APUNTES DE GENTICA y MEJORA VEGETAL Parte 2: Mejora Vegetal (Temas 5-12) E.U.I.T.A.

Curso 2007/2008

Profesores: Adrian Rodriguez Burruezo Ana Mara Fita Fernndez

Telfono despacho: 96 3879383 96 3879418

TEMA 5. VARIACIN

5.1. Importancia en Mejora Vegetal.

Sin variacin no se puede efectuar seleccin. Obviamente, si todos los individuos de una poblacin son idnticos no podremos seleccionar los mejores, con lo cual no podremos conseguir ninguna mejora. De ah que la existencia de variacin sea de una importancia fundamental en el desarrollo de nuevos cultivares mejorados. Sin embargo, la mera existencia de variacin no es suficiente para que la seleccin sea eficaz.

La variacin observada en una poblacin puede tener dos componentes: gentica y ambiental. La componente gentica de la variacin es la que est causada por diferencias en los genes que afectan al carcter. La componente ambiental es la causada por las diferencias en el ambiente en el que se desarrollan los distintos individuos de la poblacin considerada. En un campo de cultivo, estas variaciones se producen por diferencias en la fertilidad del suelo, disponibilidad de luz y agua, ataques de plagas y enfermedades, y otros factores que en muchas ocasiones son difciles o imposibles de controlar. La variacin de utilidad para el mejorador es la variacin gentica, ya que nicamente los genes se heredan y se transmiten a la descendencia. Por contra, el ambiente no es heredable.

Si en un programa de mejora no se dispone de variacin gentica para el carcter o caracteres que se pretende mejorar, ste no tendr xito. Efectivamente, si queremos obtener una variedad con un genotipo AA y no existe variacin en la poblacin para los genes que lo controlan, ya que todos los individuos de los que disponemos son aa, no se pueden seleccionar individuos con el genotipo deseado. De esta forma, a mayor diversidad gentica disponible para el mejorador, mayor ser el rango de posibilidades de eleccin que podr realizar ste y, por tanto, mayores posibilidades tendr el mejorador de llevar a cabo el programa de mejora con xito.

La variacin existente en las especies cultivadas se ha ido generando gracias al proceso de la domesticacin. Con la aparicin de la Agricultura, el hombre empez a domesticar plantas 2

para adaptarlas a sus necesidades. Durante miles de aos, estas plantas han ido evolucionando en un hbitat creado por el hombre. El hombre las ha ido seleccionando y ha conservado los tipos mutantes que eran de su inters. En muchas ocasiones, estos tipos mutantes no se habran mantenido en la Naturaleza ya que las caractersticas que presentan (falta de dispersin de semillas, eliminacin de las barreras protectoras frente a depredadores, etc.) son totalmente deletreas en la Naturaleza, lo cual llevara a su rpida desaparicin. De hecho, en pocas ocasiones se encuentran plantas cultivadas en estado silvestre en zonas no alteradas por la accin del Hombre.

Como consecuencia de este proceso milenario en el que se ha buscado adaptacin a diferentes condiciones locales y necesidades, se ha generado una enorme diversidad gentica. Esta diversidad es de gran utilidad para el mejorador y le ha permitido desarrollar nuevas variedades mejoradas.

Cuando un mejorador empieza un programa de mejora necesita fuentes de variacin, es decir, materiales vegetales en los que se encuentren formas de genes que permitan la consecucin del objetivo/s deseado/s. En determinados casos esta variacin se encuentra disponible en otros cultivares ya mejorados, lo cual facilita el trabajo del mejorador. En otros casos, es posible que las fuentes de variacin no se encuentren ni tan siquiera en la especie cultivada, por lo que tiene que recurrir a especies silvestres relacionadas.

Para cada cultivo la mayor variacin se puede encontrar en los centros de diversidad para esta especie. En determinadas zonas concretas del globo terrqueo se concentra una gran cantidad de tipos para muchas especies. Son los llamados centros de diversidad. En la dcada de 1930, Vavilov estableci 8 centros de diversidad, indicando las especies que correspondan a estos centros. En muchos casos, aunque existen notables excepciones, estos centros de diversidad coinciden con el centro de origen de las especies cultivadas, lo cual es lgico ya que en la mayora de ocasiones los centros de origen coinciden con la regin en que se domestic el cultivo. De esta forma, por ejemplo en el caso del trigo, se encuentra una gran diversidad en su regin de origen, situada en Oriente Prximo. A partir de esta zona, se produjo una migracin de algunos materiales a otras zonas, en las cuales se originaron nuevas variedades. Esto supone que slo una parte de la variacin existente migr hacia otras zonas, por lo cual la base gentica de 3

estos cultivos fuera de su zona de origen y/o domesticacin suele ser menor. Tambin se pueden encontrar centros de diversidad en zonas que han sido centros de comercio en tiempos remotos. A estos centros llegaban materiales de muchas procedencias distintas y en muchas ocasiones estos materiales pasaban a formar parte de las variedades locales, evolucionando en las condiciones de estas zonas.

En algunos casos incluso es posible que, an recurriendo a los materiales citados anteriormente, el mejorador no encuentre la variacin deseada por lo que en estos casos se puede generar variacin nueva, como por ejemplo mediante mutacin inducida. Tambin se puede recurrir a genes presentes en materiales no relacionados con la especie objeto de la mejora, para lo cual ser necesario utilizar tcnicas derivadas del las nuevas biotecnologas.

5.2. Recursos fitogenticos.

Los materiales genticos que forman parte de las especies cultivadas y de sus especies silvestres relacionadas se denominan recursos fitogenticos. Estos recursos son de gran utilidad ya que constituyen la principal fuente de variacin para el mejorador.

Gracias a los recursos fitogenticos ha sido posible obtener variedades nuevas mejoradas. Sin embargo, como consecuencia de la aparicin de variedades mejoradas, con caractersticas superiores a las existentes hasta el momento, se ha ido produciendo un re-emplazamiento de las variedades tradicionales por cultivares mejorados. Esto est provocando la desaparicin de las variedades tradicionales. Adems, la demanda de uniformidad de los mercados, la desaparicin de las pequeas unidades de autoconsumo y la internacionalizacin de la produccin, transporte y comercializacin estn favoreciendo este proceso. Todo esto est causando una fuerte erosin gentica, perdindose un gran nmero de variedades que podran suponer fuentes de variacin para los programas de mejora actuales y futuros. De esta forma, nos encontramos que los cultivares tradicionales, que han servido de base para la obtencin de cultivares mejorados se estn perdiendo. Esto compromete seriamente la posibilidad de obtener futuras variedades nuevas, al limitar las fuentes de variacin disponibles. Por otra parte, la utilizacin cada vez mayor de unos pocos cultivares de cada especie est provocando un estrechamiento de la base gentica de los cultivos, lo cual aumenta la 4

vulnerabilidad de las cosechas frente a plagas, enfermedades y cambios ambientales. Existen multitud de ejemplos de los peligros causados por este estrechamiento de la base gentica. Un ejemplo claro lo constituye el caso de la hambruna ocurrida en el siglo pasado en Irlanda. Los cultivos tradicionales de nabos en que se basaba la alimentacin fueron sustituidos por unas pocas variedades de patatas. La mayor produccin por hectrea permita alimentar un mayor nmero de personas. Sin embargo, la aparicin de un ataque de mildiu (Phytophtora infestans) al que resultaron susceptibles las pocas variedades de patata cultivadas provoc la destruccin casi completa de las cosechas y una impresionante falta de alimentos que provoc la famosa emigracin irlandesa a los Estados Unidos.

Para evitar la prdida irreemplazable de los recursos fitogenticos aparece la necesidad de recolectarlos y conservarlos antes de que desaparezcan para siempre. Las actividades de recoleccin de recursos fitogenticos fueron espordicas hasta la dcada de 1960, en que se empezaron a realizar actividades internacionales para la salvaguarda de los recursos fitogenticos. As, existe un organismo dependiente de la FAO, el IPGRI (siglas en ingls del Instituto Internacional para los Recursos Fitogenticos) que establece cuales son los cultivos y regiones prioritarias para recolectar, organiza misiones de recoleccin, se encarga de la conservacin de los recursos fitogenticos, elabora descriptores con los cuales se recogen los datos de cada muestra recolectada (accesin) y publica directorios con los materiales disponibles en cada uno de los lugares donde se encuentran almacenados los recursos fitogenticos.

Para la conservacin de los recursos fitogenticos existen dos estrategias bsicas, que se denominan conservacin in situ y conservacin ex situ.

La conservacin in situ consiste en favorecer, en los lugares donde se concentra la diversidad gentica, el mantenimiento de la misma de forma espontnea. Esto requiere el establecimiento de "reservas" o "parques" en dnde se mantenga la diversidad. Adems la conservacin in situ permite que contine la dinmica evolutiva en un ambiente natural de los recursos fitogenticos conservados. Este tipo de conservacin est especialmente indicado para el caso de especies silvestres, forestales y pastos. As, protegiendo determinadas zonas donde se encuentra una especial concentracin de diversidad, estos recursos se pueden mantener de forma fcil. En el caso de la mayor parte de especies cultivadas este tipo de conservacin es ms 5

compleja. Por una parte, sera necesaria una incentivacin econmica para compensar a aquellos agricultores que renuncien a cultivar las variedades modernas. Por otra parte, habra que mantener un control para comprobar que efectivamente estos agricultores cumplen con la labor que se les ha encomendado. En la prctica este sistema resulta demasiado caro y difcil de controlar. Una alternativa a estos sistemas es la conservacin mediante la utilizacin.

La conservacin ex situ consiste en conservar los recursos fitogenticos fuera de las zonas de diversidad u origen. Este tipo de conservacin incluye a los jardines botnicos y arboretos por una parte y a los bancos de germoplasma por otra. Los jardines botnicos y arboretos son colecciones vivas de especies vegetales y en la actualidad tienen poca importancia. Ello es debido al elevado coste que conlleva mantener las plantaciones (espacio requerido, mano de obra,...) y a los peligros de que se pierdan las colecciones por accidentes climatolgicos, plagas y enfermedades. Por otra parte, los bancos de germoplasma son los centros donde se conservan los recursos fitogenticos mediante el almacenamiento de estructuras que permiten su propagacin o reproduccin. En estos bancos se puede almacenar gran cantidad de material a un costo relativamente bajo. El IPGRI considera dos tipos de bancos de germoplasma, "bancos base" y "bancos activos", dependiendo del tipo de colecciones de germoplasma. En el caso de los bancos base se almacenan colecciones a largo plazo (decenas o centenas de aos) como legado para las generaciones futuras y nicamente se pueden extraer accesiones de ellas para su regeneracin o en casos excepcionales, como por ejemplo, cuando en los bancos activos no se encuentre disponible algn material en concreto. En los bancos activos se almacenan colecciones a medio plazo (entre 3 y 20 aos) para la utilizacin de los materiales almacenados por los mejoradores, investigadores y otros usuarios pblicos y privados. Las muestras de estos bancos pueden ser fcilmente remitidas a los usuarios. De esta forma, cuando un mejorador necesita fuentes de variacin para un programa de mejora no necesita ir a los centros de diversidad a Abuscarla@, sino que puede recurrir a los bancos de germoplasma. En las especies reproducidas por semillas la conservacin se realiza almacenando las mismas en bancos de semillas, los cuales son habitaciones con unas condiciones especiales en donde se almacenan las semillas en bolsas, frascos u otros recipientes convenientemente ordenados. En el caso de las especies de reproduccin vegetativa, por su naturaleza habitualmente heterocigota (ver tema 10) no slo interesa conservar los genes, sino que tambin es de inters conservar el genotipo entero. Esto presenta el inconveniente de tener que conservar 6

rganos como tubrculos, estaquillas, rizomas, estolones,...) que tienen una vida corta. Para solventar este problema en los bancos de germoplasma en que se almacena este tipo de muestras se suele recurrir a otras tcnicas, como el almacenaje in vitro o la criopreservacin, los cuales sern tratados ms adelante.

Almacenaje del germoplasma. Almacenaje de semillas. Es la forma ms cmoda para el mantenimiento de los recursos fitogenticos de los materiales reproducidos por semilla. Dependiendo de su tolerancia a los mtodos ms comunes de conservacin se consideran dos tipos de semillas:

-Ortodoxas: Son aquellas en las cuales puede inducirse un aumento de su longevidad disminuyendo la temperatura y humedad de almacenamiento. La mayora de semillas de las especies cultivadas son de este tipo. Se ha demostrado que mediante la reduccin de la temperatura y de la humedad se puede aumentar extraordinariamente la longevidad de las semillas. Una aproximacin para la prediccin de la longevidad de estas semillas viene dada por la ley de Harrington (tambin llamada ley de la tumba). Esta ley predice que por cada 51C que baja la temperatura de almacenaje o por cada 2% de disminucin de la humedad interna de la semilla la longevidad se duplica. Aunque en la actualidad existen modelos para la prediccin de la longevidad ms exactos, la ley de Harrington da una idea de la longevidad aproximada de una semilla ortodoxa almacenada en determinadas condiciones. Mediante la desecacin y descenso de la temperatura de almacenaje se puede conseguir que la longevidad de las semillas sea de decenas, centenares o incluso miles de aos. As, se ha predicho que si se almacenasen semillas de trigo con una viabilidad inicial del 100% con una humedad del 5% a una temperatura de -20 1C, al cabo de 390 aos nicamente un 5% de semillas habran perdido la viabilidad. En los bancos de germoplasma la semilla se deseca de forma suave y luego se coloca en frascos hermticos que se mantienen a temperaturas bajas (normalmente -31C para bancos activos y 181C para bancos base). Si se congela antes de desecar la semilla puede perder la viabilidad debido a la formacin de cristales de hielo que pueden daar las estructuras celulares. Normalmente, la semilla se suele desecar de una forma suave, como por ejemplo encerrndolas en un frasco junto con algn agente hidrfilo, como el silica-gel.

-Recalcitrantes: Son aquellas que no toleran la reduccin de su humedad interna y/o la 7

reduccin en la temperatura de almacenamiento. Estos tratamientos provocan daos irreparables que originan la muerte de las semillas. Muchas especies que producen semillas grandes y carnosas (castaa, nuez, nspero,...) o que son de origen tropical (mango, cacao, coco,...) presentan un comportamiento de este tipo. En estas especies generalmente no se conserva la semilla, sino que se deben seguir otros sistemas de conservacin, en los que se conservan otras estructuras, generalmente vegetativas, que permitan la propagacin de estos materiales. Para ello suele ser habitual la conservacin in vitro o la criopreservacin. La conservacin de colecciones de campo supone, adems de un coste de mantenimiento elevado, los riesgos de prdida del material por accidentes meteorolgicos, plagas, enfermedades, etc.

Manejo de la informacin sobre recursos fitogenticos.

Para que los recursos fitogenticos sean tiles a los mejoradores, no es suficiente con conservarlos. Es necesario disponer del mximo de informacin posible sobre cada una de las accesiones y disponer de esta informacin en un formato que permita realizar bsquedas selectivas de los materiales que presenten las caractersticas de inters para el mejorador y que ste tenga a su alcance toda la informacin posible sobre cada accesin (cada una de las muestras distintas conservadas en un banco de germoplasma). Las colecciones de germoplasma pueden ser muy voluminosas, con decenas o centenares de miles de accesiones, por lo que es deseable estandarizar lo mximo posible la toma y almacenamiento de datos. La toma de datos referente a las accesiones se realiza mediante descriptores. Los descriptores son unidades de informacin que pueden hacer referencia a caractersticas intrnsecas de la planta o a otros datos de inters para la coleccin, como el pas de origen, fecha de colecta, etc. Existen 4 categoras de descriptores:

-Datos de pasaporte, que son datos registrados en el momento de efectuar la colecta en campo, junto con nombres y datos de identificacin

-Datos de caracterizacin, que son datos sobre caracteres heredables, fcilmente evaluables visualmente y que se expresan en cualquier ambiente (por ejemplo, forma de la hoja,...).

-Datos de evaluacin preliminar, que se refieren a un nmero limitado de caracteres considerados de inters general por los usuarios de un determinado cultivo (por ejemplo, resistencia a determinadas enfermedades,...).

-Datos de evaluacin completa, que se trata de informacin sobre caracteres relacionados principalmente con programas de mejora (presencia de alguna sustancia determinada,...)

5.3. Mutacin puntual y cambios numricos y estructurales.

Una mutacin es un cambio detectable heredable no causado por segregacin ni recombinacin gentica. Es decir, no se trata de los cambios producidos por la segregacin de los gametos ni tampoco por el intercambio de fragmentos entre cromosomas homlogos durante la meiosis como consecuencia del cruzamiento entre individuos genotpicamente distintos o de la autofecundacin de un individuo heterocigoto. La mutacin es la fuente primaria de variacin, ya que es el nico mecanismo que genera cambios permanentes en el genoma. Para que el cambio sea heredable es necesario que la mutacin se encuentre presente en las estructuras reproductivas. Segn la informacin gnica implicada en la mutacin se pueden distinguir:

-Mutacin gnica: Es cualquier cambio heredable producido dentro de los lmites de un gen. Como resultado aparecen estados alternativos de un mismo gen, los alelos. Una mutacin gnica puntual podra ser, por ejemplo, el resultado de una sustitucin de una base por otra en la cadena de ADN, por la adicin de un par de bases o por la delecin de un par de bases.

