha, e a interao entre ambos foi filmada durante dez minutos para posterior coleta de dados e anlise. Testes comportamentais

20

A frequncia dos comportamentos foram analisadas atravs das gravaes de vdeos. Para cada par de ratos testados, foram avaliados 6 comportamentos: 1) ataque, ocorre quando o filhote atacante tenta acertar a nuca do outro filhote com o focinho; 2) esquiva, ocorre quando o defensor desvia lateralmente do atacante; 3) imobilidade, ocorre quando o filhote defensor permanece imvel ao ataque; 4) rotao parcial, ocorre quando o defensor gira a parte dianteira do corpo em torno de si prprio, permanecendo sobre as suas patas traseiras, a fim de afastar a nuca do atacante; 5) contra ataque, ocorre quando o defensor consegue atingir a nuca do atacante e 6) rotao completa, na qual o defensor gira completamente seu corpo, permanecendo com o dorso apoiado no cho e o ventre voltado para cima.

Figura 8. Experimento de Play Fighting.

Sociabilizao O teste comportamental foi realizado com 24 ratos adultos e iniciou-se entre 90 e 95 dias do ps-natal. Tanto ratos machos, quanto fmeas foram utilizados no experimento. Os testes de sociabilizao foram realizados durante o perodo das 10 horas da manh at s 4 horas da tarde, durante o ms de Janeiro no laboratrio de anlise experimental do comportamento da Universidade Presbiteriana Mackenzie. A aparelhagem para realizao do teste, assim como o mtodo para sua realizao, foi adaptada de Crawley (2007) e Yang (2011), posteriormente utilizada por Novaes (2012).

21

O aparelho usado foi uma caixa retangular de acrlico, com trs compartimentos (39 cm de altura, 26 cm de largura e 41 cm de profundidade) com portas retrteis. A sociabilizao precedida por um perodo de habituao de 10 minutos, no qual o rato x (teste) se mantm no compartimento do meio, isolado e com as portas fechadas. Depois deste perodo de habituao um rato desconhecido, ou seja, que no irmo do rato que ser testado, colocado em um dos dois compartimentos dentro de uma gaiola de metal, enquanto o outro compartimento recebe uma gaiola de metal vazia, assim as portas so abertas para o incio do teste. Os lados em que ficam ambas as gaiolas so alternados em cada nova observao. Observa-se o rato x explorar o aparelho durante 10 minutos. A sesso filmada, e contado o nmero de vezes que o rato x entra com as 4 patas em cada compartimento, o tempo em que ele se mantm em cada compartimento e o nmero de vezes em que o rato x interage com o rato desconhecido realizando o comportamento de nose poke. A aparelhagem e as gaiolas so limpas depois do uso com lcool 5%. A frequncia e a durao dos comportamentos foram analisadas atravs das gravaes de vdeos. Para cada par de ratos testados, os seguintes comportamentos sociais foram avaliados: frequncia da interao social entre os dois animais, por meio do comportamento de nose poke (focinho focinho); durao do tempo, em segundos, em que o animal testado permaneceu em cada compartimento e o nmero de vezes em que o animal testado atravessa a porta de cada compartimento.

Figura 9 - Teste comportamental de sociabilizao

22

Anlise Estatstica

Para a avaliao do peso dos filhotes foi realizado uma mdia de cada varivel que foi analisada por ANOVA de duas vias seguida pelo teste de Bonferroni. O nvel de significncia aceito foi de p<0,05. Para a avaliao do play fighting foi realizada a mdia de cada varivel que foi analisada por ANOVA de uma via seguida pelo texto de Bonferroni. O nvel de significncia aceito foi de p<0,05. Por fim, para o teste de sociabilizao foi realizado uma mdia de cada varivel que foi analisada por ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni. O nvel de significncia aceito foi de p<0,05.

23

4.

RESULTADOS Avaliao do desenvolvimento fsico

A figura 10 ilustra respectivamente os resultados obtidos do peso dos filhotes fmeas e machos, realizado do dia DL2 ao DL21. Para os machos a ANOVA de duas vias indicou diferenas estatsticas com relao aos dias de observao [F(7/112)=724,6, p<0,0001); e quanto ao tratamento (F(7/112)=0,1330, p=0,7160), mas no havendo interao entre os fatores (F(7/112)=0,188, p=0,9874). Para as fmeas a ANOVA de duas vias indicou diferenas estatsticas com relao aos dias de observao [F(7/112)=912,8, p<0,0001); e quanto ao tratamento (F(7/112)=5,20, P=0,0245), mas no havendo interao entre os fatores (F(7/112)=2,363, p=0,0273].

