Anda di halaman 1dari 54

FOCUS GROUP 4.

2
Lita Lianti (1106011120) Mohamad Teguh Gumelar (1106000741) Nadia Rizali Nurcahya Nararya Taufik Hidayat Abdullah (1106004071) Wahyu Ari Wibowo (1106020983) Yulianto (1106002116)

ANALISIS ASAM NUKLEAT

Staining
Staining adalah proses identifikasi adanya DNA atau RNA dengan memperikan pewarna (dye) kedalam sampel dan menganalisa warna untuk mengidentifikasi adanya DNA maupun RNA

EtBr ( Ethidium Bromide )


Ethidum bromide memiliki absorbansi sinar UV antara 300 -360 nm dan dapat menyerap energi dari nukleotida degan absorbansi 260 nm. EtBr memandarkan warna kuning/ oranye dengan panjang gelombang 590 nm EtBr berikatan diantara basa hidrofobik pada nukleotida DNA dan merentangkan fragment DNA sehingga meningkatkan daya pendar

Acridine Orange (DNA)


Pada DNA, acridine orange dapat bereksitasi pada 502 nm dengan emisi 565 nm dan memancarkan warna hijau DNA berinterkalasi dengan AO dan menghasilkan warna hijau. AO berikatan dengan asam nukleat pada pH 3,5

Acridine Orange (RNA)


Analisa RNA menggunakan Acridin Orange AO akan bereksitasi pada 460 nm dan memancarkan emisi 650 nm (merah)

DNA Staining
Pengamatan sel staining berguna untuk :
1. Mengetahui letak nukleus dimana dapat didentifikasi dari warna pendar 2. Mengetahui siklus sel dengan menganalisa letak DNA 3. Untuk mengetahui sel tersebut termasuk sel hidup dengan menganalisa adanya DNA

RNA Staining
RNA staining berfungsi untuk mengetahui siklus sel dari sel yang dianalisis, adanya RNA menunjukkan bahwa suatu sel hidup sedang dalam proses sintesis protein

Molecular Probe / Hybridization


Proses penghubungan DNA probe dengan DNA sampel untuk mendeteksi kandungan basa nitrogen yang terdpat pada sampel

PROBE
Probe adalah sekuens asam nukleat yang telah diberi label atau penanda yang digunakan untuk mendeteksi basa nitrogen dalam sekuens sampel DNA ataupun RNA Probe memiliki urutan basa nitrogen yang komplementer terhadap urutan BASA nitrogen DNA dan RNA sampel Probe biasanya berupa mRNA atau single strained DNA (ssDNA) Probe biasanya terdiri dari 20-30 untaian basa dan diberi penanda radioaktif atau penanda pendar Radioaktif isotop fosfor atau fosofdiester yang berikatan pada DNA

Proses Hibridisasi

1. Proses Denaturasi: Proses ini dimana DNA sampel dipisahkan sehingga menjadi rantai tunggal. DNA biasanya dipanaskan atau dengan enzim restriksi 2. Proses Renaturasi Proses ini dimana Probe dipasangkan dengan DNA sampel dan kemudian dia analisis

Elektroforesis Gel
elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran.

Sebelum dilakukan electroforesis, DNA terlebih dahulu dipotong-potong dengan enzim restriksi sesuai dengan recognition site yang diinginkan Sampel kemudian diletakkan dalam media agar. Media agar yang digunakan adalah media agarose dan poliakrilamid Sampel diletakkan pada kutub negatif sumbu-sumbu agar

Sebelum dimasukkan sampel diberi pemberat berupa larutan buffer seperti polietilenglikol atau gliserin, bromofenol biru dan aquades agar dapat masuk ke gel dengan baik Gel kemudian dialiri listrik, sampel dna akan bergerak menuju kutub positif Semakin panjang rantai DNA maka semakin banyak pula waktu yang dibutuhkan untuk menuju kutub positif Kemudian sampel diberi warna (staining) agar dapat terlihat jelas

GEL-TRANSFER HYBRIDIZATION RFLP DNA & RNA SEQUENCING

Gel-transfer hybridization
DNA : Southern blotting RNA : Northern blotting

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)


Perbedaan urutan DNA pada kromosom homolog menghasilkan pola fragmen restriksi yang berbeda RFLP dapat ditekesi dengan Southern Blotting RFLP diwariskan dengan pola Mendelian, dapat digunakan untuk analisis genetika.

DNA Sequencing Metode Sanger


Dideoxy Chain Termination Method

1. DNA yang akan di-sequencing diinkubasi dalam tabung bersama dengan bahan lain yang dibutuhkan untuk sintesis DNA

DNA Sequencing Metode Sanger


Dideoxy Chain Termination Method

2. Sintesis DNA akan berlangsung dan berhenti jika dideoksiribonukleotida digunakan. Proses ini menghasilkan DNA dengan panjang yang bervariasi sesuai urutan nukleotida

DNA Sequencing Metode Sanger


Dideoxy Chain Termination Method

3. Campuran kemudian dielektroforesis dengan gel polyacrilamide. Fluoresensi dari dideoksiribonukleotida yang digunakan dideteksi oleh detektor

RNA Sequencing Metode Sanger


Dideoxy Chain Termination Method

RNA bersifat relatif kurang stabil dibanding DNA Agar dapat di-sequencing dengan metode sanger, RNA perlu diubah menjadi cDNA

ANALISIA KUANTITATIF DNA DAN RNA

Tahapan Uji Kuantitatif

Mengisolasi DNA atau RNA dengan metode elektorforesis gel agarose

Melakukan Identifikasi DNA atau RNA dengan pewarna berfluoresent

Menggunakan metode spektroskopi untuk menentukkan kemurnian dan konsentrasi DNA atau RNA