-Mutacin cromosmica: Es cualquier cambio que implica la prdida o ganancia del nmero de cromosomas. Si el conjunto de todos los genomas se duplica puede formarse un poliploide. Las mutaciones cromosmicas pueden ser resultado de un error en la meiosis. Las plantas superiores, en comparacin con los animales superiores, normalmente soportan bastante bien los cambios en el nmero de cromosomas.

-Mutacin estructural: Es cualquier cambio en la posicin de los segmentos cromosmicos. Entre los cambios estructurales se incluyen: 9

*Deleciones: Prdida real de porciones terminales o intercalares del cromosoma. Con ello, los genes que se encuentran en estos segmentos se pierden. *Duplicaciones: Presencia de un fragmento de informacin gentica ms de una vez en un cromosoma. Esto implica que al existir ms copias de estos genes, aumente la cantidad de los productos de su traduccin, aunque esto no tiene siempre porque ocurrir debido a los mecanismos reguladores de la clula o a que el nuevo trozo haya cado en una zona del cromosoma con poca actividad. *Inversiones: Inversin de un segmento cromosmico e insercin en su posicin original. Esto provoca que unos genes se siten en una posicin en la que no se encontraban antes, lo cual puede llevar a diferencias en la expresin. *Traslocaciones: Cambio de posicin de segmentos cromosmicos dentro o entre cromosomas. Al igual que en el caso anterior, se puede producir una mayor o menor actividad de los genes implicados, dependiendo de la zona en la cual se siten los fragmentos traslocados.

Existen especies en que muchas de las variedades existentes son el resultado de simples mutaciones puntuales. Muchas variedades de ctricos han aparecido como resultado de mutaciones espontneas aparecidas en el campo. Otro ejemplo es la diversidad que se encuentra en las coles (coliflor, col de Bruselas, col lombarda,...), la cual es producto de unas pocas mutaciones. Adems de las mutaciones espontneas, es posible inducir mutaciones, ya sea con agentes fsicos o qumicos. Estos agentes pueden aplicarse a la semilla, aunque tambin se pueden aplicar sobre yemas, polen, tejidos y clulas somticas, tubrculos, bulbos, etc. Los agentes mutgenicos son tambin carcingenos, por lo cual su manejo debe ser realizado con cuidado.

Tabla 5.1. Algunos agentes mutgenicos. Agentes fsicos Rayos X Rayos gamma Rayos ultravioleta Agentes qumicos Etil metan sulfonato Dietil sulfato Azida sdica

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Partculas beta Partculas alfa

Etil imina

La mejora por mutacin fue recibida con mucho entusiasmo por los mejoradores. Sin embargo, en la inmensa mayora de los casos, las mutaciones inducidad (al igual que las que se dan de forma natural) son de naturaleza deletrea y, en la prctica, los resultados de la mutacin inducida han sido menos espectaculares de lo esperado. An as, se han obtenido muchos tipos variantes de utilidad en la mejora mediante la mutacin inducida. Uno de los grupos de plantas en que ha resultado ms exitoso este tipo de tcnicas ha sido en plantas ornamentales, donde muchas mutaciones producen fenotipos de inters ornamental.

5.4. Hibridacin intra e interespecfica.

La hibridacin permite la transferencia de informacin gentica entre poblaciones, lo cual puede dar lugar a la aparicin de genotipos novedosos por combinacin de genes presentes en ambas poblaciones. Por tanto, es una herramienta que puede generar genotipos de inters para el mejorador. La hibridacin normalmente se realiza por cruzamiento por va sexual. Esto implica la transferencia controlada de polen desde un parental masculino hasta el estigma de las flores del parental femenino, habindose asegurado previamente que ningn grano de polen extrao pueda llegar al estigma de dicha flor. Para ello, en las flores del parental femenino se suelen eliminar las anteras (emasculacin) antes de que se produzca la liberacin del polen y se realiza el embolsamiento de la flor o inflorescencia. Una vez realizada la polinizacin se embolsa otra vez para evitar que posteriormente algn grano de polen extrao pueda llegar al estigma y fecundar alguna ovoclula. Cuando el cruzamiento directo no es posible debido a la incompatibilidad entre parental femenino y masculino, otra serie de tcnicas, como la fusin de protoplastos (Tema 11), pueden ser de gran utilidad para conseguir la hibridacin sin pasar por la fase sexual.

La hibridacin intraespecfica es la que se realiza entre individuos de una misma especie. Normalmente, no existen problemas para conseguir la hibridacin entre individuos frtiles de una misma especie, aunque stos sean considerablemente diferentes o pertenezcan a subespecies

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distintas, y los individuos resultantes suelen ser frtiles.

La hibridacin interespecfica es aquella que tiene lugar entre especies distintas. La hibridacin interespecfica nicamente es posible entre especies filogenticamente relacionadas. El xito de los cruces interespecficos depender en gran medida de las relaciones genticas entre las especies. As, como resultado de los cruzamientos interespecficos se pueden conseguir resultados que van desde que no se consiga obtener el hbrido por incompatibilidad del cruzamiento (falta de germinacin del polen, de crecimiento del tubo polnico, etc.) hasta que ste sea completamente viable. En muchas ocasiones, el hbrido interespecfico no resulta viable debido a que las diferencias entre cromosomas interfieren con el apareamiento y disyuncin durante la meiosis, incompatibilidad entre genes nucleares del parental masculino y genes citoplasmticos del parental femenino o entre el desarrollo del endospermo y el del embrin. En otros casos, el hbrido resulta ser poco frtil o estriles debido a las diferencias en el nmero cromosmico de las especies parentales o a la no homologa entre stos. Esto provoca que la meiosis sea irregular, y en lugar de formarse bivalentes aparezcan univalentes que llevan a gametos desequilibrados y a esterilidad.

Otra utilidad de gran inters para la mejora de la hibridacin interespecfica es la introgresin. La introgresin implica la transferencia de una pequea cantidad del genoma de una especie a otra. As, en muchos casos, en la especie cultivada no se encuentra variacin para algn carcter que si se encuentra en las especies silvestres. En este caso, interesa transferir slo ese carcter de la especie silvestre en cuestin. Por tanto, la introgresin es el resultado de la hibridacin de dos especies, con cruzamientos consecutivos de los productos de recombinacin hacia una de las especies parentales (retrocurzamiento) durante varias generaciones.

5.5. Las modernas tcnicas derivadas de la biotecnologa en la generacin de variacin.

Existen muchas tcnicas no convencionales de aumentar la variacin disponible para el mejorador. Entre stas se encuentran la generacin de variacin somaclonal, la fusin de protoplastos, el rescate de embriones in vitro, la fertilizacin in vitro y sobretodo la transformacin gentica, la cual permite insertar genes de cualquier origen en el genoma de una planta cultivada, dando lugar a genotipos insospechados hace slo unos pocos aos. Todas estas 12

tcnicas sern discutidas en el tema 11 (El cultivo in vitro y la ingeniera gentica en el desarrollo de nuevas variedades).

TEMA 6. ESTRUCTURA GENTICA DE LAS POBLACIONES DE PLANTAS

6.1. Definicin de estructura gentica.

La estructura gentica de una poblacin hace referencia a la frecuencia en que se encuentran distribuidos los genes y los genotipos en una poblacin. La estructura gentica condiciona de forma importante los programas de mejora a aplicar, ya que dependiendo de sta sern ms adecuados unos mtodos u otros.

Dos poblaciones distintas pueden presentar distintas frecuencias para los alelos de un gen dado (frecuencias allicas o frecuencias gnicas). As, si nos fijamos en un gen dado con dos alelos (A y a), en una poblacin (poblacin 1) estos alelos podran estar, por ejemplo en unas frecuencias f(A)=0.50 y f(a)=0.50, mientras que en otra poblacin (poblacin 2) las frecuencias podran ser f(A)=0.99 y f(a)=0.01. Esto indica que en la poblacin 1 un 50% de las copias de este gen correspondern al alelo A y un 50% al alelo a, mientras que en la poblacin 2 un 99% de las copias correspondern al alelo A y un 1% al alelo a. Por otra parte, para unas mismas frecuencias gnicas, las frecuencias genotpicas pueden diferir entre poblaciones distintas. Dos poblaciones (poblaciones 3 y 4) pueden tener unas frecuencias gnicas de f(A)=0.30 y f(a)=0.70 y las frecuencias de cada uno de los genotipos posibles (frecuencias genotpicas) podran ser f(AA)=0.30, f(AA)=0.00 y f(aa)=0.70 en la poblacin 3 y f(AA)=0.09, f(Aa)=0.42 y f(aa)=0.49 en la poblacin 4.

Obviamente, las frecuencias genotpicas y gnicas estn relacionadas. As, en un individuo diploide las frecuencias gnicas para un gen con dos alelos (A y a) seran: f(A) = f(AA) + 0.5 f(Aa) f(a) = f(aa) + 0.5 f(Aa)

6.2. Sistemas reproductivos. 13

Las plantas pueden reproducirse sexual o asexualmente. En la reproduccin sexual se da fusin de gametos (clulas con la mitad de la dotacin cromosmica de las clulas somticas), mientras que en la asexual se utilizan partes vegetativas (conjuntos de clulas con la dotacin cromosmica completa) de la planta para producir nuevos individuos. De esta forma, los resultados de la reproduccin sexual y asexual son distintos. En la reproduccin sexual se dan los fenmenos de segregacin y recombinacin durante la meiosis, lo cual puede dar lugar a combinaciones genticas nuevas y por tanto, a individuos genticamente distintos a sus parentales. En cambio en la reproduccin asexual no tiene lugar la meiosis, con lo cual la configuracin gentica de los individuos reproducidos vegetativamente no cambia. De esta forma, en la reproduccin asexual el genotipo se mantiene inalterado, o lo que es lo mismo, los descendientes de un individuo reproducido asexualmente sern genticamente idnticos a su progenitor.

Plantas reproducidas sexualmente.

Segn su sistema reproductivo, las plantas reproducidas sexualmente se dividen en dos grandes grupos: Autgamas y algamas. Plantas autgamas son aquellas que normalmente se autofecundan, es decir, que el polen de una planta dada fecunda a los vulos de esa misma planta. Habitualmente, lo que ocurre es que el polen de una flor hermafrodita fecunda a los vulos de la misma. Plantas algamas son aquellas que presentan polinizacin al azar. En condiciones ideales, esto significa que las probabilidades de que el polen de todas y cada una de las plantas de la poblacin fecunden a un vulo de una planta cualquiera es la misma.

Plantas reproducidas asexualmente.

En este tipo de plantas, la reproduccin se realiza por estructuras vegetativas que son capaces de dar lugar a un individuo nuevo (tubrculos, estolones, estaquillas, bulbos, cormos, etc.) o por cultivo de tejidos in vitro. Con las tcnicas de cultivo in vitro, en la actualidad es posible reproducir vegetativamente muchas especies vegetales que antes de la aparicin de estas tcnicas no podan reproducirse vegetativamente y evitar la transmisin de enfermedades con los rganos de propagacin. Esto ha sido muy til en la mejora (tema 11). Por otra parte, hay que 14

sealar que el que una especie se reproduzca de forma vegetativa en la prctica agrcola no significa que no pueda reproducirse de forma sexual. De hecho en aquellos cultivos de reproduccin vegetativa aprovechados por sus frutos o sus semillas, como muchos frutales y la fresa, necesitan de la polinizacin para producir. Incluso en algunos casos, sobretodo en frutales, es necesario que esta polinizacin sea cruzada por la existencia de sistemas de autoincompatibilidad. La posibilidad de obtener descendencia por va sexual en este tipo de plantas es de gran inters para la mejora, tal y como veremos en el tema 10.

En algunos casos, las plantas de reproduccin vegetativa son estriles, como por ejemplo las bananas que consumimos habitualmente. Gracias a esta esterilidad no tienen semillas, pero esto hace que su reproduccin nicamente pueda realizarse por va asexual.

Otro tipo particular de reproduccin asexual es la apomixis o agamospermia, en la cual se da produccin de semilla, pero el embrin no se forma a partir de la fusin de gametos, sino a partir de tejido materno, generalmente nucelar.

Especies autgamas. Cereales Cebada Avena Arroz Trigo Mijo Sorgo* Leguminosas Garbanzo Juda Cacahuete Guisante Soja Lenteja Veza Haba*

Hortcolas Tomate Pimiento Berenjena Lechuga

Industriales Lino Tabaco Algodn*

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*Sistema reproductivo intermedio con predominio de la autogamia

Especies algamas. Cereales Maz Centeno Leguminosas Alfalfa Trbol blanco

Hortcolas Sanda Calabaza Pepino Meln Esprrago Cebolla Zanahoria Col Rbano

Industriales Remolacha Camo

Especies reproducidas vegetativamente. Hortalizas Patata Alcachofa Fresa Frutales Casi todos

6.3. Estructura gentica de plantas autgamas, algamas, de reproduccin vegetativa y apomcticas.

Plantas autgamas. En las especies autgamas, normalmente las plantas sern homocigotas para todos los loci. Es decir, en un mismo individuo para cada gen nicamente existir un alelo. Esto es debido a que la autofecundacin continuada conduce a la homocigosis. Si se autofecunda una planta 16

homocigota, su descendencia seguir siendo homocigota, es decir su genotipo permanecer invariante. En cambio si existe alguna planta heterocigota, al autofecundarse nicamente la mitad de la descendencia seguir siendo heterocigota, mientras que la otra mitad pasar a ser homocigota. Como resultado, la proporcin de heterocigotos se reducir a la mitad en cada generacin. De esta forma, despus de n generaciones de autofecundacin, la proporcin de heterocigotos se habr reducido a (1/2)n. En el caso de una poblacin finita, al cabo de un nmero suficiente de generaciones de autofecundacin los heterocigotos habrn desaparecido. Plantas algamas. En las poblaciones de algamas el cruzamiento se realiza al azar. De esta forma, en un locus determinado pueden existir homocigotos y heterocigotos. Debido al cruzamiento al azar, en cada generacin se van produciendo nuevas combinaciones de genes. En el caso de alogamia estricta (a=1), las frecuencias genotpicas siguen la ley de Hardy-Weinberg. Imaginemos que tenemos un gen con dos alelos A y a que se encuentran en frecuencias f(A)=p y f(a)=q. Esto significa que del total de gametos masculinos formados en esta poblacin la proporcin de gametos de tipo A ser p y la de gametos de tipo a ser q. Lo mismo ocurrir en el caso de los gametos femeninos. Al producirse los cruzamientos al azar, los genotipos resultantes de la unin de los gametos masculinos y femeninos sern: P(AA)=p2 P(Aa)=2*p*q P(aa)=q2

Plantas de reproduccin vegetativa y apomcticas. En ausencia de seleccin, la composicin de una poblacin de plantas de reproduccin vegetativa o apomcticas permanecer inalterada. Por tanto, si nos encontramos con una poblacin de en que existen distintos genotipos, con este tipo de reproduccin stos se mantendrn en las mismas proporciones que en la generacin inicial.

6.4. Depresin consangunea y heterosis.

En las poblaciones de algamas la autofecundacin continuada durante varias generaciones normalmente conduce a una prdida de vigor (depresin consangunea). En estas 17

poblaciones suelen existir genes que presentan alelos detrimentales en frecuencias gnicas bajas. Esto hace que estos alelos se encuentren en su mayor parte en estado heterocigoto. Si un alelo a est en una frecuencia f(a)=0.5 la frecuencia de heterocigotos Aa ser 0.5 y la de homocigotos aa 0.25. En cambio si a estuviese en una frecuencia de f(a)=0.01 la frecuencia de heterocigotos Aa sera de 0.0198 y la de homocigotos aa slo de 0.0001. Es decir el alelo detrimental se encuentra en su mayor parte "oculto" en los heterocigotos. Al forzar la autofecundacin se va produciendo la desaparicin de los alelos que estn en heterocigosis, los cuales pasan a estar en homocigosis. Por cada generacin de autofecundacin el nmero de heterocigotos se reduce a la mitad, con lo cual aumenta la frecuencia de homocigotos y ms individuos llevarn el alelo detrimental en homocigosis. Cuando existen muchos genes detrimentales ocultos en los heterocigotos, lo cual suele ser habitual, la consecuencia es que muchos de los individuos procedentes de la autofecundacin llevan al menos un gen detrimental en homocigosis, lo cual provoca prdida de vigor. De hecho, muchas plantas presentan sistemas genticos de autoincompatibilidad, lo cual evita los efectos negativos de la autofecundacin. Por lo tanto, los mtodos de mejora de algamas, en general, tratarn de evitar que como producto final del programa se obtengan homocigotos. En cambio, tratarn de explotar el vigor hbrido.