24

Peso dos filhotes machos

60

Controle 50mg/kg

Gramas

40

20

14

21

Dias

Peso dos filhotes fmeas

60

Controle 50mg/kg

Gramas

40

20

14

21

Dias

Figura 10. Peso (em g) dos filhotes machos e fmeas de ratas do grupo controle e de ratas submetidas a dose de 50mg/kg de glifosato, durante 15 gestao ao 7 dia de lactao. So apresentadas as mdias e os respectivos erros-padro; N=8 animais por grupo. A ANOVA de duas vias, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerada significante, p<0,05.

Avaliao do play fighting

A figura 11 ilustra os resultados da frequncia de ataque da prole de machos e fmeas de ratas controles e de ratas tratadas prenatalmente com 50mg/Kg de glifosato. O teste ANOVA de uma via no indicou diferenas estatsticas significantes entre os grupos [F(3/23)=1,804, p=0,1789)].

25

Ataque
25 20

Frequncia

15 10 5 0

Machos exp. 50mg/kg Machos controle Fmeas exp. 50mg/kg Fmeas controle

Grupos

Figura 11. Frequncia do comportamento de ataque da prole de ratas prenhes do grupo controle e de ratas submetidas dose de 50mg/kg glifosato, durante 15 gestao ao 7 dia de lactao. So apresentadas as mdias e os respectivos erros-padro; N=6 animais por grupo. A ANOVA de uma via seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante, p<0.05.

A figura 12 ilustra os resultados da frequncia do comportamento de esquiva da prole de machos e fmeas de ratas controles e de ratas tratadas prenatalmente com 50mg/Kg de glifosato. O teste ANOVA de uma via no indicou diferenas estatsticas significantes entre os grupos [F(3/23)=1,478, p=0,2507)].

Esquiva
15

Frequncia

10

Machos exp. 50mg/kg Machos controle Fmeas exp. 50mg/kg Fmeas controle

Grupos

Figura 12. Frequncia do comportamento de esquiva da prole de ratas prenhes do grupo controle

26
e de ratas submetidas dose de 50mg/kg de glifosato, durante 15 gestao ao 7 dia de lactao. So apresentadas as mdias e os respectivos erros-padro; N=6 animais por grupo. A ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante, p<0,005.

A figura 13 ilustra os resultados da frequncia de imobilidade da prole de machos e fmeas de ratas controles e de ratas tratadas prenatalmente com 50mg/Kg de glifosato. O teste ANOVA de uma via no indicou diferenas estatsticas significantes entre os grupos [F(3/23)=2,418, p=0,0963)].

Imobilidade
20 15 10 5 0

Frequncia

Machos exp. 50mg/kg Machos controle Fmeas exp. 50mg/kg Fmeas controle

Grupos

Figura 13. Frequncia do comportamento de imobilidade da prole de ratas prenhes do grupo controle e de ratas submetidas dose de 50mg/kg de glifosato, durante 15 gestao ao 7 dia de lactao. So apresentadas as mdias e os respectivos erros-padro; N=6 animais por grupo. A ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante, p<0,005.

A figura 14 ilustra os resultados da frequncia de rotao parcial da prole de machos e fmeas de ratas controles e de ratas tratadas prenatalmente com 50mg/Kg de glifosato. O teste ANOVA de uma via indicou diferenas estatsticas significantes entre as fmeas experimentais e controle [F(3/23)=6,167, p=0,0038)].

27

Rotao Parcial
2.0

**

Frequncia

1.5 1.0 0.5 0.0

Machos exp. 50mg/kg Machos controle Fmeas exp. 50mg/kg Fmeas controle

**

Grupos

Figura 14. Frequncia do comportamento de rotao parcial da prole de ratas prenhes do grupo controle e de ratas submetidas dose de 50mg/kg de glifosato, durante 15 gestao ao 7 dia de lactao. So apresentadas as mdias e os respectivos erros-padro; N=6 animais por grupo. A ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante, p<0,005

A figura 15 ilustra os resultados da frequncia de contra-ataque da prole de machos e fmeas de ratas controles e de ratas tratadas prenatalmente com 50mg/Kg de glifosato. O teste ANOVA de uma via indicou diferenas estatsticas significantes entre as fmeas experimentais e controle [F(3/23) = 3,566, p=0,0325)].