Menentukan Konsentrasi DNA dan RNA


Konsentrasi DNA dan RNA dapat ditentukan dengan menggunakan : 1. Spektroskopi Sinar Tampak 2. Spektroskopi UV-Vis

Spektroskopi Sinar Tampak Spektroskopi UV-Vis Menggunakan sinar Gabungan sinar tampak tampak sebagai sumber dan UV cahaya Panjang gelombang 190 Panjang gelombang 380 380 nm 750 nm Sampel bening bisa Sampel harus dibuat langsung dianalisa berwarna terlebih dahulu dengan reagen spesifik

Menentukkan Kemurnian DNA


Kemurnian = 260/280

Rentang kemurnian DNA 1.8 2.0 Kemurnian DNA <1.8 maka isolasi DNA belum murni Kemurnian DNA >2.0 maka nilai ddH2O yang diambil lebih banyak dari DNA

Mengukur Konsentrasi DNA dan RNA


[DNA] = 260 x 50 x faktor pengenceran

260 = Nilai absorbansi pada 260 nm 50 = larutan dengan nilai absorbansi 1.0 sebanding dengan 50 ug untai ganda DNA per ml (dsDNA)
[RNA] = 260 x 40 x faktor pengenceran

40 = 40ug/ml untai tunggal RNA (ssRNA)

Metode RT-PCR
Relative Kuantifikasi
Mengacu pada refrensi internal gen untuk menentukan perbedaan reaksi gen yang diuji

Absolut Kuantifikasi
Memberikan nilai pasti dari molekul DNA yang diuji dengan mengacu pada DNA standar

Metode Kuantifikasi Logarithmic Scale


1. Threshold Cycle (Ct) Jumlah siklus yang memiliki threshold kelebihan fluoresens 2. Quantification Cycle (Cq) Berdasarkan acuan dari MIQE, dimana nilai Cq menjadi pangkat eksponensial dari 2

Menghitung Gen
Kurva Kalibrasi Ct-method

MAK2 method

APLIKASI DNA DAN RNA

RNAi (RNA interference) merupakan sebuah mekanisme menghilangkan ekspresi gen setelah gen berhasil ditranskripsi atau suatu proses alami yang meminimalisir atau menghilangkan suatu aktivitas gen tertentu. Pertama kali diteliti melalui penghasil pigmen pada bunga. Setelah itu diteliti lebih lanjut melalui untai ganda RNA pada cacing, Andrew Fire dan Craig Mello mendapatkan penghargaan atas penemuaanya.

Mekanisme kerja RNAi


RNAi bekerja dengan menghancurkan molekul messengger yang membawa informasi gen untuk penghasil protein sel.
RNA memicu Memotong RNAi Fragmen kecil

Menempel pada mRNA

Kode/ pesan dihancurkan

Mekanisme RNAi Secara Umum

Aplikasi RNAi
Kanker - Mengisolasi sel kanker untuk pertumbuhan sel tumor, metastasis, agriogenesis, dan kemoresisten
Terapi Imun Kanker - Mengaktivkan kembali sistem imun pada tubuh penderita kanker atau merekayasa pertumbuhan imun

Tantangan Dalam Mengembangkan RNAi


Respons Imun dan Off-Target

Pengiriman

Kejenuhan dari Pembuat RNAi

Memonitor Aktivitas RNAi

REKAYASA GENETIKA

Pengetahuan Biologi Molekular


ASAM NUKLEAT LEMAK

POLISAKARIDA

PROTEIN

Aplikasi pengetahuan biologi molekular :

1. Pendeteksian dan penyembuhan penyakit 2. Teknologi Obat dan Herbal 3. Teknologi Pangan

4.Rekayasa Genetika

Pendahuluan

Microinjection

Materi Genetik yang ada di mahluk hidup


Struktur dan fungsi tertentu

modifikasi

Materi Genetik yang telah dimodifikasi


Struktur dan fungsi baru Ada fungsi yang dihilangkan

Yang diketahui :
Struktur dan sifat kimia materi genetik Kode yang disusun materi genetik Fungsi kode materi genetik Replikasi materi genetik Isolasi materi genetik dll.

Ketahui

Terapkan

Rekayasa Genetika

Hasilkan

APA SAJA HASILNYA?


Identifikasi

Replikasi
Teknik atau Metode Transfer Materi Genetik
Injeksi Mikro DNA Recombinant Chemical and Electro poration Bioballistic

Modifikasi

Transfer

Contoh hasil rekayasa genetika :


Glow Fish (Pray, 2008) Lembu -lactalbumin (Eyestone, 1999) Sapi Omega-3 (Wu, 2011) Kelinci penghasil antibodi bispesifik (Hovest et al, 2004) Ayam penghasil tetrasiklin (Kwon, 2011) Tikus resisten infeksi bakteri (Queenie, 2008)

Paru-Paru mencit (abc) normal, (def) infeksi dengan rekayasa genetika, (ghi) infeksi tanpa rekayasa genetika (Queenie, 2008)

Anopeles Transgenik Menurunkan Wabah Penyakit Malaria

Ikan Salmon Transgenik

Metode

TERAPI GEN

Definisi

Teknik untuk mengoreksi gengen yang cacat yang yang dapat menyebabkan suatu penyakit.
Insersi gen normal, penggantian gen yang tidak berfungsi Penghilangan gen abnormal Perbaikan gen abnormal Pengaturan gen Terapi gen somatik Terapi gen germinal

Prinsip

Jenis

Cara memasukan gen baru

Terima Kasih