Existen distintos puntos de vista sobre la definicin de vigor hbrido o heterosis. As, algunos mejoradores consideran que existe heterosis para un caracter cuando el hbrido presenta para este caracter un valor superior a cualquiera de los parentales. Otros mejoradores, en cambio, consideran que es suficiente que el hbrido sea superior al valor medio de los parentales para que se pueda decir que existe heterosis. Existen dos grandes hiptesis para explicar el fenmeno de la heterosis. Una es la de la dominancia. Segn esta hiptesis, el mayor valor del hbrido se debe a que en los parentales existirn alelos distintos dominantes que contribuyen al caracter. De esta forma, el hbrido reunir en heterocigosis a los alelos para los que difieren los parentales. Al ser genes dominantes, el hbrido presentar un mayor valor que los parentales. La otra hiptesis que pretende explicar el fenmeno de la heterosis es la de la superdominancia. Segn esta hiptesis el heterocigoto es en s mismo superior a cualquiera de los homocigotos. La mayora de trabajos de investigacin apoyan a la primera hiptesis. Esto indica que sera posible derivar a partir de un hbrido individuos homocigotos con un valor tan elevado como el del hbrido para un caracter determinado. A diferencia de lo que ocurre algamas, en autgamas generalmente no existe depresin 18

consangunea como consecuencia de la autofecundacin. Ello no quiere decir que no exista vigor hbrido en individuos con un alto nivel de heterocigosis, los cuales suelen ser obtenidos por hibridacin artificial. La falta de depresin consangunea como resultado de la autofecundacin se debe a que el sistema natural de reproduccin de estas plantas es la autofecundacin y los posibles alelos detrimentales que existiesen o que vayan apareciendo por mutacin son rpidamente eliminados por la seleccin natural. Adems, al ser homocigotos para todos los genes, al producirse la autofecundacin, el genotipo de estas plantas no vara. Por tanto, en autgamas se pueden obtener homocigotos como producto final de un programa de mejora. Eso no significa que no se puedan obtener tambin variedades que sean heterocigotas, las cuales pueden presentar vigor hbrido

6.5. Incidencia del sistema reproductivo y de la biologa floral en los objetivos de la Mejora Vegetal.

El conocimiento de la estructura gentica de una poblacin es de gran importancia antes de iniciar un programa de mejora. Por otra parte, es interesante sealar que en ltima instancia, la estructura gentica de una poblacin depende de la biologa floral de la especie. Es decir que el que una planta sea autgama o algama depende de su biologa floral.

En las plantas algamas estrictas, los apareamientos se producen al azar. Si tomamos el caso de un gen hipottico con dos alelos presentes en la poblacin, existirn homocigotos para cada uno de los alelos y heterocigotos y adems, se encontrarn en las frecuencias predichas por la ley de Hardy-Weinberg. De esta forma, en las poblaciones de algamas, existe una alta frecuencia de heterocigotos, sobre todo cuando las frecuencias gnicas se encuentran en valores medios.

En las plantas reproducidas vegetativamente y apomcticas se mantiene el genotipo de la planta originaria. Si sta es heterocigota su descendencia seguir siendo heterocigota. Lo mismo ocurrir si es homocigota. Este tipo de plantas suele presentar un elevado grado de heterocigosis, lo cual permite explotar el vigor hbrido. Al reproducirse vegetativamente la constitucin gentica original se mantiene. La biologa y morfologa floral tiene un papel muy importante en los programas de 19

Mejora. Adems, la biologa reproductiva condiciona en gran medida el tipo de estrategia de mejora a seguir. Los planes de mejora requieren frecuentemente la realizacin de cruzamientos. En el caso de las variedades hbridas su obtencin requiere la realizacin de cruzamientos en gran escala. En plantas en que esto se puede realizar fcilmente y obtener un elevado nmero de semillas por cruzamiento, como el maz, la estrategia de obtener hbridos puede ser adecuada. En otras es difcil ya que, como en el caso del trigo, la realizacin de cruzamientos es tcnicamente complicada y como mucho se puede obtener una semilla por cruzamiento, por lo que la obtencin de hbridos no parece la estrategia ms adecuada. TEMA 7. VARIEDADES GENTICAS.

7.1. Cultivares y variedades genticas.

Un cultivar es un material vegetal cultivado con unas caractersticas morfolgicas, fisiolgicas o agronmicas distintivas y reproducibles. Es decir, debe ser posible distinguirlo de los dems cultivares y debe presentar unas caractersticas que se repitan campaa tras campaa. El trmino variedad es ms amplio, ya que no se restringe a las plantas cultivadas. En el contexto de la Botnica, el trmino variedad botnica se utiliza para designar....Como vemos, una diferencia fundamental entre estos dos trminos es que el cultivar necesariamente debe corresponder a una especie cultivada y la variedad no. De esta forma, en un contexto de Mejora sera ms correcto hablar de cultivar que de variedad. Sin embargo, en muchas ocasiones se utilizan como sinnimos, y el uso de ambos trminos para designar a materiales cultivados se ha generalizado. En ocasiones se utiliza el trmino variedad gentica para referirse a un cultivar.

Existen muchos tipos de variedades genticas, que se diferencian en caractersticas de gran importancia desde el punto de vista del manejo agrcola. De la misma forma, la obtencin de uno u otro tipo de variedades puede requerir a menudo la utilizacin de mtodos de mejora distintos. Los tipos fundamentales de variedades son los siguientes. En este tema nos dedicaremos a estudiar los principales tipos de cultivares, que son los siguientes: -Lneas puras -Variedades poblacin -Clones -Variedades multimezcla 20

-Variedades multilnea -Hbridos -Variedades sintticas

7.2. Lneas puras.

Una lnea pura est formada por un conjunto de individuos con un mismo genotipo, el cual es homocigoto para todos los loci.

Las lneas puras son habituales en cultivos autgamos, ya que en este tipo de cultivos los heterocigotos tienden a desaparecer con la autofecundacin (Tema 6). Adems, una vez se tiene un individuo homocigoto, con la autofecundacin su genotipo se mantiene inalterado. Por otra parte, en este tipo de cultivos es habitual que no exista depresin consangunea ya que por su forma de reproduccin la seleccin natural y artificial han actuado para eliminar a los genes detrimentales. En cambio, en cultivos algamos las lneas puras generalmente son muy dbiles y normalmente no tienen inters para su utilizacin en cultivo. Sin embargo, son muy tiles para la obtencin de otras variedades, como los hbridos.

Las lneas puras presentan un nivel mnimo de diversidad gentica. Esto es porque todos los individuos son genticamente iguales y adems al ser homocigotos, todos los alelos que se encuentran en un locus son iguales. Por su estructura gentica, las lneas puras presentan una elevada uniformidad, lo cual presenta ventajas para las exigencias del mercado.

Las lneas puras se pueden obtener fcilmente por autofecundacin continuada hasta obtener un individuo homocigtico para todos sus loci. En cultivos autgamos son muy fciles de obtener ya que por el propio sistema reproductivo se tiende a la homocigosis. De esta forma, la semilla de autofecundacin de un individuo homocigoto constituye una lnea pura. De la misma forma su mantenimiento tambin tiene poca complicacin ya que mediante la autofecundacin perpeta el mismo genotipo. De esta forma, un agricultor que compre semilla de una lnea pura podr seguir utilizando la semilla que coseche para el futuro, siempre y cuando no ocurran entrecruzamientos ocasionales con otros cultivares de la misma especie. Esto se puede asegurar en gran medida si no existen otras variedades en campos circundantes. En algamas, la 21

obtencin de lneas puras requiere de la autofecundacin o la realizacin de cruzamientos consanguneos de forma continuada, por lo que en estos casos el mejorador debe controlar la polinizacin.

7.3. Variedades poblacin.

Una variedad poblacin est formada por un conjunto de individuos con unas caractersticas diferenciales y que se mantienen por polinizacin libre, no controlada de forma directa por el hombre.

Las variedades poblacin han sido las variedades utilizadas de forma tradicional hasta la aparicin de las modernas variedades. Este tipo de variedades han aparecido por seleccin natural y artificial en un ambiente dado sin control de la polinizacin y normalmente tienen una antigedad de decenas o cientos de aos. Este tipo de variedades normalmente son mantenidas ao tras ao por los propios agricultores, los cuales han ido eligiendo las semillas de las mejores plantas para la siguiente generacin. Como resultado de la aparicin de mutaciones, cruzamientos incontrolados con otros cultivares o especies silvestres relacionadas, mezcla de semillas, etc., estas variedades han ido acumulando un alto grado de variacin.

Las variedades poblacin son comunes tanto en autgamas como en algamas. En autgamas estn formadas por mezclas de distintos genotipos homocigticos puros. En algamas, las variedades poblacin se encuentran formadas tanto por individuos homocigotos como heterocigotos. Cuando no exista seleccin, las frecuencias de los distintos genotipos se encuentran en las proporciones dadas por el equilibrio de Hardy-Weinberg.

Las variedades poblacin normalmente presentan una elevada diversidad gentica, por lo cual es comn que presenten un menor grado de uniformidad que las lneas puras. Aunque la uniformidad suele ser mayor para el/los caracter/es por los que se aprovechan, ya que ha habido una seleccin artificial consciente para este/os caracter/es, siguen presentando un rango de variacin superior al que existe para otros materiales como las lneas puras, clones o hbridos simples.

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Las variedades poblacin normalmente presentan un elevado grado de tamponamiento frente a cambios en las condiciones ambientales y suelen estar muy adaptadas al ambiente de cultivo en que han evolucionado, presentando un elevado grado de tolerancia o resistencia a las plagas y enfermedades con las que han coexistido y evolucionado durante muchos aos. Sin embargo, en muchos casos son sensibles a las plagas o enfermedades nuevas. Por otra parte, su rendimiento suele ser menor que el de otro tipo de cultivares. Adems, su falta de uniformidad, con las consiguientes dificultades que esto supone para su xito en el mercado, estn haciendo que su uso cada vez sea menor. A pesar de esto, las variedades poblacin son y han sido la base gentica ms ampliamente utilizada para la obtencin de la mayora de cultivares nuevos, ya que suponen una fuente de variacin de gran inters para muchos programas de mejora. Por otra parte, (tal y como veremos en los temas 8 y 9), la mejora de las variedades poblacin puede ser relativamente fcil.

7.4. Clones.

Un clon es un conjunto de individuos con un mismo genotipo y en el que la reproduccin se realiza de forma vegetativa. Por tanto, no tiene lugar intercambio de material gentico a travs de procesos sexuales y el genotipo se mantiene inalterado generacin tras generacin. Esto permite que una vez que se detecte un genotipo superior, ste puede ser reproducido dando lugar a una descendencia con ese mismo genotipo independientemente de su constitucin gentica y del sistema reproductivo sexual habitual de la especie. Normalmente, los clones presentan un elevado grado de heterocigosis, con lo cual se aprovecha el vigor hbrido. Al ser muy heterocigotos, la descendencia de un clon obtenida por va sexual segrega, y por lo tanto no presentar las mismas caractersticas que la planta madre. Esto puede utilizarse en la mejora de cultivos de propagacin vegetativa (Tema 10).

Los clones son habituales en muchos frutales, tanto en especies autgamas como en algamas, y en otros cultivos de alto valor econmico en que este tipo de reproduccin es fcil. Un clon presenta un nivel mnimo de diversidad gentica, ya que todos los individuos son genticamente iguales. Sin embargo, al contrario de lo que ocurre en las lneas puras, en cada locus se pueden encontrar alelos diferentes,.

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Al ser todos los individuos genticamente iguales presentan una gran uniformidad. Muchos clones han aparecido como consecuencia de mutaciones espontneas, que al conferir a los individuos que las portaban alguna caracterstica deseable se han ido propagando vegetativamente. Los clones se mantienen por reproduccin vegetativa continuada. De esta forma hay clones, especialmente en frutales, que tienen una antigedad de cientos de aos.

La principal desventaja de este tipo de variedades es el alto coste de la reproduccin vegetativa, en comparacin con la reproduccin por semilla, y la acumulacin de enfermedades transmisibles por tejidos somticos (Tema 10).

7.5. Variedades multimezcla.

Se trata de variedades formadas por una mezcla de otras variedades. As, se pueden realizar mezclas de lneas puras, mezclas de hbridos, de lneas puras e hbridos, etc...

Las variedades multimezcla se pueden utilizar tanto en autgamas como en algamas. Presentan una elevada diversidad gentica, lo que les confiere una gran estabilidad en el rendimiento. Adems, muchos estudios indican que el rendimiento de las variedades multimezcla es superior al rendimiento medio de sus variedades componentes cultivados por separado. Sin embargo, la produccin de una variedad multimezcla no suele superar al de la mejor variedad componente de la mezcla. De todas formas, en muchas ocasiones es imposible conocer a priori cual ser la mejor variedad de entre un conjunto de variedades. De esta forma, las variedades multimezcla permiten una menor variacin en los rendimientos obtenidos en cada campaa, es decir, proporcionan una mayor estabilidad en el rendimiento. Al existir distintos genotipos, existe una compensacin entre unos y otros genotipos frente a cambios ambientales producidos por causas climatolgicas, plagas o enfermedades o cualquier otro factor no controlado.

El principal inconveniente de las variedades multimezcla deriva de su poca uniformidad. Al mezclar variedades distintas, el producto final es poco uniforme, las cualidades agronmicas de cada variedad son distintas, etc. Esto constituye un problema para los mercados actuales y para el manejo agrcola de estos materiales.

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7.5. Variedades multilnea.

Las variedades multilnea estn formadas por una mezcla de lneas puras genticamente iguales, excepto para uno o unos pocos genes.

Las variedades multilnea se utilizan en autgamas (ya que se trata de lneas puras) y su utilidad fundamental es para la lucha contra enfermedades, y muy especialmente en cereales. De la misma forma que se han encontrado genes que proporcionan una proteccin efectiva frente a una enfermedad durante muchos aos, para otras se trata de una lucha continua entre el mejorador y la enfermedad, ya que los genes de resistencia que se introducen son superados rpidamente por razas nuevas del patgeno. Esto suponde que contnuamente se deben obtener variedades nuevas con genes de resistencia distintos, los cuales slo ofrecen proteccin durante un tiempo limitado. Las variedades multilnea tratan de evitar esto ltimo. Para ello, las distintas lneas que forman la variedad multilnea difieren en los alelos que presentan resistencia a una enfermedad. Es comn que para una enfermedad dada existan diferentes razas del patgeno y diferentes genes de resistencia en la planta. Si se utiliza siempre el mismo gen de resistencia, se establece una presin de seleccin muy fuerte en favor de razas que pueden superar ese gen de resistencia. De esta forma, una raza que se encuentre en muy baja frecuencia puede pasar a convertirse en la raza predominante. En esta situacin al resistencia se ve superada y el cultivo se ve afectado por la enfermedad. Sin embargo, si existen individuos con diferentes genes de resistencia frente a un mismo patgeno, al no establecerse una presin de seleccin tan fuerte, es posible que se vean infectados individuos de alguna lnea o lneas que no presentan resistencia a la raza predominante, pero las dems se vern libres. Adems, al existir un mosaico de plantas con genotipo distinto para la resistencia se dificulta la expansin del patgeno. Esto permite que con unas prdidas mnimas tengamos una resistencia til durante muchos aos (resistencia durable).

Las variedades multilnea son muy uniformes, ya que todo su genotipo es igual, excepto para los genes de resistencia implicados, los cuales no suelen tener un efecto muy grande sobre el fenotipo.

Se suelen obtener por introgresin, generalmente mediante retrocruzamiento (Tema 8) de 25

varios alelos para un gen de resistencia en una lnea pura, obtenindose tantas lneas puras (lneas isognicas) como de alelos distintos se disponga para el carcter en cuestin.

La desventaja principal de las variedades multilnea se derivan de la necesidad de obtener y mantener varias lneas distintas (en ocasiones hasta 10 o ms) en lugar de una sola. Esto multiplica el trabajo necesario para obtener una variedad de este tipo.

7.6. Variedades hbridas.

Una variedad hbrida es aquella resultante del cruzamiento de parentales que presentan distinto genotipo. Los hbridos son muy comunes en la Agricultura actual en un gran nmero de especies. Normalmente presentan un elevado grado de heterocigosis, lo cual les confiere vigor hbrido.

Para la obtencin de hbridos es necesario realizar cruzamientos o asegurarse de que stos se han realizado. Los cruzamientos pueden realizarse manualmente o mediante mecanismos que permitan asegurarnos que las semillas que obtenemos proceden en realidad del cruzamiento. Uno de los mecanismos que suele utilizarse es la androesterilidad (esterilidad masculina). As si el parental que utilizamos como parental femenino presenta polen estril no se podr autofecundar. En autgamas nos evitaremos la eliminacin de las anteras (emasculacin) antes de que liberen el polen. En algamas, al producirse polinizacin cruzada nos evitaremos no slo la emasculacin, sino la necesidad de transferir el polen del parental masculino al femenino.