28

Contra-Ataque
8 6 4 2 0

Frequncia

Machos Experimentais 50mg/kg Machos Controle Fmeas Experimentais 50mg/kg Fmeas Controle

Grupos

Figura 15. Frequncia do comportamento de contra-ataque da prole de ratas prenhes do grupo controle e de ratas submetidas dose de 50mg/kg de glifosato, durante 15 gestao ao 7 dia de lactao. So apresentadas as mdias e os respectivos erros-padro; N=6 animais por grupo. A ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante, p<0,005

O quadro 2 mostra a frequncia de rotaes completas ocorridas durante o teste de play fighting dos grupos controle e dos grupos experimentais, ambos com filhotes machos e fmeas, submetidos dose de 50 mg/kg de glifosato durante o 15 dia de gestao ao 7 dia de lactao. Apenas uma das duplas, em um dos grupos (machos experimentais 50 mg/kg), realizou a rotao completa. Quadro 2. Frequncia de rotaes completas ocorridas nos grupos controle (machos e fmeas) e nos grupos experimentais 50mg/kg (machos e fmeas). Duplas 1 2 3 4 5 6 Macho Controle 0 0 0 0 0 0 Machos Experimentais 0 4 0 0 0 0 Fmeas Controle 0 0 0 0 0 0 Fmeas Experimentais 0 0 0 0 0 0

29

Avaliao da interao social

A figura 16 ilustra os resultados envolvendo o tempo da prole de machos e fmeas de ratas experimentais e controles que ficaram no compartimento onde s havia uma gaiola vazia. O teste ANOVA de uma via no indicou diferenas estatsticas entre os grupos [F(3/23)=0,8075, p=0,5045)].

Tempo (s) no compartimento com a gaiola vazia

250 200

Tempo (s)

150 100 50 0

Machos exp. 50mg/kg Machos controle Fmeas exp. 50mg/kg Fmeas controle

Grupos
Figura 16. Tempo (em seg.) em que ratos, na idade adulta, machos e fmeas controles e experimentais que foram submetidos dose de 50mg/kg de glifosato passaram no compartimento onde havia a gaiola vazia. So apresentadas as mdias e os respectivos errospadro; N = 6 animais por grupo. A ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante, p<0,05.

A figura 17 ilustra os resultados envolvendo o tempo da prole de machos e fmeas de ratas experimentais e controles que ficaram no compartimento onde havia a gaiola com o animal estranho. O Teste ANOVA de uma via no indicou diferenas estatsticas entre os grupos [F(3/23)=0,2823, p=0,8375)].

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Tempo (s) no compartimento com a gaiola com o animal estranho.

400 300

Tempo (s)

200 100 0

Machos exp. 50mg/kg Machos controle Fmeas exp. 50mg/kg Fmeas controle

Grupos
Figura 17. Tempo em que ratos, na idade adulta, machos e fmeas (em seg.) controles e experimentais que foram submetidos dose de 50mg/kg de glifosato passaram no compartimento onde havia a gaiola com o animal estranho. So apresentadas as mdias e os respectivos erros-padro; N = 6 animais por grupo. A ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante, p<0,05

A figura 18 ilustra os resultados envolvendo o nmero de vezes em que a prole de machos e fmeas de ratas experimentais e controles passaram pela porta do compartimento onde s havia uma gaiola vazia. O teste ANOVA de uma via no indicou diferenas estatsticas entre os grupos [F(3/23) = 0,2202, p=0,8812)].
Nmero de vezes em que o animal passou pela porta onde havia a gaiola vazia.
5

Nmero de vezes

4 3 2 1 0

Machos exp. 50mg/kg Machos controle Fmeas exp. 50mg/kg Fmeas controle

Grupos

Figura 18. Nmero de vezes em que ratos, na idade adulta, machos e fmeas (em seg.) controles e experimentais que foram submetidos dose de 50mg/kg de glifosato passaram pela porta do compartimento onde havia a gaiola vazia. So apresentadas as mdias e os respectivos errospadro; N = 6 animais por grupo. A ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante, p<0,05

31

A figura 19 ilustra os resultados envolvendo o nmero de vezes em que a prole de machos e fmeas de ratas experimentais e controles passaram pela porta do compartimento onde havia a gaiola com o animal estranho. O teste ANOVA de uma via indicou diferena estatstica entre os grupos experimentais machos e fmeas [F(3/23)=4,545, p=0,0138)].

Nmero de vezes em que o animal passa pela porta com o animal estranho.

Nmero de vezes

Machos exp. 50mg/kg Machos controle Fmeas exp. 50mg/kg Fmeas controle

Grupos

Figura 19. Nmero de vezes em que ratos, na idade adulta, machos e fmeas (em seg.) controles e experimentais que foram submetidos dose de 50mg/kg de glifosato passaram pela porta do compartimento onde havia a gaiola com o animal estranho. So apresentadas as mdias e os respectivos erros-padro; N = 6 animais por grupo. A ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante,*p<0,05.

A figura 20 ilustra os resultados envolvendo o nmero de vezes em que a prole de machos e fmeas de ratas experimentais e controles realizaram o comportamento de nose poke com o animal estranho que estava dentro da gaiola em um dos compartimentos da caixa de acrlico. O teste ANOVA de uma via no indicou diferenas estatsticas entre os grupos [F(3/23)=1,151, p=0,3528)].

32

Nose poke
6

Nmero de vezes

Machos exp. 50mg/kg Machos controle Fmeas exp. 50mg/kg Fmeas controle

Grupos
Figura 20. Nmero de vezes em que ratos, na idade adulta, machos e fmeas controles e experimentais que foram submetidos dose de 50mg/kg de glifosato realizaram o comportamento de nose poke com o animal estranho que estava dentro da gaiola. So apresentadas as mdias e os respectivos erros-padro; N = 6 animais por grupo. A ANOVA de uma via, seguida pelo teste de Bonferroni, foi considerado significante, p<0,05

33

5.

DISCUSSO A toxicologia do desenvolvimento estuda os efeitos adversos que ocorrem

nos organismos em desenvolvimento, expostos diferentes agentes qumicos antes da concepo, durante o desenvolvimento pr-natal e ps-natal at a puberdade. A toxicologia do desenvolvimento engloba a teratologia e a toxicologia da reproduo (BARROS e SOLANGE, 1996). Antigamente a teratologia estava relacionada apenas com alteraes de ordem morfolgica, atualmente, o estudo do desenvolvimento anormal do feto, incluindo malformaes estruturais, retardo no crescimento, dano no desenvolvimento e comportamento e at mesmo morte (HANSEN e YANKOVITZ, 2002). Estas alteraes podem ser causadas pela ao direta de um agente txico sobre o feto ou atravs da ao no organismo materno (BERNARDI et al., 1999, EATON; GILBERT, 2012). O efeito txico de uma substncia pode ocorrer durante todo o desenvolvimento embriofetal de um mamfero, no entanto, as consequncias podem variar conforme o perodo de exposio. O desenvolvimento embriofetal de mamferos pode ser dividido em quatro perodos: implantao, organognese ou organogentico, desenvolvimento fetal e perodo neonatal. A toxicidade a agentes txicos no perodo inicial do desenvolvimento (implantao) pode variar conforme o nmero de clulas atingidas pelo agente txico, ou seja, quanto maior o nmero de clulas atingidas, maior ser a chance de ocorrer uma embrioletalidade. O perodo de organognese abrange desde a proliferao e migrao celular at a formao de rgos rudimentares; nesta fase ocorre uma maior suscetibilidade ao do agente txico, podendo acarretar em malformaes estruturais. Aps a organognese, segue-se o perodo de desenvolvimento fetal e neonatal, exposies que se iniciam durante estes perodos podem apresentar anormalidades celulares e teciduais, podendo interferir em funes normais de importantes sistemas, tais como o sistema nervoso central, sistema imune ou sistema endcrino, alm de causar retardo geral do desenvolvimento (OGA, 2008). Um outro tipo de estudo sobre a toxicidade apresenta relao com a toxicologia reprodutiva, onde so analisados os efeitos de um agente ambiental