En algunas especies, como el maz y el tomate, la obtencin de hbridos es sencilla y barata ya que los cruzamientos son fciles de realizar y se obtienen muchas semillas de cada uno de ellos. En maz, se plantan varias lneas del parental femenino por cada lnea de parental masculino. Al estar separadas las inflorescencias masculinas y femeninas se corta antes de que aparezca el penacho de las inflorescencias masculinas de las plantas femeninas. De esta forma, las mazorcas que se recojan sobre estas plantas necesariamente procederan de cruzamiento entre ambos parentales. En otros cultivos como el trigo y la alfalfa, la obtencin de hbridos es muy cara, debido a que la polinizacin es dificultosa y por cada cruzamiento realizado se obtiene como mucho una sola semilla. 26

Dependiendo de los parentales utilizados, existen varios tipos de hbridos:

Hbrido simple:

Es el producto del cruzamiento de dos lneas puras. Por tanto, todos los individuos son genticamente iguales. Suelen presentar un elevado grado de heterocigosis, ya que las lneas parentales utilizadas suelen diferir en los alelos presentes en muchos loci. Esto permite una mayor explotacin del vigor hbrido. Las lneas parentales que dan lugar al hbrido se eligen de forma que cuando se cruzen entre ellas den lugar a un hbrido con buenas caractersticas.

Los hbridos simples son comunes en autgamas y en algamas. En este ltimo caso es frecuente que las lneas parentales sean muy dbiles, ya que para la obtencin de las lneas puras se ha tenido que recurrir a realizar cruzamientos consanguneos y/o autofecundaciones. Esto implica que se les debe dedicar un especial cuidado y que la produccin de semillas obtenida puede ser baja. Hasta hace unas dcadas la utilizacin de hbridos simples en un cultivo como el maz no era muy frecuente. En este cultivo, las lneas puras eran muy dbiles, obteniendose muy poca semilla por planta, lo cual la encareca. En la actualidad, los hbridos simples de maz son ms comunes ya que se han obtenido lneas puras con un mayor vigor.

Los hbridos simples presentan poca diversidad gentica, ya que todos los individuos son genticamente iguales. Sin embargo, al presentar un elevado grado de heterocigosis, en muchos loci se encuentran alelos distintos.

Al ser todos los individuos genticamente idnticos, presentan una elevada uniformidad. Tambin suelen ser muy productivos debido al vigor hbrido que presentan. Por otra parte, es fcil acumular resistencias a enfermedades en estos materiales. Estos genes suelen ser dominantes, con lo cual realizando cruzamientos entre lneas puras parentales con resistencia a distintos patgenos, el hbrido poseer en heterocigosis los que confieren resistencia. Al tratarse de genes dominantes, el hbrido acumular las resistencias que se encuentren en ambos parentales.

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Como ya hemos dicho, los hbridos simples se obtienen por el cruzamiento de dos lneas puras y su obtencin requiere el control de la polinizacin. Si el agricultor utiliza la semilla que da el hbrido la descendencia segregar, tanto si se trata de una autgama como de una algama, con lo cual el producto que obtendr ser muy poco uniforme y se perder una parte importante del vigor hbrido. Esto hace que cada ao el agricultor tenga que comprar la semilla si quiere que sus plantas que siembra mantengan las caractersticas de la variedad. Esto supone una patente fsica sobre los hbridos por parte de las casas de semillas, ya que la nica forma en que se puede obtener el hbrido es realizando el cruzamiento entre las dos variedades parentales y a stas slo las posee la casa de semillas en cuestin. Este es uno de los motivos prinicpales por los cuales las casas de semillas estn interesadas en la comercializacin de cultivares hbridos.

Hbrido doble:

Es el resultante de realizar el cruzamiento entre dos hbridos simples. Los hbridos dobles presentan la ventaja sobre los simples de que la obtencin de semilla es barata ya que los dos parentales son hbridos y por tanto, presentan mucho vigor y dan una elevada cantidad de polen (parental masculino) y de semilla (parental femenino).

Los hbridos dobles se han utilizado fundamentalmente en maz. Presentan mayor diversidad gentica que los hbridos simples, ya que al proceder del cruzamiento entre genotipos heterocigotos se producir segregacin. Debido a esto presentan una menor uniformidad que los hbridos simples. Adems, en general, los mejores hbridos dobles presentan una produccin menor que los mejores hbridos simples.

Este tipo de hbridos se utilizan en zonas donde no compensa econmicamente la utilizacin de semilla de hbridos simples. Sin embargo, su utilizacin se encuentra cada vez ms en desuso debido a que la semilla de hbridos simples es cada vez ms barata, por haberse obtenido lneas puras de mayor vigor.

Hbrido de tres vas:

Tambin se denomina hbrido triple. Es el resultante de cruzar una lnea pura con un 28

hbrido simple. Normalmente se suele utilizar como parental masculino a la lnea pura y como femenino al hbrido. Se trata de un tipo de hbrido intermedio entre el simple y el doble. Al utilizarse como parental femenino un hbrido se obtiene una elevada produccin de semillas. Aunque el parental masculino sea dbil, con el polen que produce, normalmente es posible polinizar adecuadamente a muchas plantas. Como en el caso de los hbridos dobles su utilizacin se encuentra en desuso.

Por lo que se refiere a la composicin gentica de los hbridos de tres vas y a su uniformidad, stas son intermedias entre el hbrido simple y el doble. Al igual que los hbridos dobles, se suelen utilizar en zonas dnde no compensa la utilizacin de hbridos simples.

Hbrido lnea x variedad:

Es el resultado del cruzamiento entre una lnea pura y una variedad poblacin. Los hbridos lnea x variedad presentan una alta diversidad gentica, ya que la variedad poblacin es genticamente diversa. Por otra parte, este tipo de hbridos presenta una menor uniformidad que el hbrido simple y en general una menor produccin. Sin embargo, al ser uno de los parentales una variedad poblacin presentan una mayor capacidad de adaptacin al ambiente. Se suelen utilizar en zonas en las que la gran mayora de hbridos no se comportan adecuadamente debido a las condiciones climatolgicas, edafolgicas, etc. En estas zonas suelen existir variedades poblacin bien adaptadas a estas condiciones. De esta forma, este tipo de cruzamientos permite explotar la ventaja del vigor hbrido y la adaptacin de la variedad poblacin, resultado de su diversidad gentica y evolucin en un ambiente dado.

7.7. Variedades sintticas.

Una variedad sinttica es una generacin avanzada obtenida a partir de una mezcla de lneas, hbridos u otro tipo de materiales de un cultivo algamo y que se mantiene por polinizacin abierta.

Es importante destacar que en la mezcla original de materiales slo se incluyen los 29

materiales que combinan bien entre s en todas las combinaciones, es decir que el cruzamiento 2 a 2 de todos los componentes da buena descendencia.

Al tratarse de especies algamas se producen cruzamientos entre los componentes originales de la variedad, alcanzndose un elevado grado de heterocigosis. En teora, si se trata de una algama pura el equilibrio de las frecuencias genotpicas se alcanza al cabo de una generacin y en ausencia de seleccin las caractersticas se deberan mantener de forma inalterada generacin tras generacin. Por tanto, el agricultor puede utilizar su propia semilla campaa tras campaa. Sin embargo, normalmente determinados genotipos suelen presentar una mayor supervivencia, con lo cual la composicin de la mezcla se va alterando con el paso del tiempo. Por tanto, en este tipo de variedades se suele recomendar que el agricultor renueve su semilla comprando semilla comercial cada cierto nmero de aos. Las variedades sintticas presentan una elevada diversidad gentica, tanto mayor como es el nmero de lneas parentales utilizadas, y una alta estabilidad en la produccin. Debido a esta diversidad, estas variedades son poco uniformes, lo cual puede ser un inconveniente para su comercializacin. En las plantas forrajeras, dnde la falta de uniformidad no es un factor excesivamente importante, existen variedades sintticas.

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TEMA 8. MTODOS DE MEJORA EN PLANTAS AUTGAMAS.

8.1. Seleccin individual y seleccin masal.

Ya hemos visto que las poblaciones de autgamas estn formadas por individuos en su mayor parte homocigticos. Por otra parte, en este tipo de plantas existen poblaciones, como las variedades poblacin, que estn constituidas por mezclas de lneas puras distintas. Esta variacin gentica existente se puede aprovechar para mejorar esta poblacin, seleccionando los mejores individuos o eliminando los peores.

Mediante la seleccin se modifican las frecuencias gnicas. El mejorador establece, dependiendo de sus objetivos la forma de seleccin que utilizar. As, en caracteres cuantitativos, un tipo de seleccin habitual es la seleccin por truncadura, en que se seleccionan los individuos que superan un cierto valor. Otra forma usual de ejercer seleccin es elegir un determinado porcentaje de individuos que presenten el carcter que nos interesa con mayor intensidad. La proporcin de individuos seleccionados es lo que se llama presin de seleccin. En caracteres cualitativos elegir los individuos que muestran el carcter.

A principios de siglo, Johannsen realiz experimentos con una variedad poblacin de juda para la que exista una gran variacin para el peso de la semilla (Figura 8.1). Johanssen escogi las judas ms grandes y las ms pequeas, las sembr y dej que las plantas procedentes de ellas se autofecundasen. Encontr que las semillas procedentes de plantas originadas a partir de semillas pequeas presentaban un peso medio inferior al de las semillas de las plantas procedentes de semillas grandes. Esta primera seleccin (seleccin entre lneas puras distintas) fue eficaz, encontrndose diferencias en el peso medio de los dos grupos de semillas. Sin embargo, cuando separ semillas grandes y semillas pequeas dentro de la descendencia de autofecundacin de una misma planta (seleccin dentro de lnea pura), los pesos medios de las semillas de la generacin siguiente de ambos grupos de semillas fueron iguales. En este caso la seleccin no es eficaz.

La poblacin inicial, no seleccionada por el peso de la semilla, constitua una mezcla de formas genticamente diferentes las unas de las otras. Al ser la juda un cultivo autgamo, esta 31

mezcla corresponda a individuos homocigotos, capaces de dar lugar cada uno a una lnea pura diferente. Las diferencias que se encontraban para el peso de la semilla en la poblacin original eran, pues, debidas en parte al genotipo y en parte al ambiente. En cambio, las semillas procedentes de la autofecundacin de un individuo de esa poblacin dar individuos con el mismo genotipo, por lo cual las diferencias que se encuentren entre el peso de las distintas semillas nicamente ser de tipo ambiental.

Sobre la base de esta explicacin se llega a las siguientes conclusiones:

-La seleccin entre lneas es eficaz. Las diferencias observadas se deben al ambiente y al genotipo. -La seleccin dentro de lnea pura no es eficaz. Toda la variacin que se observa es debida al ambiente.

Si nuestra poblacin de partida es una lnea pura, no tiene sentido la realizacin de seleccin dentro de ella. Antes habr que introducir variacin, mediante hibridacin, mutagnesis, etc. Una vez se disponga de variacin de origen gentico la seleccin puede ser eficaz.

Seleccin individual.

La seleccin individual, tambin denominada seleccin de lneas puras, consiste en la seleccin de aquellos individuos con un fenotipo que se ajusta a los objetivos del programa de mejora. Una vez realizada esta seleccin, la semilla recogida de cada planta se evala por sus caractersticas.

Una vez realizada la seleccin inicial se realiza una prueba de descendencia. Las pruebas de descendencia permiten evaluar mejor los genotipos seleccionados, ya que la descendencia obtenida ser igual en genotipo a la planta madre, por proceder de una planta autgama homocigtica. Esto permite distinguir los parentales genticamente buenos de aquellos que presentaban un buen fenotipo como consecuencia de un efecto ambiental favorable. Para ello, se recoge la semilla por separado, sembrndose una pequea parcela con cada una de las 32

descendencias de las plantas seleccionadas. La seleccin se efecta ahora entre parcelas distintas, no realizndose seleccin de plantas dentro de parcela, ya que todas las plantas son genticamente iguales. Una vez realizada la seleccin de parcelas se recoge la semilla de cada parcela por separado. Con la descendencia de las parcelas seleccionadas se realizan ensayos comparativos que permitan identificar a los genotipos superiores. Si de los resultados de estos ensayos comparativos se desprende que se ha seleccionado algn genotipo de inters se realiza su multiplicacin. De esta forma tan sencilla podemos obtener una nueva variedad.

La eficacia del mtodo depender en gran medida de la variacin existente en la poblacin original y de lo eficaz que haya sido la primera seleccin, lo cual depender a su vez de la heredabilidad del carcter. Cuanto mejor sea la heredabilidad del carcter, mejor va a ser esta seleccin. Por lo que respecta al ambiente se debe tratar de que sea lo ms homogneo posible, lo cual aumentar el valor de la heredabilidad al reducir la varianza ambiental.

Seleccin masal.

La principal diferencia entre la seleccin individual y la seleccin masal es que en la seleccin individual el tipo final obtenido constituye una lnea pura. En cambio en la seleccin masal se conserva un nmero elevado de lneas distintas. El resultado final, por tanto, no es una lnea pura sino un conjunto de lneas puras.

Existen dos variantes de la seleccin masal, la negativa y la positiva. La diferencia entre ellas es la presin de seleccin que se aplica. As, en la negativa la presin de seleccin es poco intensa, de forma que nicamente se eliminan los fenotipos ms desfavorables. En la positiva, la presin de seleccin es ms fuerte, de forma que nicamente se conserva la semilla de los fenotipos mejores. La seleccin masal ha sido muy til para la mejora de variedades locales. Estas variedades se encuentran muy bien adaptadas a los ambientes en que han evolucionado.

8.2. Cruzamientos transgresivos y complementarios.

Mediante la seleccin individual y masal nicamente se efecta una seleccin entre genotipos ya existentes en una poblacin determinada. Sin embargo, en muchas ocasiones 33

deseamos obtener genotipos que no estn presentes en la poblacin original de la que partimos. Una de las vas ms utilizadas en los programas de mejora en autgamas es introducir variacin mediante cruzamientos. De esta forma, en las generaciones segregantes, por recombinacin, aparecern genotipos nuevos que finalmente por autofecundacin darn lugar a hacia lneas puras con un genotipo nuevo.

Segn el fin que se persiga se habla de dos tipos de cruzamientos:

Cruzamientos complementarios:

En este tipo de cruzamientos se intenta obtener un nuevo genotipo homocigtico que rena determinadas caractersticas de cada genitor. Se pretende obtener un genotipo en el que los caracteres deseados se encuentran repartidos entre los dos parentales.

Supongamos que poseemos dos variedades de trigo: Una con una produccin elevada, con caa fuerte y resistente al fro, pero con tendencia al desgranado, baja calidad panadera y susceptible a la roya. La segunda, con produccin baja, con caa dbil, no resistente al fro, pero sin tendencia al desgranado, alta calidad panadera y resistente a la roya. Tal vez se podra realizar un cruzamiento complementario entre las dos intentando conseguir en las generaciones segregantes un genotipo con produccin elevada, caa fuerte, resistente al fro, sin tendencia al desgranado, alta calidad panadera y resistente a la roya.

Cruzamientos transgresivos:

En este tipo de cruzamientos se intenta obtener en la descendencia genotipos que muestren un caracter cuantitativo con mayor o menor intensidad (segn interese) que la de los genitores. Los cruzamientos de tipo transgresivo pueden dar buen resultado en la mejora de caractersticas reguladas por sistemas polignicos. Dos parentales que muestren similar intensidad para un caracter polignico pueden presentar genotipos distintos para este caracter y en la segregacin del correspondiente cruzamiento se pueden obtener nuevos genotipos que acumulen mayor nmero de genes favorables. 34

Supongamos en trigo dos genotipos que muestran la misma resistencia al fro y que sus constituciones genticas son: AABBccddeeFF y aabbCCDDEEff, siendo los alelos con letras maysculas los que confieren mayor resistencia al fro segn un modelo aditivo. En la segregacin procedente de la autofecundacin del hbrido se obtendrn genotipos con distinto nivel de resistencia al fro y si se utilizan tamaos de poblacin suficientemente grandes se podr obtener el genotipo AABBCCDDEEFF, el cual acumula ms alelos de resistencia al fro que cualquiera de sus parentales.

8.3. Mejora por hibridacin con seleccin masal.

En este mtodo, una vez se ha obtenido la generacin F2, ya sea a partir de un cruzamiento de tipo complementario o transgresivo, sta se siembra en una parcela y se recoge la semilla en conjunto de la F3 sin efectuar seleccin o eliminando nicamente los tipos ms desfavorables. La semilla de esta generacin se vuelve a plantar y se repite el esquema hasta alcanzar un grado de homocigosis elevado. Habitualmente se considera que en las generaciones F6-F8 el grado de homocigosis es suficientemente elevado. La eleccin de la generacin en que se considera que se ha alacanzado un grado de homocigosis suficiente depende de la amplitud de la segregacin obtenida, que a su vez depender del grado de diferencia gentica de los progenitores. Cuanto mayor sea la diferencia gentica entre los progenitores mayor nmero de generaciones de autofecundacin debern transcurrir para que se alcance un mismo grado de homocigosis. Ya hemos visto (tema 6) que la autofecundacin reduce el nmero de heterocigotos para un gen a la mitad en cada generacin. De esta forma, en estas generaciones, el nmero de heterocigotos ser 2n-1, siendo n el nmero de generaciones de autofecundacin. Una vez alcanzadas las generaciones antes indicadas, se realiza una siembra de plantas aisladas para elegir entre ellas las mejores. Estas plantas elegidas se denominan genearcas y pueden ser el punto de partida de nuevas variedades.

En la generacin siguiente F7, F8 F9, se siembra una parcela con la semilla de cada genearca para comprobar la homocigosis y el mantenimiento de los buenos caracteres que constituan el fenotipo seleccionado. Se realiza entonces una seleccin de parcelas y con la semilla de cada parcela seleccionada se realizan ensayos comparativos frente a los parentales 35

originales y otras variedades comerciales para comprobar que efectivamente se ha conseguido una mejora respecto a los materiales ya existentes. Para que estos ensayos comparativos nos proporcionen informacin suficiente para decidir si merece la pena liberar las lneas seleccionadas como nuevas variedades, stos debern realizarse durante ms de un ao y en ms de una localidad.

Este mtodo es burdo, pero puede ser muy eficaz. Lo que persigue es la obtencin de una poblacin heterognea de individuos homocigotos de entre los cuales seleccionar los mejores genotipos. Es por ello que no se efecta seleccin en las generaciones iniciales de autofecundacin. En estas generaciones existir un elevado grado de heterocigosis. Lo nico que se pretende es que se alcance la homocigosis y en este caso, la autofecundacin que se da por el propio sistema reproductivo de la planta ayuda al mejorador a alcanzar este objetivo.

8.4. Mtodo genealgico con cruzamientos simples.

En los mtodos genealgicos o de pedigr se siembran las plantas de la F2, procedentes al igual que en el caso anterior de un cruzamiento, pero en este caso deben situarse espaciadas lo suficiente como para ser evaluadas de forma individual. En esta generacin se realiza una seleccin eligindose las mejores plantas. La semilla de cada una de las plantas se recolecta y se guarda separadamente. Esta semilla se siembra en parcelas separadas (1 por planta), dando lugar a la generacin F3. Esto permite correlacionar el comportamiento medio de la parcela de la F3 con el conjunto de caractersticas por las que se seleccion la planta correspondiente en la F2. En la F3 se efecta primero una seleccin por parcelas, eligindose las que presentan, como media, un mejor comportamiento y luego se seleccionan plantas individuales dentro de estas parcelas, recogindose separadamente la semilla de cada planta seleccionada para sembrar la F4 de manera anloga a como se hizo en la generacin anterior.

Se contina de esta forma, seleccionando en cada generacin primero parcelas y luego plantas dentro de parcelas. Conforme avanzan las generaciones la homocigosis dentro de parcela aumenta debido a la autogamia, de modo que cuando se alcanzan las generaciones F6-F9 la homogeneidad dentro de parcela es muy elevada. En estas generaciones se pueden seleccionar los genearcas que pueden dar lugar a una nueva variedad. 36

Una vez seleccionados los genearcas, se cultivan durante un ao o dos sus descendencias para comprobar la fijacin de la variedad y obtener semilla para los ensayos comparativos que se realizarn en ms de un ao y en varias localidades antes de comercializar el material obtenido como nueva variedad.

El manejo genealgico presenta las siguientes ventajas sobre el manejo masal:

-Permite la eliminacin de una gran carga de material no prometedor en generaciones tempranas. -Al conocerse el pedigr de cada planta, permite la evaluacin de selecciones en base al comportamiento de varios aos.

La desventaja principal de este mtodo frente a la seleccin masal es que la cantidad de material que se puede evaluar est limitada por el tiempo que se requiere para evaluar las plantas de forma individual. Con la misma cantidad de recursos se pueden evaluar un nmero total de plantas muy inferior a las que se podran evaluar con el manejo masal.

Cuando el mejorador quiere obtener la mxima informacin de uno o unos pocos cruzamientos en el menor tiempo posible, ste es mejor mtodo que el masal. Pero no es as cuando se desean evaluar un elevado nmero de cruzamientos como fuentes de genotipos superiores.

Bajo dos condiciones determinadas, los mejoradores suelen utilizar el manejo masal en lugar del genealgico. La primera es cuando es necesario manejar grandes cantidades de material segregante. La segunda es cuando la presin de seleccin natural o artificial puede eliminar grandes proporciones de plantas no deseables en poblaciones segregantes. De todas formas, para cualquier poblacin hbrida, la eleccin de un mtodo no excluye al otro y se han desarrollado diferentes combinaciones de ambos.

8.5. Mejora por retrocruzamiento.

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El mtodo del retrocruzamiento tiene inters cuando se dispone de una variedad con buenas caractersticas agronmicas, pero que posee una deficiencia especfica que se pretende superar. Estas deficiencias pueden ser provocadas por la aparicin de un nuevo patgeno, de un gusto nuevo en el mercado, etc. En estos casos es deseable incorporar a la variedad que ya tenemos el gen o los genes que permitan superar esta deficiencia especfica pero manteniendo en todo lo posible el fondo gentico de nuestra variedad. Es importante destacar que a pesar de explicarse en este tema, el mtodo de retrocruzamiento es aplicable tanto a autgamas como a algamas.

En el mtodo de retrocruzamiento se denomina parental recurrente al que deseamos introducir los genes para el carcter en cuestin y se denomina donante al genotipo fuente de variacin, a partir del cual se incorporarn los nuevos genes en el fondo gentico del genotipo recurrente.

Los factores principales que condicionan el xito de un programa de retrocruzamiento son:

-Nmero de genes: Cuanto menor sea el nmero de genes a introducir ms fcil es la ejecucin del programa. -Modo de accin gnica: Es ms fcil la incorporacin de caracteres controlados por genes dominantes que por genes recesivos.

Introduccin de un caracter controlado por un gen dominante:

Este es el caso ms sencillo. Supongamos que deseamos introducir un caracter controlado por un gen dominante A presente en un material vegetal V (fuente de variacin) de fondo gentico G= en una variedad comercial R de fondo gentico G, que presenta el alelo a en homocigosis.

Para que sea posible aplicar el mtodo de retrocruzamiento el producto de los cruzamientos RxV y (RxV)xR ha de ser frtil (Figura 8.4).

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Descripcin del proceso: 1) Cruzamiento del parental recurrente R como genitor femenino con el parental donante V como masculino. Se obtiene una F1 con genotipo Aa para el carcter de inters. El citoplasma ser el de la variedad comercial y el fondo gentico tendr un 50% de cada parental (G50%G=50%). Los genes que se encuentran en los orgnulos citoplasmticos nicamente son transmitidos por va maternal. De esta forma, al utilizar al parental recurrente R como parental femenino los genes contenidos en el citoplasma sern en un 100% los de R. 2) A partir de aqu se efectuar el primer retrocruce con el parental recurrente con lo que se obtiene la primera generacin de retrocruzamiento (BC1; del ingls Aback-crossing@). Al retrocruzar vamos forzando la eliminacin de los genes del parental donante e introduciendo genes de la variedad comercial deseada. En este caso ya no sera necesario utilizar como parental femenino a R, ya que ahora el citoplasma de ambos parentales es el mismo. De hecho sera conveniente a partir de aqu utilizar como parental masculino a R y como femenino al producto de los retrocruzamientos. Eso permite disminuir el impacto de las consecuencias derivadas de errores cometidos en cruzamientos (ver ms adelante). Por lo que respecta al resto del genoma, ahora nos encontraremos con unas proporciones G75%G=25%. De esta forma, ya habremos recuperado 3/4 partes del genoma del parental recurrente. 3) Al existir segregacin para el carcter que estamos mejorando (50% Aa y 50% aa) es necesario realizar una seleccin de plantas que presenten el fenotipo A. Estas plantas seleccionadas se retrocruzan de nuevo con el parental recurrente para obtener la segunda generacin de retrocruzamiento (BC2). En este caso volvemos a obtener segregacin 50% Aa y 50% aa para el carcter deseado. Las proporciones de genoma sern ahora G87.5%G=12.5%. 4) El proceso descrito en el punto 3 se repite hasta la BC5-BC9, dependiendo del grado de diferencia gentica entre el parental donante y el recurrente. A mayor diferencia, mayor nmero de generaciones de retrocruzamiento. Al aumentar el nmero de retrocruzamientos la eliminacin del fondo gentico G= va siendo mayor (la mitad en cada generacin), hasta llegar a un momento en que el aumento de una nica generacin de retrocruzamiento no supone una mejora del material de inters, ya que en ser muy poca la nueva incorporacin de genoma del parental recurrente. El producto final obtenido no ser idntico a la variedad R, puesto que no se consigue eliminar al 100% el genoma del parental donante. Como resultado de toda la serie de retrocruzamientos se obtienen plantas con fenotipo similar al del parental donante para el caracter que se desea introducir, pero heterocigotos para el gen que deseamos introducir. 39

5) A partir de estas plantas se obtiene una generacin de autofecundacin. Entre estas plantas, un 25% sern AA, 50% Aa y 25% aa. 6) De los descendientes de la generacin de autofecundacin se seleccionarn aquellos que muestren el carcter buscado. Para poder distinguir a los homocigotos de los heterocigotos es necesario autofecundar o realizar un cruzamiento de prueba con el parental recurrente R y estudiar la descendencia de cada planta. Aquellas descendencias que no muestren segregaciones para el carcter son las que provienen de un genotipo homocigoto. 7) Con las descendencias de los homocigotos se llevarn a cabo ensayos comparativos en los que el testigo ser el parental recurrente. De este modo se pueden identificar aquellos genotipos que habiendo incorporado el carcter deseado posean caracteres agronmicos ms similares a la variedad comercial.

La seleccin en las descendencias de los retrocruzamientos, a lo largo de todo el programa, en contra de aquellas plantas que no muestren caracteres de inters agronmico similares a los de la variedad comercial, aunque no es necesario, permite acelerar el programa.

As mismo, la realizacin de varios ciclos en un mismo ao, siempre y cuando sea posible, permitir conseguir el objetivo deseado en menos tiempo.

En el caso de la introduccin de un gen recesivo, el manejo de los materiales es algo diferente y ms complicado que en el caso de un gen dominante, por lo que no ser tratado en este curso. En este caso no podemos seleccionar en contra de los homocigotos para el alelo dominante AA (presente en el parental recurrente) ya que fenotpicamente sern indistinguibles de los heterocigotos Aa, portadores del alelo que nos interesa incorporar (a).

Cuando queremos introducir varios caracteres monognicos en una variedad sin alterar su fondo gentico el problema se complica, pues el nmero de plantas necesario se multiplica. Sin embargo, cuando se abordan este tipo de problemas se pueden utilizar varias estrategias basadas en el retrocruzamiento, las cuales tampoco pueden ser abordadas en este curso.

8.6. Variedades hbridas.

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En la actualidad, existen variedades hbridas en muchos cultivos autgamos. Las ventajas que presentan los hbridos es que en muchos casos presentan heterosis o vigor hbrido para produccin, facilitan la acumulacin de genes de resistencia y representan una patente fsica para las casas comerciales (Tema 7). Aunque en autgamas no existen genes recesivos detrimentales, ya que la seleccin los ha eliminado (tema 6), los hbridos en autgamas suelen presentar heterosis. La hiptesis ms aceptada para explicar esta teora es que los alelos que aportan vigor son dominantes. De esta forma, reuniendo en un mismo material alelos favorables de distintos parentales se puede obtener un mayor vigor en el hbrido. En este caso, sera posible desarrollar lneas puras que acumulasen todos los alelos favorables en homocigosis, con lo cual seran tan productivas como los hbridos. La otra teora es la de la superdominancia, que asume que para los genes que afectan al vigor el estado heterocigoto confiere ms vigor que cualquiera de los estados homocigotos. De esta forma, no sera posible obtener lneas puras tan vigorosas como los hbridos.

La obtencin de variedades hbridas implica que se deben realizar cruzamientos controlados para asegurar que se ha conseguido la obtencin del hbrido. En algunos casos, como en el tomate, los cruzamientos son fciles de realizar y de cada uno se pueden obtener incluso cientos de semillas. En otros, como el trigo y el arroz, las polinizaciones son difciles de realizar y por cada cruzamiento nicamente se obtiene, como mucho, una semilla. Esto hace que en algunos cultivos autgamos los hbridos sean frecuentes a nivel comercial, mientras que en otros slo se utilizan a nivel experimental.

Para la obtencin de hbridos es necesario que el cruzamiento sea compatible y que de el mayor nmero posible de semillas. Normalmente no suele haber problemas en el cruzamiento entre lneas puras dentro de una misma especie, especialmente en el caso de especies autgamas, en que no hay depresin consangunea.

TEMA 9. MTODOS DE MEJORA EN PLANTAS ALGAMAS

9.1. Seleccin masal

La forma ms sencilla de mejorar una poblacin de plantas algamas en la que existe 41

variacin es la seleccin masal (Figura 9.1). En este tipo de seleccin se eligen en cada generacin aquellos individuos cuyo fenotipo sea ms interesante. La semilla de las plantas seleccionadas se mezcla formndose la generacin siguiente. Despus de varias generaciones sucesivas de seleccin puede lograrse un aumento en la frecuencia de genes favorables, desplazndose la media del carcter en cuestin hacia valores agronmicamente superiores.

A lo largo del proceso de seleccin y, de forma simultnea, puede ser de inters la multiplicacin de la semilla obtenida en cada generacin, con objeto de efectuar ensayos que permitan evaluar la mejora conseguida, o incluso para obtener en cada generacin semilla comercial.

La seleccin masal en plantas algamas, al igual que en autgamas, ha sido sin duda el primer mtodo de mejora utilizado, llevndose a cabo desde la revolucin del Neoltico. Es lgico pensar que los agricultores han ido escogiendo de sus campos las plantas de mayor inters econmico para obtener de ellas la semilla a utilizar en la siembra del siguiente ciclo de cultivo. El efecto producido por esta seleccin masal realizada durante muchas generaciones con toda probabilidad ha sido seguramente mayor que todos los mtodos de mejora modernos, dando lugar a la mayor parte de tipos varietales que se cultivan en la actualidad.

La seleccin masal ha sido efectiva cuando ha sido posible identificar los genotipos superiores a partir de los mejores fenotipos, esto es, cuando la heredabilidad del carcter es alta. En general, ha sido til para la obtencin de variedades adaptadas a zonas especficas de produccin, con unas caractersticas ambientales concretas, cuando la expresin favorable de ciertas estructuras genticas es el resultado de la interaccin del genotipo con el ambiente.

En el mtodo masal, si la seleccin se ha realizado por algn carcter que ha permitido eliminar las plantas no seleccionadas antes de que tengan lugar los cruzamientos, stos nicamente se realizarn entre las plantas seleccionadas. En el caso de que la seleccin se tenga que efectuar una vez las plantas se han cruzado (por ejemplo, produccin de semilla) nicamente conoceremos cual es el parental femenino. De todas formas, an en este ltimo caso se consigue un incremento en la frecuencia de los genes favorables.

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Cuando la seleccin masal no es efectiva, por tener dificultades el mejorador para distinguir los mejores genotipos a partir del fenotipo, un mtodo eficaz para diferenciar los genotipos superiores es mediante pruebas de descendencia. Bsicamente, este mtodo consiste en recoger la semilla de aquellas plantas que han mostrado una expresin del carcter ms favorable. Las semillas procedentes de una misma planta se guardan separadamente. Cada uno de los lotes constituye un conjunto de medios hermanos. Ya que la polinizacin se ha efectuado al azar, slo conocemos al parental femenino. Si la polinizacin es realmente al azar (tasa de alogamia =1) se puede considerar que cada planta ha sido polinizada por una muestra representativa de la poblacin. Por lo tanto, se puede asumir que el efecto producido por los genes aportados por el gameto masculino sern los mismos para cada planta. De esta forma, las diferencias que se observen entre progenies de plantas se pueden atribuir a diferencias en el genotipo de la planta productora de semilla (parental femenino). Al ao siguiente, parte de esta semilla se siembra en parcelas separadas, de forma que en cada parcela se siembra slo semilla de una sola de las plantas seleccionadas en el ao anterior. La valoracin de las plantas de una parcela proporciona una estima del valor de mejora de la planta madre seleccionada el ao anterior. Las parcelas que tengan un valor medio superior nos indican cuales son las mejores madres, es decir, los mejores genotipos seleccionados el ao anterior. La semilla procedente de stos se mezcla y constituye la poblacin en la que se seleccionar durante el ao siguiente. De esta forma se procede durante varios ciclos (Figura 9.2).