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fsico ou qumico sobre o embrio ou feto, sendo que tais efeitos so dependentes de diversos fatores, como a via e o perodo de exposio e da gestao, dose, susceptibilidade gentica materna ou embrio-fetal e a presena ou natureza de exposies simultneas (BRENT, 2001). Nos dias de hoje, sabese que o feto pode ser facilmente afetado por compostos txicos presente no sangue materno, j que estes atravessam a placenta e chegam a corrente sangunea do feto (MYLLYNEN; PASANEN; PELKNONEN, 2005). O glifosato considerado um agente txico por ser capaz de contaminar animais e seres humanos. um herbicida bastante solvel em gua e considerado um dos maiores poluidores de rios e guas de superfcie. Sendo assim, a exposio ele durante a gestao poderia interferir com o desenvolvimento da prole de ratas expostas ao mesmo. No entanto, os presentes resultados em relao ao peso da prole de ratas que foram expostas a dose de 50mg/kg de glifosato na fase perinatal no demonstraram diferenas significativas de peso, evidenciando assim que no houve sinais de toxicidade no perodo embriofetal, sendo que, os filhotes tambm foram avaliados quanto a sua morfologia ao nascimento e no apresentaram diferenas morfolgicas em relao aos filhotes controles. O play fighting, de acordo com Pellis et al. (1997), possui diferenas de acordo com o sexo do filhote. E isto apresentaria relao com os hormnios esterides que esto presentes no perodo perinatal. E devido ao fato do glifosato atuar como um desregulador endcrino, possvel que ele gere mudanas neste comportamento. Os resultados no mostraram diferenas significantes entre os grupos experimentais e controle em relao ao parmetro ataque, imobilidade, contraataque, rotao completa e esquiva. Mas, o parmetro de rotao parcial mostrou-se significante com diferena entre os machos do grupo experimental de 50mg/kg e as fmeas do mesmo grupo. Resultado que corrobora com a ideia de que os hormnios esteroides influenciam no dimorfismo de comportamento de machos e fmeas. Evidenciando assim, que o herbicida no causou prejuzos no comportamento infantil da prole.

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A interao social em indivduos adultos dependente da ao de feromnios volteis e no volteis (FERGUNSON; YOUNG; INSEL, 2002). E o reconhecimento atravs do cheiro caraterstico gera uma identidade grupal para os roedores (CARVALHO ALMEIDA, 1988). A memria social e o aprendizado apresentam-se relacionados ao reconhecimento social, sendo que, de acordo com Choleris, et al. (2004) existem neurotransmissores envolvidos na memria, como a vasopressina e a ocitocina. E estes podem sofrer influncia de desreguladores endcrinos, afetando o comportamento social. Os resultados presentes sobre o comportamento social, no entanto, no mostraram diferenas significantes entre os grupos que foram expostos ao glifosato e o grupo controle. Somente o parmetro nmero de vezes em que o animal passa pela porta onde h o desconhecido mostrou-se significante para o grupo experimental de fmeas. Neste caso, as fmeas foram com mais frequncia ao compartimento com o animal estranho, embora no tenha realizado tanto o comportamento de nose poke quanto o macho, apresentando, assim, uma interao social inferior. Tais resultados demonstram que a fmea apresenta um comportamento exploratrio maior do que o macho, investigando mais um novo ambiente onda h um animal desconhecido, o que explicado devido ao dimorfismo sexual. A baixa interao social, influenciada pelo parmetro nose poke, ou seja, o contato direto entre os dois animais, relacionado com o sistema olfatrio. Esta interao menor, pode ser devido fase do ciclo estral em que a fmea se encontra, j que a memria social possui relao com a ocitocina, regulada pelo estrognio e assim, em diferentes fases do ciclo, esta interao pode mudar, sendo mais evidente ou no. Estes resultados, em conjunto, no mostraram diferenas significantes entre os animais do grupo experimental e controle, tanto em relao ao comportamento de brincar de filhotes, quanto ao comportamento social dos adultos.

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6.

CONCLUSO A exposio perinatal dose de 50mg/kg de glifosato-Roundup:

No induziu diferenas na avaliao do peso dos filhotes. No induziu sinais de toxicidade evidente nos filhotes. No alterou os comportamentos de brincar dos filhotes. No alterou o comportamento e a interao social da prole de idade

adulta.

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7.

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