Este mtodo ha sido muy utilizado en maz (es el llamado mtodo de mazorca-lnea). Sin embargo, tiene el inconveniente de retrasar el plan de mejora un ao por ciclo de seleccin.

Al contrario que en autgamas, la seleccin individual para la obtencin de una variedad directamente a partir de una nica planta no se utiliza, ya que la descendencia de estas plantas originales segregara por no ser una lnea pura. Adems, al utilizar una sola planta apareceran efectos derivados de la consanguinidad, lo cual resultara en una prdida de vigor.

9.2. Seleccin recurrente

La seleccin recurrente consiste en la realizacin de ciclos alternantes de seleccin y cruzamiento: seleccin para elevar al frecuencia de genes favorables en la poblacin de mejora y 43

cruzamiento de las mejores plantas entre s para mantener una variabilidad gentica que permita obtener las mejores recombinaciones gnicas.

La ventaja de este sistema es que el tope que se puede obtener en la mejora no est determinado por el genotipo de una sola planta fundacional, sino por la combinacin ms favorable de genes contenida en un grupo de plantas fundacionales. De esta forma, se aumenta la probabilidad de obtener individuos superiores en comparacin con la seleccin dentro de las lneas obtenidas por autofecundacin ya que existen ms oportunidades para la recombinacin. Al mismo tiempo, puesto que se puede mantener un nivel de consanguinidad bajo, ser posible mantener una variabilidad gentica alta y por lo tanto la seleccin ser efectiva durante un periodo de tiempo ms largo.

Existen varios mtodos de seleccin recurrente.

Seleccin recurrente simple.

Este mtodo presenta las siguientes fases: 1) Se autopolinizan las plantas de una poblacin heterognea y al mismo tiempo se valoran por algn carcter o caracteres deseables. La autopolinizacin se realiza para evitar que los genes de las plantas con genotipo favorable se diluyan al cruzarse con una muestra del resto de la poblacin. Si autofecundamos una planta con genes favorables y se utiliza para crear la siguiente generacin, estamos incrementando la frecuencia de genes favorables mucho ms que si utilizamos la semilla de una planta en la que la polinizacin se ha realizado al azar. 2) Se desechan las plantas que presentan un comportamiento inferior con respecto al caracter que se pretende mejorar. 3) Se propagan las plantas superiores a partir de la semilla procedente de la autofecundacin. Estas plantas presentarn unas frecuencias de alelos favorables superiores a la poblacin anterior. Sin embargo, al autofecundar tambin se favorecer la aparicin de depresin consangunea, con lo cual estas plantas puede que sean menos vigorosas que la poblacin anterior. 4) Se efectan a mano todos los cruzamientos posibles entre los descendientes superiores. En algunos casos esto no es posible, debido a la cantidad de mano de obra que se requerira. 44

Entonces se dejan en polinizacin libre, con lo cual se realizarn cruzamientos al azar. Lo que se consigue con este paso es favorecer la recombinacin gentica y restaurar el vigor. Para evitar los efectos de depresin consangunea es necesario no reducir en exceso la poblacin de plantas seleccionadas. 5) La poblacin resultante de los cruzamientos ser una poblacin con una frecuencia de genes favorables superior a la inicial y no presentar depresin consangunea. Esta poblacin sirve de punto de partida para ciclos posteriores de seleccin y cruzamiento.

Puesto que en este mtodo no se realizan pruebas de descendencia ni de cruzamiento debe ser utilizado nicamente para la mejora de aquellos caracteres con un grado de heredabilidad lo suficientemente alto como para que la seleccin fenotpica realizada visualmente o por simple medicin del carcter o caracteres de inters resulte efectiva.

9.3. Variedades hbridas.

Ya se ha comentado varias veces que el aumento de consanguinidad en algamas va asociado a depresin consangunea. Esto trae como consecuencia una modificacin, a veces profunda, en muchos caracteres de la planta como son un menor desarrollo vegetativo, reduccin en la tasa de crecimiento y descenso de la produccin. Incluso pueden existir grandes dificultades para conservar el genotipo. La aptitud reproductiva puede disminuir hasta el punto de que no puedan conservarse ni en condiciones ptimas de cultivo. Adems de esto, en las primeras generaciones de autofecundacin aparecen un gran nmero de tipos letales y subvitales y se pueden perder muchas lneas potenciales porque. Por contra, los hbridos presentan un gran vigor, manifestando exuberancia para los caracteres que se citaban mermados por la depresin consangunea.

Los hbridos son especialmente ventajosos en algamas, ya que debido a la existencia de genes detrimentales la probabilidad de encontrar un gen detrimental en homocigosis es menor.

La obtencin de lneas puras para el desarrollo de hbridos se realiza normalmente utilizando un sistema que aumente progresivamente la consanguinidad, como por ejemplo, autofecundaciones sucesivas, cruces de hermanos, etc... Si la depresin consangunea es muy 45

elevada, se corre el riesgo de perder la lnea, por lo que hay que trabajar con un elevado nmero de plantas. Si se obliga de forma sistemtica a los cruzamientos consanguneos conseguimos la fijacin de las lneas. Mediante la consanguinidad se consigue reducir la varianza dentro de lnea y aumenta la varianza entre lneas. Esto es, la homocigosis y la uniformidad aumentan dentro de las progenies de cada lnea, con lo cual las distintas lneas se van haciendo ms diferentes.

9.4. Variedades sintticas.

La mejora de plantas algamas se basa en la utilizacin controlada de la heterosis que aparece en los hbridos entre ciertos genotipos. Sin embargo, existen muchas especies en que la produccin de semilla hbrida comercial no resulta practicable. En estas condiciones, las variedades sintticas pueden ofrecer una buena oportunidad para la utilizacin de una apreciable cantidad de heterosis, aunque sta ser menor que la de un hbrido.

Las variedades sintticas tienen la ventaja sobre la variedad hbrida de que el agricultor puede conservar semilla de su cosecha y no precisa la fabricacin del hbrido anualmente.

El punto clave en la distincin de una variedad sinttica y otra variedad obtenida por otros mtodos de mejora es la forma en que son elegidos los genotipos constitutivos. Una variedad sinttica se construye con genotipos cuya aptitud combinatoria ha sido ensayada. Slo los genotipos que se combinan bien entre s en todas las combinaciones entran a formar parte de la variedad sinttica.

Las ventajas de las variedades sintticas son tres:

1) Pueden ser de considerable utilidad en zonas marginales de un determinado cultivo, en las que el costo de la semilla hbrida es muy elevado en relacin al valor de la posible cosecha. 2) La mayor variabilidad de las variedades sintticas en comparacin con los hbridos dobles permite mayor flexibilidad para soportar las condiciones ambientales variables en las zonas marginales. 3) Las variedades sintticas podran utilizarse en zonas donde la superficie destinada al cultivo comercial es demasiado pequea para poder mantener una industria de produccin de 46

semillas hbridas.

Estas ventajas no han sido desestimadas, especialmente en Europa, dnde las variedades sintticas han sido muy utilizadas en la mejora de las especies forrajeras.

El comportamiento de una variedad sinttica depende del nmero de lneas que la compongan, el comportamiento medio de los genotipos constitutivos y el comportamiento medio de los n(n-1)/2 hbridos posibles.

En las variedades sintticas se puede conseguir un mejor comportamiento por medio de cualquiera de los siguientes factores o por una combinacin de ellos:

1) Aumentando el nmero de genotipos selectos. En un material fecundado al azar derivado de n progenitores tendr 1/n menos superioridad sobre la mezcla de la poblacin mezcla de hbridos original (Tema 7). Sin embargo, llega un momento en que se encuentran dificultades para obtener nuevos progenitores que combinen bien con el resto de progenitores. 2) Aumentando la expresin media del carcter en la F1. Ello implica que las poblaciones parentales sean seleccionadas por su elevada aptitud combinatoria. TEMA 10. MTODOS DE MEJORA EN PLANTAS DE MULTIPLICACIN VEGETATIVA

10.1. Introduccin

Las plantas de multiplicacin vegetativa se reproducen asexualmente a partir de rganos somticos, tales como tubrculos, cormos, rizomas, esquejes, estaquillas, etc. Las nuevas plantas obtenidas presentarn un genotipo idntico al de la planta madre, independientemente de la naturaleza de ste (homocigoto, heterocigoto, poliploide, etc.). En este tipo de plantas se mantiene el genotipo entero despus de su reproduccin, ya que no tiene lugar el proceso de recombinacin gentica caracterstico de la reproduccin sexual.

Al transmitirse todo el genotipo una vez se hay seleccionado una nica planta con genotipo superior, ste podr ser replicado de forma sencilla. Eso simplifica enormemente los 47

programas de mejora. Si la seleccin en este tipo de plantas es ms efectiva y simple que en plantas de reproduccin sexual y prcticamente todas las especies de importancia econmica se pueden reproducir vegetativamente, sea de una forma o de otra, cabe preguntarse porqu la reproduccin vegetativa no se lleva a cabo en ms especies. Dos de las causas ms importantes son la degeneracin clonal, consistente en el deterioro de las caractersticas propias de la variedad (ver ms adelante) y que la obtencin del material reproductivo normalmente requiere mucho ms trabajo y medios que en el caso de las especies propagadas sexualmente. Por otra parte, el mantenimiento de las plantas madre de los clones es comparativamente caro con el almacenaje de semillas. De esta forma, las plantas reproducidas vegetativamente suelen corresponder a especies de alto valor econmico, y en las cuales la reproduccin del material es un paso relativamente poco costoso en comparacin con otras labores culturales. Muchos cultivos de reproduccin vegetativamente son perennes, aunque existen excepciones, como la patata o la fresa, que se tratan como cultivos anuales. Tambin muchas ornamentales se reproducen de forma vegetativa. De la misma forma, muchos genotipos estriles se mantienen por multiplicacin clonal. Esto incluye a formas que presentan un nmero cromosmico distinto al tpico de la especie (poliploides, aneuploides, etc.).

10.2. Seleccin clonal en plantas de multiplicacin vegetativa.

Si tenemos una poblacin formada por una mezcla de clones ser posible aislar algn clon superior y mantenerlo y propagarlo, con lo cual habremos obtenido una mejora sobre la poblacin original. Existen muchas Avariedades poblacin@ de clones en las que a pesar de darse un mantenimiento por reproduccin vegetativa existen distintos genotipos. stos han ido surgiendo por mutacin espontnea en distintas plantas del clon original. En este caso el lmite superior de la seleccin viene establecido por el mejor genotipo existente en la poblacin.

En muchas especies, la seleccin de individuos aparecidos despus de una mutacin espontnea ha originado cultivares nuevos. Este es el caso de muchos genotipos de frutales y ctricos.

10.3. Induccin de variacin y seleccin 48

Con el mtodo anterior el alcance de la mejora est limitado por la variacin existente en la poblacin original. Una va para inducir variacin en una poblacin de plantas de reproduccin vegetativa es mediante la mutacin inducida, ya sea con agentes fsicos o qumicos. Otra forma de inducir variacin es mediante el cultivo in vitro para generar variacin somaclonal. En estos casos generamos variacin nueva en una poblacin y podemos seguir el mtodo sealado en el apartado anterior. Este tipo de induccin de variacin puede utilizarse tanto en el caso de genotipos frtiles como infrtiles.

En el caso de que dispongamos de genotipos frtiles se puede recurrir a la hibridacin. En este caso, la reproduccin sexual ofrece una va de crear variabilidad gentica mediante el proceso de la recombinacin gentica. De esta forma si cruzamos clones distintos, se pueden crear poblaciones que pueden ser utilizadas para la seleccin de nuevos clones. En el caso de que la fertilidad sea reducida, por ejemplo debido a que uno de los parentales sea androestril puede utilizarse ste como parental femenino, con lo cual an en este caso se podr realizar el cruzamiento.

Los clones comerciales de plantas de propagacin vegetativa suelen mantener un alto grado de heterocigosis por lo que el cruzamiento de dos clones distintos da lugar a una generacin F1 que no es homognea. En esta generacin podemos efectuar seleccin, pues existirn genotipos distintos. Al proceder de un cruzamiento entre clones distintos usualmente suelen seguir manteniendo un elevado grado de heterocigosis, el cual puede ser mantenido mediante propagacin vegetativa. Si la planta seleccionada mantiene sus caractersticas superiores puede llevar a la liberacin de un nuevo cultivar.

Al ser los clones normalmente heterocigotos, la autofecundacin de stos tambin da lugar a la aparicin de genotipos distintos. Sin embargo, en muchas ocasiones no se suele encontrar ningn genotipo superior al parental del que proceden, ya que la autofecundacin en estas especies suele llevar asociada depresin consangunea y por tanto, los individuos son ms dbiles.

10.4. Degeneracin clonal. 49

En ocasiones, los clones de variedades comerciales Adegeneran@. Esto suele ser debido a dos causas principales:

1) A pesar de que se supone que el genotipo de los clones se mantiene invariante, la acumulacin de mutaciones espontneas acaecidas a lo largo del tiempo puede resultar en una prdida de vigor, reduccin en la produccin, etc., ya que normalmente las mutaciones suelen ser deletreas. En algunas ocasiones, las mutaciones ocurridas son favorables y pueden ser de gran utilidad para el mejorador. Muchas de las Avariedades poblacin@ de clones han aparecido como consecuencia de mutaciones en plantas individuales que luego han sido utilizadas como planta madre de parte de la generacin siguiente

2) La propagacin vegetativa facilita la acumulacin de enfermedades que pueden ser transmitidas con el rgano vegetativo de reproduccin. El problema es especialmente grave en el caso de virus y viroides. As, los rganos utilizados para propagar vegetativamente una planta infectada sern portadoras de la enfermedad. En consecuencia las plantas que se desarrollen a partir de ella tambin desarrollarn la enfermedad. Adems, con este tipo de multiplicacin se pueden ir acumulando distintas enfermedades, de forma que al final el fenotipo que obtenemos es, como consecuencia de las enfermedades, distinto al del clon original.

La solucin a estos problemas pasa por utilizar plantas madre para la reproduccin que se mantengan bajo condiciones controladas ambientes libres de enfermedades y en su observacin para poder detectar la aparicin de mutaciones deletreas, siendo recomendable realizar anlisis peridicos para la deteccin de las enfermedades transmisibles por va vegetativa que afectan ms frecuentemente a la especie.

TEMA 11. LAS NUEVAS HERRAMIENTAS DE LA BIOTECNOLOGA EN EL DESARROLLO DE NUEVAS VARIEDADES.

11.1. Introduccin

Las nuevas tecnologas derivadas del cultivo in vitro y de la manipulacin del ADN 50

(incluyendo la ingeniera gentica) ofrecen una ayuda de gran utilidad para el mejorador. De hecho, algunas de estas tcnicas estan revolucionando la mejora vegetal.

El cultivo in vitro consiste en el cultivo de clulas vegetales aisladas o fragmentos de tejido vegetal en un medio nutriente bajo condiciones aspticas. En estas condiciones, en las que no existe competencia con otros seres vivos, y mediante la utilizacin de un medio de cultivo con los nutrientes y fitorreguladores adecuados en unas condiciones ambientales adecuadas, en muchos casos, es posible regenerar plantas enteras a partir de tejidos diferenciados e incluso clulas individuales. Esto es posible gracias a la totipotencia de clulas vegetales de muchos tejidos.

La ingeniera gentica se define como la formacin de nuevas combinaciones de material heredable por la insercin de molculas de cido nucleico, producidas por el medio que sea fuera de la clula, en un virus, plsmido bacteriano u otro vector, para permitir su incorporacin en un organismo en el cual esas molculas no se dan de forma natural, pero en el cual son capaces de su propagacin continuada. La disponibilidad de tcnicas de cultivo in vitro ha hecho posible del desarrollo de la ingeniera gentica.

La aplicacin del cultivo in vitro de clulas y tejidos y de las tcnicas de ingeniera gentica ofrece la posibilidad de una autntica revolucin en la mejora de plantas, ya que permite superar algunas de las limitaciones de la mejora convencional. En trminos simples, las nuevas herramientas de la biotecnologa pueden ayudar al mejorador incrementando la efectividad de la seleccin al hacer ms rpidos o sencillos los programas de mejora y aumentando la base gentica disponible para el mejorador al ofrecerle la posibilidad de obtener combinaciones genticas nuevas que no era posible obtener por mtodos convencionales. Entre las tcnicas que permiten incrementar la efectividad de la seleccin cabe destacar: -El uso de marcadores moleculares. -El cultivo de anteras y polen. -La seleccin in vitro. -La multiplicacin in vitro. Entre las que pueden aumentar la base gentica disponible para el mejorador se encuentran: 51

-La transformacin gentica. -La fusin de protoplastos. -La generacin de variacin somaclonal. -El rescate de embriones in vitro. -La polinizacin y fertilizacin in vitro.

11.2. Seleccin asistida por marcadores moleculares.

En muchas ocasiones la seleccin de determinados genotipos es difcil debido a que el fenotipo asociado a dicho carcter es difcil de evaluar, que se expresa en nicamente en determinados ambientes, que presenta penetracin incompleta o que requiere de mtodos costosos para su evaluacin. Incluso, imaginemos el caso en que una empresa de semillas pretende seleccionar para resistencia a una enfermedad y sus instalaciones estn situadas en una zona en que no existe esa enfermedad. Si para seleccionar es necesario infectar a las plantas, se correra el riesgo de introducir esa enfermedad en esa regin.

La utilizacin de marcadores que permitan ayudar a la seleccin es de gran utilidad para la mejora. Un marcador es una diferencia fenotpica controlada genticamente utilizada en el anlisis gentico. El principio bsico de la utilizacin de marcadores es la utilizacin de genes polimrficos (es decir, que presenten alelos distintos) que sean fenotpicamente fciles de evaluar y que estn asociados a determinado carcter. De esta forma, si un carcter morfolgico fcilmente observable est asociado a un carcter de inters, seleccionando las plantas que presentan el marcador morfolgico estamos seleccionando las plantas con el genotipo que nos interesa. La utilizacin de marcadores morfolgicos fcilmente identificables a nivel visual y controlados por genes ligados a caracteres de inters ha sido til en determinados casos. Sin embargo, existe un nmero extremadamente limitado de marcadores morfolgicos y para la mayora de caracteres de inters no existen marcadores de este tipo.

Los avances en las tcnicas de manipulacin y anlisis de cidos nucleicos han permitido el desarrollo de un nuevo tipo de marcadores prcticamente ilimitados basados en polimorfismos de ADN (variaciones en las secuencias de nucletidos, deleciones, inserciones, traslocaciones, 52

etc.). Los organismos interfrtiles presentan una alta similitud en sus secuencias de ADN, pero an as pueden existir diferencias en el ADN en muchos lugares del genoma. Estas diferencias pueden utilizarse para el desarrollo de marcadores moleculares. Estos marcadores son claramente ventajosos, ya que su nmero es prcticamente ilimitado, se encuentran tanto en regiones codificantes como no codificantes del genoma y no estn influenciados por el ambiente.

Una vez disponemos de un marcador molecular ligado al carcter que se quiere mejorar, no es necesaria la expresin fenotpica del carcter para llevar a cabo la seleccin. Esta seleccin indirecta permite llevar a cabo una seleccin temprana y un aumento en el tamao de las poblaciones empleadas en los programas de mejora. Tambin facilita la deteccin precoz de caracteres que se expresan en una fase tarda del crecimiento (Figura 12.1.).

Entre la actualidad existen muchos tipos de marcadores que permiten utilizar como marcadores a la propia molcula de ADN.

11.3. Cultivo de anteras y polen.

Mediante el cultivo in vitro de anteras y/o polen ha sido posible regenerar individuos haploides en muchas especies de inters econmico. Estos individuos haploides por s mismos no suelen presentar una utilidad prctica a nivel econmico. Por lo general, los haploides son estriles ya que la ausencia de cromosomas homlogos durante la meiosis provoca la formacin de gametos no viables. Sin embargo, mediante determinados tratamientos fsicos y qumicos se puede conseguir un elevado grado de diploidizacin (obtencin de individuos diploides) mediante una duplicacin espontnea del nmero de cromosomas en determinadas clulas (Figura 12.2).

Un tratamiento habitual para la diploidizacin es el tratamiento con colchicina, el cual es un txico celular que se liga a la tubulina y previene la formacin del huso mittico durante la meiosis, lo cual puede llevar a la duplicacin del nmero de cromosomas.

La principal utilidad del cultivo de anteras y polen es la obtencin de lneas homocigotas en una sola generacin, lo cual permite un acortamiento importante de los programas de mejora, 53

en muchos de los cuales debe transcurrir un tiempo considerable para alcanzar la homocigosis.

11.4. Seleccin in vitro.

La seleccin in vitro consiste en seleccionar para caracteres deseables a nivel celular en lugar de a nivel de planta entera. Esto presenta la gran ventaja de poder probar grandes poblaciones celulares en un espacio muy reducido. A pesar de que en una planta, en principio es de suponer que todas las plantas presentan el mismo genotipo, la existencia de mutaciones espontneas en clulas somticas nos puede permitir efectuar una seleccin. A pesar de que la tasa de mutacin es pequea, al probarse muchas clulas (incluso millones) es posible encontrar entre ellas mutantes que puedan ser de inters.

Para poder efectuar la seleccin in vitro es necesario disponer de algn agente selectivo que elimine las clulas que no sean de nuestro inters o que permita identificar a las tiles por alguna caracterstica.

La seleccin in vitro se ha utilizado para la obtencin de genotipos vegetales con resistencia a herbicidas, a la salinidad y a enfermedades (utilizando en este caso como agente selectivo por ejemplo, la toxina producida por el patgeno).

A pesar de que a priori la seleccin in vitro parece presentar grandes ventajas para seleccionar para determinados caracteres, en la prctica los resultados no han sido tan satisfactorios como se esperaba. Adems para algunos caracteres, como la produccin, es difcil llevar a cabo la seleccin a nivel celular. Esto exigira no slo la determinacin de caracteres a nivel celular que se correlacionen con la produccin, sino tambin la bsqueda de algn agente selectivo adecuado.

Otra desventaja de las tcnicas de la seleccin in vitro es que a veces es complicado regenerar plantas a partir de tejido tisular, sobretodo si se han llevado a cabo varios ciclos de subcultivo. En otros casos, se ha encontrado falta de expresin del carcter a nivel de planta. Esto ocurre porque el comportamiento a nivel de clula no tiene porque corresponderse con el comportamiento a nivel de planta entera. 54

A pesar de estas desventajas, la seleccin in vitro es extremadamente til para la regeneracin de plantas transgnicas (ver apartado 11.5). Estas ltimas suelen incorporar un gen seleccionable, que en muchas ocasiones confiere resistencia a un antibitico txico para clulas vegetales. De esta forma aadiendo ese antibitico al medio de cultivo para la regeneracin de plantas a partir de las clulas, nicamente sobreviven las plantas transformadas que expresan el gen de resistencia.

11.5. Multiplicacin in vitro.

El cultivo de tejidos vegetales para la multiplicacin clonal se ha convertido en un mtodo muy popular para la propagacin vegetativa de genotipos de inters. Este mtodo denominado micropropagacin se basa en la obtencin de nuevas plntulas a partir de un explante (trozo de tejido).

Para ello el tejido inicial cultivado in vitro da lugar a plantulitas, ya sea mediante la formacin de yemas adventicias directamente a partir del tejido original, o despus de pasar por una fase de callo. Las clulas vegetales se pueden multiplicar indefinidamente en cultivo in vitro de forma muy rpida, formndose masas de tejido desorganizado denominadas callos. A partir de un callo se pueden diferenciar plantulitas a travs de la organognesis, en que el callo da lugar al desarrollo de tallos y/o races, o a travs de la embriognesis somtica, en la cual se forman embriones.

Las tcnicas de multiplicacin in vitro son muy utilizadas para la obtencin de material vegetal libre de patgenos en especies de propagacin vegetativa. Para la recuperacin de clones infectados o para asegurar la produccin de plantas libres de virus, se suele realizar cultivo de meristemos. Para ello, de una planta original, se cortan meristemos apicales (con un tamao de entre 0.1-0.5 mm). En estos tejidos meristemticos, con una divisin celular muy activa y sin una conexin vascular diferenciada, en muchas ocasiones no se encuentran partculas virales. De esta forma, cultivando meristemos, se pueden obtener plantas libres de virus.

Otra tcnica de micropropagacin, para la eliminacin de virus de tejidos vegetales, 55

consiste en el microinjerto in vitro. Para ello, en condiciones aspticas, se injerta una plntula de patrn con un meristemo del genotipo a injertar. Esta tcnica es muy utilizada en frutales y en ctricos.

11.6. Transformacin gentica.

La transformacin gentica consiste en la transferencia de genes forneos especficos, aislados a partir de distintos organismos, a un nuevo contexto gentico. El objetivo final de la transformacin gentica es la obtencin de plantas que expresen los genes forneos insertados. Mediante la transformacin gentica se puede conseguir insertar en plantas genes de otras especies, ya sean vegetales, animales, hongos, bacterias, virus e incluso genes artificiales. De esta forma, el mejorador puede tener a su disposicin combinaciones genticas hasta hace poco insospechadas.

Las plantas transformadas genticamente se denominan plantas transgnicas. La obtencin de plantas transgnicas requiere la identificacin y aislamiento de los genes a insertar y su insercin e integracin en el genoma de la planta.

Para la identificacin de genes se trocea el genoma completo de un organismo y cada fragmento de ADN se clona en un vector adecuado (por ejemplo, en plsmidos de la bacteria Escherichia coli) para construir una biblioteca genmica. Para poder encontrar el clon que contiene el gen de inters se puede utilizar al ARNm complementario al gen que nos interesa marcado (generalmente radioactivamente). Al hibridar ese ARNm con los miles de clones obtenidos, nicamente se aparear con aquel clon que posea una secuencia complementaria, y en el cual estar el gen en cuestin con sus secuencias reguladoras y sus intrones. Para ello es necesario poder aislar el ARNm correspondiente a ese ADN. Eso puede hacerse a partir de clulas especializadas en las cuales el producto gnico se produce en grandes cantidades, o por comparacin entre los ARNs entre clulas que expresan el gen y otras que no lo expresan.

Otra solucin es que cuando se conozca la secuencia de al menos un trozo de la protena producto el gen, construir una secuencia de nucletidos que codificara para esa secuencia de aminocidos y utilizarla como sonda marcada. 56

Tambin es posible identificar un gen por homologa de secuencia con genes conocidos de funcin similar. De esta forma, si se ha aislado ya un gen y nosotros deseamos aislar otro, tal vez de otra especie, y que presenta una funcin similar podemos utilizar a ese gen aislado como sonda, ya que probablemente presentar secuencias conservadas comunes.

Por otra parte, los mapas de elevada densidad obtenidos mediante marcadores moleculares han facilitado el posicionamiento de muchos genes en regiones cromosmicas concretas, an incluso cuando se desconoce totalmente el mecanismo de accin o la secuencia del gen, o no se ha conseguido aislar ningn ARNm producto de la transcripcin del gen. Una vez identificada la posicin aproximada del gen en el genoma, mediante la tcnica de Apaseo cromosmico@ se puede localizar su posicin exacta y clonarlo. Esta estrategia denominada clonacin basada en el posicionamiento de genes en el mapa ha sido enormemente facilitada por las nuevas tcnicas, que permiten la manipulacin de grandes fragmentos de ADN, como la clonacin en cromosomas artificiales de levadura (YACs). Otra estrategia para la identificacin de genes es la mutagnesis insercional. La insercin de un elemento gentico mvil (transposn) en un gen y la alteracin fenotpica que origina, proporciona una asociacin entre el locus y el cambio fenotpico. A partir de ah, el gen mutado se puede clonar con relativa facilidad.

Una vez identificado y aislado el gen que nos interesa el siguiente paso es su insercin e integracin en el genoma objetivo. Para la insercin de los genes existen dos grandes categoras de mtodos: Transferencia mediante vectores y transferencia directa. Un requisito imprescindible para la obtencin de plantas transgnicas es que una vez transformadas sean capaces de regenerar plantas enteras. ste es uno de tantos pasos en donde la ingeniera gentica se ha beneficiado de las tcnicas de cultivo in vitro.

Al transformar una planta, el gen que se introduce debe acompaarse de varias secuencias. Por una parte, requerir de promotores, terminadores y otras secuencias reguladoras para obtener el nivel deseado de expresin que puede ser constitutivo (en todas las clulas en todo momento), especfico de tejido (slo en determinados tejidos) o inducible (por algn estmulo externo). Para ello se utilizan secuencias reguladoras de distintos organismos. As, un ejemplo de promotor constitutivo es el del gen 35 S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV). 57

Por otra parte, junto con el gen que nos interesa integrar, se debe incluir un marcador seleccionable que permita la seleccin del material transformado. Eso es as, porque al realizar la transformacin, nicamente un porcentaje muy bajo de las clulas que regeneran para dar lugar a planta han sido transformadas. Para evitar tener que realizar pruebas a posteriori entre miles de plantas adultas para identificar las transformadas, se hace uso de la seleccin in vitro. Para ello se suele acompaar al gen a introducir de un gen marcador seleccionable, como puede ser la resistencia a un antibitico txico para vegetales o resistencia a un herbicida. Si en el medio de cultivo se aade esos agentes selectivos, nicamente sobrevivirn las clulas transformadas, que sern las que proliferarn.

Otro componente til para transferir junto con el gen de inters es un gen informador. Los genes informadores permiten saber en que clulas se est expresando el gen y que nivel de expresin presenta. Un ejemplo de gen informador es el gen de la -glucuronidasa, que a partir del sustrato 4-metilumbeliferil --D-glucurnido da lugar a 4-metilumbeliferona, la cual bajo luz ultravioleta da lugar a fluorescencia. De esta forma, segn la intensidad de la fluorescencia, se puede saber el nivel de expresin en distintas plantas y distintos tejidos.

Por tanto, la transformacin gentica implica la realizacin de construcciones genmicas denominadas T-ADNs (ADNs transformantes) en las que se sitan varios genes. Estas construcciones se suelen denominar construcciones quimricas, porque en ellas habitualmente intervienen componentes procedentes de especies distintas. As, por ejemplo, una construccin genmica podra incluir por ejemplo un promotor procedente de un virus, un gen marcador procedente de una bacteria, un gen informador procedente de un insecto un gen de otra planta que nos interesa expresar.

Una vez se dispone de la construccin genmica, se puede pasar a la transformacin.

Transformacin mediante Agrobacterium. Existen dos especies de bacterias del gnero Agrobacterium (A. tumefaciens y A. rhizogenes) que tienen la capacidad de transferir parte de su material gentico (T-DNA) al genoma de clulas vegetales (Figura 11.3). Este material gentico es parte de un plsmido, 58

pequea molcula circular de ADN extracromosmico de la planta. Dicho plsmido se denomina Ti (inductor de tumores) en A. tumefaciens y Ri (inductor de races) en A. rhizogenes. El ADN-T incluye por una parte genes responsables de la produccin de fitorreguladores y que provocan una divisin exacerbada de las clulas vegetales transformadas. Adems de genes inductores de este crecimiento anormal de tipo tumoral (agallas), en el ADN-T se encuentran genes que codifican la sntesis de opinas, productos de los cuales Agrobacterium se alimenta. De esta forma, Agrobacterium consigue que un elevado nmero de clulas vegetales produzcan sustancias de las cuales la bacteria se aprovecha.

Si el plsmido Ti (o el Ri) son modificados de forma que se eliminan los factores oncognicos y de las sntesis de opinas y se sustituyen por las construciones genmicas que nos interesa transferir a la planta, podemos aprovechar la sofisticada maquinaria de la bacteria para transferir a la planta los genes que nos interesan. Posteriormente, se han desarrollado sistemas binarios, en que por en un plsmido Adesarmado@ se encuentran los factores responsables de la trasnferencia del ADN a las clulas vegetales, pero no los oncogenes ni los genes de opinas y otro plsmido en el cual se encuentra la construccin genmica. Mediante cocultivo in vitro de Agrobacterium con clulas o explantes de tejido vegetal se pueden infectar clulas individuales o explantes de tejido y regenerar plantas enteras transformadas.

Transferencia directa de genes.

Existen especies (particularmente monocotiledoneas) a las cuales Agrobacterium no infecta y que, por tanto, no pueden transformarse utilizando esta bacteria. En estas especies, la transformacin puede realizarse utilizando otros mtodos, como los que se exponen a continuacin:

-Mtodos basados en la biolstica. Se trata de bombardear las clulas o tejidos vegetales con microproyectiles de un material inerte recubiertos con el ADN que se quiere transferir. Para ello se disparan estos proyectiles a alta velocidad (>400 m/s) con la esperanza de que algunas partculas de ADN queden liberadas dentro del ncleo al atravesar la clula y se incorporen al genoma vegetal. Con esta tcnica se han conseguido buenos resultados en muchas especies. Adems, presenta la ventaja de que puede utilizarse en prcticamente cualquier tejido vegetal, e 59

incluso se ha conseguido obtener plantas transgnicas bombardeando plantas adultas, lo cual evita el paso de cultivo in vitro. La principal problemtica de este mtodo es el relativamente bajo nmero de clulas que resultan transformadas.

-Mtodos que permiten incrementar la permeabilidad de la membrana celular al ADN. Para ello, se sitan protoplastos (clulas vegetales desprovistas de paredes) en un medio en el que existe una gran concentracin del ADN que queremos insertar en el genoma de la planta y se aplican tratamientos que permitan incrementar la permeabilidad de la molcula al ADN mediante tratamientos qumicos, por ejemplo con polietilenglicol, o fsicos, como descargas elctricas (electroporacin) o la aplicacin de ultrasonidos (ultrasonicacin).

-Microinyeccin de ADN, consistente en la inyeccin del ADN que pretendemos introducir en el genoma vegetal en el ncleo de una clula vegetal mediante una microjeringa. El principal problema se deriva de la complejidad de la operacin de microinyeccin, lo cual impide que se puedan manejar poblaciones grandes.

Una vez se han conseguido regenerar plantas supuestamente transformadas, debe comprobarse que el gen que nos interesa se ha integrado en el genoma de la planta, que se expresa y que se hereda de forma mendeliana. Una vez comprobado todo esto se puede afirmar que tenemos una planta transformada genticamente. Una vez obtenida esa planta transgnica, los genes transferidos pasarn a su descendencia como cualquier gen del genoma de la planta.

La transformacin gentica de plantas es una herramienta extremadamente poderosa para introducir nueva variacin de utilidad en la mejora de las plantas cultivadas. De esta forma, se han conseguido importantes avances en muchos campos de la mejora de plantas. Entre algunas de las contribuciones ms importantes destacan:

-Resistencia a herbicidas. Las plantas resistentes a herbicidas son las plantas transgnicas que en la actualidad ocupan una mayor superficie. Si se obtiene una planta transgnica resistente a un herbicida no selectivo, es decir que elimina todos los vegetales, se puede tratar todo el campo con ese herbicida. As, mueren todas las hierbas excepto nuestro cultivo. Se han utilizado diversos mtodos para la obtencinde plantas trasngnicas resistentes a 60

herbicidas. Existen bacterias que poseen genes que codifican para enzimas capaces de detoxificar determinados herbicidas. Otra estrategia para la obtencin de plantas transgnicas incluye la sobreexpresin en plantas de las proteinas vegetales sobre las que actua el herbicida. De esta forma, las plantas con esa caracterstica resistiran una mayor dosis de herbicida. Otra posibilidad es la insercin en plantas de genes que codifican para protenas que permiten realizar la misma funcin de forma eficiente que las protenas afectadas por el herbicida.

-Resistencia a plagas. Existen varias estrategias para conferir resistencia a insectos, pero las ms habituales consisten en la transferencia a plantas de genes que codifican para endotoxinas de la bacteria Bacillus thuringiensis (Bt). Las protenas Bt son especialmente efectivas contra lepidpteros. La digestin alcalina que presentan estos insectos provoca la transformacin de la prototoxina en toxina. Otra estrategia consiste en la utilizacin de genes derivados de plantas que codifican para principios antimetablicos para insectos que interfieren con los procesos digestivos de los insectos. Entre estos se encuentran que inhiben enzimas inhibidores de proteasas o de la -amilasa o productores de sustancias txicas como lectinas o quitinasas.

-Resistencia a patgenos. Se han citado muchas estrategias de resistencia a hongos y bacterias a partir de genes de origen vegetal (genes homlogos) o de origen no vegetal (genes heterlogos) que codifiquen para proteinas que confieren resistencia a patgenos. Esas protenas pueden ser especficas para un determinado patgeno, o inespecficas. Estas ltimas se denominan protenas relacionadas con la patognesis y se producen por la planta como respuesta a un ataque externo. Por lo que respecta a la resistencia a virus, tambin se han utilizado diversas estrategias. Entre stas se encuentran la utilizacin de genes derivados del patgeno, expresin de ARNs satlite, uso de ARN antisentido, ribozimas y genes de resistencia derivados de plantas. Una de las estrategias ms utilizadas es la de insertar en el genoma de la planta el gen de la protena de cubierta del virus. Se ha demostrado que plantas que expresan la protena de cubierta de un virus no se ven infectadas por partculas virales de dicho virus, al verse interrumpido el ciclo vital del virus.

-Mejora de la calidad. La calidad engloba muchos aspectos, lo cual puede dificultar su mejora por transformacin gentica. Sin embargo, se han conseguido xitos destacables. Un 61

ejemplo de mejora de la calidad es el control de la maduracin del fruto. La primera variedad transgnica comercializada (el tomate >Flavr Savr= en 1994) tenia la maduracin alterada por la expresin de un gen antisentido del enzima poligalacturonasa, que provoca un ablandamiento de las paredes celulares. La tecnologa antisentido consiste en insertar en el genoma un gen que produzca un ARNm complementario del que va a traducirse para dar lugar a la protena en cuestin. Al aparearse formndose una doble cadena en el citoplasma el ARN se degrada, con lo cual no se produce la traduccin. Otras propuestas para la mejora de la calidad implican la alteracin del contenido en carbohidratos, protenas, lpidos, compuestos aromticos, etc.

-Mejora del rendimiento y de la resistencia al estrs. La mejora de estos caracteres es una tarea difcil. El rendimiento en s mismo es un carcter complejo, en el que intervienen multitud de procesos que interactan unos con otros. Las estrategias futuras se basan en la manipulacin de la fotosntesis, la fijacin del nitrgeno, la absorcin de nutrientes y en la transferencia de genes situados en loci de caracteres cuantitativos (QTLs). Por lo que respecta al estrs ambiental los resultados no han sido demasiado positivos. A pesar de que se han obtenido plantas que expresan el enzima superxido dismutasa, que protege a las plantas contra el anin superxido, el cual se produce en condiciones de estrs, en la prctica los resultados no han sido los esperados. Lo mismo ha ocurrido con la insercin de genes de tolerancia a la salinidad (genes de halotolerancia) procedentes de levadura y genes de resistencia al fro procedentes de peces polares.

-Floricultura. El valor ornamental de una planta depende de su fenotipo. Mediante la insercin de genes individuales en una planta se pueden modificar numerosas caractersticas fenotpicas de valor ornamental (color de la flor, arquitectura de la planta, etc.). Tambin se han introducido genes que alteran la sntesis del etileno, el cual provoca la senescencia, de forma que se pueden obtener flores de larga vida.

-Produccin de metabolitos. La transformacin gentica permite la conversin de plantas en Abioreactores@ para que produzcan metabolitos de inters industrial, medicinal, etc.

-Tcnicas de mejora. Muchas veces existen dificultades importantes en la obtencin de hbridos. Para ello son muy tiles las lneas androestriles (ver Tema 8). Mediante 62

transformacin gentica se han conseguido avances importantes para la obtencin de hbridos va lneas androestriles.

-Vacunas. Existe la posibilidad de obtener plantas transgnicas que expresen antgenos que al ser administrados por va oral provoquen una respuesta inmune. Eso ha permitido la obtencin de vacunas en plantas transgnicas frente a Streptococcus mutans y frente a hepatitis B.

-Plantas acumuladoras de sustancias txicas. Se han obtenido plantas transgnicas capaces de acumular determinados metales pesados. Este tipo de plantas podran contribuir a recuperar suelos contaminados.

-Investigacin. La capacidad de introducir o expresar genes especficos en una planta proporciona una poderosa herramienta experimental para la investigacin en muchos campos: gentica, fisiologa, bioqumica, patologa... De la misma forma, la capacidad de inactivar genes (por ejemplo con la tecnologa antisentido, o mediante silenciamiento de genes) tambin es extremadamente til para su utilizacin en investigacin.

11.7. Fusin de protoplastos

En muchas ocasiones existen barreras que impiden la transferencia de material gentico por cruzamiento sexual entre especies filogenticamente relacionadas. Estas barreras, en ocasiones se pueden superar mediante la fusin de protoplastos (clulas somticas vegetales desprovistas de pared) y la regeneracin del producto de fusin. La fusin de protoplastos es una tcnica complicada con varios pasos crticos. Adems de la fusin de los protoplastos (estimulada mediante tratamientos qumicos o fsicos), es necesario seleccionar los productos de la fusin (heterocariones) y la regeneracin de dichos productos.

La hibridacin somtica puede ser simtrica o asimtrica. La hibridacin simtrica consiste en la obtencin de heterocariones que contienen todo el material gentico de ambas clulas. As, obtendremos hbridos interespecficos alopoliploides que contienen el genoma de 2 especies distintas. En la hibridacin asimtrica, se realiza algn tratamiento (usualmente con 63

rayos X o rayos ) que provoca la fragmentacin de los cromosomas de uno de los donantes. De esta forma, los heterocariones contienen toda la informacin de uno de los donantes y slo parte de la del otro. Por seleccin se pueden elegir los que integren los caracteres que nos interesen.

11.8. Generacin de variacin somaclonal.

En muchas ocasiones, durante el cultivo in vitro aparecen variantes que pueden ser aprovechadas por el mejorador. Este tipo de variacin, aparecida como consecuencia del cultivo in vitro se denomina variacin somaclonal. Mediante el cultivo in vitro de callos, suspensiones de clulas o protoplastos se pueden regenerar plantas enteras que se supone sern rplicas genticamente idnticas de las plantas de las cuales proceden. Sin embargo, a medida que se han ido generalizando las tcnicas de cultivo in vitro se ha ido encontrando que a veces aparecen variantes genticas a una frecuencia relativamente alta como consecuencia del proceso de cultivo in vitro. Este tipo de variacin supone una desventaja para los procesos de cultivo in vitro destinados a obtener rplicas idnticas de determinadas plantas. Sin embargo, puede suponer una ventaja para el mejorador ya que aporta variacin. La cantidad de variacin que aparece como consecuencia del cultivo in vitro depende de varios factores. Entre ellos se ellos se encuentran:

-Tipo de tejido del que se parte; por ejemplo, con tejidos desorganizados (callos) se obtiene una mayor tasa de variacin somaclonal. -Constitucin gentica, de forma que determinados genotipos de una misma especie presentan diferentes tasas de variacin somaclonal. -Medio de cultivo. La adicin de altos niveles de ciertos fitorreguladores como 2,4-D y citoquininas al medio de cultivo aumenta la tasa de variacin. -Edad del tejido. Normalmente la variacin somaclonal aumenta con la edad del tejido.

La variacin obtenida por variacin somaclonal en muchos casos lleva a resultados similares a la obtenida por mutacin inducida. De esta forma, en muchos casos la variacin obtenida no ha sido til ya que en la mayor parte de casos la variacin era negativa. En los casos en que aparecen variantes positivos, suelen ir acompaado de cambios negativos. Por otra parte, en ocasiones los cambios obtenidos no son nuevos. En otros casos han aparecido cambios no heredables (epigenticos) o que son heredables pero reversibles (por ejemplo, como 64

consecuencia de metilacin del ADN).

La variacin somaclonal ha sido til sobretodo en determinados grupos de especies, como las ornamentales.

11.9. El rescate de embriones in vitro.

El cultivo de embriones inmaduros puede utilizarse cuando en un cruzamiento entre dos especies relacionadas no existe incompatibilidad prezigtica, es decir el polen es capaz de germinar y fecundar el vulo, pero el embrin aborta en las ltimas fases de su desarrollo debido a la incompatibilidad de ste con el endospermo de la semilla o a la descoordinacin entre el embrin y el endospermo.

En esta tcnica, se extraen los embriones inmaduros de las semillas en desarrollo en un estado en que el embrin todava es viable. Inmediatamente se sitan en un medio de cultivo adecuado con el fin de regenerar el hbrido. Su utilidad principal es en la obtencin de hbridos interespecficos.

11.10. Polinizacin y fertilizacin in vitro.

En muchas ocasiones no es posible la obtencin de cruzamientos entre especies relacionadas debido a la incapacidad del polen para germinar sobre el estigma (incompatibilidad) o por la incapacidad del tubo polnico para alcanzar el vulo. Mediante la polinizacin in vitro se pueden evitar estas barreras en algunos casos. Esto permite la hibridacin entre especies que presentan incompatibilidad pre-fertilizacin, as como la autofecundacin en especies autoincompatibles.

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TEMA 12. REGISTRO, CONSERVACIN Y MULTIPLICACIN DE LAS NUEVAS VARIEDADES.

12.1. Registro de variedades comerciales.

El desarrollo de un nuevo material vegetal mejorado normalmente implica un proceso que puede ser largo y econmicamente costoso. Una de las formas de incentivar a los obtentores para el desarrollo de nuevos materiales es proteger sus obtenciones con unos derechos de propiedad que permitan al obtentor recuperar las inversiones realizadas. La Unin internacional para la proteccin de las obtenciones vegetales (UPOV), que incluye a 37 Estados miembros, entre ellos Espaa, regula la proteccin jurdica de las obtenciones vegetales. Los principales requisitos para acceder a la proteccin de un nuevo cultivar son:

-Novedad: Debe tratarse de un material nuevo, no comercializado previamente y no esencialmente derivado, es decir un material ya existente con una ligera modificacin. -Uniformidad: Debe tratarse de un material en el que no exista variacin importante para sus caractersticas esenciales, tenindose en cuenta su sistema reproductivo particular (autgama, algama o de reproduccin vegetativa). -Estabilidad: Las caractersticas de la variedad deben mantenerse a lo largo del tiempo.

Por otra parte, se debe comprobar el valor agronmico de ese nuevo material, es decir, que presente caractersticas que justifiquen su liberacin como nuevo cultivar.

Si un nuevo material cumple con estos requisitos entonces puede protegerse e inscribirse en el Registro de Variedades Protegidas del Instituto Nacional de Semillas y Plantas de Vivero. Esa proteccin reconoce unos derechos, que suelen ser de un mnimo de 20 aos, al obtentor de la variedad. Sin autorizacin del titular de los derechos, no se puede producir, reproducir, preparar, vender, comercializar, exportar, importar o poseer ese material vegetal.

Sin embargo, existen dos excepciones a estos derechos, que son las denominadas 66

Aexencin del obtentor@ y la Aexencin del agricultor@. La exencin del obtentor permite a un mejorador utilizar cualquier variedad protegida para el desarrollo de nuevas variedades sin necesidad de obtener permiso. La exencin del agricultor permite a ste utilizar en su propia explotacin el producto de la cosecha obtenido por el mismo. De esta forma, si un agricultor ha comprado una lnea pura o una variedad sinttica, podr continuar cultivndola sin necesidad de comprar semilla a pesar de que est protegida. Es por eso que las empresas de semillas, siempre que pueden, recurren a la obtencin de hbridos, los cuales adems de sus ventajas constituyen una patente fsica ya que tanto el agricultor como el mejorador que intente utilizar este material obtendr segregacin en el material de reproduccin obtenido a partir de l.

Hasta hace poco todas las variedades vegetales se protegan con estos derechos. Sin embargo, con la aparicin de variedades transgnicas, en algunos pases, como los Estados Unidos, se ha empezado la proteccin de determinadas variedades de este tipo mediante patentes. Esto supone una variacin importante, ya que elimina las exenciones del obtentor y del agricultor.

12.2. Conservacin y multiplicacin.

Una vez se ha obtenido un material que se piensa puede dar lugar a una nueva variedad, ste debe ser conservado por el obtentor y multiplicado en cantidad suficiente para la realizacin de ensayos y, posteriormente, si las evaluaciones son positivas, para la produccin de semilla comercial para el agricultor.

La semilla del mejorador es la semilla inicial para la fase de multiplicacin. A partir de esta se van produciendo nuevas generaciones de semillas (semilla de prebase, de base, certificada de primera multiplicacin, certificada de segunda multiplicacin, etc.).

Obviamente, a medida que aumenta la escala de multiplicacin no se pueden tener los mismos cuidados que en el mantenimiento de la semilla fundacional del obtentor. Sin embargo, se deben tomar ciertas precauciones para mantener en lo posible la integridad del cultivar. Entre estas precauciones se encuentran: -Eliminacin de plantas que no se corresponden con el tipo de la variedad. 67

-Evitar la mezcla de semilla con otras variedades. -Evitar cultivar las plantas para obtencin de semilla en un campo donde en ciclos anteriores se encontraba un cultivo de la misma especie, ya que pueden quedar semillas en el suelo que den lugar a plantas. -Situar los campos de cultivo para obtencin de semillas en parcelas lo ms alejadas posible de otras parcelas de la misma especie. Esto es especialmente importante en algamas, ya que pueden darse cruzamientos que provoquen una degeneracin de la variedad.

Tambin hay que tener en cuenta que en variedades en que existen genotipos distintos (por ejemplo, variedades de polinizacin libre y variedades sintticas), puede existir un efecto de seleccin natural de forma que algunos genotipos sean ms eficaces reproductivamente y se produzca una modificacin de las caractersticas de la variedad con el tiempo.

Finalmente, las semillas que se comercializan deben cumplir unos requisitos mnimos en cuanto a pureza especfica y varietal, germinacin, humedad, sanidad y tratamientos fitosanitarios, etc.

Por lo que respecta a las plantas de multiplicacin vegetativa debe tenerse una especial precaucin para evitar que el material se encuentre contaminado por enfermedades transmisibles a travs del material de propagacin. As, el material de propagacin debe cultivarse en ambientes libres de determinados patgenos o haberse propagado de forma que se evite la propagacin de enferemdades. Un ejemplo de este ltimo caso es la micropropagacin en plantas leosas.

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